R-Loops ve RNA:DNA Hibritlerinin S9.6 Tabanlı İmmünopresipitasyon Yöntemleri ile Haritalanması

R-döngüleri, hem DNA dizisine hem de topolojik uygunluğa bağlı olarak tüm genomlarda meydana gelen, transkripsiyona dayalı B olmayan DNA yapılarının yaygın bir sınıfını oluşturur. Son yıllarda, R-döngüleri çeşitli adaptif ve uyumsuz rollerde yer almıştır ve insan bozuklukları bağlamında genomik kararsızlık ile ilişkilendirilmiştir. Sonuç olarak, genomlardaki bu yapıların doğru bir şekilde haritalanması birçok araştırmacı için büyük ilgi çekmektedir. DRIP-seq (DNA:RNA İmmünopresipitasyonu ve ardından yüksek verimli dizileme) burada açıklanmaktadır. R-döngülerinin doğru ve yarı kantitatif haritalanmasına izin veren sağlam ve tekrarlanabilir bir tekniktir. Yöntemin yeni bir yinelemesi, R-döngülerinin ipliğe özgü ve yüksek çözünürlüklü haritalanmasına izin veren sonikasyon (sDRIP-seq) kullanılarak parçalanmanın gerçekleştirildiği de açıklanmaktadır. Bu nedenle sDRIP-seq, çözünürlük ve örgülülük açısından DRIP-seq yönteminin bazı yaygın sınırlamalarını ele alır ve bu da onu R-döngü haritalaması için tercih edilen bir yöntem haline getirir.

R-döngüleri, hem DNA dizisine hem de topolojik uygunluğa bağlı olarak tüm genomlarda meydana gelen, transkripsiyona dayalı B olmayan DNA yapılarının yaygın bir sınıfını oluşturur. Son yıllarda, R-döngüleri çeşitli adaptif ve uyumsuz rollerde yer almıştır ve insan bozuklukları bağlamında genomik kararsızlık ile ilişkilendirilmiştir. Sonuç olarak, genomlardaki bu yapıların doğru bir şekilde haritalanması birçok araştırmacı için büyük ilgi çekmektedir. DRIP-seq (DNA:RNA İmmünopresipitasyonu ve ardından yüksek verimli dizileme) burada açıklanmaktadır. R-döngülerinin doğru ve yarı kantitatif haritalanmasına izin veren sağlam ve tekrarlanabilir bir tekniktir. Yöntemin yeni bir yinelemesi, R-döngülerinin ipliğe özgü ve yüksek çözünürlüklü haritalanmasına izin veren sonikasyon (sDRIP-seq) kullanılarak parçalanmanın gerçekleştirildiği de açıklanmaktadır. Bu nedenle sDRIP-seq, çözünürlük ve örgülülük açısından DRIP-seq yönteminin bazı yaygın sınırlamalarını ele alır ve bu da onu R-döngü haritalaması için tercih edilen bir yöntem haline getirir.

R-döngüleri, esas olarak, yeni oluşan RNA transkriptinin şablon DNA zincirine hibridizasyonunun ardından transkripsiyon sırasında oluşan üç sarmallı nükleik asit yapılarıdır. Bu, bir RNA:DNA melezinin oluşumuyla sonuçlanır ve şablon olmayan DNA zincirinin tek sarmallı ilmekli bir durumda yer değiştirmesine neden olur. Biyokimyasal sulandırma ^1,2,3,4 ve matematiksel modelleme⁵, diğer biyofiziksel ölçümlerle ^6,7 birlikte, R-döngülerinin belirli olumlu özellikler sergileyen bölgeler üzerinde meydana gelme olasılığının daha yüksek olduğunu ortaya koymuştur. Örneğin, guaninlerin (G) ve sitozinlerin (C) dağılımında, RNA'nın G-açısından zengin olduğu şekilde iplik asimetrisi gösteren bölgeler, pozitif GC çarpıklığı adı verilen bir özellik, DNA dupleksi^8'e kıyasla DNA:RNA hibritinin daha yüksek termodinamik stabilitesi nedeniyle kopyalandığında R-döngüleri oluşturmak için tercih edilir. Birçok ökaryotik gen ^4,9,10,11'in erken kısımları gibi pozitif GC çarpıklığı gelişen bölgeler, in vitro ve in vivo ^3,4,12 R-döngüleri oluşturmaya eğilimlidir. Negatif DNA süper sarmal stresi de yapı oluşumunu^13,14 büyük ölçüde destekler, çünkü R-döngüleri bu tür topolojik stresleri verimli bir şekilde emer ve çevredeki DNA lifini uygun bir gevşemiş duruma ^5,15 geri döndürür.

Tarihsel olarak, R-döngü yapılarının, transkripsiyon sırasında RNA'nın DNA ile nadir, kendiliğinden dolaşmasından kaynaklandığı düşünülüyordu. Bununla birlikte, yüksek verimli DNA dizilimi (DRIP-seq) ile birlikte DNA:RNA immünopresipitasyonunun (DRIP) geliştirilmesi, R-döngülerinin ilk genom çapında haritalanmasına izin verdi ve bu yapıların insan hücrelerinde beklenenden çok daha yaygın olduğunu ortaya çıkardı ^4,16. R-döngüleri, memeli genomlarında on binlerce korunmuş, kopyalanmış, genetik sıcak nokta üzerinde meydana gelir ve genlerin ilk intronu ve çok sayıda genin terminal bölgeleri ile örtüşen GC çarpık CpG adaları için bir tercih vardır¹⁷. Genel olarak, R-döngüleri toplu olarak insan hücrelerinde genomun %3-5'ini kaplar ve mayalar, bitkiler, sinekler ve fareler dahil olmak üzere diğer organizmalardaki ölçümlerle tutarlı olarak 18,19,20,21,22.

İnsan hücrelerinde R-döngüsü oluşturan sıcak noktaların analizi, bu tür bölgelerin spesifik kromatin imzaları²³ ile ilişkili olduğunu ortaya koymuştur. R-döngüleri, genel olarak, daha düşük nükleozom doluluğu ve daha yüksek RNA polimeraz yoğunluğuna sahip bölgelerde bulunur. Promotörlerde, R-döngüleri, iki ko-transkripsiyonel olarak biriken histon modifikasyonu, H3K4me1 ve H3K36me3^17'nin artan alımı ile ilişkilidir. Gen terminallerinde, R-döngüleri, önceki gözlemlerle²⁴ tutarlı olarak, verimli transkripsiyon sonlandırması¹⁷ geçiren yakından düzenlenmiş genlerle ilişkilidir. R-döngülerinin ayrıca bakteriyofaj, plazmid, mitokondriyal ve maya genomlarının replikasyon kökenlerinde DNA replikasyonunun başlatılmasına katıldığı gösterilmiştir 25,26,27,28,29,30,31. Ek olarak, R-döngüsüne eğilimli insan CpG ada destekleyicilerinin %76'sı, R-döngüleri ve replikasyon kökenleri arasındaki bağlantıları daha da güçlendirerek, erken, kurucu replikasyon kökenleri 32,33,34,35 olarak işlev görür. Toplu olarak, bu çalışmalar, R-döngülerinin, bağlama bağlı bir şekilde belirli biyolojik çıktıları tetikleyebilen yeni bir biyolojik sinyal türünü temsil ettiğini göstermektedir²³.

Önceleri, R-döngülerinin, immünoglobulin sınıf anahtarı rekombinasyonu ^3,36,37 işlemi sırasında sınıf değiştirme dizilerinde oluştuğu gösterilmiştir. Bu tür programlanmış R-döngülerinin, çift sarmallı DNA kırılmalarının³⁸ eklenmesi yoluyla sınıf anahtarı rekombinasyonunu başlattığı düşünülmektedir. O zamandan beri, genellikle aşırı R-döngüsü oluşumundan kaynaklandığı anlaşılan zararlı R-döngüsü oluşumu, genomik kararsızlık ve hiper rekombinasyon, transkripsiyon-replikasyon çarpışmaları, replikasyon ve transkripsiyonel stres gibi süreçlerle ilişkilendirilmiştir (gözden geçirme için 39,40,41,42,43). Sonuç olarak, R-döngü yapılarının daha iyi haritalanması, bu yapıların sağlık ve hastalıktaki dağılımını ve işlevini daha iyi deşifre etmek için heyecan verici ve önemli bir zorluğu temsil eder.

DNA:RNA immünopresipitasyonu (DRIP), DNA:RNA hibritleri⁴⁴ için S9.6 monoklonal antikorunun yüksek afinitine dayanır. DRIP-seq, R-döngü oluşumunun ^4,45 genom çapında sağlam profillenmesine izin verir. Yararlı olsa da, bu teknik, nazik DNA parçalanması elde etmek için kısıtlama enzimlerinin kullanılması nedeniyle sınırlı çözünürlükten muzdariptir. Ek olarak, DRIP-seq, R-döngü oluşumunun yönlülüğü hakkında bilgi sağlamaz. Burada, R-döngülerinin diziye özgü bir şekilde yüksek çözünürlükte eşlenmesine izin veren bir DRIP-seq varyantını rapor ediyoruz. Bu yöntem, immünopresipitasyondan önce genomu parçalamak için sonikasyona dayanır ve bu nedenle yöntem sDRIP-seq (sonikasyon DNA: RNA immünopresipitasyonu, yüksek verimli dizileme ile birleştiğinde) olarak adlandırılır (Şekil 1). Sonikasyon kullanımı, artan bir çözünürlüğe izin verir ve DRIP-seq yaklaşımlarında gözlenen kısıtlama enzimine bağlı parçalanma önyargılarını sınırlar⁴⁶. sDRIP-seq, hem DRIP-seq hem de immünopupsipite R-döngü yapılarının⁴⁵ RNA ipliklerinden dizileme kitaplıklarının oluşturulduğu daha önce açıklanan yüksek çözünürlüklü DRIPc-seq yönteminden elde edilen sonuçlarla güçlü bir uyum içinde olan R-döngü haritaları üretir.

Aralarından seçim yapabileceğiniz çok sayıda yöntemle karşı karşıya kalan kullanıcılar, ihtiyaçları için hangi DRIP tabanlı yaklaşımın tercih edildiğini merak edebilirler. Aşağıdaki tavsiyeleri sunuyoruz. DRIP-seq, sınırlamalarına rağmen, teknik olarak en kolayıdır ve burada tartışılan üç yöntemin de en sağlamıdır (en yüksek verim); bu nedenle geniş ölçüde kullanışlı olmaya devam eder. Yeni veri kümeleri için yararlı bir karşılaştırma noktası sağlayan çok sayıda DRIP-seq veri kümesi yayınlanmıştır. Son olarak, biyoinformatik analiz boru hattı, veriler mahsur kalmadığı için daha basittir. Yeni kullanıcıların DRIP ile R-döngü haritalama becerilerini geliştirmeye başlamaları ve ardından kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ve DRIP-seq ile devam etmeleri önerilir. sDRIP-seq biraz daha yüksek bir teknik zorluk derecesini temsil eder: sonikasyon (aşağıda tartışılmıştır) nedeniyle verimler biraz azalır ve sıralama kütüphanesi süreci biraz daha karmaşıktır. Yine de, mahsur kalma ve daha yüksek çözünürlük kazancı paha biçilmezdir. sDRIP-seq'in hem iki sarmallı RNA:DNA hibritlerini hem de üç sarmallı R-döngülerini yakalayacağı belirtiliyor. Kütüphane yapım adımları nedeniyle, DRIP-seq iki sarmallı RNA:DNA hibritlerini yakalayamaz. DRIPc-seq, teknik olarak en zorlu olanıdır ve daha yüksek miktarda başlangıç malzemesi gerektirir. Karşılığında, en yüksek çözünürlüğü ve büküklüğü sunar. Dizileme kitaplıkları, R-döngülerinin veya hibritlerin RNA kısmından oluşturulduğundan, DRIPc-seq, özellikle S9.6, dsRNA 19,47,48 için artık afiniteye sahip olduğundan, olası RNA kontaminasyonundan muzdarip olabilir. sDRIP-seq, dizileme kitaplıkları DNA zincirlerinden türetildiğinden, RNA kontaminasyonu konusunda endişelenmeden ipliğe özgü, yüksek çözünürlüklü haritalamaya izin verir. Genel olarak, bu üç yöntem yararlı olmaya devam ediyor ve farklı karmaşıklık dereceleri ve biraz farklı uyarılar sunuyor. Bununla birlikte, üçü de oldukça uyumlu veri kümeleri⁴⁸ üretir ve sinyal özgüllüğünü^45,49 sağlamak için temel bir kontrolü temsil eden RNase H ön işlemine karşı oldukça hassastır. Dizileme kütüphanelerine uygulanan boyut seçimi göz önüne alındığında, gecikmeli iplikçik DNA replikasyon hazırlama bölgeleri (Okazaki primerleri) etrafında geçici olarak oluşanlar gibi küçük hibritlerin (tahmini <75 bp) hariç tutulacağı belirtilmektedir. Benzer şekilde, tüm DRIP yöntemleri DNA parçalanmasını içerdiğinden, stabiliteleri için negatif DNA süper sarılması gerektiren kararsız R-döngüleri kaybolacaktır⁵. Bu nedenle, DRIP yaklaşımları, özellikle in vivo yaklaşımlar^45,48 kullanılarak en iyi şekilde yakalanabilen kısa, kararsız R-döngüleri için R-döngü yüklerini hafife alabilir. R-döngülerinin ayrıca derin kapsama alanında, yüksek çözünürlükte ve sodyum bisülfit işleminden sonra tek DNA molekülleri üzerinde ipliğe özgü bir şekilde S9.6'dan bağımsız bir şekilde profillenebileceği^{belirtilmektedir 12}. Ek olarak, katalitik olarak aktif olmayan bir RNaz H1 enzimi kullanan stratejiler, doğal R-döngülerini in vivo olarak haritalamak için kullanılmıştır ve esas olarak duraklatılmış promotörlerde^50,51,52 oluşan kısa, kararsız R-döngülerini vurgulamaktadır.

Aşağıdaki protokol, kültürde yetiştirilen insan Ntera-2 hücre hattı için optimize edilmiştir, ancak bir dizi diğer insan hücre hattına (HEK293, K562, HeLa, U2OS), birincil hücrelere (fibroblastlar, B hücreleri) ve ayrıca küçük modifikasyonlara sahip diğer organizmalara (fareler, sinekler) modifikasyon yapılmadan başarılı bir şekilde uyarlanmıştır.

1. Hücre hasadı ve lizis

1. Kültür Ntera-2 hücreleri% 75 -% 85 birleşmeye kadar. Herhangi bir DRIP prosedürünü başlatmak için optimal hücre sayısının %>90 canlı sayımla 5 ila 6 milyon hücre olduğundan emin olun.
2. Hücreleri bir kez 1x PBS ile yıkayın, 1.5 mL Tripsin-EDTA 1x ekleyin ve ardından hücreler tabaktan ayrılana kadar 37 ° C'de 2 dakika inkübe edin.
3. 5 mL ılık ortam ekleyin ve hücreleri tek bir hücre süspansiyonuna yeniden süspanse etmek için iyice pipetleyin. İçeriği 15 mL'lik yeni bir tüpe aktarın ve hücreleri 3 dakika boyunca 300 x g'da nazikçe pellet edin.
4. Hücreleri 5 mL 1x PBS ile bir kez yıkayın ve hücreleri 300 x g'da 3 dakika boyunca nazikçe peletleyin.
5. Hücreleri 1.6 mL TE tamponunda (10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1 mM EDTA pH 8.0) tamamen yeniden süspanse edin. 5 μL proteinaz K (20 mg / mL stok çözeltisi) ve 50 μL SDS (% 20 stok çözeltisi) ekleyin ve çözelti viskoz hale gelene kadar tüpleri beş kez hafifçe ters çevirin. Çözeltiyi pipetlemeye çalışmayın, sadece ters çevirerek karıştırın.
6. Tüpleri gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.

2. DNA ekstraksiyonu

1. DNA lizatını önceden bükülmüş 15 mL yüksek yoğunluklu faz kilitli jel tüpüne dökün ve 1 hacim (1.6 mL) Fenol / Kloroform İzoamil alkol (25: 24: 1) ekleyin. Beş kez nazikçe ters çevirin ve 5 dakika boyunca 1.500 x g'da döndürün.
2. Yeni bir 15 mL tüpe 1/10 hacim 3 M sodyum asetat (NaOAc) (pH 5.2) ve 2.5 hacim %100 Etanol ekleyin. Faz kilitli jel tüpünden üst sulu fazı dökün ve DNA tamamen çökelene kadar (10 dakikaya kadar) hafifçe ters çevirin.
3. DNA ipliklerini geniş delikli 1.000 μL'lik bir uç kullanarak sarın ve artık süpernatanı taşımamaya dikkat ederek temiz 2 mL'lik bir tüpe aktarın.
4. 1.5 mL% 80 etanol ekleyerek DNA'yı yıkayın ve tüpü beş kez nazikçe ters çevirin. 10 dakika inkübe edin.
5. Önceki adımı iki kez yineleyin. Yıkama adımları sırasında santrifüj yapmayın. DNA'yı rahatsız etmemeye çalışırken son yıkamadan sonra pipetleyerek mümkün olduğunca fazla etanolü dikkatlice çıkarın.
6. Tüpü ters çevirirken DNA'nın tamamen kurumasına izin verin. Bu adım, DNA miktarına bağlı olarak 30 dk -1 saat sürebilir.
7. Kısıtlama enzimi sindirimi yoluyla DNA'yı parçalamak için doğrudan DNA peletine 125 μL TE tamponu veya sonikasyon yoluyla DNA'yı kesmek için 100 μL TE tamponu ekleyin. 1 saat buz üzerinde tutun ve 200 μL'lik geniş çaplı bir uçla birkaç kez pipetleyerek DNA'yı nazikçe yeniden süspanse edin. Parçalanma adımına başlamadan önce 1 saat buz üzerinde bırakın.

3. DNA parçalanması

NOT: Restriksiyon enzimi bazlı DRIP-seq için adım 3.1'i izleyin. Sonikasyon tabanlı DRIP-seq için, adım 3.2'ye atlayın.

1. Restriksiyon enzimi (RE) parçalanması
   1. Tedarikçinin talimatlarına göre bir RE kokteyli kullanarak yeniden askıya alınmış genomik DNA'yı (çok viskoz) sindirin.
      1. Son reaksiyona 0.1 mM spermidin ekleyin. Toplam hacmi 150 μL olan her enzimden 30 U olan 4-5 enzimden oluşan bir kokteyl kullanın.
         NOT: DRIP-seq (HindIII, SspI, EcoRI, BsrGI, XbaI)⁴ için ilk kokteyl, ortalama 5 kilobazlık bir parça uzunluğu oluşturmak üzere geliştirilmiştir. CpG metilasyonu ile herhangi bir girişimden kaçının ve genomun GC açısından zengin bölgelerini yedekleyin. Diğer kokteyller de mümkündür¹⁶). Bu kokteyller hem insan hem de fare genomları için uygundur, ancak gerektiği gibi ayarlanabilir.
      2. Reaksiyon karışımını gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
         NOT: Sindirim sonrası DNA karışımı artık viskoz olmamalıdır. Bu adımda kalan herhangi bir viskozite, eksik bir sindirimin göstergesidir.
      3. Gözlenirse, her enzimden 10 U daha ekleyin ve 37 ° C'de 2-4 saat daha inkübe edin.
         NOT: Kullanıcılar, burada önerilenden daha fazla hücre toplamaları durumunda peletin tamamını sindiremeyebilir.
   2. Gece boyunca sindirilen DNA'yı (150 μL) önceden bükülmüş 2 mL'lik faz kilitli jel ışık tüpüne nazikçe pipetleyin. 100 μL su ve bir hacim (250 μL) Fenol/Kloroform İzoamil alkol (25:24:1) ekleyin. Beş kez nazikçe ters çevirin ve 10 dakika boyunca 16.000 x g'da döndürün.
   3. Yeni bir 1.5 mL tüpe 1.5 μL glikojen, 1/10 hacim 3 M NaOAc (pH 5.2) ve 2.5 hacim %100 Etanol ekleyin. DNA'yı faz kilitli jel tüpünden pipetleyin ve beş kez ters çevirerek karıştırın. -20 °C'de 1 saat inkübe edin.
   4. 4 ° C'de 35 dakika boyunca 16.000 x g'da döndürün. DNA'yı 200 μL% 80 etanol ile yıkayın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16.000 x g'da döndürün.
   5. Peleti havayla kurutun ve pelete 50 μL TE tamponu ekleyin. Tüpü 30 dakika boyunca buz üzerinde bırakın ve DNA'yı nazikçe yeniden süspanse edin.
   6. Bir spektrofotometre kullanarak parçalanmış DNA'nın konsantrasyonunu (OD₂₆₀) ölçün.
   7. İsteğe bağlı ancak önerilir: Sindirimin tamamlandığını doğrulamak için bir boyut işaretleyicinin yanı sıra% 0.8'lik bir agaroz jel üzerine 1 μg sindirilmiş DNA yükleyin. Jeli 100 V'ta bir saat çalıştırın.
      NOT: Eksikse, ek enzim eklenebilir. Eksik sindirim, immünopresipitasyondan sonra çözünürlük kaybına neden olabilir.
   8. Bu adımdan sonra, immünopresipitasyon üzerine alınan sinyalin DNA: RNA hibritlerinden türetildiğinden emin olmak için 10 μg sindirilmiş DNA'yı 4 μL ribonükleaz H (RNaz H) ile 37 ° C'de 1-2 saat tedavi edin. Ardından, S9.6 immünopresipitasyonuna geçin (adım 4).
      NOT: Sindirilen DNA'lar, önemli bir verim kaybı olmadan -80 ° C'de bir aya kadar donmuş halde tutulabilir.
2. Sonikasyon
   1. Ekstrakte edilen DNA'nın tamamını veya bir kısmını 100 μL toplam hacimde 0.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde sonikleştirin. Bir sonikatör üzerinde 15-20 döngü 30 s AÇIK / 30 s KAPALI gerçekleştirin (homojen sonikasyonu sağlamak için 5, 10 ve 15 döngüden sonra döndürün).
   2. Bir spektrofotometrede sonikasyonlu DNA'nın konsantrasyonunu (OD₂₆₀) ölçün.
      NOT: Bu adımda, DNA'nın viskozitesi ortadan kalkmış olmalıdır.
   3. Sonikasyonlu DNA'nın (300-500 bp) boyut dağılımını doğrulamak için bir agaroz jeli çalıştırın.
      NOT: DNA'nın aşırı sonikasyonu, R-döngü yapılarının kırılması ve ayrışmasından kaynaklanan verimde önemli bir azalmaya yol açabilir.
   4. Bu adımdan sonra, immünopresipitasyon üzerine alınan sinyalin DNA: RNA hibritlerinden türetildiğinden emin olmak için 37 ° C'de 1-2 saat boyunca 4 μL RNase H ile 10 μg sonikasyonlu DNA muamelesi yapın. Ardından, S9.6 immünopresipitasyonuna geçin (adım 4).

4. S9.6 immünopresipitasyon

NOT: İmmünopresipitasyon adımları, DNA'nın RE'ler veya sonikasyon yoluyla parçalanıp parçalanmadığına bakılmaksızın benzerdir.

1. Üç tüp hazırlayın ve tüp başına 500 μL TE tamponunun son hacminde 4.4 μg parçalanmış DNA alın. Daha sonra giriş DNA'sı olarak kullanmak üzere her tüpten 50 μL (hacmin 1/10'u) tasarruf edin.
2. Seyreltilmiş DNA'nın 450 μL'sine 50 μL 10x bağlayıcı tampon (100 mM NaPO4 pH 7, 1.4 M NaCl, %0.5 Triton X-100) ve 10 μL S9.6 antikoru (1 mg/mL) ekleyin.
3. Gece boyunca 4 °C'de 7-10 rpm'de bir mini tüp döndürücüde inkübe edin.
4. Her tüp için, 50 μL Protein A/G agaroz boncuk bulamacını 700 μL 1x bağlayıcı tampon ile yıkayın ve tüpleri oda sıcaklığında 7-10 rpm'de 10 dakika boyunca bir mini döndürücü üzerinde ters çevirin. Boncukları 1,100 x g'da 1 dakika boyunca döndürün ve süpernatanı atın. Bu adımı bir kez tekrarlayın.
5. Adım 4.3'ten DNA'yı 50 μL boncuklara ekleyin ve bir mini döndürücü üzerinde 7-10 rpm'de ters çevirirken 4 ° C'de 2 saat inkübe edin.
6. Boncukları 1.100 x g'da 1 dakika döndürün ve süpernatanı atın.
7. Boncukları 750 μL 1x bağlayıcı tampon ile mini döndürücüde 7-10 rpm'de ters çevirerek 15 dakika yıkayın. 1.100 x g'da 1 dakika aşağı çevirin ve süpernatanı atın. Bu adımı bir kez tekrarlayın.
8. Boncuklara 250 μL elüsyon tamponu (50 mM Tris-Cl pH 8, 10 mM EDTA pH 8, %0.5 SDS) ve 7 μL proteinaz K (20 mg/mL stok) ekleyin ve 55 ° C'de (12 rpm) 45 dakika boyunca rotasyonla inkübe edin.
9. Boncukları 1.100 x g'da 1 dakika aşağı döndürün. Süpernatanı önceden bükülmüş 2 mL faz kilitli jel ışık tüpüne aktarın ve bir hacim (250 μL) Fenol/Kloroform İzoamil alkol (25:24:1) ekleyin. Tüpleri beş kez ters çevirin ve oda sıcaklığında 16.000 x g'da 10 dakika döndürün.
10. Yeni bir 1.5 mL tüpe 1.5 μL glikojen, 1/10 hacim 3M NaOAc (pH 5.2) ve 2.5 hacim %100 Etanol ekleyin. DNA'yı faz kilitli jel tüpünden pipetleyin ve beş kez ters çevirerek karıştırın. -20 °C'de 1 saat inkübe edin.
11. 4 ° C'de 35 dakika boyunca 16.000 x g'da döndürün. DNA'yı 200 μL% 80 etanol ile yıkayın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16.000 x g'da döndürün.
12. Peletleri havayla kurutun ve her tüpe 15 μL 10 mM Tris-Cl (pH 8) ekleyin. Tüpleri 20 dakika buz üzerinde bırakın ve yavaşça yeniden askıya alın. Üç tüpün içeriğini tek bir tüpte (45 μL) birleştirin.
13. 45 μL yeniden süspanse edilmiş DNA'nın 5 μL'sini kullanarak qPCR ile DRIP verimliliğini kontrol edin (bkz. 5 μL'yi 10 μL su ile seyreltin ve reaksiyon başına 2 μL kullanın.

5. Yalnızca sonikasyonlu DNA için ön kütüphane adımı

NOT: Sonikasyon, R-döngülerinin yer değiştirmiş ssDNA zincirinin kırılmasına neden olur. Böylece, üç sarmallı R-döngü yapıları, sonikasyon üzerine iki sarmallı DNA: RNA hibritlerine dönüştürülür. Sonuç olarak, bu DNA:RNA hibritleri, kütüphane yapımından önce çift sarmallı DNA'ya geri dönüştürülmelidir. Burada, ikinci bir iplik sentezi adımı kullanılır. Başarılı bir şekilde kullanılan alternatif bir yaklaşım, bunun yerine tek sarmallı bir DNA ligasyonu ve ardından ikinci bir iplik sentezi^{gerçekleştirmektir 53}.

1. Adım 4.12'den itibaren 40 μL DRIP'lenmiş DNA'ya 20 μL 5x saniye iplikçik tamponu (200 mM Tris pH 7, 22 mM MgCl₂, 425 mM KCl), 10 mM dNTP karışımı (dATP, dCTP, dGTP ve kullanıcı ipliğe özgü DRIP dizilimi elde etmeyi planlıyorsa dTTT veya dUTP), 1 μL 16 mM NAD ekleyin, ve 32 μL su. İyice karıştırın ve buz üzerinde 5 dakika inkübe edin.
2. 1 μL DNA polimeraz I (10 birim), 0.3 μL RNase H (1.6 birim) ve 0.5 μL E. coli DNA ligaz ekleyin. Karıştırın ve 16 °C'de 30 dakika inkübe edin.
3. Reaksiyonu hemen 1.6x oranında paramanyetik boncuklar kullanarak temizleyin. DNA'yı 40 μL'lik 10 mM Tris-Cl'de (pH 8) elute edin.

6. Yalnızca RE DNA için kütüphane öncesi sonikasyon adımı

NOT: DRIP, genellikle kilobaz uzunluğunda olan ve bu nedenle hemen kütüphane inşası için uygun olmayan RE parçalarının geri kazanılmasına yol açar.

1. Kütüphane yapımı için malzemenin boyutunu azaltmak için, immünopresipite edilmiş DNA'yı 0.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde sonikleştirin. Bir sonikatör üzerinde 12 döngü 15 s AÇIK / 60 s KAPALI gerçekleştirin (homojen sonikasyonu sağlamak için altı döngüden sonra döndürün). 7. adıma geçin.
   NOT: İmmünopupipüle edilmiş materyal, yan taraftaki çift sarmallı DNA'dan farklı şekilde sonikasyona yanıt veren üç sarmallı R-döngülerini hala taşır.
2. İsteğe bağlı adım: DRIP profillerini eşitlemek için, immünopresipite edilmiş materyali, sonikasyondan önce 37 ° C'de 1 saat boyunca 1x RNase H tamponunda 1 μL RNase H ile muamele edin.

7. Kütüphane inşaatı

1. Adım 4.12'den (RE parçalanması) veya adım 5.3'ten (sonikasyon kesme) 40 μL'ye 5 μL 10x uç onarım modülü tamponu, 2.5 μL 10 mM ATP ve 2.5 μL Uç onarım modülü enzimi (toplam 50 μL) ekleyerek son onarımı gerçekleştirin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Giriş DNA'sına karşılık gelen kontrol dizileme kitaplıkları oluşturmak için 1 μg YENİDEN sindirilmiş ve sonikasyonlu (DRIP) veya sonikasyonlu (sDRIP) giriş DNA'sı ekleyin.
2. Reaksiyonu paramanyetik boncuklar (1.6x oran) kullanarak temizleyin ve 34 μL'lik 10 mM Tris-Cl'de (pH 8) elute edin.
3. 5 μL tampon 2, 10 μL 1 mM dATP ve 1 μL Klenow exo- (toplam 50 μL) ekleyerek A-tailing gerçekleştirin. İyice karıştırın ve karışımı 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
4. Reaksiyonu paramanyetik boncuklar (1.6x oran) kullanarak temizleyin ve 12 μL'lik 10 mM Tris-Cl'de (pH 8) elute edin.
5. 15 μL 2x hızlı ligasyon tamponu, 1 μL 15 μM adaptör ve 2 μL hızlı ligaz (toplam 30 μL) ekleyerek adaptörleri bağlayın. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
6. Reaksiyonu paramanyetik boncuklar (1x oranı) kullanarak temizleyin ve 20 μL 10 mM Tris-Cl (pH 8) içinde elute edin.
7. Sonikasyon kesme yapıldıysa ve adım 5.1'de dUTP kullanıldıysa, 1.5 μL (1.5 U) Urasil N-glikosilaz ekleyin ve ipliğe özgü bir DRIP elde etmek için 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
8. PCR, adım 6.6 veya 6.7'den itibaren kütüphanenin 10 μL'sini yükseltir. 1 μL PCR primer 1.0 P5 (Malzeme Tablosuna bakınız), 1 μL PCR primer 2.0 P7 (Malzeme Tablosuna bakınız), 15 μL ana karışım ve 3 μL su ekleyin. İyice karıştırın.
9. Bir termo döngüleyicide programı Tablo 1'de gösterildiği gibi çalıştırın.
10. Paramanyetik boncuklar kullanarak kitaplığın iki aşamalı temizliğine devam edin. İlk olarak, 500 bp'nin üzerindeki parçaları çıkarmak için 0,65x oranını kullanın. Süpernatanı koruyun. 200 bp'nin altındaki parçaları çıkarmak için süpernatan üzerinde 1x oranına ilerleyin. 12 μL'lik 10 mM Tris-HCl'de (pH 8) elüte edin.

8. Kalite kontrol

1. Pfaffl yöntemini kullanarak iki negatif ve üç pozitif lokus üzerinde qPCR ile R-döngü zenginleştirmelerini kontrol etmek için, adım 6.10'daki temizleme kitaplığının 1 μL'sini kullanın. Kütüphanenin 1 μL'sini 10 μL su ile seyreltin ve lokus başına 2 μL kullanın.
2. Yüksek hassasiyetli bir DNA kiti kullanarak temizlenen kitaplığın boyut dağılımını adım 6.10'dan kontrol edin.

DRIP ve sDRIP, qPCR (Şekil 2A) ve/veya dizileme (Şekil 2B) yoluyla analiz edilebilir. İmmünopresipitasyon adımından sonra, deneyin kalitesi ilk olarak pozitif ve negatif kontrol lokusları üzerinde qPCR ile ve ayrıca RNase H ile tedavi edilen kontrollerle doğrulanmalıdır. Birden fazla insan hücre hattında sık kullanılan lokuslara karşılık gelen primerler Tablo 2'de verilmiştir. qPCR'den elde edilen sonuçlar, belirli bir lokus için lizis sırasında bir R-döngüsü taşıyan hücrelerin yüzdesine karşılık gelen bir girdi yüzdesi olarak gösterilmelidir. Başarılı bir DRIP deneyinde, negatif lokuslar için verim %0.1'den az olmalıdır, oysa pozitif lokuslar RPL13A gibi yüksek oranda kopyalanmış lokuslar için %1 ila %10 arasında değişebilir (Şekil 2A). sDRIP için, verimler DRIP-qPCR tarafından değerlendirildiği gibi tipik olarak daha düşüktür (%20-%50), ancak geri kazanımı eşit şekilde etkiliyor gibi görünmektedir, öyle ki R-döngülerinin belirli bir alt kümesi diğerinden daha fazla etkilenmez. Sonuç olarak, DRIP, sDRIP ve DRIPc'den türetilen haritalar iyi bir uyum içindedir (Şekil 2B). qPCR verileri, pozitif lokuslar için girdi yüzdesinin negatif lokuslara göre kat zenginleştirilmesi olarak da görüntülenebilir, böylece deneyin özgüllüğü değerlendirilir. Kat zenginleştirmeleri, analiz için seçilen lokuslara bağlı olarak tipik olarak minimum 10 kat ile 200 kat arasında değişir. Gen nakavtlarını, nakavtları veya çeşitli farmakolojik tedavileri temsil eden birden fazla numunede kesin miktar tayini gerektiğinde, numuneler arası deneysel varyasyonu normalleştirmek için kontrollerde spike kullanımı şiddetle teşvik edilir. Bu tür sivri uçlar, sentetik melezlere⁵³ veya ilgisiz türlerin⁵⁴ genomlarına karşılık gelebilir.

DRIP ve sDRIP malzemeleri, tek veya çift uçlu dizileme stratejileri kullanılarak dizilenebilir. Veriler, standart hesaplama işlem hatları kullanılarak çoğu ChIP verisine benzer şekilde çıkarılabilir ve analiz edilebilir (DRIP ile ilgili bilgiler için^45'e bakın). Adaptör kırpıldıktan ve PCR kopyalarının çıkarılmasından sonra, okumalar bir referans genoma eşlenebilir ve bir genom tarayıcısına yüklenebilir. DRIP ve sDRIP'in tipik bir beklenen çıktısı Şekil 2B'de gösterilmiştir. DRIP çıkışı, iplik özgüllüğüne izin vermediği için tek yeşil iz ile temsil edilirken, sDRIP sırasıyla kırmızı ve mavi ile gösterilen pozitif ve negatif ipliklere R-döngü eşlemesini gösterir. RNase H ile ön işleme tabi tutulmuş bir numuneye karşılık gelen kontrol izleri, sinyallerin net bir şekilde azaldığını gösterir ve RNA:DNA hibritinden türetilmiş malzemeler için tekniğin özgüllüğünü doğrular. sDRIP tarafından izin verilen çözünürlük kazanımları, girdi DNA materyalinin boyutları karşılaştırıldığında açıkça gösterilmiştir (Şekil 2C). RNase H1 ön işleminin küresel etkisi ve sDRIP-seq ile DRIPc-seq arasındaki korelasyon ile birlikte sDRIP-seq'in tekrarlanabilirliği, Şekil 2D'deki XY grafikleri ile gösterilmektedir.

Şekil 1: DRIP-seq ve sDRIP-seq prosedürlerine genel bakış. Her iki yaklaşım da R-döngülerini korumak için geliştirilen aynı DNA ekstraksiyon adımlarıyla başlar (R-döngüleri içindeki RNA zincirleri dalgalı çizgilerle temsil edilir). DRIP-seq için, genom kısıtlama enzimleri kullanılarak parçalanır, bu da genellikle daha kısa R-döngülerinin gömülü olduğu kilobaz boyutunda fragmanlarla sonuçlanır. sDRIP-seq için, genom sonikasyon yoluyla parçalanır, bu da daha küçük fragmanlar ve yer değiştirmiş tek iplikçikli R-döngülerinin (kesikli çizgilerle gösterilir) kesilmesi ve kaybolmasına neden olur. S9.6 antikoru ile immünopresipitasyonu takiben, DRIP, kısıtlama fragmanları içine gömülü üç sarmallı R-döngülerinin geri kazanılmasına yol açarken, sDRIP, çok az yan DNA'ya sahip iki sarmallı RNA:DNA hibritlerini geri kazanarak daha yüksek çözünürlük sağlar. sDRIP için, RNA:DNA hibritlerini tekrar dubleks DNA'ya dönüştürmek için bir kitaplık oluşturma adımı dahil edilmelidir. Burada gösterildiği gibi, bu, diziye özgü kitaplıklar oluşturmak için bir fırsattır. Protokolün kendisinde detaylandırıldığı gibi, RNase H ile ekzojen tedavi, her iki prosedürün özgüllüğü için anahtar bir kontrolü temsil eder; burada gösterilmez. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: R-döngü haritalama stratejilerinin sonucu. (A) qPCR, DRIP ve sDRIP yöntemi kullanılarak yapılan başarılı immünopresipitasyonlardan elde edilir (qPCR kontrol adımı 4.13'e karşılık gelir). Sonuçlar, yüksek derecede R-döngü eğilimli RPL13A lokusu ve orta derecede R-döngü eğilimli TFPT lokusu dahil olmak üzere, negatif bir lokusta ve iki pozitif lokusta insan Ntera-2 hücrelerinden yapılan iki bağımsız deneyden elde edilmiştir. Y ekseni, girdi DNA'sının yüzdesi olarak immünopresipitasyonun verimini gösterir. Geri kazanımın DRIP için sDRIP'ten biraz daha sağlam olduğunu unutmayın. (B) İnsan Ntera-2 hücrelerinde gerçekleştirilen R-döngü haritalamasının sonuçları, CCND1 ve komşu ORAOV1 genleri etrafında merkezlenmiş bir bölge üzerinde gösterilir. İlk iki parça, sırasıyla RNase H tedavisi olmadan ve RNase H tedavisi ile DRIP-seq sonuçlarına karşılık gelir. Genomu parçalamak için kullanılan kısıtlama enzimlerinin konumu en üstte gösterilmiştir. Sonraki altı parça, (+) ve (-) iplikler (her biri iki kopya) arasında parçalanmış ve belirtildiği gibi RNase H ile ön işleme tabi tutulmuş veya işlenmemiş, ipliğe özgü sDRIP-seq'in sonuçlarını temsil eder. Son dört parça, yüksek çözünürlüklü ipliğe özgü DRIPc-seq yöntemi aracılığıyla R-döngü haritalamasının sonuçlarını temsil eder (Sanz ve diğerleri, 2016; Sanz ve Chedin, 2019), kütüphanelerin R-döngülerinin RNA ipliklerinden inşa edildiği yer. Açıkça görülebileceği gibi, CCND1 ve ORAOV1 genleri, yönlülükleri ile tutarlı olarak sırasıyla (+) ve (-) iplikler üzerinde R-döngü oluşumuna yol açar. RNase H tedavisi, beklendiği gibi sinyali ortadan kaldırır. (C) Kısıtlama enzim parçalanmasından (solda) ve sonikasyondan (sağda) sonra giriş DNA materyalleri, materyaller agaroz jel elektroforezi ile ayrıldıktan sonra gösterilir. DNA merdiveni 100 bp'lik bir merdivene karşılık gelir ve 500 bp'lik bant bir yıldızla vurgulanır. (D) XY sinyal korelasyon grafiklerinin, sDRIP-seq'in tekrarlanabilirliğini (solda), sDRIP-seq'in RNase H1 ön işlemine (ortada) genel duyarlılığını ve sDRIP-seq ile DRIPc-seq arasındaki küresel korelasyonu (sağda) gösterdiği gösterilmiştir. Tüm veriler Ntera-2 insan hücrelerinden alınmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: PCR program ayarları. PCR döngüleri için süre ve sıcaklık ayarları listelenir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: İnsan hücre hatlarında qPCR validasyonu için kullanılan primerler. Tüm diziler 5' ila 3' yönünde listelenir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Burada, S9.6 antikorunu kullanarak potansiyel olarak herhangi bir organizmada R-döngü yapılarını haritalamak için iki protokol açıklanmıştır. DRIP-seq, geliştirilen ilk genom çapında R-döngü haritalama tekniğini temsil eder. Herhangi bir genom boyunca R-döngülerinin dağılımını haritalamaya izin veren kolay, sağlam ve tekrarlanabilir bir tekniktir. DRIP-seq olarak adlandırılan ikinci teknik de sağlam ve tekrarlanabilirdir, ancak bir sonikasyon adımının ve çok telli bir sıralama kütüphanesi oluşturma protokolünün dahil edilmesi nedeniyle daha yüksek çözünürlük ve iplikçik özgüllüğü elde eder. Her iki teknik de immünopresipitasyondan önce RNase H tedavisine oldukça duyarlıdır ve sinyalin esas olarak gerçek RNA:DNA hibritlerinden türetildiğini doğrular. Son olarak, R-döngü pozitif ve R-döngü negatif lokuslar arasındaki immünopresipitasyon verimlerini karşılaştırırken, her iki teknik de birkaç insan hücre hattında 100 kata kadar bir fark sunar ve düşük arka plan ile yüksek özgüllük haritalaması sağlar.

Hangi yöntemin uygulanacağını düşünürken, kendi güçlü yönlerini ve sınırlamalarını göz önünde bulundurmak faydalı olacaktır. Daha önce belirtildiği gibi, DRIP-seq daha düşük çözünürlüklü haritalar üretir ve R-döngü oluşumunun mahsur kalması hakkında bilgi vermez. Daha düşük çözünürlük, esas olarak genomu parçalamak için RE'lerin kullanılmasının bir ürünüdür. Bu nazik yöntem, R-döngülerini korumada en iyisidir, böylece bu tür yapıların eşsiz bir şekilde geri kazanılmasına izin verir ve DRIP-seq'i çok sağlam hale getirir. Yüksek geri kazanımı korurken sınırlı çözünürlük sorununu aşmak için, RE kokteylleri uyarlanabilir ve/veya çözünürlüğü iyileştirmek için farklı RE kokteyllerinden kaynaklanan haritalar birleştirilebilir¹⁶. DRIP-seq'in çözünürlüğünü iyileştirmek için 4 bp kesici kullanan bir teknik geliştirilmiştir ve elde edilen veri kümeleri henüz diğer insan veri kümeleriyle sistematik olarak karşılaştırılmamış olsa da, ipliğe özgü haritalama^22,55 elde edebilir. RE tabanlı yaklaşımlarda, daha büyük parçaların daha verimli bir şekilde geri kazanılma eğiliminde olduğuna dikkat etmek önemlidir, çünkü birden fazla R-döngüsü oluşturma bölgesi taşıyabilirler. DRIP-seq veri kümelerini analiz ederken bu önyargı dikkate alınmalıdır. Benzer şekilde, DRIP-seq verileri için tepe çağrısı, nihai olarak R-döngüsü-pozitif RE fragmanlarına çevrilmelidir, çünkü immünopresipite edilen bu fragmanlardır ve bu fragmanlar içindeki R-loop'ların konumu çıkarılamaz. Genel olarak, kullanıcıların yöntemi öğrenmek ve Şekil 2A'da belgelenen verimleri elde etme konusunda güvenlerini oluşturmak için önce RE tabanlı DRIP-seq'i benimsemeleri önerilir. sDRIP-seq tipik olarak daha düşük verimle sonuçlanır, bu da eğitimsiz ellerde daha düşük sinyal-gürültü oranlarına sahip haritalarla sonuçlanabilir. Genomu parçalamanın bir aracı olarak sonikasyonun kullanılması, tipik olarak RE fragmanlarının çoğunluğunu oluşturan R ilmekli olmayan kısımlar kırılacağından ve S9.6'nın esas olarak R-ilmekli kısımları almasına izin verdiğinden, çözünürlükte büyük bir gelişme sağlar (Şekil 1). Sonikasyonun, R-döngülerinin yer değiştirmiş ssDNA zincirinin kırılmasına neden olduğunu belirtmekte fayda var. Bu nedenle, dizileme kütüphaneleri oluşturmadan önce, bu hibritleri dsDNA'ya geri dönüştürecek olan sonikasyonlu DNA: RNA hibritlerini immünopresipitize ettikten sonra ikinci bir iplik sentezi eklemek önemlidir. Bu adım olmadan, dsDNA adaptörlerine bağlanabilecek tek fragmanlar arka plan dsDNA fragmanları olacaktır; Böylece, ortaya çıkan haritalar herhangi bir sinyalden yoksun olacaktır. Iplikçik özgüllüğü, R-döngü oluşum mekanizmalarının anlaşılmasına çok sayıda başka fayda sağlar ve sDRIP-seq'i R-döngülerinin incelenmesi için tercih edilen bir yöntem haline getirir.

Daha da önemlisi, DRIP-seq ve sDRIP-seq aracılığıyla elde edilen haritalar, bir hücre popülasyonu boyunca R-döngülerinin ortalama dağılımını temsil eder; bu nedenle, tek tek R-döngülerinin uzunluğu ve konumu bu tekniklerle ele alınamaz. Bunun için, tek moleküllü R-döngü ayak izi (SMRF-seq)¹² olarak adlandırılan bağımsız ve tamamlayıcı bir yöntem, ipliğe özgü bir şekilde yüksek çözünürlükte bireysel R-döngülerini ortaya çıkarmak için kullanılabilir. S9.6'dan bağımsız olarak da dahil olmak üzere 20 farklı lokus üzerinde SMRF-seq kullanılarak R-döngü oluşumunun değerlendirilmesi, bireysel R-döngü ayak izlerinin toplanması ile DRIP tabanlı yaklaşımlar¹² tarafından toplanan popülasyon ortalama dağılımı arasında güçlü bir uyum olduğunu ortaya koydu ve DRIP tabanlı yaklaşımlara güçlü destek verdi. R-loop haritalama verilerinin yalnızca R-loop genomik dağılımının bir anlık görüntüsünü sağladığını ve R-loop oluşumu, kararlılığı ve çözünürlüğünün dinamikleri hakkında bilgi sağlamadığını dikkate almak da önemlidir. Bununla birlikte, spesifik ilaç tedavileri ve zaman serileri yoluyla R-döngü dağılımlarının değerlendirilmesi ile birleştirilen DRIP yaklaşımları, bu parametreleri ele almak için kullanılabilir^17,53. R-döngüsü profil oluşturma metodolojilerinin sınırlamaları, amaç genetik, çevresel veya farmakolojik bozulmalara yanıt olarak değiştirilmiş R-döngü dağılımlarını karakterize etmek olduğunda akılda tutulması özellikle önemlidir. Yukarıda daha önce açıklananlara ek olarak, yeni ortaya çıkan transkripsiyonda olası herhangi bir değişikliği göz önünde bulundurmak önemlidir, çünkü bunlar, bu yapıların ko-transkripsiyonel doğası nedeniyle doğal olarak R-döngü değişikliklerine neden olacaktır. Titiz R-döngü haritalama yaklaşımları geliştirmek için bu konular ve kılavuzlar kapsamlı bir şekilde tartışılmıştır ^48,56 ve okuyucuların bu çalışmalara başvurmaları teşvik edilmektedir.

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Chedin laboratuvarındaki çalışmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (R01 GM120607) bir hibe ile desteklenmektedir.