Mapeo de R-loops e híbridos de ARN:ADN con métodos de inmunoprecipitación basados en S9.6

Los bucles R constituyen una clase prevalente de estructuras de ADN no B impulsadas por la transcripción que se producen en todos los genomas dependiendo de la secuencia de ADN y la favorabilidad topológica. En los últimos años, los bucles R se han implicado en una variedad de roles adaptativos y desadaptativos y se han relacionado con la inestabilidad genómica en el contexto de los trastornos humanos. Como consecuencia, el mapeo preciso de estas estructuras en los genomas es de gran interés para muchos investigadores. Aquí se describe DRIP-seq (inmunoprecipitación de ADN:ARN seguida de secuenciación de alto rendimiento). Es una técnica robusta y reproducible que permite un mapeo preciso y semicuantitativo de los bucles R. También se describe una iteración reciente del método en la que la fragmentación se logra mediante sonicación (sDRIP-seq), que permite el mapeo de bucles R específicos de la hebra y de alta resolución. Por lo tanto, sDRIP-seq aborda algunas de las limitaciones comunes del método DRIP-seq en términos de resolución y varado, lo que lo convierte en un método de elección para el mapeo de bucle R.

Los bucles R constituyen una clase prevalente de estructuras de ADN no B impulsadas por la transcripción que se producen en todos los genomas dependiendo de la secuencia de ADN y la favorabilidad topológica. En los últimos años, los bucles R se han implicado en una variedad de roles adaptativos y desadaptativos y se han relacionado con la inestabilidad genómica en el contexto de los trastornos humanos. Como consecuencia, el mapeo preciso de estas estructuras en los genomas es de gran interés para muchos investigadores. Aquí se describe DRIP-seq (inmunoprecipitación de ADN:ARN seguida de secuenciación de alto rendimiento). Es una técnica robusta y reproducible que permite un mapeo preciso y semicuantitativo de los bucles R. También se describe una iteración reciente del método en la que la fragmentación se logra mediante sonicación (sDRIP-seq), que permite el mapeo de bucles R específicos de la hebra y de alta resolución. Por lo tanto, sDRIP-seq aborda algunas de las limitaciones comunes del método DRIP-seq en términos de resolución y varado, lo que lo convierte en un método de elección para el mapeo de bucle R.

Los bucles R son estructuras de ácido nucleico tricatenario que se forman principalmente durante la transcripción tras la hibridación de la transcripción de ARN naciente con la cadena de ADN molde. Esto da como resultado la formación de un híbrido ARN:ADN y provoca el desplazamiento de la hebra de ADN no molde en un estado de bucle monocatenario. La reconstitución bioquímica ^1,2,3,4 y el modelado matemático⁵, en combinación con otras mediciones biofísicas ^6,7, han establecido que es más probable que ocurran bucles R en regiones que exhiben características favorables específicas. Por ejemplo, las regiones que muestran una asimetría de hebra en la distribución de guaninas (G) y citosinas (C) de modo que el ARN es rico en G, una propiedad llamada sesgo positivo de GC, se ven favorecidas para formar bucles R cuando se transcriben debido a la mayor estabilidad termodinámica del híbrido ADN:ARN en comparación con el dúplex de ADN⁸. Las regiones que han desarrollado un sesgo positivo de GC, como las primeras porciones de muchos genes eucariotas 4,9,10,11, son propensas a formar bucles R in vitro e in vivo ^3,4,12. La tensión superhelicoidal negativa del ADN también favorece en gran medida la formación de estructuras^13,14 porque los bucles R absorben eficientemente dichas tensiones topológicas y devuelven la fibra de ADN circundante a un estado relajado favorable ^5,15.

Históricamente, se consideraba que las estructuras de bucle R eran el resultado de entrelazamientos raros y espontáneos de ARN con ADN durante la transcripción. Sin embargo, el desarrollo de la inmunoprecipitación ADN:ARN (DRIP) junto con la secuenciación de ADN de alto rendimiento (DRIP-seq) permitió el primer mapeo de todo el genoma de los R-loops y reveló que esas estructuras son mucho más prevalentes de lo esperado en las células humanas ^4,16. Los bucles R ocurren en decenas de miles de puntos calientes genéticos conservados y transcritos en los genomas de los mamíferos, con una predilección por las islas CpG sesgadas por GC que se superponen al primer intrón de genes y las regiones terminales de^{numerosos genes.} En general, los bucles R ocupan colectivamente entre el 3% y el 5% del genoma de las células humanas, lo que coincide con las mediciones en otros organismos, como levaduras, plantas, moscas y ratones 18,19,20,21,22.

El análisis de los puntos calientes formadores de bucle R en células humanas reveló que tales regiones se asocian con firmas específicas de cromatina²³. Los bucles R, en general, se encuentran en regiones con menor ocupación de nucleosomas y mayor densidad de ARN polimerasa. En los promotores, los bucles R se asocian con un mayor reclutamiento de dos modificaciones de histonas depositadas cotranscripcionalmente, H3K4me1 y H3K36me3¹⁷. En los extremos de los genes, los bucles R se asocian con genes estrechamente dispuestos que experimentan una terminación de transcripción eficiente¹⁷, lo que concuerda con observaciones previas²⁴. También se demostró que los R-loops participan en el inicio de la replicación del ADN en los orígenes de replicación de los genomas de bacteriófagos, plásmidos, mitocondriales y levaduras 25,26,27,28,29,30,31. Además, el 76% de los promotores de islas CpG humanos propensos a los bucles R funcionan como orígenes de replicación constitutivos tempranos 32,33,34,35, lo que refuerza aún más las conexiones entre los bucles R y los orígenes de replicación. En conjunto, estos estudios sugieren que los bucles R representan un nuevo tipo de señal biológica que puede desencadenar salidas biológicas específicas de una manera dependiente del contexto²³.

Al principio, se demostró que se formaban bucles R en las secuencias de cambio de clase durante el proceso de recombinación de interruptores de clase de inmunoglobulinas ^3,36,37. Se cree que estos bucles R programados inician la recombinación de cambios de clase mediante la introducción de roturas de ADN bicatenario³⁸. Desde entonces, la formación dañina de R-loops, generalmente entendida como el resultado de una formación excesiva de R-loops, se ha relacionado con la inestabilidad genómica y procesos como la hiperrecombinación, las colisiones transcripción-replicación, la replicación y el estrés transcripcional (para revisión 39,40,41,42,43). Como consecuencia, el mapeo mejorado de las estructuras del bucle R representa un desafío emocionante y esencial para descifrar mejor la distribución y la función de estas estructuras en la salud y la enfermedad.

La inmunoprecipitación ADN:ARN (DRIP) se basa en la alta afinidad del anticuerpo monoclonal S9.6 para los híbridos ADN:ARN⁴⁴. DRIP-seq permite un perfil robusto de todo el genoma de la formación de bucles R ^4,45. Si bien es útil, esta técnica sufre de una resolución limitada debido al hecho de que se utilizan enzimas de restricción para lograr una fragmentación suave del ADN. Además, DRIP-seq no proporciona información sobre la direccionalidad de la formación de R-loop. Aquí, reportamos una variante de DRIP-seq que permite el mapeo de R-loops a alta resolución de una manera específica para cada cadena. Este método se basa en la sonicación para fragmentar el genoma antes de la inmunoprecipitación y, por lo tanto, el método se denomina sDRIP-seq (inmunoprecipitación de ADN por ARN en sonicación junto con secuenciación de alto rendimiento) (Figura 1). El uso de la sonicación permite una mayor resolución y limita los sesgos de fragmentación ligados a enzimas de restricción observados en los enfoques de DRIP-seq⁴⁶. sDRIP-seq produce mapas de bucle R que concuerdan fuertemente con los resultados tanto de DRIP-seq como del método DRIPc-seq de alta resolución descrito anteriormente, en el que las bibliotecas de secuenciación se construyen a partir de las hebras de ARN de estructuras de bucle R inmunoprecipitadas⁴⁵.

Frente a una gran cantidad de métodos para elegir, los usuarios pueden preguntarse qué enfoque particular basado en DRIP es preferible para sus necesidades. Te ofrecemos los siguientes consejos. DRIP-seq, a pesar de sus limitaciones, es técnicamente más fácil y es el más robusto (rendimientos más altos) de los tres métodos discutidos aquí; Por lo tanto, sigue siendo ampliamente útil. Se han publicado numerosos conjuntos de datos DRIP-seq, que proporcionan un punto de comparación útil para nuevos conjuntos de datos. Por último, la canalización de análisis bioinformático es más sencilla ya que los datos no están varados. Se recomienda que los nuevos usuarios comiencen a perfeccionar sus habilidades de mapeo de bucle R con DRIP, seguido de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) y DRIP-seq. sDRIP-seq representa un grado ligeramente mayor de dificultad técnica: los rendimientos se reducen ligeramente debido a la sonicación (comentada más adelante) y el proceso de la biblioteca de secuenciación es ligeramente más complejo. Sin embargo, la ganancia de varado y mayor resolución es invaluable. Se observa que sDRIP-seq capturará tanto híbridos de ARN:ADN de dos cadenas como bucles R de tres cadenas. Debido a los pasos de construcción de la biblioteca, DRIP-seq no capturará híbridos de ARN:ADN de dos cadenas. DRIPc-seq es el más exigente técnicamente y requiere una mayor cantidad de materiales de partida. A cambio, ofrece la mayor resolución y varado. Debido a que las bibliotecas de secuenciación se construyen a partir de la fracción de ARN de R-loops o híbridos, DRIPc-seq puede sufrir una posible contaminación por ARN, especialmente porque S9.6 posee afinidad residual por dsRNA 19,47,48. sDRIP-seq permite el mapeo de alta resolución específico de la cadena sin preocuparse por la contaminación del ARN, ya que las bibliotecas de secuenciación se derivan de las cadenas de ADN. En general, estos tres métodos siguen siendo útiles y presentan diferentes grados de complejidad y advertencias ligeramente diferentes. Los tres, sin embargo, producen conjuntos de datos altamente congruentes⁴⁸ y son altamente sensibles al pretratamiento de RNasa H, lo que representa un control esencial para garantizar la especificidad de la señal^45,49. Se observa que, dada la selección de tamaño impuesta a las bibliotecas de secuenciación, se excluirán los híbridos pequeños (estimados <75 pb), como los que se forman transitoriamente alrededor de los sitios de cebado de replicación del ADN de hebras rezagadas (cebadores de Okazaki). Del mismo modo, dado que todos los métodos de goteo implican la fragmentación del ADN,^{se perderán} los bucles R inestables que requieren un superenrollamiento negativo del ADN para su estabilidad. Por lo tanto, los enfoques de DRIP pueden subestimar las cargas de los bucles R, especialmente para los bucles R cortos e inestables que pueden capturarse mejor utilizando enfoques in vivo ^45,48. Se observa que los bucles R también se pueden perfilar de manera independiente de S9.6 con cobertura profunda, alta resolución y de manera específica de la cadena en moléculas individuales de ADN después del tratamiento con bisulfito de sodio¹². Además, se han empleado estrategias que utilizan una enzima RNasa H1 catalíticamente inactiva para mapear los bucles R nativos in vivo, destacando los bucles R cortos e inestables que se forman principalmente en los promotores en pausa 50,51,52.

El siguiente protocolo está optimizado para la línea celular humana Ntera-2 cultivada, pero se ha adaptado con éxito sin modificaciones a una serie de otras líneas celulares humanas (HEK293, K562, HeLa, U2OS), células primarias (fibroblastos, células B), así como en otros organismos con pequeñas modificaciones (ratones, moscas).

1. Recolección y lisis celular

1. Cultivo de células Ntera-2 con una confluencia del 75%-85%. Asegúrese de que el recuento óptimo de células sea de 5 a 6 millones de células con recuentos viables del >90% para iniciar cualquier procedimiento de goteo.
2. Lavar las células una vez con 1x PBS, añadir 1,5 mL de tripsina-EDTA 1x y, a continuación, incubar durante 2 min a 37 °C hasta que las células se disocien de la placa.
3. Agregue 5 mL de medio tibio y pipetee bien para resuspender las células en una suspensión de una sola célula. Transfiera el contenido a un nuevo tubo de 15 ml y granule suavemente las células a 300 x g durante 3 minutos.
4. Lave las células una vez con 5 mL de 1x PBS y granule suavemente las células a 300 x g durante 3 min.
5. Vuelva a suspender completamente las células en 1,6 mL de tampón TE (10 mM de Tris-Cl pH 7,5, 1 mM EDTA pH 8,0). Añadir 5 μL de proteinasa K (20 mg/ml de solución madre) y 50 μL de SDS (20% de solución madre) e invertir suavemente los tubos cinco veces hasta que la solución se vuelva viscosa. No intente pipetear la solución, solo mezcle por inversión.
6. Incubar los tubos durante la noche a 37 °C.

2. Extracción de ADN

1. Vierta el lisado de ADN en un tubo de gel de bloqueo de fase de alta densidad de 15 mL prehilado y agregue 1 volumen (1,6 mL) de alcohol isoamílico de fenol/cloroformo (25:24:1). Invierta suavemente cinco veces y gire a 1.500 x g durante 5 minutos.
2. Agregue 1/10 de volumen de acetato de sodio (NaOAc) 3 M (pH 5.2) y 2.5 volúmenes de etanol al 100% a un nuevo tubo de 15 mL. Vierta en la fase acuosa superior del tubo de gel de bloqueo de fase e invierta suavemente hasta que el ADN esté completamente precipitado (hasta 10 minutos).
3. Enrolle los hilos de ADN con una punta de 1.000 μL de diámetro ancho y transfiéralos a un tubo limpio de 2 mL teniendo cuidado de no arrastrar el sobrenadante residual.
4. Lave el ADN añadiendo 1,5 ml de etanol al 80% e invierta suavemente el tubo cinco veces. Incubar durante 10 min.
5. Repita el paso anterior dos veces. No centrifugar durante los pasos de lavado. Retire con cuidado la mayor cantidad de etanol posible pipeteando después del último lavado mientras intenta no alterar el ADN.
6. Deje que el ADN se seque completamente al aire mientras invierte el tubo. Este paso puede durar entre 30 min y 1 h dependiendo de la cantidad de ADN.
7. Añadir 125 μL de tampón TE directamente sobre la pastilla de ADN para fragmentar el ADN mediante la digestión de la enzima de restricción o 100 μL de tampón TE para cizallar el ADN mediante sonicación. Mantener en hielo durante 1 h y resuspender suavemente el ADN pipeteando varias veces con una punta de 200 μL de diámetro ancho. Dejar actuar en hielo durante 1 h antes de iniciar la etapa de fragmentación.

3. Fragmentación del ADN

NOTA: Para DRIP-seq basado en enzimas de restricción, siga el paso 3.1. Para el DRIP-seq basado en sonicación, vaya al paso 3.2.

1. Fragmentación de la enzima de restricción (RE)
   1. Digiera el ADN genómico resuspendido (muy viscoso) utilizando un cóctel de REs de acuerdo con las instrucciones del proveedor.
      1. Añadir 0,1 mM de espermidina a la reacción final. Utilice un cóctel de 4-5 enzimas con 30 U de cada enzima en un volumen total de 150 μL.
         NOTA: El cóctel inicial para DRIP-seq (HindIII, SspI, EcoRI, BsrGI, XbaI)⁴ se desarrolló para generar una longitud promedio de fragmento de 5 kilobases. Evite cualquier interferencia con la metilación de CpG y evite las regiones ricas en GC del genoma. Otros cócteles también son posibles¹⁶). Estos cócteles son adecuados tanto para el genoma humano como para el del ratón, pero se pueden ajustar según sea necesario.
      2. Incubar la mezcla de reacción durante la noche a 37 °C.
         NOTA: La mezcla de ADN después de la digestión ya no debe ser viscosa. Cualquier viscosidad restante en este paso es indicativa de una digestión incompleta.
      3. Si se observa, agregue 10 U adicionales de cada enzima e incube durante otras 2-4 h a 37 °C.
         NOTA: Es posible que los usuarios no digieran todo el pellet en caso de que hayan cosechado más células de las recomendadas aquí.
   2. Pipetear suavemente el ADN digerido durante la noche (150 μL) en un tubo de luz de gel de bloqueo de fase de 2 ml prehilado. Añadir 100 μL de agua y un volumen (250 μL) de fenol/cloroformo alcohol isoamílico (25:24:1). Invierta suavemente cinco veces y gire hacia abajo a 16,000 x g durante 10 minutos.
   3. Añadir 1,5 μL de glucógeno, 1/10 de volumen de 3 M de NaOAc (pH 5,2) y 2,5 volúmenes de etanol 100% a un nuevo tubo de 1,5 mL. Pipetear el ADN del tubo de gel de bloqueo de fase y mezclar invirtiendo cinco veces. Incubar durante 1 h a -20 °C.
   4. Centrifugar a 16.000 x g durante 35 min a 4 °C. Lavar el ADN con 200 μL de etanol al 80% y centrifugar a 16.000 x g durante 10 min a 4 °C.
   5. Seque el pellet al aire y añada 50 μL de tampón TE al pellet. Deje el tubo en hielo durante 30 minutos y vuelva a suspender suavemente el ADN.
   6. Mida la concentración (OD₂₆₀) del ADN fragmentado utilizando un espectrofotómetro.
   7. Opcional pero recomendado: Cargue 1 μg de ADN digerido en un gel de agarosa al 0,8% junto con un marcador de tamaño para verificar que la digestión se ha completado. Deje correr el gel durante una hora a 100 V.
      NOTA: Si está incompleto, se puede agregar una enzima adicional. La digestión incompleta puede llevar a la pérdida de resolución después de la inmunoprecipitación.
   8. Después de este paso, tratar 10 μg de ADN digerido con 4 μL de ribonucleasa H (RNasa H) durante 1-2 h a 37 °C para asegurarse de que la señal recuperada tras la inmunoprecipitación se deriva de híbridos de ADN:ARN. A continuación, proceda a la inmunoprecipitación de S9.6 (paso 4).
      NOTA: El ADN digerido puede mantenerse congelado a -80 °C durante un máximo de un mes sin pérdida significativa de rendimiento.
2. Sonicación
   1. Sonicar todo o parte del ADN extraído en un tubo de microcentrífuga de 0,5 mL en un volumen total de 100 μL. Realice 15-20 ciclos de 30 s ON / 30 s OFF en un sonicador (gire después de 5, 10 y 15 ciclos para garantizar una sonicación homogénea).
   2. Mida la concentración (OD₂₆₀) de ADN sonicado en un espectrofotómetro.
      NOTA: En este paso, la viscosidad del ADN debería haber desaparecido.
   3. Ejecute un gel de agarosa para confirmar la distribución del tamaño del ADN sonicado (300-500 pb).
      NOTA: La sobresonicación del ADN puede provocar una reducción significativa del rendimiento derivada de la rotura y disociación de las estructuras del bucle R.
   4. Después de este paso, tratar 10 μg de ADN sonicado con 4 μL de ARNasa H durante 1-2 h a 37 °C para asegurarse de que la señal recuperada tras la inmunoprecipitación se deriva de híbridos de ADN:ARN. A continuación, proceda a la inmunoprecipitación de S9.6 (paso 4).

4. Inmunoprecipitación S9.6

NOTA: Los pasos de inmunoprecipitación son similares independientemente de si el ADN se fragmentó a través de ER o sonicación.

1. Prepare tres tubos y una alícuota de 4,4 μg de ADN fragmentado en un volumen final de 500 μL de tampón TE por tubo. Guarde 50 μL (1/10 del volumen) de cada tubo para usarlo más tarde como ADN de entrada.
2. Añadir 50 μL de tampón de unión 10x (100 mM de NaPO4 pH 7, 1,4 M de NaCl, 0,5% de Triton X-100) y 10 μL de anticuerpo S9.6 (1 mg/mL) a los 450 μL del ADN diluido.
3. Incubar durante la noche a 4 °C en un rotor de minitubos a 7-10 rpm.
4. Para cada tubo, lavar 50 μL de lechada de perlas de agarosa Protein A/G con 700 μL de tampón de unión 1x invirtiendo los tubos en un mini-rotador a 7-10 rpm a temperatura ambiente durante 10 min. Gire las cuentas a 1.100 x g durante 1 minuto y deseche el sobrenadante. Repita este paso una vez.
5. Añadir el ADN del paso 4.3 a los 50 μL de perlas e incubar durante 2 h a 4 °C mientras se invierte a 7-10 rpm en un mini-rotador.
6. Girar las perlas durante 1 minuto a 1.100 x g y desechar el sobrenadante.
7. Lave las perlas con 750 μL de tampón de unión 1x invirtiendo a 7-10 rpm en un mini-rotador durante 15 min. Girar durante 1 minuto a 1.100 x g y desechar el sobrenadante. Repita este paso una vez.
8. Añadir 250 μL del tampón de elución (50 mM de Tris-Cl pH 8, 10 mM de EDTA pH 8, 0,5% SDS) y 7 μL de proteinasa K (20 mg/mL de caldo) a las perlas e incubar con rotación a 55 °C (12 rpm) durante 45 min.
9. Girar las cuentas durante 1 minuto a 1.100 x g. Transfiera el sobrenadante a un tubo de luz de gel de bloqueo de fase de 2 mL prehilado y agregue un volumen (250 μL) de alcohol isoamílico fenol/cloroformo (25:24:1). Invierta los tubos cinco veces y gírelos durante 10 minutos a 16.000 x g a temperatura ambiente.
10. Añadir 1,5 μL de glucógeno, 1/10 de volumen de NaOAc 3M (pH 5,2) y 2,5 volúmenes de etanol al 100% a un nuevo tubo de 1,5 mL. Pipetear el ADN del tubo de gel de bloqueo de fase y mezclar invirtiendo cinco veces. Incubar durante 1 h a -20 °C.
11. Centrifugar a 16.000 x g durante 35 min a 4 °C. Lavar el ADN con 200 μL de etanol al 80% y centrifugar a 16.000 x g durante 10 min a 4 °C.
12. Secar al aire los pellets y añadir 15 μL de 10 mM de Tris-Cl (pH 8) en cada tubo. Deje los tubos en hielo durante 20 minutos y vuelva a suspenderlos suavemente. Combine el contenido de los tres tubos en un solo tubo (45 μL).
13. Compruebe la eficiencia del goteo mediante qPCR utilizando 5 μL de los 45 μL de ADN resuspendido (ver Resultados representativos). Diluir los 5 μL en 10 μL de agua y utilizar 2 μL por reacción.

5. Paso previo a la biblioteca solo para ADN sonicado

NOTA: La sonicación hace que la hebra desplazada de ssDNA de los bucles R se rompa. Así, las estructuras de bucle R de tres cadenas se convierten en híbridos de ADN:ARN de dos cadenas tras la sonicación. Como resultado, estos híbridos ADN:ARN deben convertirse de nuevo en ADN bicatenario antes de la construcción de la biblioteca. Aquí, se emplea un segundo paso de síntesis de hebras. Un enfoque alternativo que se ha utilizado con éxito es realizar una ligadura de ADN monocatenario seguida de una síntesis de segunda cadena⁵³.

1. A los 40 μL de ADN DRIP del paso 4.12, agregue 20 μL de tampón de segunda cadena 5x (200 mM de Tris pH 7, 22 mM MgCl₂, 425 mM KCl), 10 mM de mezcla de dNTP (dATP, dCTP, dGTP y dTTT o dUTP si el usuario planea lograr una secuenciación de DRIP específica de la cadena), 1 μL 16 mM de NAD, y 32 μL de agua. Mezclar bien e incubar durante 5 min en hielo.
2. Añadir 1 μL de ADN polimerasa I (10 unidades), 0,3 μL de RNasa H (1,6 unidades) y 0,5 μL de ADN ligasa de E. coli . Mezclar e incubar a 16 °C durante 30 min.
3. Limpie inmediatamente la reacción utilizando perlas paramagnéticas con una proporción de 1,6x. Eluir el ADN en 40 μL de Tris-Cl de 10 mM (pH 8).

6. Paso de sonicación previa a la biblioteca solo para RE DNA

NOTA: El goteo conduce a la recuperación de fragmentos de RE que a menudo tienen kilobases de longitud y, por lo tanto, no son adecuados para la construcción inmediata de bibliotecas.

1. Para reducir el tamaño del material para la construcción de bibliotecas, sonicar el ADN inmunoprecipitado en un tubo de microcentrífuga de 0,5 mL. Realice 12 ciclos de 15 s ON / 60 s OFF en un sonicador (gire después de seis ciclos para garantizar una sonicación homogénea). Continúe con el paso 7.
   NOTA: El material inmunoprecipitado sigue llevando los bucles R de tres hebras que responden a la sonicación de forma diferente a la del ADN bicatenario que flanquea.
2. Paso opcional: Para igualar los perfiles de goteo, tratar el material inmunoprecipitado con 1 μL de RNasa H en 1x tampón de RNasa H durante 1 h a 37 °C antes de la sonicación.

7. Construcción de la biblioteca

1. Realice la reparación del extremo añadiendo a los 40 μL del paso 4.12 (fragmentación de RE) o del paso 5.3 (cizallamiento por sonicación) 5 μL de tampón del módulo de reparación de extremos 10x, 2,5 μL de ATP de 10 mM y 2,5 μL de enzima del módulo de reparación de extremos (50 μL en total). Mezclar bien e incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Incluya 1 μg de ADN de entrada RE-digerido y sonicado (DRIP) o sonicado (sDRIP) para crear bibliotecas de secuenciación de control correspondientes al ADN de entrada.
2. Limpie la reacción utilizando perlas paramagnéticas (relación 1,6x) y eluya en 34 μL de 10 mM de Tris-Cl (pH 8).
3. Realice la cola A añadiendo 5 μL de tampón 2, 10 μL de 1 mM de dATP y 1 μL de Klenow exo- (50 μL en total). Mezclar bien e incubar la mezcla durante 30 min a 37 °C.
4. Limpie la reacción utilizando perlas paramagnéticas (relación 1,6x) y eluya en 12 μL de 10 mM de Tris-Cl (pH 8).
5. Ligate adaptadores añadiendo 15 μL de tampón de ligadura rápida 2x, 1 μL de adaptadores de 15 μM y 2 μL de ligasa rápida (30 μL en total). Mezclar bien e incubar durante 20 min a temperatura ambiente.
6. Limpie la reacción utilizando perlas paramagnéticas (relación 1x) y eluya en 20 μL de 10 mM de Tris-Cl (pH 8).
7. Si se ha realizado un cizallamiento por sonicación y se ha utilizado dUTP en el paso 5.1, añadir 1,5 μL (1,5 U) de uracilo N-glicosilasa e incubar durante 30 min a 37 °C para obtener un DRIP específico de la cadena.
8. La PCR amplifica 10 μL de la biblioteca desde el paso 6.6 o 6.7. Agregue 1 μL de cebador de PCR 1.0 P5 (ver Tabla de Materiales), 1 μL de cebador de PCR 2.0 P7 (ver Tabla de Materiales), 15 μL de mezcla maestra y 3 μL de agua. Mezclar bien.
9. En un termociclador, ejecute el programa como se muestra en la Tabla 1.
10. Proceda a una limpieza de dos pasos de la biblioteca utilizando perlas paramagnéticas. En primer lugar, utilice una relación de 0,65x para eliminar fragmentos de más de 500 pb. Conserva el sobrenadante. Proceda a una proporción de 1x en el sobrenadante para eliminar los fragmentos por debajo de 200 pb. Eluir en 12 μL de 10 mM de Tris-HCl (pH 8).

8. Control de calidad

1. Para comprobar el enriquecimiento del bucle R con qPCR en dos loci negativos y tres positivos utilizando el método Pfaffl, utilice 1 μL de la biblioteca de limpieza del paso 6.10. Diluir 1 μL de la biblioteca en 10 μL de agua y utilizar 2 μL por locus.
2. Compruebe la distribución de tamaños de la biblioteca limpiada del paso 6.10 utilizando un kit de ADN de alta sensibilidad.

Tanto el DRIP como el sDRIP pueden analizarse mediante qPCR (Figura 2A) y/o secuenciación (Figura 2B). Después de la etapa de inmunoprecipitación, la calidad del experimento debe confirmarse primero mediante qPCR en loci de control positivos y negativos, así como con controles tratados con RNasa H. En la Tabla 2 se proporcionan cebadores correspondientes a loci de uso frecuente en múltiples líneas celulares humanas. Los resultados de la qPCR deben mostrarse como un porcentaje de entrada, que corresponde al porcentaje de células que llevan un bucle R en el momento de la lisis para un locus determinado. En un experimento de DRIP exitoso, el rendimiento para los loci negativos debe ser inferior al 0,1%, mientras que los loci positivos pueden variar desde el 1% hasta más del 10% para los loci altamente transcritos como RPL13A (Figura 2A). En el caso de sDRIP, los rendimientos suelen ser más bajos (20%-50%) a juzgar por DRIP-qPCR, pero parecen afectar a la recuperación de manera uniforme, de modo que ningún subconjunto particular de bucles R se ve afectado más que otro. Como resultado, los mapas derivados de DRIP, sDRIP y DRIPc concuerdan bien (Figura 2B). Los datos de qPCR también se pueden mostrar como un enriquecimiento del porcentaje de entrada para loci positivos sobre loci negativos, evaluando así la especificidad del experimento. Los enriquecimientos de pliegues suelen oscilar entre un mínimo de 10 veces y más de 200 veces, dependiendo de los loci elegidos para el análisis. Cuando se requiere una cuantificación precisa en múltiples muestras que representan caídas de genes, eliminaciones o varios tratamientos farmacológicos, se recomienda encarecidamente el uso de picos en los controles para normalizar la variación experimental entre muestras. Tales espigas pueden corresponder a híbridos sintéticos⁵³ o genomas de especies no relacionadas⁵⁴.

Los materiales DRIP y sDRIP se pueden secuenciar utilizando estrategias de secuenciación de extremo único o emparejado. Los datos se pueden extraer y analizar de manera similar a la mayoría de los datos de ChIP utilizando canalizaciones computacionales estándar (consulte⁴⁵ para obtener información relevante para DRIP). Después del recorte del adaptador y la eliminación de los duplicados de PCR, las lecturas se pueden asignar a un genoma de referencia y cargarse en un navegador de genoma. En la Figura 2B se muestra una salida esperada típica de DRIP y sDRIP. La salida de DRIP está representada por la única pista verde, ya que no permite la especificidad de la hebra, mientras que sDRIP muestra la asignación del bucle R a las hebras positivas y negativas indicadas respectivamente en rojo y azul. Las pistas de control correspondientes a una muestra pretratada con RNasa H muestran una clara reducción de las señales, lo que confirma la especificidad de la técnica para materiales derivados de híbridos de ARN:ADN. Las ganancias en la resolución permitidas por sDRIP se ilustran claramente cuando se comparan los tamaños del material de ADN de entrada (Figura 2C). La reproducibilidad de sDRIP-seq, junto con el impacto global del pretratamiento de RNasa H1 y la correlación entre sDRIP-seq y DRIPc-seq se representan mediante gráficos XY en la Figura 2D.

Figura 1: Descripción general de los procedimientos DRIP-seq y sDRIP-seq. Ambos enfoques comienzan con los mismos pasos de extracción de ADN desarrollados para preservar los bucles R (las hebras de ARN dentro de los bucles R están representadas por líneas onduladas). Para DRIP-seq, el genoma se fragmenta utilizando enzimas de restricción, lo que a menudo resulta en fragmentos del tamaño de una kilobase dentro de los cuales se incrustan bucles R más cortos. En el caso de sDRIP-seq, el genoma se fragmenta mediante sonicación, lo que da lugar a fragmentos más pequeños y al cizallamiento y pérdida de la cadena única desplazada de los bucles R (indicada por líneas discontinuas). Después de la inmunoprecipitación con el anticuerpo S9.6, DRIP conduce a la recuperación de bucles R tricatenarios incrustados dentro de fragmentos de restricción, mientras que sDRIP recupera híbridos de ARN:ADN bicatenarios con poco ADN flanqueante, lo que garantiza una mayor resolución. En el caso de sDRIP, se debe incluir un paso de construcción de biblioteca para convertir los híbridos de ARN:ADN de nuevo en ADN dúplex. Como se muestra aquí, esta es una oportunidad para crear bibliotecas específicas de la cadena. Tal y como se detalla en el propio protocolo, el tratamiento exógeno con RNasa H representa un control clave para la especificidad de ambos procedimientos; no se muestran aquí. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Resultado de las estrategias de mapeo de R-loop. (A) La qPCR es el resultado de inmunoprecipitaciones exitosas utilizando el método DRIP y sDRIP (correspondiente al paso de verificación 4.13 de qPCR). Los resultados provienen de dos experimentos independientes de células humanas Ntera-2 con un locus negativo y dos loci positivos, incluido el locus RPL13A altamente propenso al bucle R y el locus TFPT moderadamente propenso al bucle R. El eje Y indica el rendimiento de la inmunoprecipitación como porcentaje del ADN de entrada. Tenga en cuenta que la recuperación es ligeramente más robusta para DRIP que para sDRIP. (B) Los resultados del mapeo de bucle R realizado en células humanas Ntera-2 se muestran en una región centrada alrededor de los genes CCND1 y ORAOV1 vecinos. Las dos primeras pistas corresponden a los resultados de DRIP-seq, sin y con tratamiento con RNasa H, respectivamente. La posición de las enzimas de restricción utilizadas para fragmentar el genoma se muestra en la parte superior. Las siguientes seis pistas representan los resultados de la secuenciación sDRIP-seq específica de la cadena, desglosada entre hebras (+) y (-) (dos réplicas cada una) y pretratadas con RNasa H, o no, según se indique. Las últimas cuatro pistas representan los resultados del mapeo de bucle R a través del método DRIPc-seq específico de hebra de alta resolución (Sanz et al., 2016; Sanz y Chedin, 2019), donde las bibliotecas se construyen a partir de las hebras de ARN de los bucles R. Como se puede ver claramente, los genes CCND1 y ORAOV1 conducen a la formación de bucles R en las hebras (+) y (-), respectivamente, lo que es consistente con su direccionalidad. El tratamiento con RNasa H suprime la señal, como se esperaba. (C) Los materiales de ADN de entrada después de la fragmentación de la enzima de restricción (izquierda) y la sonicación (derecha) se muestran después de que los materiales se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa. La escalera de ADN corresponde a una escalera de 100 pb y la banda de 500 pb está resaltada con un asterisco. (D) Se muestran gráficos de correlación de señales XY para ilustrar la reproducibilidad de sDRIP-seq (izquierda), la sensibilidad general de sDRIP-seq al pretratamiento de RNasa H1 (centro) y la correlación global entre sDRIP-seq y DRIPc-seq (derecha). Todos los datos provienen de células humanas Ntera-2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Configuración del programa de PCR. Se enumeran los ajustes de duración y temperatura para los ciclos de PCR. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Primers utilizados para la validación de qPCR en líneas celulares humanas. Todas las secuencias se enumeran en la dirección de 5' a 3'. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Aquí se describen dos protocolos para mapear las estructuras del bucle R en potencialmente cualquier organismo que utilice el anticuerpo S9.6. DRIP-seq representa la primera técnica de mapeo de bucle R de todo el genoma desarrollada. Es una técnica fácil, robusta y reproducible que permite mapear la distribución de los bucles R a lo largo de cualquier genoma. La segunda técnica, denominada sDRIP-seq, también es robusta y reproducible, pero logra una mayor resolución y especificidad de hebra gracias a la inclusión de un paso de sonicación y un protocolo de construcción de bibliotecas de secuenciación trenzada. Ambas técnicas son altamente sensibles al tratamiento con RNasa H antes de la inmunoprecipitación, lo que confirma que la señal se deriva principalmente de híbridos genuinos de ARN:ADN. Por último, al comparar los rendimientos de inmunoprecipitación entre los loci positivos para el bucle R y los negativos para el bucle R, ambas técnicas ofrecen una diferencia de hasta 100 veces en varias líneas celulares humanas, lo que proporciona un mapeo de alta especificidad con un fondo bajo.

Al considerar qué método implementar, es útil considerar sus respectivas fortalezas y limitaciones. Como se señaló anteriormente, DRIP-seq produce mapas con una resolución más baja y no proporciona información sobre la varada de la formación de R-loop. La menor resolución es principalmente producto del uso de REs para fragmentar el genoma. Este método suave es el mejor para preservar los bucles R, lo que permite una recuperación insuperable de dichas estructuras y hace que DRIP-seq sea muy robusto. Para evitar el problema de la resolución limitada y al mismo tiempo preservar una alta recuperación, se pueden adaptar los cócteles de ER y/o combinar los mapas resultantes de diferentes cócteles de RE para mejorar la resolución¹⁶. Se ha desarrollado una técnica que utiliza cortadores de 4 pb para mejorar la resolución de DRIP-seq y puede lograr un mapeo específico de la hebra^22,55, aunque los conjuntos de datos resultantes aún no se han comparado sistemáticamente con otros conjuntos de datos humanos. Es importante tener en cuenta que en los enfoques basados en RE, los fragmentos más grandes tienden a recuperarse de manera más eficiente porque pueden transportar múltiples regiones de formación de bucle R. Este sesgo debe tenerse en cuenta al analizar los conjuntos de datos DRIP-seq. De manera similar, la llamada de picos para los datos de DRIP-seq debe traducirse en última instancia en fragmentos de RE positivos para el bucle R, ya que son estos fragmentos los que están inmunoprecipitados y no se puede inferir la posición de los bucles R dentro de estos fragmentos. En general, se recomienda que los usuarios adopten primero DRIP-seq basado en RE para aprender el método y aumentar su confianza en el logro de los rendimientos documentados en la Figura 2A. Por lo general, sDRIP-seq da como resultado rendimientos más bajos, lo que podría resultar en mapas con relaciones señal-ruido más bajas en manos no entrenadas. El uso de la sonicación como medio para fragmentar el genoma ofrece a cambio una gran mejora en la resolución, ya que las partes no en bucle R que suelen constituir la mayoría de los fragmentos de RE se romperán, lo que permitirá a S9.6 recuperar principalmente las partes en bucle R (Figura 1). Vale la pena señalar que la sonicación hace que la hebra de ssDNA desplazada de los bucles R se rompa. Por lo tanto, es esencial añadir una segunda síntesis de hebra después de la inmunoprecipitación de híbridos de ADN:ARN sonicados, que convertirá estos híbridos de nuevo en dsDNA, antes de construir bibliotecas de secuenciación. Sin este paso, los únicos fragmentos que se pueden ligar a los adaptadores de dsDNA serán los fragmentos de dsDNA de fondo; Por lo tanto, los mapas resultantes estarán desprovistos de cualquier señal. La especificidad de la hebra proporciona numerosos beneficios adicionales para la comprensión de los mecanismos de formación de bucles R, lo que hace que sDRIP-seq sea un método de elección para el estudio de los bucles R.

Es importante destacar que los mapas obtenidos a través de DRIP-seq y sDRIP-seq representan la distribución promedio de los bucles R a través de una población de células; por lo tanto, la longitud y la posición de los bucles R individuales no se pueden abordar con esas técnicas. Para ello, se puede aprovechar un método independiente y complementario denominado huella de bucle R de una sola molécula (SMRF-seq)¹² para revelar bucles R individuales a alta resolución de una manera específica de la hebra. La evaluación de la formación de R-loop utilizando SMRF-seq en 20 loci diferentes, incluso independientemente de S9.6, reveló una fuerte concordancia entre la recolección de huellas individuales de R-loop y la distribución promedio de la población recopilada por los enfoques basados en DRIP¹², lo que brinda un fuerte apoyo a los enfoques basados en DRIP. También es importante tener en cuenta que los datos de mapeo de R-loop solo proporcionan una instantánea de la distribución genómica de R-loop y no proporcionan información sobre la dinámica de la formación, estabilidad y resolución de R-loop. No obstante, se pueden implementar enfoques de DRIP, combinados con tratamientos farmacológicos específicos y una evaluación de las distribuciones de bucle R a través de series temporales, para abordar estos parámetros^17,53. Es particularmente importante tener en cuenta las limitaciones de las metodologías de perfiles de bucle R cuando el objetivo es caracterizar distribuciones alteradas de bucle R en respuesta a perturbaciones genéticas, ambientales o farmacológicas. Además de los ya descritos anteriormente, es clave considerar cualquier posible cambio en la transcripción naciente, ya que estos causarán inherentemente cambios en el bucle R debido a la naturaleza cotranscripcional de estas estructuras. Estos temas y las directrices para el desarrollo de enfoques rigurosos de mapeo de bucle R han sido ampliamente discutidos^48,56 y se anima a los lectores a consultar estos estudios.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

El trabajo en el laboratorio de Chedin está respaldado por una subvención de los Institutos Nacionales de Salud (R01 GM120607).