S9.6ベースの免疫沈降法によるRループおよびRNA:DNAハイブリッドのマッピング

Rループは、DNA配列とトポロジカルな好感度の両方に応じて、すべてのゲノムで発生する転写駆動型の非B DNA構造の一般的なクラスを構成します。近年、Rループはさまざまな適応的および不適応的な役割に関与しており、ヒトの障害の文脈でゲノム不安定性と関連しています。その結果、ゲノム内のこれらの構造の正確なマッピングは、多くの研究者にとって高い関心を集めています。ここでは、DRIP-seq(DNA:RNA Immunoprecipitation followed to high throughput sequencing)について説明します。これは、Rループの正確で半定量的なマッピングを可能にする堅牢で再現性のある手法です。この方法の最近の反復についても説明されており、超音波処理(sDRIP-seq)を使用してフラグメンテーションが達成され、これによりRループの鎖特異的で高分解能のマッピングが可能になります。このように、sDRIP-seqは、分解能と座礁性に関するDRIP-seq法の一般的な制限の一部に対処し、Rループマッピングに最適な方法となっています。

Rループは、DNA配列とトポロジカルな好感度の両方に応じて、すべてのゲノムで発生する転写駆動型の非B DNA構造の一般的なクラスを構成します。近年、Rループはさまざまな適応的および不適応的な役割に関与しており、ヒトの障害の文脈でゲノム不安定性と関連しています。その結果、ゲノム内のこれらの構造の正確なマッピングは、多くの研究者にとって高い関心を集めています。ここでは、DRIP-seq(DNA:RNA Immunoprecipitation followed to high throughput sequencing)について説明します。これは、Rループの正確で半定量的なマッピングを可能にする堅牢で再現性のある手法です。この方法の最近の反復についても説明されており、超音波処理(sDRIP-seq)を使用してフラグメンテーションが達成され、これによりRループの鎖特異的で高分解能のマッピングが可能になります。このように、sDRIP-seqは、分解能と座礁性に関するDRIP-seq法の一般的な制限の一部に対処し、Rループマッピングに最適な方法となっています。

Rループは、主に新生RNA転写産物がテンプレートDNA鎖にハイブリダイゼーションされる転写中に形成される3本鎖核酸構造です。これにより、RNA:DNAハイブリッドが形成され、非テンプレートDNA鎖が一本鎖ループ状態で置換されます。生化学的再構成^1,2,3,4および数学的モデリング⁵は、他の生物物理学的測定^6,7と組み合わせて、Rループが特定の好ましい特性を示す領域で発生する可能性が高いことを立証した。例えば、グアニン(G)とシトシン(C)の分布に鎖の非対称性を示す領域は、RNAがGリッチである(正のGCスキューと呼ばれる特性)ため、DNAとRNAハイブリッドの熱力学的安定性がDNA二本鎖8よりも高いため、転写時にRループを形成するのに^{好ましい。}多くの真核生物遺伝子4,9,10,11の初期部分など、正のGCスキューを進化させた領域は、in vitroおよびin vivoでRループを形成する傾向があります^3,4,12。負のDNA超らせんストレスもまた、Rループがそのようなトポロジカルストレスを効率的に吸収し、周囲のDNA繊維を好ましい^{緩和状態に戻す}ため、構造形成^13,14を大いに促進する^5,15。

歴史的に、Rループ構造は、転写中にRNAとDNAがまれに自然に絡み合う結果であると考えられていました。しかし、DNA:RNA免疫沈降法(DRIP)とハイスループットDNAシーケンシング(DRIP-seq)の組み合わせにより、Rループの最初のゲノムワイドマッピングが可能になり、それらの構造がヒト細胞で予想よりもはるかに一般的であることが明らかになりました^4,16。Rループは、哺乳類のゲノムにおいて数万の保存された転写された遺伝子ホットスポットで発生し、GCに歪んだCpGアイランドは遺伝子の最初のイントロンと多数の遺伝子の末端領域と重なる傾向がある¹⁷。全体として、Rループは、ヒト細胞におけるゲノムの3%〜5%を集合的に占めており、これは、酵母、植物、ハエ、およびマウスを含む他の生物における測定と一致している18,19,20,21,22。

ヒト細胞におけるRループ形成ホットスポットの解析により、そのような領域が特定のクロマチンシグネチャーと関連していることが明らかになった²³。一般に、Rループは、ヌクレオソームの占有率が低く、RNAポリメラーゼ密度が高い領域に見られます。プロモーターでは、Rループは、共転写的に沈着した2つのヒストン修飾、H3K4me1およびH3K36me3の動員の増加と関連しています¹⁷。遺伝子末端では、Rループは、効率的な転写終結¹⁷を受ける密接に配置された遺伝子と会合し、これは以前の観察結果²⁴と一致する。Rループは、バクテリオファージ、プラスミド、ミトコンドリア、および酵母ゲノムの複製起点25,26,27,28,29,30,31でもDNA複製の開始に関与することも示されました。さらに、Rループを起こしやすいヒトCpGアイランドプロモーターの76%は、初期の構成的複製起点32,33,34,35として機能し、Rループと複製起点との間の接続をさらに強化する。まとめると、これらの研究は、Rループが文脈依存的な方法で特定の生物学的出力をトリガーできる新しいタイプの生物学的シグナルを表していることを示唆しています²³。

早い段階で、Rループは免疫グロブリンクラススイッチ組換えのプロセス中にクラススイッチ配列で形成されることが示されました^3,36,37。このようなプログラムされたRループは、二本鎖DNA切断³⁸の導入を通じてクラススイッチの組換えを開始すると考えられている。それ以来、有害なRループ形成は、一般に過剰なRループ形成に起因すると理解されており、ゲノムの不安定性や、超組換え、転写-複製衝突、複製、転写ストレスなどのプロセスに関連していることがわかっています(レビュー39,40,41,42,43).その結果、Rループ構造のマッピングの改善は、健康と疾患におけるこれらの構造の分布と機能をよりよく解読するためのエキサイティングで重要な課題を表しています。

DNA:RNA免疫沈降(DRIP)は、DNA:RNAハイブリッド⁴⁴に対するS9.6モノクローナル抗体の高い親和性に依存しています。DRIP-seqは、Rループ形成^4,45の堅牢なゲノムワイドプロファイリングを可能にします。この技術は有用ですが、制限酵素を使用して穏やかなDNA断片化を達成するため、分解能が限られています。また、DRIP-seqはRループ形成の方向性に関する情報を提供していません。ここでは、ストランド特異的な方法で高分解能でRループをマッピングできるDRIP-seqの変種を報告します。この方法は、免疫沈降の前にゲノムを断片化するために超音波処理に依存しているため、この方法はsDRIP-seq(超音波処理DNA:RNA免疫沈降とハイスループットシーケンシングの組み合わせ)と呼ばれます(図1)。超音波処理の使用は、分解能の向上を可能にし、DRIP-seqアプローチ⁴⁶で観察される制限酵素結合フラグメンテーションバイアスを制限する。sDRIP-seqは、DRIP-seqと、免疫沈降したRループ構造のRNA鎖からシーケンシングライブラリを構築する前述の高分解能DRIPc-seq法の両方の結果と強く一致するRループマップを生成する⁴⁵。

選択できる方法が多すぎる場合、ユーザーはどの特定のDRIPベースのアプローチが自分のニーズに適しているか疑問に思うかもしれません。私たちは、以下のアドバイスを提供します。DRIP-seqは、その制限にもかかわらず、技術的に最も簡単で、ここで説明した3つの方法すべての中で最も堅牢(最高の収率)です。したがって、それは広く有用であり続けています。多数のDRIP-seqデータセットが公開されており、新しいデータセットの比較ポイントとして有用です。最後に、バイオインフォマティクス解析のパイプラインは、データが孤立していないため、よりシンプルです。新規ユーザーは、DRIPを使用してRループマッピングスキルを磨き始め、その後に定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)とDRIP-seqを使用することをお勧めします。sDRIP-seqは、わずかに高い技術的難易度を表しています:超音波処理(後述)により収量がわずかに減少し、シーケンシングライブラリプロセスはわずかに複雑になります。それでも、座礁と高解像度の利益は非常に貴重です。なお、sDRIP-seqは、2本鎖RNA:DNAハイブリッドと3本鎖Rループの両方を捕捉します。ライブラリ構築手順のため、DRIP-seqは二本鎖RNA:DNAハイブリッドを捕捉しません。DRIPc-seqは最も技術的に要求が厳しく、より多くの出発材料を必要とします。その見返りとして、最高の解像度と撚り線を提供します。シーケンシングライブラリはRループまたはハイブリッドのRNA部分から構築されるため、特にS9.6はdsRNA19,47,48に対して残留親和性を有するため、DRIPc-seqはRNA汚染の可能性に苦しむ可能性があります。sDRIP-seqは、シーケンシングライブラリがDNA鎖に由来するため、RNA汚染の心配なしに、鎖特異的で高分解能のマッピングが可能です。全体として、これら 3 つの方法は依然として有用であり、複雑さの度合いが異なり、注意点もわずかに異なります。しかし、これら3つすべてが、非常に一致したデータセット⁴⁸を生成し、シグナル特異性^45,49を確保するために不可欠な制御を表すRNase H前処理に非常に敏感である。シーケンシングライブラリに課せられるサイズ選択を考えると、遅延鎖DNA複製プライミング部位(岡崎プライマー)の周囲に一過性に形成されるもの(岡崎プライマー)などの小さなハイブリッド(推定<75 bp)は除外されることに注意してください。同様に、すべてのDRIP法はDNA断片化を伴うため、安定性のために負のDNAスーパーコイルを必要とする不安定なRループは失われます⁵。したがって、DRIPアプローチは、特にin vivoアプローチ^45,48を使用して最もよく捕捉できる可能性のある短く不安定なRループの場合、Rループ負荷を過小評価する可能性があります。Rループは、重亜硫酸ナトリウム処理¹²後、深部被覆、高分解能、および単一DNA分子上の鎖特異的な方法でS9.6非依存的にプロファイリングすることもできることに注意してください。さらに、触媒的に不活性なRNase H1酵素を用いた戦略が、in vivoでのネイティブRループのマッピングに採用されており、主に一時停止したプロモーター50,51,52で形成される短く不安定なRループが強調されている。

以下のプロトコールは、培養で増殖したヒトNtera-2細胞株に最適化されていますが、他のさまざまなヒト細胞株(HEK293、K562、HeLa、U2OS)、初代細胞(線維芽細胞、B細胞)、および小さな修飾を持つ他の生物(マウス、ハエ)に改変なしで適応することに成功しています。

1. 細胞の採取と溶解

1. Ntera-2細胞を75%-85%のコンフルエント度まで培養します。最適な細胞数が500万から600万の細胞で、生存率が>90%であることを確認して、DRIP手順を開始します。
2. 細胞を1x PBSで1回洗浄し、1.5 mLのTrypsin-EDTA 1xを加え、細胞が皿から解離するまで37°Cで2分間インキュベートします。
3. 5 mLの温かい培地を加え、よくピペットで動かして、細胞を単一細胞懸濁液に再懸濁します。内容物を新しい15 mLチューブに移し、細胞を300 x g で3分間穏やかにペレット化します。
4. 細胞を5 mLの1x PBSで1回洗浄し、細胞を300 x g で3分間穏やかにペレット化します。
5. 1.6 mLのTEバッファー(10 mM Tris-Cl pH 7.5、1 mM EDTA pH 8.0)に細胞を完全に再懸濁します。5 μL のプロテイナーゼ K (20 mg/mL ストック溶液) と 50 μL の SDS (20% ストック溶液) を加え、溶液が粘性になるまでチューブを 5 回静かに反転させます。溶液をピペットで動かそうとせず、反転して混合するだけです。
6. チューブを37°Cで一晩インキュベートします。

2. DNA抽出

1. DNAライセートを紡糸済みの15 mL高密度フェーズロックゲルチューブに注ぎ、1容量(1.6 mL)のフェノール/クロロホルムイソアミルアルコール(25:24:1)を加えます。5回静かに反転させ、1,500 x g で5分間スピンダウンします。
2. 1/10容量の3 M酢酸ナトリウム(NaOAc)(pH 5.2)と2.5容量の100%エタノールを新しい15 mLチューブに加えます。フェーズロックゲルチューブから上部水相を注ぎ、DNAが完全に沈殿するまで(最大10分)穏やかに反転させます。
3. 広口径1,000μLのチップでDNA糸をスプールし、上清が残らないように注意しながら、きれいな2mLチューブに移します。
4. 1.5 mLの80%エタノールを加えてDNAを洗浄し、チューブを5回静かに反転させます。10分間インキュベートします。
5. 前の手順を 2 回繰り返します。洗浄ステップ中に遠心分離しないでください。DNAを乱さないようにしながら、最後の洗浄後にピペッティングして、できるだけ多くのエタノールを慎重に取り除きます。
6. DNAを完全に風乾させながら、チューブを反転させます。このステップは、DNAの量にもよりますが、30分〜1時間かかる場合があります。
7. 125 μLのTEバッファーをDNAペレットに直接添加して制限酵素消化でDNAを断片化するか、100 μLのTEバッファーを添加して超音波処理でDNAをせん断します。氷上に1時間保持し、ワイドボア200μLチップで数回ピペッティングしてDNAを穏やかに再懸濁します。フラグメンテーションステップを開始する前に、氷上に1時間放置します。

3. DNAの断片化

注:制限酵素ベースのDRIP-seqについては、ステップ3.1に従ってください。超音波処理ベースのDRIP-seqの場合は、ステップ3.2にスキップしてください。

1. 制限酵素(RE)の断片化
   1. 再懸濁したゲノムDNA(非常に粘性が高い)を、サプライヤーの指示に従ってREのカクテルを使用して消化します。
      1. 最終反応に0.1 mMのスペルミジンを添加します。4〜5個の酵素と各酵素30Uを合計150μLのカクテルで使用します。
         注:DRIP-seq(HindIII、SspI、EcoRI、BsrGI、XbaI)⁴ の初期カクテルは、平均フラグメント長5キロベースを生成するために開発されました。CpGメチル化との干渉を避け、ゲノムのGCリッチ領域を予備にします。他のカクテルも可能です¹⁶)。これらのカクテルは、ヒトゲノムとマウスゲノムの両方に適していますが、必要に応じて調整することができます。
      2. 反応混合物を37°Cで一晩インキュベートします。
         注:消化後のDNA混合物は、もはや粘性であってはなりません。このステップで残っている粘度は、消化が不完全であることを示しています。
      3. 観察された場合は、各酵素をさらに10U加え、37°Cでさらに2〜4時間インキュベートします。
         注:ここで推奨されているよりも多くの細胞を採取した場合、ユーザーはペレット全体を消化することはできません。
   2. 一晩消化したDNA(150 μL)を、あらかじめ紡糸した2 mLのフェーズロックゲルライトチューブに静かにピペットで移します。100 μLの水と1容量(250 μL)のフェノール/クロロホルムイソアミルアルコール(25:24:1)を加えます。5回静かに反転させ、16,000 x g で10分間スピンダウンします。
   3. グリコーゲン1.5 μL、1/10容量の3 M NaOAc(pH 5.2)、および2.5容量の100%エタノールを新しい1.5 mLチューブに加えます。フェーズロックゲルチューブからDNAをピペットで取り出し、5回反転させて混合します。-20°Cで1時間インキュベートします。
   4. 16,000 x g で4°Cで35分間遠心します。 DNAを200 μLの80%エタノールで洗浄し、16,000 x g で4°Cで10分間遠心します。
   5. ペレットを風乾し、50 μL の TE バッファーをペレットに加えます。チューブを氷上に30分間放置し、DNAを静かに再懸濁します。
   6. 分光光度計を使用して、断片化されたDNAの濃度(OD₂₆₀)を測定します。
   7. オプションですが、推奨:0.8%アガロースゲルに1 μgの消化済みDNAをサイズマーカーと一緒にロードして、消化が完了したことを確認します。ゲルを100Vで1時間泳がせます。
      注:不完全な場合は、追加の酵素を追加できます。消化が不完全であると、免疫沈降後の分解能が失われる可能性があります。
   8. このステップの後、消化したDNA10 μgを4 μLのリボヌクレアーゼH(RNase H)で37°Cで1〜2時間処理し、免疫沈降時に取得されるシグナルがDNA:RNAハイブリッドに由来することを確認します。その後、S9.6免疫沈降(ステップ4)に進みます。
      注:消化されたDNAは、-80°Cで最大1ヶ月間凍結保存でき、収量を大幅に損なうことはありません。
2. 超音波
   1. 抽出したDNAの全部または一部を、0.5 mLの微量遠心チューブで、総容量100 μLで超音波処理します。ソニケーターで15秒ON / 30秒OFFの20〜30サイクルを実行します(均一な超音波処理を確保するために、5、10、および15サイクル後に回転します)。
   2. 超音波処理されたDNAの濃度(OD₂₆₀)を分光光度計で測定します。
      注:このステップでは、DNAの粘度が消えているはずです。
   3. アガロースゲルを泳動して、超音波処理したDNA(300〜500 bp)のサイズ分布を確認します。
      注:DNAを過剰に超音波処理すると、Rループ構造の切断および解離に起因する収率の大幅な減少につながる可能性があります。
   4. このステップの後、10μgの超音波処理されたDNAを4μLのRNase Hで37°Cで1〜2時間処理し、免疫沈降時に取得されるシグナルがDNA:RNAハイブリッドに由来することを確認します。その後、S9.6免疫沈降(ステップ4)に進みます。

4. S9.6免疫沈降

注:免疫沈降のステップは、DNAがREによって断片化されたか超音波処理によって断片化されたかに関係なく、類似しています。

1. 3本のチューブを調製し、チューブあたり500 μLのTEバッファーの最終容量に4.4 μgの断片化されたDNAを分注します。各チューブから50 μL(容量の1/10)を保存して、後でインプットDNAとして使用します。
2. 希釈したDNA450 μLに、10x結合バッファー(100 mM NaPO4 pH 7、1.4 M NaCl、0.5% Triton X-100)50 μLとS9.6抗体(1 mg/mL)10 μLを添加します。
3. ミニチューブローテーターで4°Cで7-10rpmで一晩インキュベートします。
4. 各チューブについて、50 μLのProtein A/Gアガロースビーズスラリーを700 μLの1x結合バッファーで洗浄し、ミニローテーター上のチューブを室温で10分間反転させます。ビーズを1,100 x g で1分間スピンダウンし、上清を捨てます。この手順を一度繰り返します。
5. ステップ4.3のDNAを50 μLのビーズに加え、ミニローテーター上で7-10 rpmで反転させながら、4°Cで2時間インキュベートします。
6. ビーズを1,100 x g で1分間スピンダウンし、上清を捨てます。
7. ビーズを750 μLの1x結合バッファーで、ミニローテーター上で7-10 rpmで15分間反転して洗浄します。1,100 x g で1分間スピンダウンし、上清を捨てます。この手順を一度繰り返します。
8. 溶出バッファー (50 mM Tris-Cl pH 8、10 mM EDTA pH 8、0.5% SDS) 250 μL と 7 μL のプロテイナーゼ K (20 mg/mL ストック) をビーズに加え、55 °C (12 rpm) で 45 分間回転させてインキュベートします。
9. ビーズを1,100 x gで1分間スピンダウンします。上清を紡糸済みの2 mLフェーズロックゲルライトチューブに移し、フェノール/クロロホルムイソアミルアルコール(25:24:1)を1容量(250 μL)加えます。チューブを5回反転させ、室温で16,000 x g で10分間スピンダウンします。
10. グリコーゲン1.5 μL、3M NaOAc(pH 5.2)1/10容量、100%エタノール2.5容量を新しい1.5 mLチューブに加えます。フェーズロックゲルチューブからDNAをピペットで取り出し、5回反転させて混合します。-20°Cで1時間インキュベートします。
11. 16,000 x g で4°Cで35分間遠心します。 DNAを200 μLの80%エタノールで洗浄し、16,000 x g で4°Cで10分間遠心します。
12. ペレットを風乾し、各チューブに15 μLの10 mM Tris-Cl(pH 8)を加えます。チューブを氷上に20分間放置し、静かに再懸濁します。3本のチューブの内容物を1本のチューブ(45μL)にまとめます。
13. 再懸濁した DNA 45 μL のうち 5 μL を使用した qPCR により、DRIP 効率を確認します ( 代表的な結果を参照)。5 μLを10 μLの水で希釈し、1反応あたり2 μLを使用します。

5. 超音波処理されたDNAのみのプレライブラリーステップ

注:超音波処理は、Rループの変位したssDNA鎖を切断します。したがって、三本鎖Rループ構造は、超音波処理時に二本鎖DNA:RNAハイブリッドに変換されます。その結果、これらのDNA:RNAハイブリッドは、ライブラリ構築前に二本鎖DNAに戻す必要があります。ここでは、第2の鎖合成ステップが採用されています。成功裏に使用されている別のアプローチは、代わりに一本鎖DNAライゲーションを行い、続いて第二鎖合成^{を行うことである53}。

1. ステップ 4.12 で DRIP した DNA 40 μL に、5x セカンドストランドバッファー (200 mM Tris pH 7、22 mM MgCl₂、425 mM KCl)、10 mM dNTP ミックス (dATP、dCTP、dGTP、およびユーザーがストランド特異的 DRIP シーケンシングを計画している場合は dTTT または dUTP)、1 μL 16 mM NAD を 20 μL 加えます。 および32μLの水。よく混ぜて、氷上で5分間インキュベートします。
2. 1 μL の DNA ポリメラーゼ I (10 単位)、0.3 μL の RNase H (1.6 単位)、0.5 μL の 大腸菌 DNA リガーゼを加えます。混合し、16°Cで30分間インキュベートします。
3. 1.6倍の比率の常磁性ビーズを使用して、反応をすぐにクリーンアップします。40 μL の 10 mM Tris-Cl (pH 8) で DNA を溶出します。

6. RE DNAのみのプレライブラリー超音波処理ステップ

注:DRIPは、長さがキロベースであることが多いため、即時のライブラリ構築に適していないREフラグメントの回収につながります。

1. ライブラリー構築のための材料のサイズを小さくするには、免疫沈降したDNAを0.5mLの微量遠心チューブで超音波処理します。ソニケーターで12秒のON / 60秒のOFFの12サイクルを実行します(均一な超音波処理を確保するために6サイクル後に回転します)。ステップ 7 に進みます。
   注:免疫沈降した材料は、隣接する二本鎖DNAとは異なる方法で超音波処理に応答する3本鎖Rループをまだ保持しています。
2. オプションのステップ:DRIPプロファイルを均一化するために、免疫沈降した材料を1x RNase Hバッファー中の1 μLのRNase Hで、超音波処理の前に37°Cで1時間処理します。

7. 図書館建設

1. ステップ4.12(REフラグメンテーション)またはステップ5.3(超音波処理せん断)の40 μLに、10x末端修復モジュールバッファー5 μL、10 mM ATP2.5 μL、および2.5 μLの末端修復モジュール酵素(合計50 μL)を添加して、末端修復を行います。よく混ぜ合わせ、室温で30分間インキュベートします。再消化および超音波処理(DRIP)または超音波処理(sDRIP)されたインプットDNA1 μgを含めて、インプットDNAに対応する制御シーケンシングライブラリを作成します。
2. 常磁性ビーズ(1.6倍比)を使用して反応をクリーンアップし、34 μLの10 mM Tris-Cl(pH 8)で溶出します。
3. バッファー 2 5 μL、1 mM dATP 10 μL、Klenow exo- 1 μL (合計 50 μL) を添加して A-テーリングを行います。よく混合し、37°Cで30分間インキュベートします。
4. 常磁性ビーズ(1.6倍比)を使用して反応をクリーンアップし、12 μLの10 mM Tris-Cl(pH 8)で溶出します。
5. 15 μL の 2x Quick Liation Buffer を、1 μL の 15 μM アダプターを 1 μL の 1 μL と 2 μL の Quick Ligase (合計 30 μL ) を加えてアダプターをライゲーティングします。よく混ぜ合わせ、室温で20分間インキュベートします。
6. 常磁性ビーズ(1倍比)を使用して反応をクリーンアップし、20 μLの10 mM Tris-Cl(pH 8)で溶出します。
7. 超音波処理のせん断を行い、ステップ5.1でdUTPを使用した場合は、1.5 μL(1.5 U)のウラシルN-グリコシラーゼを加え、37°Cで30分間インキュベートして、ストランド特異的なDRIPを得ます。
8. ステップ6.6または6.7のライブラリー10 μLをPCR増幅します。PCR プライマー 1.0 P5 1 μL ( 材料表を参照)、PCR プライマー 2.0 P7 1 μL ( 材料表を参照)、マスターミックス 15 μL 、水 3 μL を添加します。よく混ぜます。
9. サーモサイクラーで、 表1に示すようにプログラムを実行します。
10. 常磁性ビーズを使用したライブラリの 2 段階のクリーンアップに進みます。まず、0.65倍の比率を使用して、500 bpを超えるフラグメントを除去します。上澄みを保管してください。上清の1倍比に進み、200 bp未満のフラグメントを除去します。12 μL の 10 mM Tris-HCl (pH 8) で溶出します。

8. 品質管理

1. Pfaffl法を用いて、2つの陰性遺伝子座と3つの陽性遺伝子座のqPCRによるRループ濃縮をチェックするには、ステップ6.10のクリーンアップライブラリーを1 μL使用します。ライブラリー1μLを10μLの水で希釈し、遺伝子座あたり2μLを使用します。
2. ステップ6.10でクリーンアップしたライブラリのサイズ分布を、高感度DNAキットで確認します。

DRIPおよびsDRIPは、qPCR(図2A)および/またはシーケンシング(図2B)によって分析できます。免疫沈降ステップの後、まず、ポジティブおよびネガティブコントロール遺伝子座、およびRNase H処理コントロールのqPCRによって実験の品質を確認する必要があります。複数のヒト細胞株で頻繁に使用される遺伝子座に対応するプライマーを 表2に示します。qPCRの結果は、インプットの割合として表示する必要がありますが、これは、特定の遺伝子座の溶解時にRループを運ぶ細胞の割合に対応します。成功したDRIP実験では、陰性遺伝子座の収率は0.1%未満であるべきですが、陽性遺伝子座は RPL13A などの高度に転写された遺伝子座の1%から10%以上まで変動する可能性があります(図2A)。sDRIPの場合、DRIP-qPCRで判断すると、収量は通常低く(20%-50%)ますが、回収率には一様に影響を与えるようで、Rループの特定のサブセットが他のサブセットよりも影響を受けることはありません。その結果、DRIP、sDRIP、および DRIPc から導出されたマップはよく一致しています (図 2B)。qPCRデータは、陰性遺伝子座に対する陽性遺伝子座のインプットの割合の倍増として表示することもでき、実験の特異性を評価することができます。フォールドエンリッチメントは、通常、分析のために選択した遺伝子座に応じて、最小の10倍から200倍を超える範囲です。遺伝子ノックダウン、ノックアウト、またはさまざまな薬理学的処理を表す複数のサンプルにわたる正確な定量が必要な場合、サンプル間の実験変動を正規化するためにSpike in Controlsを使用することを強く推奨します。このようなスパイクインは、合成雑種⁵³ または無関係な種⁵⁴のゲノムに対応することができる。

DRIPおよびsDRIP材料は、シングルエンドまたはペアエンドシーケンシング戦略を使用してシーケンシングできます。データは、標準的な計算パイプラインを使用して、ほとんどのChIPデータと同様に抽出および分析できます(DRIP関連情報については⁴⁵ を参照)。アダプターのトリミングとPCR重複の除去後、リードを参照ゲノムにマッピングし、ゲノムブラウザにアップロードすることができます。DRIPとsDRIPの一般的な期待出力を 図2Bに示します。DRIP出力は、ストランドの特異性を許容しないため、唯一の緑のトラックで表されますが、sDRIPは、赤と青でそれぞれ示される正と負のストランドへのRループマッピングを示します。RNase Hで前処理したサンプルに対応するコントロールトラックは、シグナルの明確な減少を示しており、RNA:DNAハイブリッド由来材料に対するこの手法の特異性を裏付けています。sDRIPによって許容される分解能の向上は、インプットDNA材料のサイズを比較すると明確に示されます(図2C)。sDRIP-seqの再現性、RNase H1前処理の世界的な影響、sDRIP-seqとDRIPc-seqの相関関係を 図2DのXYプロットで示しています。

図1:DRIP-seqおよびsDRIP-seqの手順の概要。 どちらのアプローチも、Rループを保存するために開発された同じDNA抽出ステップから始まります(Rループ内のRNA鎖は波線で表されます)。DRIP-seqでは、制限酵素を用いてゲノムを断片化し、多くの場合、キロベースサイズの断片を作り、その中に短いRループが埋め込まれます。sDRIP-seqでは、超音波処理によってゲノムが断片化され、その結果、断片が小さくなり、変位したRループの一本鎖がせん断され、失われます(破線で示されています)。S9.6抗体による免疫沈降後、DRIPは制限フラグメントに埋め込まれた3本鎖Rループを回収し、sDRIPはDNAの隣接性がほとんどない2本鎖RNA:DNAハイブリッドを回収し、より高い分解能を確保します。sDRIPの場合、RNA:DNAハイブリッドを二本鎖DNAに戻すためのライブラリ構築ステップを含める必要があります。ここに示すように、これはストランド固有のライブラリを構築する機会です。プロトコル自体に詳述されているように、RNase Hによる外因性治療は、両方の手順の特異性に対する重要な制御を表しています。ここには示されていません。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:Rループマッピング戦略の結果 (A)DRIPおよびsDRIP法(qPCRチェックステップ4.13に対応)を使用した免疫沈降の成功によるqPCRの結果。結果は、ヒトNtera-2細胞の陰性遺伝子座と2つの陽性遺伝子座(Rループが多発する RPL13A 遺伝子座と中等度にRループが起こりやすい TFPT 遺伝子座を含む)の2つの独立した実験から得られたものです。y軸は、インプットDNAのパーセンテージとしての免疫沈降の収量を示します。リカバリは SDRIPよりもDRIPの方がわずかに堅牢であることに注意してください。(B)ヒトNtera-2細胞を用いたR-loopマッピングの結果は、 CCND1 遺伝子と隣接する ORAOV1 遺伝子を中心とした領域で示されています。最初の2つのトラックは、それぞれRNase H処理なしとRNase H処理ありのDRIP-seq結果に対応しています。ゲノムの断片化に用いる制限酵素の位置を上部に示します。次の6つのトラックは、鎖特異的なsDRIP-seqの結果を(+)鎖と(-)鎖(それぞれ2回)に分け、示されているようにRNase Hで前処理したか、または示さなかったかを表しています。最後の4つのトラックは、高分解能ストランド特異的DRIPc-seq法によるRループマッピングの結果を表しています(Sanz et al., 2016;Sanz and Chedin, 2019)、ライブラリはRループのRNA鎖から構築されます。このように、 CCND1 遺伝子と ORAOV1 遺伝子は、それぞれ(+)鎖と(-)鎖にRループ形成をもたらし、その方向性と一致しています。RNase H処理により、予想通りシグナルがなくなります。(C)アガロースゲル電気泳動により材料を分離した後、制限酵素断片化後(左)および超音波処理後(右)のインプットDNA材料を示す。DNAラダーは100 bpのラダーに対応し、500 bpのバンドはアスタリスクで強調表示されます。(D)XYシグナル相関プロットは、sDRIP-seqの再現性(左)、RNase H1前処理に対するsDRIP-seqの全体的な感度(中央)、およびsDRIP-seqとDRIPc-seqの全体的な相関(右)を示しています。すべてのデータはNtera-2ヒト細胞からのものです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:PCRプログラムの設定。 PCRサイクルの期間と温度設定が一覧表示されます。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表2:ヒト細胞株のqPCRバリデーションに使用したプライマー。すべての配列は5'から3'の方向にリストされています。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ここでは、S9.6抗体を使用して任意の生物のRループ構造をマッピングするための2つのプロトコルについて説明します。DRIP-seqは、開発された最初のゲノムワイドRループマッピング技術です。これは、簡単で堅牢で再現性のある手法であり、任意のゲノムに沿ってRループの分布をマッピングできます。sDRIP-seqと呼ばれる2番目の技術も堅牢で再現性がありますが、超音波処理ステップとストランドシーケンシングライブラリ構築プロトコルが含まれているため、より高い分解能とストランド特異性が達成されます。どちらの手法も、免疫沈降前のRNase H処理に対して非常に感度が高く、シグナルが主に本物のRNA:DNAハイブリッドに由来することが確認されています。最後に、Rループ陽性遺伝子座とRループ陰性遺伝子座の免疫沈降収量を比較すると、どちらの手法もいくつかのヒト細胞株で最大100倍の違いを示し、低いバックグラウンドで高い特異性マッピングを提供します。

どの方法を実装するかを検討する際には、それぞれの長所と制限を考慮すると便利です。前述のように、DRIP-seqは低解像度のマップを生成し、Rループ形成の撚り線に関する情報を提供しません。解像度が低いのは、主にREを使用してゲノムを断片化した結果です。この穏やかな方法は、Rループの保存に最も適しており、それによってそのような構造の卓越した回復を可能にし、DRIP-seqを非常に堅牢にします。高い回収率を維持しながら解像度が制限されるという問題を回避するために、REカクテルを適合させたり、異なるREカクテルから生じるマップを組み合わせて分解能^{を向上させることができる16}。DRIP-seqの分解能を向上させるために4bpカッターを使用する技術が開発されており、ストランド特異的マッピング^22,55を達成できる可能性がありますが、結果として得られるデータセットはまだ他のヒトデータセットと体系的に比較されていません。REベースのアプローチでは、より大きなフラグメントは複数のRループ形成領域を運ぶことができるため、より効率的に回収される傾向があることに注意することが重要です。このバイアスは、DRIP-seqデータセットを解析する際に考慮する必要があります。同様に、DRIP-seqデータのピークコールは、免疫沈降されるのはこれらのフラグメントであり、これらのフラグメント内のRループの位置を推測できないため、最終的にはRループ陽性REフラグメントに変換する必要があります。一般に、ユーザーはまずREベースのDRIP-seqを採用して、図2Aに示した収率を達成するための方法を学び、自信を深めることをお勧めします。sDRIP-seqは通常、収量が低くなり、訓練を受けていない手ではS/N比の低いマップになる可能性があります。ゲノムを断片化する手段として超音波処理を使用すると、REフラグメントの大部分を構成する非Rループ部分が切断され、S9.6が主にRループ部分を取り出すことができるため、解像度が大幅に向上します(図1)。超音波処理がRループの変位したssDNA鎖を切断することに注目する価値があります。したがって、シーケンシングライブラリを構築する前に、これらのハイブリッドをdsDNAに戻す超音波処理DNA:RNAハイブリッドを免疫沈降した後に、第2鎖合成を追加することが不可欠です。このステップを行わないと、dsDNAアダプターにライゲーションできるフラグメントは、バックグラウンドのdsDNAフラグメントのみになります。したがって、結果のマップには信号がありません。ストランド特異性は、Rループ形成メカニズムの理解にさらに多くの利点をもたらし、sDRIP-seqをRループの研究に最適な方法にしています。

重要なことに、DRIP-seqおよびsDRIP-seqを介して取得されたマップは、細胞集団を介したRループの平均分布を表しています。したがって、個々の R ループの長さと位置は、これらの手法では対処できません。このために、単一分子Rループフットプリント(SMRF-seq)¹²と呼ばれる独立した補完的な方法を活用して、個々のRループを鎖特異的な方法で高分解能で明らかにすることができます。S9.6とは無関係に、20の異なる遺伝子座に対するSMRF-seqを用いたRループ形成の評価では、個々のRループフットプリントの収集とDRIPベースのアプローチによって収集された母集団平均分布との間に強い一致が見られ¹²、DRIPベースのアプローチを強力に支持していることが明らかになった。また、Rループマッピングデータは、Rループのゲノム分布のスナップショットを提供するだけで、Rループの形成、安定性、および分解能のダイナミクスに関する情報を提供しないことを考慮することも重要です。DRIPアプローチは、特定の薬物治療および時系列によるRループ分布の評価と組み合わせて、これらのパラメータ^17,53に対処するために展開することができる。R-loopプロファイリング手法の限界は、遺伝的、環境的、または薬理学的な摂動に応答して変化したR-ループ分布を特徴づけることを目標とする場合に、特に留意することが重要です。すでに上述したものに加えて、これらの構造の共転写性により、新生転写が本質的にRループの変化を引き起こすため、新生転写に対する可能な変化を考慮することが重要です。厳密なRループマッピングアプローチを開発するためのこれらの問題とガイドラインは^{広く議論されており}、読者はこれらの研究を参照することをお勧めします。

著者は、利益相反を宣言しません。

チェディン研究室での研究は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)からの助成金(R01 GM120607)によってサポートされています。