JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

לולאות R מהוות מחלקה נפוצה של מבני DNA שאינם B מונעי שעתוק המתרחשים בכל הגנומים בהתאם הן לרצף ה-DNA והן להעדפה טופולוגית. בשנים האחרונות, לולאות R היו מעורבות במגוון תפקידים אדפטיביים ולא מסתגלים ונקשרו לחוסר יציבות גנומית בהקשר של הפרעות אנושיות. כתוצאה מכך, המיפוי המדויק של מבנים אלה בגנום מעורר עניין רב עבור חוקרים רבים. DRIP-seq (DNA:RNA Immunoprecipitation ואחריו ריצוף תפוקה גבוהה) מתואר כאן. זוהי טכניקה חזקה וניתנת לשחזור המאפשרת מיפוי מדויק וחצי כמותי של לולאות R. מתואר גם איטרציה עדכנית של השיטה שבה מתבצע פיצול באמצעות סוניקציה (sDRIP-seq), המאפשרת מיפוי ספציפי לגדיל וברזולוציה גבוהה של לולאות R. sDRIP-seq מתייחס אפוא לכמה מהמגבלות הנפוצות של שיטת DRIP-seq מבחינת רזולוציה ותקיעות, מה שהופך אותה לשיטה הנבחרת למיפוי לולאת R.

Abstract

לולאות R מהוות מחלקה נפוצה של מבני DNA שאינם B מונעי שעתוק המתרחשים בכל הגנומים בהתאם הן לרצף ה-DNA והן להעדפה טופולוגית. בשנים האחרונות, לולאות R היו מעורבות במגוון תפקידים אדפטיביים ולא מסתגלים ונקשרו לחוסר יציבות גנומית בהקשר של הפרעות אנושיות. כתוצאה מכך, המיפוי המדויק של מבנים אלה בגנום מעורר עניין רב עבור חוקרים רבים. DRIP-seq (DNA:RNA Immunoprecipitation ואחריו ריצוף תפוקה גבוהה) מתואר כאן. זוהי טכניקה חזקה וניתנת לשחזור המאפשרת מיפוי מדויק וחצי כמותי של לולאות R. מתואר גם איטרציה עדכנית של השיטה שבה מתבצע פיצול באמצעות סוניקציה (sDRIP-seq), המאפשרת מיפוי ספציפי לגדיל וברזולוציה גבוהה של לולאות R. sDRIP-seq מתייחס אפוא לכמה מהמגבלות הנפוצות של שיטת DRIP-seq מבחינת רזולוציה ותקיעות, מה שהופך אותה לשיטה הנבחרת למיפוי לולאת R.

Introduction

לולאות R הן מבני חומצות גרעין תלת-גדיליות הנוצרים בעיקר במהלך השעתוק עם הכלאה של תעתיק ה-RNA המתהווה לגדיל ה-DNA של התבנית. זה מביא להיווצרות הכלאה של RNA:DNA וגורם לתזוזה של גדיל ה-DNA שאינו תבנית במצב לולאה חד-גדילי. בנייה מחדש ביוכימית 1,2,3,4 ומודלים מתמטיים5, בשילוב עם מדידות ביופיזיקליות אחרות 6,7, קבעו כי לולאות R נוטות יותר להתרחש באזורים המציגים מאפיינים חיוביים ספציפיים. לדוגמה, אזורים המציגים אסימטריה של גדיל בהתפלגות הגואנינים (G) והציטוזינים (C) כך שה-RNA עשיר ב-G, תכונה הנקראת הטיית GC חיובית, מועדפים ליצור לולאות R בעת העתקה בשל היציבות התרמודינמית הגבוהה יותר של היברידית DNA:RNA בהשוואה לדופלקסה-DNA 8. אזורים שפיתחו הטיית GC חיובית, כמו החלקים המוקדמים של גנים אוקריוטיים רבים 4,9,10,11, נוטים ליצור לולאות R במבחנה וב-vivo 3,4,12. מתח על-סלילי שלילי של DNA גם מעדיף מאוד היווצרות מבנה13,14 מכיוון שלולאות R סופגות ביעילות מתחים טופולוגיים כאלה ומחזירות את סיבי ה-DNA שמסביב למצב רגוע חיובי 5,15.

מבחינה היסטורית, מבני לולאת R נחשבו כנובעים מהסתבכות נדירה וספונטנית של RNA עם DNA במהלך השעתוק. עם זאת, הפיתוח של DNA:RNA immunoprecipitation (DRIP) יחד עם ריצוף DNA בתפוקה גבוהה (DRIP-seq) אפשרו את המיפוי הראשון של לולאות R ברחבי הגנום וחשפו כי מבנים אלה נפוצים הרבה יותר מהצפוי בתאים אנושיים 4,16. לולאות R מתרחשות על פני עשרות אלפי נקודות חמות גניות משומרות, מתועתקות, בגנום של יונקים, עם נטייה לאיי CpG מוטים GC החופפים את האינטרון הראשון של הגנים ואת האזורים הסופיים של גניםרבים 17. בסך הכל, לולאות R תופסות ביחד 3%-5% מהגנום בתאים אנושיים, בהתאם למדידות באורגניזמים אחרים, כולל שמרים, צמחים, זבובים ועכברים 18,19,20,21,22.

ניתוח של נקודות חמות היוצרות לולאת R בתאים אנושיים גילה כי אזורים כאלה קשורים לחתימות כרומטין ספציפיות23. לולאות R, באופן כללי, נמצאות באזורים עם תפוסה נמוכה יותר של נוקלאוזומים וצפיפות RNA פולימראז גבוהה יותר. אצל מקדמים, לולאות R קשורות לגיוס מוגבר של שני שינויים בהיסטון שהושקעו במשותף, H3K4me1 ו-H3K36me317. בטרמיני גנים, לולאות R מתקשרות לגנים מסודרים היטב שעוברים סיום שעתוק יעיל17, בהתאם לתצפיות קודמות24. כמו כן, הוכח כי לולאות R משתתפות בהתחלת שכפול ה-DNA במקורות השכפול של גנום הבקטריופאג'ים, הפלסמיד, המיטוכונדריה והשמרים 25,26,27,28,29,30,31. בנוסף, 76% ממקדמי האיים האנושיים המועדים ללולאת R מתפקדים כמקורות שכפול מוקדמיםומכוננים 32,33,34,35, מה שמחזק עוד יותר את הקשרים בין לולאות R למקורות שכפול. באופן קולקטיבי, מחקרים אלה מצביעים על כך שלולאות R מייצגות סוג חדש של אות ביולוגי שיכול לעורר יציאות ביולוגיות ספציפיות באופן תלוי הקשר23.

בשלב מוקדם, הוכח כי לולאות R נוצרות ברצפי מתגי מחלקה במהלך תהליך רקומבינציה של מתג מחלקה אימונוגלובולין 3,36,37. לולאות R מתוכנתות כאלה נחשבות ליזום רקומבינציה של מתגי מחלקה באמצעות הכנסת שבירות DNA דו-גדיליות38. מאז, היווצרות לולאת R מזיקה, המובנת בדרך כלל כנובעת מהיווצרות מוגזמת של לולאת R, נקשרה לחוסר יציבות גנומית ולתהליכים כגון רקומבינציה יתר, התנגשויות שעתוק-שכפול, שכפול ומתח שעתוק (לסקירה 39,40,41,42,43). כתוצאה מכך, מיפוי משופר של מבני לולאת R מייצג אתגר מרגש וחיוני לפענוח טוב יותר של התפוצה והתפקוד של מבנים אלה בבריאות ובחולי.

DNA:RNA immunoprecipitation (DRIP) מסתמך על זיקה גבוהה של הנוגדן החד-שבטי S9.6 להכלאות DNA:RNA44. DRIP-seq מאפשר פרופיל חזק בכל הגנום של היווצרות לולאת R 4,45. למרות שהיא שימושית, טכניקה זו סובלת מרזולוציה מוגבלת בשל העובדה שאנזימי הגבלה משמשים להשגת פיצול DNA עדין. בנוסף, DRIP-seq אינו מספק מידע על הכיווניות של היווצרות לולאת R. כאן, אנו מדווחים על גרסה של DRIP-seq המאפשרת מיפוי של לולאות R ברזולוציה גבוהה באופן ספציפי לגדיל. שיטה זו מסתמכת על סוניקציה כדי לפצל את הגנום לפני המשקעים החיסוניים, ולכן השיטה נקראת sDRIP-seq (סוניקציה של DNA:RNA immunoprecipitation יחד עם ריצוף תפוקה גבוהה) (איור 1). השימוש בסוניקציה מאפשר רזולוציה מוגברת ומגביל הטיות פיצול הקשורות לאנזים הגבלה שנצפו בגישות DRIP-seq46. sDRIP-seq מייצר מפות לולאת R העולות בקנה אחד עם התוצאות הן מ-DRIP-seq והן משיטת DRIPc-seq ברזולוציה גבוהה שתוארה קודם לכן, שבה ספריות ריצוף נבנות מגדילי ה-RNA של מבני לולאת R משקעים חיסוניים45.

מול שפע של שיטות לבחירה, משתמשים עשויים לתהות איזו גישה מסוימת מבוססת DRIP עדיפה לצרכים שלהם. אנו מציעים את העצה הבאה. DRIP-seq, למרות מגבלותיו, הוא הקל ביותר מבחינה טכנית והוא החזק ביותר (התשואות הגבוהות ביותר) מבין כל שלוש השיטות שנדונו כאן; לכן הוא נשאר שימושי באופן נרחב. פורסמו מערכי נתונים רבים של DRIP-seq, המספקים נקודת השוואה שימושית עבור מערכי נתונים חדשים. לבסוף, צינור הניתוח הביואינפורמטי פשוט יותר מכיוון שהנתונים אינם תקועים. מומלץ למשתמשים חדשים להתחיל לחדד את כישורי מיפוי לולאת ה-R שלהם עם DRIP ואחריו תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR) ו-DRIP-seq. sDRIP-seq מייצג דרגה מעט גבוהה יותר של קושי טכני: התשואות מופחתות מעט עקב סוניקציה (נדון להלן) ותהליך ספריית הרצף מעט מורכב יותר. עם זאת, הרווח של תקיעה ורזולוציה גבוהה יותר לא יסולא בפז. יצוין כי sDRIP-seq יתפוס גם RNA דו-גדילי: היברידיות DNA וגם לולאות R תלת-גדיליות. בשל שלבי בניית הספרייה, DRIP-seq לא יתפוס היברידיות RNA:DNA דו-גדיליות. DRIPc-seq הוא התובעני ביותר מבחינה טכנית ודורש כמות גבוהה יותר של חומרי התחלה. בתמורה, הוא מציע את הרזולוציה הגבוהה ביותר ואת התקיעות הגבוהות ביותר. מכיוון שספריות ריצוף בנויות מחלק ה-RNA של לולאות R או היברידיות, DRIPc-seq עלול לסבול מזיהום RNA אפשרי, במיוחד מכיוון של-S9.6 יש זיקה שיורית ל-dsRNA 19,47,48. sDRIP-seq מאפשר מיפוי ספציפי לגדיל ברזולוציה גבוהה ללא דאגות לגבי זיהום RNA מכיוון שספריות ריצוף נגזרות מגדילים של DNA. בסך הכל, שלוש השיטות הללו נותרו שימושיות ומציגות דרגות שונות של מורכבות ואזהרות שונות במקצת. עם זאת, כל השלושה מייצרים מערכי נתונים תואמים מאוד48 ורגישים מאוד לטיפול מקדים ב-RNase H, המייצג בקרה חיונית להבטחת ספציפיות האות 45,49. יצוין כי בהתחשב בבחירת הגודל המוטלת על ספריות ריצוף, הכלאות קטנות (מוערך <75 bp), כגון אלה הנוצרות באופן חולף סביב אתרי תחול שכפול DNA של גדיל מפגר (פריימרים של אוקזאקי) לא ייכללו. באופן דומה, מכיוון שכל שיטות ה-DRIP כוללות פיצול DNA, לולאות R לא יציבות הדורשות סליל-על שלילי של DNA ליציבותן יאבדו5. לפיכך, גישות DRIP עשויות להמעיט בהערכת עומסי לולאת R, במיוחד עבור לולאות R קצרות ולא יציבות שניתן ללכוד בצורה הטובה ביותר באמצעות גישות in vivo 45,48. יצוין כי ניתן לאפיין לולאות R גם באופן בלתי תלוי ב-S9.6 בכיסוי עמוק, ברזולוציה גבוהה ובאופן ספציפי לגדיל על מולקולות DNA בודדות לאחר טיפול בנתרן ביסולפיט12. בנוסף, נעשה שימוש באסטרטגיות המשתמשות באנזים RNase H1 לא פעיל מבחינה קטליטית כדי למפות לולאות R מקוריות in vivo, תוך הדגשת לולאות R קצרות ולא יציבות הנוצרות בעיקר במקדמים מושהים 50,51,52.

Protocol

הפרוטוקול הבא מותאם לקו תאי Ntera-2 אנושי שגדל בתרבית, אך הוא הותאם בהצלחה ללא שינוי למגוון קווי תאים אנושיים אחרים (HEK293, K562, HeLa, U2OS), תאים ראשוניים (פיברובלסטים, תאי B) וכן באורגניזמים אחרים עם שינויים קטנים (עכברים, זבובים).

1. קצירת תאים וליזה

  1. תרבית תאי Ntera-2 למפגש של 75%-85%. ודא שספירת התאים האופטימלית היא 5 עד 6 מיליון תאים עם >90% ספירות ברות קיימא כדי להתחיל כל הליך DRIP.
  2. שוטפים את התאים פעם אחת עם 1x PBS, מוסיפים 1.5 מ"ל של Trypsin-EDTA 1x, ולאחר מכן מדגרים למשך 2 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס עד שהתאים מתנתקים מהצלחת.
  3. הוסף 5 מ"ל של מדיה חמה ופיפטה היטב כדי להשעות תאים לתרחיף תא בודד. העבירו את התוכן לצינור חדש של 15 מ"ל וגלו בעדינות את התאים ב-300 x גרם למשך 3 דקות.
  4. שטפו את התאים פעם אחת עם 5 מ"ל של 1x PBS וגלו בעדינות את התאים ב-300 x גרם למשך 3 דקות.
  5. השעיה מלאה של התאים ב-1.6 מ"ל של מאגר TE (10 מ"מ Tris-Cl pH 7.5, 1 מ"מ EDTA pH 8.0). הוסיפו 5 מיקרוליטר של פרוטאינאז K (תמיסת מלאי של 20 מ"ג/מ"ל) ו-50 מיקרוליטר של SDS (תמיסת מלאי של 20%) והפכו בעדינות את הצינורות חמש פעמים עד שהתמיסה הופכת לצמיגה. אל תנסה לזרוק את התמיסה, רק לערבב על ידי היפוך.
  6. דגרו את הצינורות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

2. מיצוי DNA

  1. יוצקים את ליזט ה-DNA לתוך שפופרת ג'ל נעילת פאזה בצפיפות גבוהה של 15 מ"ל שסובבה מראש ומוסיפים נפח אחד (1.6 מ"ל) של אלכוהול פנול/כלורופורם איזואמיל (25:24:1). הפוך בעדינות חמש פעמים וסובב כלפי מטה ב-1,500 x גרם למשך 5 דקות.
  2. הוסף 1/10 נפח של 3 M נתרן אצטט (NaOAc) (pH 5.2) ו-2.5 נפחים של 100% אתנול לצינור חדש של 15 מ"ל. יוצקים פנימה את השלב המימי העליון מצינור הג'ל של נעילת הפאזה והופכים בעדינות עד שה- DNA משקע במלואו (עד 10 דקות).
  3. סליל את חוטי ה-DNA באמצעות קצה רחב של 1,000 מיקרוליטר והעביר לצינור נקי של 2 מ"ל תוך הקפדה לא לשאת את שאריות הסופרנטנט.
  4. שטפו את ה-DNA על ידי הוספת 1.5 מ"ל של 80% אתנול והפכו בעדינות את הצינור חמש פעמים. דגירה למשך 10 דקות.
  5. חזור על השלב הקודם פעמיים. אין לבצע צנטריפוגה במהלך שלבי הכביסה. הסר בזהירות כמה שיותר אתנול על ידי פיפטינג לאחר הכביסה האחרונה תוך ניסיון לא להפריע ל- DNA.
  6. אפשר ל-DNA להתייבש לחלוטין באוויר תוך כדי היפוך הצינור. שלב זה יכול להימשך 30 דקות -שעה בהתאם לכמות ה-DNA.
  7. הוסף 125 מיקרוליטר של מאגר TE ישירות על גלולת ה-DNA כדי לפצל את ה-DNA באמצעות עיכול אנזים הגבלה או 100 מיקרוליטר של מאגר TE כדי לגזור את ה-DNA באמצעות סוניקציה. המשיכו על הקרח למשך שעה אחת והשעו בעדינות את ה-DNA על ידי פיפטינג מספר פעמים עם קצה רחב של 200 מיקרוליטר. השאירו על קרח למשך שעה לפני תחילת שלב הפיצול.

3. פיצול DNA

הערה: עבור DRIP-seq מבוסס אנזימי הגבלה, בצע את שלב 3.1. עבור DRIP-seq מבוסס סוניקציה, דלג לשלב 3.2.

  1. פיצול אנזים הגבלה (RE)
    1. עכל את ה-DNA הגנומי המושהה (צמיג מאוד) באמצעות קוקטייל של REs לפי הוראות הספק.
      1. הוסף 0.1 מ"מ ספרמידין לתגובה הסופית. השתמש בקוקטייל של 4-5 אנזימים עם 30 U מכל אנזים בנפח כולל של 150 מיקרוליטר.
        הערה: הקוקטייל הראשוני עבור DRIP-seq (HindIII, SspI, EcoRI, BsrGI, XbaI)4 פותח כדי ליצור אורך שבר ממוצע של 5 קילו-בסיסים. הימנע מכל הפרעה למתילציה של CpG ושמור על אזורים עשירים ב-GC בגנום. קוקטיילים אחרים אפשריים גםכן. קוקטיילים אלו מתאימים הן לגנום האנושי והן לעכבר, אך ניתנים להתאמה לפי הצורך.
      2. דגרו את תערובת התגובה למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס.
        הערה: תערובת ה-DNA לאחר העיכול כבר לא צריכה להיות צמיגה. כל צמיגות שנותרה בשלב זה מעידה על עיכול לא שלם.
      3. אם נצפה, הוסף 10 U נוספים מכל אנזים ודגירה למשך 2-4 שעות נוספות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
        הערה: משתמשים אינם רשאים לעכל את כל הגלולה במקרה שהם אספו יותר תאים מהמומלץ כאן.
    2. פיפטה בעדינות את ה-DNA המעוכל בן לילה (150 מיקרוליטר) לתוך צינור אור ג'ל נעילת פאזה של 2 מ"ל שסובב מראש. יש להוסיף 100 מיקרוליטר מים ונפח אחד (250 מיקרוליטר) של אלכוהול פנול/כלורופורם איזואמיל (25:24:1). הפוך בעדינות חמש פעמים וסובב כלפי מטה ב-16,000 x גרם למשך 10 דקות.
    3. הוסף 1.5 מיקרוליטר גליקוגן, 1/10 נפח של 3 M NaOAc (pH 5.2) ו-2.5 נפחים של 100% אתנול לצינור חדש של 1.5 מ"ל. פיפטו את ה-DNA מצינור הג'ל לנעילת פאזה וערבבו על ידי היפוך חמש פעמים. יש לדגור למשך שעה בחום של -20 מעלות צלזיוס.
    4. סובב ב-16,000 x גרם למשך 35 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. שטפו את ה-DNA עם 200 מיקרוליטר של 80% אתנול וסובבו ב-16,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    5. יבש את הגלולה באוויר והוסף 50 מיקרוליטר של מאגר TE לגלולה. השאירו את הצינור על קרח למשך 30 דקות והשעו בעדינות את ה-DNA.
    6. מדוד את הריכוז (OD260) של ה-DNA המקוטע באמצעות ספקטרופוטומטר.
    7. אופציונלי אך מומלץ: טען 1 מיקרוגרם של DNA מעוכל על ג'ל אגרוז 0.8% לצד סמן גודל כדי לוודא שהעיכול הושלם. הפעל את הג'ל למשך שעה בחום של 100 וולט.
      הערה: אם לא שלם, ניתן להוסיף אנזים נוסף. עיכול לא שלם עלול להוביל לאובדן הרזולוציה לאחר משקעים חיסוניים.
    8. לאחר שלב זה, טפל ב-10 מיקרוגרם של DNA מעוכל עם 4 מיקרוליטר של ריבונוקלאז H (RNase H) למשך 1-2 שעות ב-37 מעלות צלזיוס כדי להבטיח שהאות שאוחזר עם משקעים חיסוניים נגזר מהכלאות DNA:RNA. לאחר מכן, המשך ל-S9.6 immunoprecipitation (שלב 4).
      הערה: ניתן לשמור את ה-DNA המעוכל קפוא בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד חודש ללא אובדן משמעותי של היבול.
  2. סוניקציה
    1. סוניקציה של כל ה-DNA המופק או חלק ממנו בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 0.5 מ"ל בנפח כולל של 100 מיקרוליטר. בצע 15-20 מחזורים של 30 שניות ON / 30 S OFF על סוניקטור (סיבוב לאחר 5, 10 ו-15 מחזורים כדי להבטיח סוניקציה הומוגנית).
    2. מדוד את הריכוז (OD260) של DNA סוניקציה בספקטרופוטומטר.
      הערה: בשלב זה, צמיגות ה-DNA הייתה אמורה להיעלם.
    3. הפעל ג'ל אגרוז כדי לאשר את התפלגות הגודל של ה-DNA הסוניקטיבי (300-500 bp).
      הערה: סוניקציה יתר של ה-DNA עלולה להוביל להפחתה משמעותית בתשואה הנובעת משבירה ודיסוציאציה של מבני לולאת R.
    4. לאחר שלב זה, טפל ב-10 מיקרוגרם של DNA סוניקטיבי עם 4 מיקרוליטר של RNase H למשך 1-2 שעות ב-37 מעלות צלזיוס כדי להבטיח שהאות שאוחזר עם משקעים חיסוניים נגזר מהכלאות DNA:RNA. לאחר מכן, המשך ל-S9.6 immunoprecipitation (שלב 4).

4. משקעים חיסוניים S9.6

הערה: שלבי המשקעים החיסוניים דומים ללא קשר אם ה-DNA פוצל באמצעות REs או סוניקציה.

  1. הכן שלוש שפופרות והכניס 4.4 מיקרוגרם של DNA מקוטע בנפח סופי של 500 מיקרוליטר של מאגר TE לכל צינור. חסוך 50 מיקרוליטר (1/10 מהנפח) מכל צינור לשימוש מאוחר יותר כקלט DNA.
  2. הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר מחייב פי 10 (100 מ"מ NaPO4 pH 7, 1.4 M NaCl, 0.5% טריטון X-100) ו-10 מיקרוליטר של נוגדן S9.6 (1 מ"ג/מ"ל) ל-450 מיקרוליטר של ה-DNA המדולל.
  3. דגירה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס על מיני צינור מסובב ב-7-10 סל"ד.
  4. עבור כל צינור, שטפו 50 מיקרוליטר של תמיסת חרוזי אגרוז חלבון A/G עם 700 מיקרוליטר של מאגר מחייב 1x על ידי היפוך הצינורות על מיני מסובב ב-7-10 סל"ד בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. סובבו את החרוזים ב-1,100 x גרם למשך דקה אחת והשליכו את הסופרנטנט. חזור על שלב זה פעם אחת.
  5. הוסף את ה-DNA משלב 4.3 ל-50 מיקרוליטר של חרוזים ודגירה למשך שעתיים ב-4 מעלות צלזיוס תוך היפוך ב-7-10 סל"ד על מיני מסובב.
  6. סובב את החרוזים למשך דקה אחת ב -1,100 x גרם והשליך את הסופרנטנט.
  7. שטפו את החרוזים עם 750 מיקרוליטר של מאגר מחייב 1x על ידי היפוך ב-7-10 סל"ד על מיני מסובב למשך 15 דקות. יש לסובב למשך דקה אחת בטמפרטורה של 1,100 x גרם ולהשליך את הסופרנטנט. חזור על שלב זה פעם אחת.
  8. הוסף לחרוזים 250 מיקרוליטר של מאגר הפליטה (50 מ"מ Tris-Cl pH 8, 10 מ"מ EDTA pH 8, 0.5% SDS) ו-7 מיקרוליטר של פרוטאינאז K (מלאי 20 מ"ג/מ"ל) ודגירה בסיבוב ב-55 מעלות צלזיוס (12 סל"ד) למשך 45 דקות.
  9. סובב את החרוזים למשך דקה אחת ב -1,100 x גרם. העבירו את הסופרנטנט לצינור אור ג'ל נעילת פאזה של 2 מ"ל שסובבו מראש והוסיפו נפח אחד (250 מיקרוליטר) של אלכוהול פנול/כלורופורם איזואמיל (25:24:1). הפוך את הצינורות חמש פעמים וסובב כלפי מטה במשך 10 דקות בטמפרטורה של 16,000 x גרם בטמפרטורת החדר.
  10. הוסף 1.5 מיקרוליטר גליקוגן, 1/10 נפח 3M NaOAc (pH 5.2) ו-2.5 נפחים של 100% אתנול לצינור חדש של 1.5 מ"ל. פיפטו את ה-DNA מצינור הג'ל לנעילת פאזה וערבבו על ידי היפוך חמש פעמים. יש לדגור למשך שעה בחום של -20 מעלות צלזיוס.
  11. סובב ב-16,000 x גרם למשך 35 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. שטפו את ה-DNA עם 200 מיקרוליטר של 80% אתנול וסובבו ב-16,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  12. יבשו את הכדורים באוויר והוסיפו 15 מיקרוליטר של 10 מ"מ Tris-Cl (pH 8) בכל צינור. השאירו את הצינורות על קרח למשך 20 דקות והשעו מחדש בעדינות. שלב את תכולת שלושת הצינורות לצינור אחד (45 מיקרוליטר).
  13. בדוק את יעילות ה-DRIP על ידי qPCR באמצעות 5 μL של ה-DNA המושעה מחדש של 45 μL (ראה תוצאות מייצגות). מדללים את 5 מיקרוליטר ב-10 מיקרוליטר מים ומשתמשים ב-2 מיקרוליטר לכל תגובה.

5. שלב טרום ספרייה עבור DNA סוניקציה בלבד

הערה: סוניקציה מובילה את גדיל ה-ssDNA העקור של לולאות R להישבר. לפיכך, מבני לולאת R תלת-גדיליים מומרים להכלאות DNA:RNA דו-גדיליות בעת סוניקציה. כתוצאה מכך, יש להמיר את הכלאיים הללו של DNA:RNA בחזרה ל-DNA דו-גדילי לפני בניית הספרייה. כאן, נעשה שימוש בשלב סינתזת גדיל שני. גישה חלופית שנעשה בה שימוש מוצלח היא לבצע במקום זאת קשירת DNA חד-גדילית ואחריה סינתזת גדיל שני53.

  1. ל-40 מיקרוליטר של DNA מטפטף משלב 4.12, הוסף 20 מיקרוליטר של מאגר גדיל שני פי 5 (200 מ"מ Tris pH 7, 22 מ"מ MgCl2, 425 מ"מ KCl), תערובת dNTP של 10 מ"מ (dATP, dCTP, dGTP ו-dTTT או dUTP אם המשתמש מתכנן להשיג רצף DRIP ספציפי לגדיל), 1 μL 16 mM NAD, ו -32 מיקרוליטר מים. מערבבים היטב ומדגרים 5 דקות על קרח.
  2. הוסף 1 מיקרוליטר של DNA פולימראז I (10 יחידות), 0.3 מיקרוליטר של RNase H (1.6 יחידות) ו-0.5 מיקרוליטר של E. coli DNA ligase. מערבבים ודוגרים בחום של 16 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  3. נקה מיד את התגובה באמצעות חרוזים פרמגנטיים ביחס של פי 1.6. יש לסלק את ה-DNA ב-40 מיקרוליטר של 10 מ"מ Tris-Cl (pH 8).

6. שלב סוניקציה טרום ספרייה עבור RE DNA בלבד

הערה: טפטוף מוביל לשחזור של שברי RE שאורכם לרוב קילו-בסיסים ולכן אינם מתאימים לבניית ספרייה מיידית.

  1. כדי להקטין את גודל החומר לבניית ספרייה, סוניקציה של ה-DNA המשקע החיסוני בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 0.5 מ"ל. בצע 12 מחזורים של 15 שניות ON / 60 S OFF על סוניקטור (סיבוב לאחר שישה מחזורים כדי להבטיח סוניקציה הומוגנית). המשך לשלב 7.
    הערה: החומר המשקע החיסוני עדיין נושא את לולאות ה-R התלת-גדיליות המגיבות לסוניקציה באופן שונה מה-DNA הדו-גדילי האגפי.
  2. שלב אופציונלי: כדי לאזן פרופילי DRIP, טפל בחומר המשקע החיסוני עם 1 מיקרוליטר של RNase H במאגר RNase H 1x למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס לפני הסוניקציה.

7. בניית ספרייה

  1. בצע תיקון קצה על ידי הוספה ל-40 μL משלב 4.12 (פיצול RE) או שלב 5.3 (גזירה סוניקציה) 5 μL של מאגר מודול תיקון קצה 10x, 2.5 μL של 10 mM ATP ו-2.5 μL של אנזים מודול תיקון קצה (50 μL סה"כ). מערבבים היטב ודוגרים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. כלול 1 מיקרוגרם של DNA קלט מעוכל מחדש וסוניקציה (DRIP) או סוניקציה (sDRIP) כדי ליצור ספריות רצף בקרה המתאימות ל-DNA הקלט.
  2. נקו את התגובה באמצעות חרוזים פרמגנטיים (יחס של פי 1.6) ושטפו פנימה 34 מיקרוליטר של 10 מ"מ Tris-Cl (pH 8).
  3. בצע זנב A על ידי הוספת 5 מיקרוליטר של מאגר 2, 10 מיקרוליטר של 1 מ"מ dATP ו-1 מיקרוליטר של אקסו קלנוב (סה"כ 50 מיקרוליטר). מערבבים היטב ומדגרים את התערובת למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.
  4. נקו את התגובה באמצעות חרוזים פרמגנטיים (יחס של פי 1.6) ושטפו פנימה 12 מיקרוליטר של 10 מ"מ Tris-Cl (pH 8).
  5. מתאמי ליגייט על ידי הוספת μL 15 של חוצץ קשירה מהיר x 2, μL 1 של מתאמי μM 15 ו- μL 2 של ליגאז מהיר (סה"כ μL 30). מערבבים היטב ודוגרים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. נקה את התגובה באמצעות חרוזים פרמגנטיים (יחס פי 1) והוציא פנימה 20 מיקרוליטר של 10 מ"מ Tris-Cl (pH 8).
  7. אם בוצעה גזירה סוניקציה ונעשה שימוש ב-dUTP בשלב 5.1, הוסף 1.5 מיקרוליטר (1.5 U) של Uracil N-glycosylase ודגירה למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס כדי לקבל DRIP ספציפי לגדיל.
  8. PCR מגביר 10 מיקרוליטר מהספרייה משלב 6.6 או 6.7. הוסף 1 מיקרוליטר של פריימר PCR 1.0 P5 (ראה טבלת חומרים), 1 מיקרוליטר של פריימר PCR 2.0 P7 (ראה טבלת חומרים), 15 מיקרוליטר של תערובת מאסטר ו-3 מיקרוליטר מים. מערבבים היטב.
  9. במחזור תרמו, הפעל את התוכנית כפי שמוצג בטבלה 1.
  10. המשך לניקוי דו-שלבי של הספרייה באמצעות חרוזים פרמגנטיים. ראשית השתמש ביחס של 0.65x כדי להסיר שברים מעל 500 bp. שמור על הסופרנטנט. המשך ליחס של פי 1 על הסופרנטנט כדי להסיר שברים מתחת ל-200 bp. נשטף ב-12 מיקרוליטר של 10 מ"מ Tris-HCl (pH 8).

8. בקרת איכות

  1. כדי לבדוק העשרה של לולאת R עם qPCR בשני מיקומים שליליים ושלושה חיוביים בשיטת Pfaffl, השתמש ב-1 מיקרוליטר של ספריית הניקוי משלב 6.10. לדלל 1 מיקרוליטר מהספרייה ב-10 מיקרוליטר מים ולהשתמש ב-2 מיקרוליטר לכל לוקוס.
  2. בדוק את התפלגות הגודל של הספרייה הנקייה משלב 6.10 באמצעות ערכת DNA ברגישות גבוהה.

תוצאות

ניתן לנתח DRIP כמו גם sDRIP באמצעות qPCR (איור 2A) ו/או ריצוף (איור 2B). לאחר שלב המשקעים החיסוניים, יש לאשר תחילה את איכות הניסוי על ידי qPCR על מוקדי בקרה חיוביים ושליליים, כמו גם עם בקרות שטופלו ב-RNase H. פריימרים המתאימים למיקומים בשימוש תכוף במספר קווי תאים אנושיים מסופקים בטבלה 2. יש להציג את התוצאות מ-qPCR כאחוז קלט, המתאים לאחוז התאים הנושאים לולאת R בזמן הליזיס עבור לוקוס נתון. בניסוי DRIP מוצלח, התשואה עבור מיקומים שליליים צריכה להיות פחות מ-0.1% בעוד שמיקומים חיוביים יכולים לנוע בין 1% ליותר מ-10% עבור מיקומים מתועתקים מאוד כגון RPL13A (איור 2A). עבור sDRIP, התשואות בדרך כלל נמוכות יותר (20%-50%) כפי שנשפט על ידי DRIP-qPCR, אך נראה כי הן משפיעות על ההתאוששות באופן אחיד כך שאף תת-קבוצה מסוימת של לולאות R אינה מושפעת יותר מאחרת. כתוצאה מכך, מפות שנגזרות מ-DRIP, sDRIP ו-DRIPc נמצאות בהתאמה טובה (איור 2B). ניתן להציג נתוני qPCR גם כהעשרה מתקפלת של אחוז הקלט עבור מיקומים חיוביים על פני מיקומים שליליים, ובכך להעריך את הספציפיות של הניסוי. העשרה בקיפול נעה בדרך כלל בין מינימום של פי 10 ליותר מפי 200 בהתאם למיקומים שנבחרו לניתוח. כאשר נדרש כימות מדויק על פני מספר דגימות המייצגות דפיקות גנים, נוקאאוט או טיפולים פרמקולוגיים שונים, מעודד מאוד את השימוש בספייק בבקרות כדי לנרמל שונות ניסויית בין דגימות. ספייק-אין כאלה יכולים להתאים להכלאות סינתטיות53 או גנומים של מינים לא קשורים54.

ניתן לרצף חומרי DRIP ו-sDRIP באמצעות אסטרטגיות ריצוף חד-צדדיות או זוגיות. ניתן לחלץ ולנתח נתונים באופן דומה לרוב נתוני ChIP באמצעות צינורות חישוביים סטנדרטיים (ראה45 למידע רלוונטי ל-DRIP). לאחר חיתוך מתאם והסרה של כפילויות PCR, ניתן למפות קריאות לגנום ייחוס ולהעלות לדפדפן גנום. פלט צפוי טיפוסי של DRIP ו-sDRIP מוצג באיור 2B. פלט ה-DRIP מיוצג על ידי המסלול הירוק היחיד מכיוון שהוא אינו מאפשר ספציפיות גדיל ואילו sDRIP מציג מיפוי לולאת R לגדילים החיוביים והשליליים המצוינים בהתאמה באדום וכחול. מסלולי בקרה המתאימים לדגימה שטופלה מראש ב-RNase H מראים הפחתה ברורה של אותות, מה שמאשר את הספציפיות של הטכניקה עבור חומרים שמקורם ב-RNA:DNA היברידי. הרווחים ברזולוציה המותרים על ידי sDRIP מודגמים בבירור כאשר משווים את הגדלים של חומר ה-DNA הקלט (איור 2C). יכולת השחזור של sDRIP-seq, יחד עם ההשפעה הגלובלית של טיפול מקדים ב-RNase H1 והמתאם בין sDRIP-seq ל-DRIPc-seq מתוארים על ידי עלילות XY באיור 2D.

figure-results-2650
איור 1: סקירה כללית של נהלי DRIP-seq ו-sDRIP-seq. שתי הגישות מתחילות באותם שלבי מיצוי DNA שפותחו כדי לשמר לולאות R (גדילי RNA בתוך לולאות R מיוצגים על ידי קווים משורבטים). עבור DRIP-seq, הגנום מקוטע באמצעות אנזימי הגבלה, וכתוצאה מכך לעתים קרובות נוצרים שברים בגודל קילו-בסיס שבתוכם מוטמעות לולאות R קצרות יותר. עבור sDRIP-seq, הגנום מקוטע באמצעות סוניקציה, מה שמביא לשברים קטנים יותר ולגזירה ואובדן של הגדיל היחיד העקור של לולאות R (מסומן בקווים מקווקוים). בעקבות משקעים חיסוניים עם נוגדן S9.6, DRIP מוביל להתאוששות של לולאות R תלת-גדיליות המוטבעות בתוך שברי הגבלה, בעוד ש-sDRIP משחזר RNA:DNA דו-גדילי היברידי עם מעט DNA מאגף, מה שמבטיח רזולוציה גבוהה יותר. עבור sDRIP, יש לכלול שלב בניית ספרייה כדי להמיר היברידיות RNA:DNA בחזרה ל-DNA דופלקס. כפי שמוצג כאן, זו הזדמנות לבנות ספריות ספציפיות לגדילים. כפי שמפורט בפרוטוקול עצמו, טיפול אקסוגני ב-RNase H מייצג בקרה מרכזית על הספציפיות של שני ההליכים; הם לא מוצגים כאן. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3903
איור 2: תוצאה של אסטרטגיות מיפוי לולאת R. (A) תוצאות qPCR ממשקעים חיסוניים מוצלחים באמצעות שיטת DRIP ו-sDRIP (המקבילה לשלב בדיקת qPCR 4.13). התוצאות הן משני ניסויים בלתי תלויים מתאי Ntera-2 אנושיים בלוקוס שלילי ושני לוקוסים חיוביים, כולל לוקוס RPL13A הנוטה מאוד ללולאת R ולוקוס TFPT הנוטה ללולאת R בינונית. ציר ה-y מציין את תפוקת המשקעים החיסוניים כאחוז מה-DNA הקלט. שים לב שההתאוששות מעט חזקה יותר עבור DRIP מאשר sDRIP. (B) התוצאות של מיפוי לולאת R שנערך בתאי Ntera-2 אנושיים מוצגות על פני אזור שמרוכז סביב CCND1 וגנים ORAOV1 שכנים. שני המסלולים הראשונים תואמים לתוצאות DRIP-seq, ללא ועם טיפול ב-RNase H, בהתאמה. המיקום של אנזימי ההגבלה המשמשים לפיצול הגנום מוצג בחלק העליון. ששת המסלולים הבאים מייצגים את התוצאות של sDRIP-seq ספציפי לגדיל, מחולק בין (+) ו-(-) גדילים (שני שכפולים כל אחד) ומטופל מראש ב-RNase H, או לא, כפי שצוין. ארבעת המסלולים האחרונים מייצגים את התוצאות של מיפוי לולאת R באמצעות שיטת DRIPc-seq ברזולוציה גבוהה (Sanz et al., 2016; Sanz and Chedin, 2019), שבו ספריות בנויות מגדילי RNA של לולאות R. כפי שניתן לראות בבירור, הגנים CCND1 ו-ORAOV1 מובילים להיווצרות לולאת R על הגדילים (+) ו-(-), בהתאמה, בהתאם לכיווניות שלהם. טיפול ב-RNase H מבטל את האות, כצפוי. (C) חומרי DNA קלט לאחר פיצול אנזים הגבלה (משמאל) וסוניקציה (מימין) מוצגים לאחר שהחומרים הופרדו על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. סולם ה-DNA מתאים לסולם של 100 bp ורצועת ה-500 bp מודגשת על ידי כוכבית. (D) תרשימי מתאם אותות XY מוצגים כדי להמחיש את יכולת השחזור של sDRIP-seq (משמאל), את הרגישות הכוללת של sDRIP-seq לטיפול מקדים של RNase H1 (באמצע), ואת המתאם הגלובלי בין sDRIP-seq ל-DRIPc-seq (מימין). כל הנתונים הם מתאים אנושיים של Ntera-2. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: הגדרות תוכנית PCR. משך הזמן והגדרות הטמפרטורה עבור מחזורי ה-PCR מפורטים. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 2: פריימרים המשמשים לאימות qPCR בשורות תאים אנושיים. כל הרצפים רשומים בכיוון 5' עד 3'. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

Discussion

מתוארים כאן שני פרוטוקולים למיפוי מבני לולאת R בכל אורגניזם פוטנציאלי המשתמש בנוגדני S9.6. DRIP-seq מייצג את טכניקת המיפוי הראשונה של לולאת R ברחבי הגנום שפותחה. זוהי טכניקה קלה, חזקה וניתנת לשחזור המאפשרת למפות את התפלגות לולאות R לאורך כל גנום. הטכניקה השנייה, המכונה sDRIP-seq, היא גם חזקה וניתנת לשחזור אך משיגה רזולוציה גבוהה יותר וספציפיות גדיל עקב הכללת שלב סוניקציה ופרוטוקול בניית ספריית רצף תקוע. שתי הטכניקות רגישות מאוד לטיפול ב-RNase H לפני משקעים חיסוניים, מה שמאשר שהאות נגזר בעיקר מהכלאות RNA:DNA אמיתיות. לבסוף, כאשר משווים תשואות משקעים חיסוניים בין מיקומים חיוביים לולאת R שליליים, שתי הטכניקות מציעות הבדל של עד פי 100 במספר קווי תאים אנושיים, ומספקות מיפוי ספציפיות גבוהה עם רקע נמוך.

כאשר שוקלים איזו שיטה ליישם, כדאי לקחת בחשבון את נקודות החוזק והמגבלות שלהם. כפי שצוין קודם לכן, DRIP-seq מייצר מפות ברזולוציה נמוכה יותר ואינו נותן מידע על התקיעה של היווצרות לולאת R. הרזולוציה הנמוכה יותר היא בעיקר תוצר של השימוש ב-REs כדי לפצל את הגנום. שיטה עדינה זו היא הטובה ביותר בשימור לולאות R, ובכך מאפשרת התאוששות ללא תחרות של מבנים כאלה, והופכת את DRIP-seq לחזק מאוד. כדי לעקוף את נושא הרזולוציה המוגבלת תוך שמירה על התאוששות גבוהה, ניתן להתאים קוקטיילים של RE ו/או לשלב מפות הנובעות מקוקטיילים שונים של RE כדי לשפר את הרזולוציה16. טכניקה המשתמשת בחותכי 4 bp פותחה כדי לשפר את הרזולוציה של DRIP-seq ועשויה להשיג מיפוי ספציפי לגדיל22,55, אם כי מערכי הנתונים המתקבלים עדיין לא הושוו באופן שיטתי למערכי נתונים אנושיים אחרים. חשוב לציין שבגישות מבוססות RE, שברים גדולים יותר נוטים להתאושש בצורה יעילה יותר מכיוון שהם יכולים לשאת אזורים מרובים היוצרים לולאת R. יש לקחת בחשבון הטיה זו בעת ניתוח מערכי נתונים של DRIP-seq. באופן דומה, קריאת שיא לנתוני DRIP-seq חייבת להיות מתורגמת בסופו של דבר לקטעי RE חיוביים ללולאת R, מכיוון שקטעים אלה הם המשקעים חיסונית ולא ניתן להסיק את מיקומם של לולאות R בתוך שברים אלה. באופן כללי, מומלץ למשתמשים לאמץ תחילה DRIP-seq מבוסס RE כדי ללמוד את השיטה ולבנות את הביטחון שלהם בהשגת התשואות המתועדות באיור 2A. sDRIP-seq מביא בדרך כלל לתשואות נמוכות יותר, מה שעלול לגרום למפות עם יחסי אות לרעש נמוכים יותר בידיים לא מאומנות. השימוש בסוניקציה כאמצעי לפיצול הגנום מציע בתמורה שיפור גדול ברזולוציה מכיוון שהחלקים שאינם לולאת R המהווים בדרך כלל את רוב מקטעי ה-RE יישברו, מה שיאפשר ל-S9.6 לאחזר בעיקר את החלקים עם לולאת R (איור 1). ראוי לציין כי סוניקציה גורמת לשבירת גדיל ה-ssDNA העקור של לולאות R. לכן חיוני להוסיף סינתזת גדיל שנייה לאחר אימונו-משקעים היברידיים של DNA:RNA, אשר ימירו את ההיברידיות הללו בחזרה ל-dsDNA, לפני בניית ספריות ריצוף. ללא שלב זה, השברים היחידים שניתן לקשור למתאמי dsDNA יהיו שברי dsDNA ברקע; לפיכך, המפות המתקבלות יהיו נטולות כל אות. ספציפיות גדיל מספקת יתרונות רבים נוספים להבנת מנגנוני היווצרות לולאת R, מה שהופך את sDRIP-seq לשיטה הנבחרת לחקר לולאות R.

חשוב לציין, מפות המתקבלות באמצעות DRIP-seq ו-sDRIP-seq מייצגות את ההתפלגות הממוצעת של לולאות R דרך אוכלוסיית תאים; לפיכך, לא ניתן לטפל באורך ובמיקום של לולאות R בודדות בטכניקות אלה. לשם כך, ניתן למנף שיטה עצמאית ומשלימה הנקראת טביעת רגל של לולאת R של מולקולה אחת (SMRF-seq)12 כדי לחשוף לולאות R בודדות ברזולוציה גבוהה באופן ספציפי לגדיל. הערכה של היווצרות לולאת R באמצעות SMRF-seq על פני 20 מיקומים שונים, כולל ללא תלות ב-S9.6, חשפה הסכמה חזקה בין איסוף טביעות רגל בודדות של לולאת R לבין ההתפלגות הממוצעת של האוכלוסייה שנאספה על ידי גישות מבוססות DRIP12, מה שמעניק תמיכה חזקה לגישות מבוססות DRIP. חשוב גם לקחת בחשבון שנתוני מיפוי לולאת R מספקים רק תמונת מצב של התפלגות גנומית של לולאת R ואינם מספקים מידע על הדינמיקה של היווצרות, יציבות ורזולוציה של לולאת R. גישות DRIP, בשילוב עם טיפולים תרופתיים ספציפיים והערכה של התפלגויות לולאת R לאורך סדרות זמן, ניתנות בכל זאת לפריסה כדי לטפל בפרמטרים אלה17,53. המגבלות של מתודולוגיות פרופיל לולאת R חשובות במיוחד לזכור כאשר המטרה היא לאפיין התפלגויות לולאת R שהשתנו בתגובה להפרעות גנטיות, סביבתיות או פרמקולוגיות. בנוסף לאלה שכבר תוארו לעיל, חשוב לשקול כל שינוי אפשרי בשעתוק המתהווה מכיוון שאלו יגרמו מטבעם לשינויים בלולאת R עקב האופי השעתוק המשותף של מבנים אלה. נושאים והנחיות אלה לפיתוח גישות מיפוי לולאת R קפדניות נדונו בהרחבה48,56 והקוראים מוזמנים להתייחס למחקרים אלה.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

העבודה במעבדת צ'דין נתמכת על ידי מענק מהמכונים הלאומיים לבריאות (R01 GM120607).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL tube High density Maxtract phase lock gelQiagen129065
2 mL tube phase lock gel lightVWR10847-800
Agarose A/G beadsThermoFisher Scientific20421
Agencourt AMPure XP beadsBeckman CoulterA63881
AmpErase Uracil N-glycosylaseThermoFisher ScientificN8080096
Index adaptersIlluminaCorresponds to the TrueSeq Single indexes
Klenow fragment (3’ to 5’ exo-)New England BioLabsM0212S
NEBNext End repair moduleNew England BioLabsE6050
PCR primers for library amplificationprimer 1.0 P5 (5’ AATGATACGGCGACCACCGAGA
TCTACACTCTTTCCCTACACGA 3’)
PCR primers for library amplificationPCR primer 2.0 P7 (5’ CAAGCAGAAGACGGCATACG
AGAT 3’)
Phenol/Chloroform Isoamyl alcohol 25:24:1Affymetrix75831-400ML
Phusion Flash High-Fidelity PCR master mixThermoFisher ScientificF548S
Quick Ligation KitNew England BioLabsM2200S
Ribonuclease HNew England BioLabsM0297S
S9.6 AntibodyKerafastENH001These three sources are equivalent
S9.6 AntibodyMillipore/SigmaMABE1095
S9.6 AntibodyAbcamab234957

References

  1. Reaban, M. E., Lebowitz, J., Griffin, J. A. Transcription induces the formation of a stable RNA.DNA hybrid in the immunoglobulin alpha switch region. The Journal of Biological Chemistry. 269 (34), 21850-21857 (1994).
  2. Daniels, G. A., Lieber, M. R. RNA:DNA complex formation upon transcription of immunoglobulin switch regions: implications for the mechanism and regulation of class switch recombination. Nucleic Acids Research. 23 (24), 5006-5011 (1995).
  3. Yu, K., Chedin, F., Hsieh, C. L., Wilson, T. E., Lieber, M. R. R-loops at immunoglobulin class switch regions in the chromosomes of stimulated B cells. Nature Immunology. 4 (5), 442-451 (2003).
  4. Ginno, P. A., Lott, P. L., Christensen, H. C., Korf, I., Chedin, F. R-loop formation is a distinctive characteristic of unmethylated human CpG island promoters. Molecular Cell. 45 (6), 814-825 (2012).
  5. Stolz, R., et al. Interplay between DNA sequence and negative superhelicity drives R-loop structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (13), 6260-6269 (2019).
  6. Duquette, M. L., Handa, P., Vincent, J. A., Taylor, A. F., Maizels, N. Intracellular transcription of G-rich DNAs induces formation of G-loops, novel structures containing G4 DNA. Genes & Development. 18 (13), 1618-1629 (2004).
  7. Carrasco-Salas, Y., et al. The extruded non-template strand determines the architecture of R-loops. Nucleic Acids Research. 47 (13), 6783-6795 (2019).
  8. Huppert, J. L. Thermodynamic prediction of RNA-DNA duplex-forming regions in the human genome. Molecular Biosystems. 4 (6), 686-691 (2008).
  9. Hartono, S. R., Korf, I. F., Chedin, F. GC skew is a conserved property of unmethylated CpG island promoters across vertebrates. Nucleic Acids Research. 43 (20), 9729-9741 (2015).
  10. Green, P., Ewing, B., Miller, W., Thomas, P. J., Green, E. D. Transcription-associated mutational asymmetry in mammalian evolution. Nature Genetics. 33 (4), 514-517 (2003).
  11. Polak, P., Arndt, P. F. Transcription induces strand-specific mutations at the 5' end of human genes. Genome Research. 18 (8), 1216-1223 (2008).
  12. Malig, M., Hartono, S. R., Giafaglione, J. M., Sanz, L. A., Chedin, F. Ultra-deep Coverage Single-molecule R-loop Footprinting Reveals Principles of R-loop Formation. Journal of Moleclar Biology. 432 (7), 2271-2288 (2020).
  13. Masse, E., Phoenix, P., Drolet, M. DNA topoisomerases regulate R-loop formation during transcription of the rrnB operon in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 272 (19), 12816-12823 (1997).
  14. Drolet, M., et al. The problem of hypernegative supercoiling and R-loop formation in transcription. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 8, 210-221 (2003).
  15. Chedin, F., Benham, C. J. Emerging roles for R-loop structures in the management of topological stress. The Journal of Biological Chemistry. 295 (14), 4684-4695 (2020).
  16. Ginno, P. A., Lim, Y. W., Lott, P. L., Korf, I., Chedin, F. GC skew at the 5' and 3' ends of human genes links R-loop formation to epigenetic regulation and transcription termination. Genome Research. 23 (10), 1590-1600 (2013).
  17. Sanz, L. A., et al. conserved R-Loop structures associate with specific epigenomic signatures in mammals. Molecular Cell. 63 (1), 167-178 (2016).
  18. El Hage, A., Webb, S., Kerr, A., Tollervey, D. Genome-wide distribution of RNA-DNA hybrids identifies RNase H targets in tRNA genes, retrotransposons and mitochondria. PLoS Genetics. 10 (10), 1004716 (2014).
  19. Hartono, S. R., et al. The affinity of the S9.6 Antibody for Double-Stranded RNAs impacts the accurate mapping of R-loops in fission yeast. Journal of Molecular Biology. 430 (3), 272-284 (2018).
  20. Wahba, L., Costantino, L., Tan, F. J., Zimmer, A., Koshland, D. S1-DRIP-seq identifies high expression and polyA tracts as major contributors to R-loop formation. Genes & Development. 30 (11), 1327-1338 (2016).
  21. Alecki, C., et al. RNA-DNA strand exchange by the Drosophila Polycomb complex PRC2. Nature Communications. 11 (1), 1781 (2020).
  22. Xu, W., et al. The R-loop is a common chromatin feature of the Arabidopsis genome. Nature Plants. 3 (9), 704-714 (2017).
  23. Chedin, F. Nascent connections: R-Loops and chromatin patterning. Trends in Genetics: TIG. 32 (12), 828-838 (2016).
  24. Skourti-Stathaki, K., Proudfoot, N. J., Gromak, N. Human senataxin resolves RNA/DNA hybrids formed at transcriptional pause sites to promote Xrn2-dependent termination. Molecular Cell. 42 (6), 794-805 (2011).
  25. Kreuzer, K. N., Brister, J. R. Initiation of bacteriophage T4 DNA replication and replication fork dynamics: a review in the Virology Journal series on bacteriophage T4 and its relatives. Virology Journal. 7, 358 (2010).
  26. Carles-Kinch, K., Kreuzer, K. N. RNA-DNA hybrid formation at a bacteriophage T4 replication origin. Journal of Molecular Biology. 266 (5), 915-926 (1997).
  27. Masukata, H., Tomizawa, J. A mechanism of formation of a persistent hybrid between elongating RNA and template DNA. Cell. 62 (2), 331-338 (1990).
  28. Itoh, T., Tomizawa, J. Formation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (5), 2450-2454 (1980).
  29. Stuckey, R., Garcia-Rodriguez, N., Aguilera, A., Wellinger, R. E. Role for RNA:DNA hybrids in origin-independent replication priming in a eukaryotic system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5779-5784 (2015).
  30. Lee, D. Y., Clayton, D. A. Initiation of mitochondrial DNA replication by transcription and R-loop processing. The Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30614-30621 (1998).
  31. Xu, B., Clayton, D. A. A persistent RNA-DNA hybrid is formed during transcription at a phylogenetically conserved mitochondrial DNA sequence. Molecular and Cellular Biology. 15 (1), 580-589 (1995).
  32. Cadoret, J. C., et al. Genome-wide studies highlight indirect links between human replication origins and gene regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15837-15842 (2008).
  33. Sequeira-Mendes, J., et al. Transcription initiation activity sets replication origin efficiency in mammalian cells. PLoS Genetics. 5 (4), 1000446 (2009).
  34. Picard, F., et al. The spatiotemporal program of DNA replication is associated with specific combinations of chromatin marks in human cells. PLoS Genetics. 10 (5), 1004282 (2014).
  35. Mukhopadhyay, R., et al. Allele-specific genome-wide profiling in human primary erythroblasts reveal replication program organization. PLoS Genetics. 10 (5), 1004319 (2014).
  36. Huang, F. T., Yu, K., Hsieh, C. L., Lieber, M. R. Downstream boundary of chromosomal R-loops at murine switch regions: implications for the mechanism of class switch recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (13), 5030-5035 (2006).
  37. Huang, F. T., et al. Sequence dependence of chromosomal R-loops at the immunoglobulin heavy-chain Smu class switch region. Molecular and Cellular Biology. 27 (16), 5921-5932 (2007).
  38. Yu, K., Lieber, M. R. Current insights into the mechanism of mammalian immunoglobulin class switch recombination. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 54 (4), 333-351 (2019).
  39. Crossley, M. P., Bocek, M., Cimprich, K. A. R-Loops as cellular regulators and genomic threats. Molecular Cell. 73 (3), 398-411 (2019).
  40. Santos-Pereira, J. M., Aguilera, A. R loops: new modulators of genome dynamics and function. Nature Reviews. Genetics. 16 (10), 583-597 (2015).
  41. Garcia-Muse, T., Aguilera, A. R Loops: From physiological to pathological roles. Cell. 179 (3), 604-618 (2019).
  42. Skourti-Stathaki, K., Proudfoot, N. J. A double-edged sword: R loops as threats to genome integrity and powerful regulators of gene expression. Genes & Development. 28 (13), 1384-1396 (2014).
  43. Costantino, L., Koshland, D. The Yin and Yang of R-loop biology. Current Opinion in Cell Biology. 34, 39-45 (2015).
  44. Boguslawski, S. J., et al. Characterization of monoclonal antibody to DNA.RNA and its application to immunodetection of hybrids. Journal of Immunological Methods. 89 (1), 123-130 (1986).
  45. Sanz, L. A., Chedin, F. High-resolution, strand-specific R-loop mapping via S9.6-based DNA-RNA immunoprecipitation and high-throughput sequencing. Nature Protocols. 14 (6), 1734-1755 (2019).
  46. Halasz, L., et al. RNA-DNA hybrid (R-loop) immunoprecipitation mapping: an analytical workflow to evaluate inherent biases. Genome Research. 27 (6), 1063-1073 (2017).
  47. Phillips, D. D., et al. The sub-nanomolar binding of DNA-RNA hybrids by the single-chain Fv fragment of antibody S9.6. Journal of Molecular Recognition. 26 (8), 376-381 (2013).
  48. Chedin, F., Hartono, S. R., Sanz, L. A., Vanoosthuyse, V. Best practices for the visualization, mapping, and manipulation of R-loops. The EMBO Journal. 40 (4), 106394 (2021).
  49. Smolka, J. A., Sanz, L. A., Hartono, S. R., Chedin, F. Recognition of RNAs by the S9.6 antibody creates pervasive artefacts when imaging RNA:DNA hybrids. Journal of Cell Biology. 220 (6), 202004079 (2021).
  50. Chen, J. Y., Zhang, X., Fu, X. D., Chen, L. R-ChIP for genome-wide mapping of R-loops by using catalytically inactive RNASEH1. Nature Protocols. 14 (5), 1661-1685 (2019).
  51. Yan, Q., Sarma, K. MapR: A Method for Identifying native R-loops genome wide. Current Protocols in Molecular Biology. 130 (1), 113 (2020).
  52. Wang, K., et al. Genomic profiling of native R loops with a DNA-RNA hybrid recognition sensor. Science Advances. 7 (8), (2021).
  53. Crossley, M. P., Bocek, M. J., Hamperl, S., Swigut, T., Cimprich, K. A. qDRIP: a method to quantitatively assess RNA-DNA hybrid formation genome-wide. Nucleic Acids Research. 48 (14), 84 (2020).
  54. Svikovic, S., et al. R-loop formation during S phase is restricted by PrimPol-mediated repriming. The EMBO Journal. 38 (3), 99793 (2019).
  55. Yang, X., et al. m(6)A promotes R-loop formation to facilitate transcription termination. Cell Research. 29 (12), 1035-1038 (2019).
  56. Vanoosthuyse, V. Strengths and weaknesses of the current strategies to map and characterize R-Loops. Non-coding RNA. 4 (2), 9 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

RRNA DNADRIP seqSDRIP seqDNA B

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved