Mappatura di R-loop e ibridi RNA:DNA con metodi di immunoprecipitazione basati su S9.6

Gli R-loop costituiscono una classe prevalente di strutture di DNA non-B guidate dalla trascrizione che si verificano in tutti i genomi a seconda sia della sequenza del DNA che della preferenza topologica. Negli ultimi anni, gli R-loop sono stati implicati in una varietà di ruoli adattivi e disadattivi e sono stati collegati all'instabilità genomica nel contesto dei disturbi umani. Di conseguenza, la mappatura accurata di queste strutture nei genomi è di grande interesse per molti ricercatori. DRIP-seq (DNA:RNA Immunoprecipitation followed by high throughput sequencing) è descritto qui. Si tratta di una tecnica robusta e riproducibile che consente una mappatura accurata e semiquantitativa dei loop R. Viene anche descritta una recente iterazione del metodo in cui la frammentazione viene realizzata utilizzando la sonicazione (sDRIP-seq), che consente la mappatura specifica del filamento e ad alta risoluzione dei loop R. sDRIP-seq affronta quindi alcune delle limitazioni comuni del metodo DRIP-seq in termini di risoluzione e incagliamento, rendendolo un metodo di scelta per la mappatura R-loop.

Gli R-loop costituiscono una classe prevalente di strutture di DNA non-B guidate dalla trascrizione che si verificano in tutti i genomi a seconda sia della sequenza del DNA che della preferenza topologica. Negli ultimi anni, gli R-loop sono stati implicati in una varietà di ruoli adattivi e disadattivi e sono stati collegati all'instabilità genomica nel contesto dei disturbi umani. Di conseguenza, la mappatura accurata di queste strutture nei genomi è di grande interesse per molti ricercatori. DRIP-seq (DNA:RNA Immunoprecipitation followed by high throughput sequencing) è descritto qui. Si tratta di una tecnica robusta e riproducibile che consente una mappatura accurata e semiquantitativa dei loop R. Viene anche descritta una recente iterazione del metodo in cui la frammentazione viene realizzata utilizzando la sonicazione (sDRIP-seq), che consente la mappatura specifica del filamento e ad alta risoluzione dei loop R. sDRIP-seq affronta quindi alcune delle limitazioni comuni del metodo DRIP-seq in termini di risoluzione e incagliamento, rendendolo un metodo di scelta per la mappatura R-loop.

Gli R-loop sono strutture di acidi nucleici a tre filamenti che si formano principalmente durante la trascrizione dopo l'ibridazione del trascritto di RNA nascente nel filamento di DNA stampo. Ciò si traduce nella formazione di un ibrido RNA:DNA e provoca lo spostamento del filamento di DNA non stampo in uno stato di loop a singolo filamento. La ricostituzione biochimica ^1,2,3,4 e la modellazione matematica⁵, in combinazione con altre misure biofisiche ^6,7, hanno stabilito che è più probabile che gli R-loop si verifichino su regioni che mostrano specifiche caratteristiche favorevoli. Ad esempio, le regioni che mostrano un'asimmetria di filamento nella distribuzione delle guanine (G) e delle citosine (C) in modo tale che l'RNA sia ricco di G, una proprietà chiamata skew GC positivo, sono favorite per formare R-loop quando trascritte a causa della maggiore stabilità termodinamica dell'ibrido DNA:RNA rispetto al duplex^{DNA 8}. Le regioni che hanno sviluppato uno skew GC positivo, come le porzioni precoci di molti geni eucariotici 4,9,10,11, sono inclini a formare R-loop in vitro e in vivo ^3,4,12. Lo stress superelicoidale negativo del DNA favorisce anche notevolmente la formazione della struttura^13,14 perché gli R-loop assorbono efficacemente tali stress topologici e riportano la fibra di DNA circostante a uno stato di rilassamento favorevole ^5,15.

Storicamente, si è ritenuto che le strutture R-loop fossero il risultato di rari e spontanei entanglement dell'RNA con il DNA durante la trascrizione. Tuttavia, lo sviluppo dell'immunoprecipitazione DNA:RNA (DRIP) accoppiato con il sequenziamento del DNA ad alto rendimento (DRIP-seq) ha permesso la prima mappatura dell'intero genoma dei loop R e ha rivelato che tali strutture sono molto più diffuse del previsto nelle cellule umane ^4,16. I R-loop si verificano su decine di migliaia di hotspot genici conservati, trascritti nei genomi dei mammiferi, con una predilezione per le isole CpG GC-distorte che si sovrappongono al primo introne dei geni e alle regioni terminali di numerosi geni¹⁷. Complessivamente, gli R-loop occupano collettivamente il 3%-5% del genoma nelle cellule umane, in linea con le misurazioni in altri organismi, tra cui lieviti, piante, mosche e topi 18,19,20,21,22.

L'analisi degli hotspot che formano l'anello R nelle cellule umane ha rivelato che tali regioni si associano a specifiche firme della cromatina²³. Gli R-loop, in generale, si trovano in regioni con minore occupazione nucleosomica e maggiore densità di RNA polimerasi. Ai promotori, gli R-loop si associano con un aumento del reclutamento di due modificazioni istoniche depositate co-trascrizionalmente, H3K4me1 e H3K36me3¹⁷. Ai termini genici, gli R-loop si associano a geni strettamente disposti che subiscono un'efficiente terminazione della trascrizione¹⁷, coerentemente con le osservazioni precedenti²⁴. È stato anche dimostrato che gli R-loop partecipano all'inizio della replicazione del DNA alle origini di replicazione dei genomi di batteriofago, plasmide, mitocondriale e lievito 25,26,27,28,29,30,31. Inoltre, il 76% dei promotori umani di isole CpG inclini all'R-loop funzionano come origini di replicazione costitutive precoci 32,33,34,35, rafforzando ulteriormente le connessioni tra gli R-loop e le origini di replicazione. Collettivamente, questi studi suggeriscono che gli R-loop rappresentano un nuovo tipo di segnale biologico che può innescare specifici output biologici in modo dipendente dal contesto²³.

All'inizio, è stato dimostrato che gli R-loop si formano nelle sequenze di commutazione di classe durante il processo di ricombinazione di commutazione di classe delle immunoglobuline ^3,36,37. Si ritiene che tali R-loop programmati avviino la ricombinazione di interruttori di classe attraverso l'introduzione di rotture di DNA a doppio filamento³⁸. Da allora, la formazione dannosa di R-loop, generalmente intesa come il risultato di un'eccessiva formazione di R-loop, è stata collegata all'instabilità genomica e a processi come l'iperricombinazione, le collisioni trascrizione-replicazione, la replicazione e lo stress trascrizionale (per la revisione 39,40,41,42,43). Di conseguenza, una migliore mappatura delle strutture R-loop rappresenta una sfida entusiasmante ed essenziale per decifrare meglio la distribuzione e la funzione di queste strutture in salute e malattia.

L'immunoprecipitazione DNA:RNA (DRIP) si basa sull'elevata affinità dell'anticorpo monoclonale S9.6 per gli ibridi DNA:RNA⁴⁴. DRIP-seq consente una robusta profilazione dell'intero genoma della formazione di R-loop ^4,45. Sebbene utile, questa tecnica soffre di una risoluzione limitata a causa del fatto che gli enzimi di restrizione vengono utilizzati per ottenere una delicata frammentazione del DNA. Inoltre, DRIP-seq non fornisce informazioni sulla direzionalità della formazione dell'R-loop. Qui, riportiamo una variante di DRIP-seq che consente la mappatura di R-loop ad alta risoluzione in modo specifico per il filamento. Questo metodo si basa sulla sonicazione per frammentare il genoma prima dell'immunoprecipitazione e il metodo è quindi chiamato sDRIP-seq (immunoprecipitazione DNA:RNA di sonicazione accoppiata con sequenziamento ad alto rendimento) (Figura 1). L'uso della sonicazione consente una maggiore risoluzione e limita le distorsioni di frammentazione enzimatiche osservate negli approcci DRIP-seq⁴⁶. sDRIP-seq produce mappe R-loop che sono in forte accordo con i risultati sia di DRIP-seq che del metodo DRIPc-seq ad alta risoluzione precedentemente descritto in cui le librerie di sequenziamento sono costruite dai filamenti di RNA di strutture R-loop immunoprecipitate⁴⁵.

Di fronte a una pletora di metodi tra cui scegliere, gli utenti potrebbero chiedersi quale particolare approccio basato su DRIP sia preferibile per le loro esigenze. Offriamo i seguenti consigli. DRIP-seq, nonostante i suoi limiti, è tecnicamente più semplice ed è il più robusto (rendimenti più elevati) di tutti e tre i metodi discussi qui; Rimane quindi ampiamente utile. Sono stati pubblicati numerosi set di dati DRIP-seq, che forniscono un utile punto di confronto per nuovi set di dati. Infine, la pipeline di analisi bioinformatica è più semplice in quanto i dati non sono incagliati. Si raccomanda ai nuovi utenti di iniziare ad affinare le proprie capacità di mappatura R-loop con DRIP seguito da reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) e DRIP-seq. sDRIP-seq rappresenta un grado di difficoltà tecnica leggermente superiore: le rese sono leggermente ridotte a causa della sonicazione (discussa di seguito) e il processo della libreria di sequenziamento è leggermente più complesso. Tuttavia, il guadagno della strandedness e della risoluzione più elevata è inestimabile. Si noti che sDRIP-seq catturerà sia ibridi RNA:DNA a due filamenti che R-loop a tre filamenti. A causa delle fasi di costruzione della libreria, DRIP-seq non catturerà ibridi RNA:DNA a due filamenti. Il DRIPc-seq è il più impegnativo dal punto di vista tecnico e richiede una maggiore quantità di materiali di partenza. In cambio, offre la massima risoluzione e incagliabilità. Poiché le librerie di sequenziamento sono costruite dalla porzione di RNA di R-loop o ibridi, DRIPc-seq può soffrire di una possibile contaminazione dell'RNA, soprattutto perché S9.6 possiede un'affinità residua per dsRNA 19,47,48. sDRIP-seq consente la mappatura ad alta risoluzione specifica del filamento senza preoccuparsi della contaminazione dell'RNA, poiché le librerie di sequenziamento derivano da filamenti di DNA. Nel complesso, questi tre metodi rimangono utili e presentano diversi gradi di complessità e avvertimenti leggermente diversi. Tutti e tre, tuttavia, producono set di dati altamente congruenti⁴⁸ e sono altamente sensibili al pretrattamento con RNasi H, che rappresenta un controllo essenziale per garantire la specificità del segnale^45,49. Si noti che, data la selezione delle dimensioni imposta alle librerie di sequenziamento, saranno esclusi piccoli ibridi (stimati <75 bp), come quelli che si formano transitoriamente attorno a siti di priming di replicazione del DNA a filamento ritardato (primer Okazaki). Allo stesso modo, poiché tutti i metodi DRIP comportano la frammentazione del DNA, gli R-loop instabili che richiedono il superavvolgimento del DNA negativo per la loro stabilità andranno persi⁵. Pertanto, gli approcci DRIP possono sottostimare i carichi R-loop, specialmente per R-loop brevi e instabili che possono essere meglio catturati utilizzando approcci in vivo ^45,48. Si noti che gli R-loop possono anche essere profilati in modo indipendente da S9.6 a copertura profonda, ad alta risoluzione e in modo specifico per filamento su singole molecole di DNA dopo il trattamento con bisolfito di sodio¹². Inoltre, sono state impiegate strategie che utilizzano un enzima RNasi H1 cataliticamente inattivo per mappare i loop R nativi in vivo, evidenziando brevi e instabili R-loop che si formano principalmente ai promotori in pausa 50,51,52.

Il seguente protocollo è ottimizzato per la linea cellulare umana di Ntera-2 coltivata in coltura, ma è stato adattato con successo senza modifiche a una serie di altre linee cellulari umane (HEK293, K562, HeLa, U2OS), cellule primarie (fibroblasti, cellule B) e in altri organismi con piccole modifiche (topi, mosche).

1. Raccolta e lisi cellulare

1. Coltura di cellule Ntera-2 con confluenza del 75%-85%. Assicurarsi che la conta cellulare ottimale sia compresa tra 5 e 6 milioni di cellule con una conta vitale del >90% per avviare qualsiasi procedura DRIP.
2. Lavare le cellule una volta con 1x PBS, aggiungere 1,5 mL di Tripsina-EDTA 1x, quindi incubare per 2 minuti a 37 °C fino a quando le cellule non si dissociano dal piatto.
3. Aggiungere 5 mL di terreno caldo e pipettare bene per risospendere le cellule in una sospensione di una singola cellula. Trasferire il contenuto in una nuova provetta da 15 ml e pellettare delicatamente le cellule a 300 x g per 3 minuti.
4. Lavare le cellule una volta con 5 mL di 1x PBS e pellettare delicatamente le cellule a 300 x g per 3 minuti.
5. Risospendere completamente le cellule in 1,6 mL di tampone TE (10 mM Tris-Cl pH 7,5, 1 mM EDTA pH 8,0). Aggiungere 5 μL di proteinasi K (20 mg/mL di soluzione madre) e 50 μL di SDS (soluzione madre al 20%) e capovolgere delicatamente le provette cinque volte fino a quando la soluzione non diventa viscosa. Non tentare di pipettare la soluzione, ma solo mescolare per inversione.
6. Incubare le provette per una notte a 37 °C.

2. Estrazione del DNA

1. Versare il lisato di DNA in una provetta di gel ad aggancio di fase ad alta densità da 15 mL pre-centrifugata e aggiungere 1 volume (1,6 mL) di alcol isoamilico fenolo/cloroformio (25:24:1). Capovolgere delicatamente cinque volte e centrifugare a 1.500 x g per 5 minuti.
2. Aggiungere 1/10 di volume di acetato di sodio 3 M (NaOAc) (pH 5,2) e 2,5 volumi di etanolo al 100% a una nuova provetta da 15 mL. Versare la fase acquosa superiore dal tubo di gel ad aggancio di fase e capovolgere delicatamente fino a quando il DNA non è completamente precipitato (fino a 10 minuti).
3. Avvolgere i fili di DNA utilizzando una punta da 1.000 μL a foro largo e trasferirli in una provetta pulita da 2 mL, facendo attenzione a non trasportare il surnatante residuo.
4. Lavare il DNA aggiungendo 1,5 ml di etanolo all'80% e capovolgere delicatamente la provetta cinque volte. Incubare per 10 min.
5. Ripetere il passaggio precedente due volte. Non centrifugare durante le fasi di lavaggio. Rimuovere con cura la maggior quantità possibile di etanolo pipettandolo dopo l'ultimo lavaggio, cercando di non disturbare il DNA.
6. Lasciare asciugare completamente il DNA all'aria mentre si capovolge il tubo. Questo passaggio può richiedere 30 minuti -1 ora a seconda della quantità di DNA.
7. Aggiungere 125 μL di tampone TE direttamente sul pellet di DNA per frammentare il DNA attraverso la digestione con l'enzima di restrizione o 100 μL di tampone TE per tagliare il DNA attraverso la sonicazione. Conservare in ghiaccio per 1 ora e risospendere delicatamente il DNA pipettandolo alcune volte con un puntale da 200 μL a foro largo. Lasciare in ghiaccio per 1 ora prima di iniziare la fase di frammentazione.

3. Frammentazione del DNA

NOTA: Per il DRIP-seq basato su enzimi di restrizione, seguire il passaggio 3.1. Per il DRIP-seq basato sulla sonicazione, andare al passaggio 3.2.

1. Frammentazione dell'enzima di restrizione (RE)
   1. Digerire il DNA genomico risospeso (molto viscoso) utilizzando un cocktail di RE secondo le istruzioni del fornitore.
      1. Aggiungere 0,1 mM di spermidina alla reazione finale. Utilizzare un cocktail di 4-5 enzimi con 30 U di ciascun enzima in un volume totale di 150 μl.
         NOTA: Il cocktail iniziale per DRIP-seq (HindIII, SspI, EcoRI, BsrGI, XbaI)⁴ è stato sviluppato per generare una lunghezza media del frammento di 5 kilobasi. Evita qualsiasi interferenza con la metilazione CpG e risparmia le regioni ricche di GC del genoma. Sono possibili anche altri cocktail¹⁶). Questi cocktail sono adatti sia per il genoma umano che per quello del topo, ma possono essere regolati secondo necessità.
      2. Incubare la miscela di reazione per una notte a 37 °C.
         NOTA: La miscela di DNA post-digestione non deve più essere viscosa. L'eventuale viscosità residua in questa fase è indicativa di una digestione incompleta.
      3. Se osservato, aggiungere altri 10 U di ciascun enzima e incubare per altre 2-4 ore a 37 °C.
         NOTA: Gli utenti potrebbero non digerire l'intero pellet nel caso in cui abbiano raccolto più cellule di quanto raccomandato qui.
   2. Pipettare delicatamente il DNA digerito durante la notte (150 μL) in una provetta leggera in gel ad aggancio di fase da 2 mL pre-centrifugata. Aggiungere 100 μL di acqua e un volume (250 μL) di alcol isoamilico fenolo/cloroformio (25:24:1). Capovolgere delicatamente cinque volte e centrifugare a 16.000 x g per 10 minuti.
   3. Aggiungere 1,5 μL di glicogeno, 1/10 di volume di NaOAc 3 M (pH 5,2) e 2,5 volumi di etanolo al 100% a una nuova provetta da 1,5 mL. Pipettare il DNA dalla provetta del gel ad aggancio di fase e mescolare capovolgendo cinque volte. Incubare per 1 ora a -20 °C.
   4. Centrifugare a 16.000 x g per 35 min a 4 °C. Lavare il DNA con 200 μl di etanolo all'80% e centrifugare a 16.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
   5. Asciugare il pellet all'aria e aggiungere 50 μl di tampone TE al pellet. Lasciare il tubo sul ghiaccio per 30 minuti e risospendere delicatamente il DNA.
   6. Misurare la concentrazione (OD₂₆₀) del DNA frammentato utilizzando uno spettrofotometro.
   7. Facoltativo ma consigliato: caricare 1 μg di DNA digerito su un gel di agarosio allo 0,8% insieme a un marcatore dimensionale per verificare che la digestione sia completa. Far funzionare il gel per un'ora a 100 V.
      NOTA: Se incompleto, è possibile aggiungere un ulteriore enzima. Una digestione incompleta può portare alla perdita di risoluzione dopo l'immunoprecipitazione.
   8. Dopo questa fase, trattare 10 μg di DNA digerito con 4 μL di ribonucleasi H (RNasi H) per 1-2 ore a 37 °C per garantire che il segnale recuperato dopo l'immunoprecipitazione derivi da ibridi DNA:RNA. Quindi, procedere all'immunoprecipitazione S9.6 (passaggio 4).
      NOTA: I DNA digeriti possono essere conservati congelati a -80 °C per un massimo di un mese senza una significativa perdita di resa.
2. Sonicazione
   1. Sonicare tutto o parte del DNA estratto in una provetta da microcentrifuga da 0,5 mL in un volume totale di 100 μL. Eseguire 15-20 cicli di 30 s ON / 30 s OFF su un sonicatore (centrifugare dopo 5, 10 e 15 cicli per garantire una sonicazione omogenea).
   2. Misurare la concentrazione (OD₂₆₀) di DNA sonicato su uno spettrofotometro.
      NOTA: A questo punto, la viscosità del DNA dovrebbe essere scomparsa.
   3. Eseguire un gel di agarosio per confermare la distribuzione dimensionale del DNA sonicato (300-500 bp).
      NOTA: L'eccessiva sonicazione del DNA può portare a una significativa riduzione della resa derivante dalla rottura e dalla dissociazione delle strutture R-loop.
   4. Dopo questa fase, trattare 10 μg di DNA sonicato con 4 μL di RNasi H per 1-2 ore a 37 °C per garantire che il segnale recuperato dopo l'immunoprecipitazione derivi da ibridi DNA:RNA. Quindi, procedere all'immunoprecipitazione S9.6 (passaggio 4).

4. Immunoprecipitazione S9.6

NOTA: Le fasi di immunoprecipitazione sono simili indipendentemente dal fatto che il DNA sia stato frammentato attraverso RE o sonicazione.

1. Preparare tre provette e aliquotare 4,4 μg di DNA frammentato in un volume finale di 500 μl di tampone TE per provetta. Conservare 50 μl (1/10 del volume) da ciascuna provetta per utilizzarla successivamente come DNA di ingresso.
2. Aggiungere 50 μl di tampone legante 10x (100 mM NaPO4 pH 7, 1,4 M NaCl, 0,5% Triton X-100) e 10 μl di anticorpo S9.6 (1 mg/mL) ai 450 μl di DNA diluito.
3. Incubare per una notte a 4 °C su un rotatore per miniprovette a 7-10 giri/min.
4. Per ogni provetta, lavare 50 μL di perlina di agarosio Protein A/G con 700 μL di tampone legante 1x capovolgendo le provette su un mini-rotatore a 7-10 giri/min a temperatura ambiente per 10 minuti. Centrifugare le perline a 1.100 x g per 1 minuto e scartare il surnatante. Ripetere questo passaggio una volta.
5. Aggiungere il DNA del passaggio 4.3 ai 50 μL di perle e incubare per 2 ore a 4 °C invertendo a 7-10 giri/min su un mini-rotatore.
6. Centrifugare le perline per 1 minuto a 1.100 x g e scartare il surnatante.
7. Lavare le perle con 750 μL di tampone legante 1x capovolgendo a 7-10 giri/min su un mini-rotatore per 15 minuti. Centrifugare per 1 minuto a 1.100 x g ed eliminare il surnatante. Ripetere questo passaggio una volta.
8. Aggiungere 250 μl di tampone di eluizione (50 mM Tris-Cl pH 8, 10 mM EDTA pH 8, 0,5% SDS) e 7 μl di proteinasi K (20 mg/mL stock) alle perle e incubare con rotazione a 55 °C (12 giri/min) per 45 min.
9. Centrifugare le perline per 1 minuto a 1.100 x g. Trasferire il surnatante in una provetta leggera in gel ad aggancio di fase da 2 mL pre-centrifugato e aggiungere un volume (250 μL) di alcol isoamilico fenolo/cloroformio (25:24:1). Capovolgere le provette cinque volte e centrifugare per 10 minuti a 16.000 x g a temperatura ambiente.
10. Aggiungere 1,5 μL di glicogeno, 1/10 di volume di NaOAc 3M (pH 5,2) e 2,5 volumi di etanolo al 100% a una nuova provetta da 1,5 mL. Pipettare il DNA dalla provetta del gel ad aggancio di fase e mescolare capovolgendo cinque volte. Incubare per 1 ora a -20 °C.
11. Centrifugare a 16.000 x g per 35 min a 4 °C. Lavare il DNA con 200 μl di etanolo all'80% e centrifugare a 16.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
12. Asciugare i pellet all'aria e aggiungere 15 μL di Tris-Cl 10 mM (pH 8) in ciascuna provetta. Lasciare i tubi in ghiaccio per 20 minuti e risospendere delicatamente. Combinare il contenuto delle tre provette in un'unica provetta (45 μL).
13. Controllare l'efficienza del DRIP mediante qPCR utilizzando 5 μL di DNA risospeso da 45 μL (vedere Risultati rappresentativi). Diluire i 5 μl in 10 μl di acqua e utilizzare 2 μl per reazione.

5. Fase di pre-libreria solo per DNA sonicato

NOTA: La sonicazione porta il filamento ssDNA spostato degli anelli R a rompersi. Pertanto, le strutture R-loop a tre filamenti vengono convertite in ibridi DNA:RNA a due filamenti dopo la sonicazione. Di conseguenza, questi ibridi DNA:RNA devono essere riconvertiti in DNA a doppio filamento prima della costruzione della libreria. Qui, viene impiegata una seconda fase di sintesi del filamento. Un approccio alternativo che è stato utilizzato con successo consiste nell'eseguire invece una legatura del DNA a singolo filamento seguita da una sintesi del secondo filamento⁵³.

1. Ai 40 μL di DNA DRRIP'ed del passaggio 4.12, aggiungere 20 μL di tampone 5x secondo filamento (200 mM Tris pH 7, 22 mM MgCl₂, 425 mM KCl), 10 mM di miscela dNTP (dATP, dCTP, dGTP e dTTT o dUTP se l'utente prevede di ottenere il sequenziamento DRIP specifico del filamento), 1 μL di 16 mM NAD, e 32 μL di acqua. Mescolare bene e incubare per 5 minuti con ghiaccio.
2. Aggiungere 1 μL di DNA polimerasi I (10 unità), 0,3 μL di RNasi H (1,6 unità) e 0,5 μL di E. coli DNA ligasi. Mescolare e incubare a 16 °C per 30 min.
3. Pulire immediatamente la reazione utilizzando perline paramagnetiche con un rapporto di 1,6x. Eluire il DNA in 40 μL di Tris-Cl 10 mM (pH 8).

6. Fase di sonicazione pre-libreria solo per RE DNA

NOTA: DRIP porta al recupero di frammenti RE che sono spesso lunghi kilobasi e quindi non adatti per la costruzione immediata di librerie.

1. Per ridurre le dimensioni del materiale per la costruzione della libreria, sonicare il DNA immunoprecipitato in una provetta da microcentrifuga da 0,5 mL. Eseguire 12 cicli di 15 s ON / 60 s OFF su un sonicatore (centrifugare dopo sei cicli per garantire una sonicazione omogenea). Procedere al passaggio 7.
   NOTA: Il materiale immunoprecipitato trasporta ancora gli anelli R a tre filamenti che rispondono alla sonicazione in modo diverso rispetto al DNA a doppio filamento fiancheggiante.
2. Passaggio opzionale: per uniformare i profili DRRIP, trattare il materiale immunoprecipitato con 1 μL di RNasi H in 1x tampone RNasi H per 1 ora a 37 °C prima della sonicazione.

7. Costruzione della biblioteca

1. Eseguire la riparazione finale aggiungendo ai 40 μl del passaggio 4.12 (frammentazione RE) o del passaggio 5.3 (taglio per sonicazione) 5 μl di tampone del modulo di riparazione terminale 10x, 2,5 μl di ATP 10 mM e 2,5 μl di enzima del modulo di riparazione finale (50 μl in totale). Mescolare bene e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Includere 1 μg di DNA di input RI-digerito e sonicato (DRIP) o sonicato (sDRIP) per creare librerie di sequenziamento di controllo corrispondenti al DNA di input.
2. Pulire la reazione utilizzando perle paramagnetiche (rapporto 1,6x) ed eluire in 34 μL di 10 mM Tris-Cl (pH 8).
3. Eseguire l'A-tailing aggiungendo 5 μL di tampone 2, 10 μL di 1 mM dATP e 1 μL di Klenow exo- (50 μL in totale). Mescolare bene e incubare la miscela per 30 minuti a 37 °C.
4. Pulire la reazione utilizzando perle paramagnetiche (rapporto 1,6x) ed eluire in 12 μL di Tris-Cl 10 mM (pH 8).
5. Adattatori Ligate aggiungendo 15 μL di tampone di legatura rapida 2x, 1 μL di adattatori da 15 μM e 2 μL di ligasi rapida (30 μL in totale). Mescolare bene e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
6. Pulire la reazione utilizzando perle paramagnetiche (rapporto 1x) ed eluire in 20 μL di Tris-Cl 10 mM (pH 8).
7. Se è stata eseguita la tranciatura per sonicazione ed è stata utilizzata la dUTP nella fase 5.1, aggiungere 1,5 μL (1,5 U) di Uracil N-glicosilasi e incubare per 30 minuti a 37 °C per ottenere una DRIP specifica per il filamento.
8. La PCR amplifica 10 μL della libreria dal passaggio 6.6 o 6.7. Aggiungere 1 μL di primer PCR 1.0 P5 (vedere la Tabella dei materiali), 1 μL di primer PCR 2.0 P7 (vedere la Tabella dei materiali), 15 μL di master mix e 3 μL di acqua. Mescola bene.
9. In un termociclatore, eseguire il programma come mostrato nella Tabella 1.
10. Procedere a una pulizia in due fasi della libreria utilizzando perline paramagnetiche. Per prima cosa, utilizzare un rapporto di 0,65x per rimuovere i frammenti oltre i 500 bp. Conserva il surnatante. Procedere con un rapporto 1x sul surnatante per rimuovere i frammenti inferiori a 200 bp. Eluire in 12 μL di 10 mM di Tris-HCl (pH 8).

8. Controllo di qualità

1. Per controllare gli arricchimenti R-loop con qPCR su due loci negativi e tre positivi utilizzando il metodo Pfaffl, utilizzare 1 μL della libreria di clean-up del passaggio 6.10. Diluire 1 μL della libreria in 10 μL di acqua e utilizzare 2 μL per locus.
2. Controlla la distribuzione delle dimensioni della libreria ripulita dal passaggio 6.10 utilizzando un kit DNA ad alta sensibilità.

Il DRIP e il sDRIP possono essere analizzati tramite qPCR (Figura 2A) e/o sequenziamento (Figura 2B). Dopo la fase di immunoprecipitazione, la qualità dell'esperimento deve essere prima confermata mediante qPCR su loci di controllo positivi e negativi, nonché con controlli trattati con RNasi H. I primer corrispondenti ai loci utilizzati di frequente in più linee cellulari umane sono forniti nella Tabella 2. I risultati della qPCR devono essere visualizzati come percentuale dell'input, che corrisponde alla percentuale di cellule che trasportano un R-loop al momento della lisi per un determinato locus. In un esperimento DRIP di successo, la resa per i loci negativi dovrebbe essere inferiore allo 0,1%, mentre i loci positivi possono variare dall'1% a oltre il 10% per loci altamente trascritti come RPL13A (Figura 2A). Per la sDRIP, le rese sono tipicamente inferiori (20%-50%) a giudizio della DRIP-qPCR, ma sembrano influenzare il recupero in modo uniforme in modo tale che nessun particolare sottoinsieme di R-loop è interessato più di un altro. Di conseguenza, le mappe derivate da DRIP, sDRIP e DRIPc sono in buon accordo (Figura 2B). I dati qPCR possono anche essere visualizzati come arricchimento della percentuale di input per loci positivi rispetto a loci negativi, valutando così la specificità dell'esperimento. Gli arricchimenti delle pieghe variano in genere da un minimo di 10 volte a oltre 200 volte a seconda dei loci scelti per l'analisi. Quando è richiesta una quantificazione precisa su più campioni che rappresentano knockdown genici, knockout o vari trattamenti farmacologici, l'uso di spike nei controlli per normalizzare la variazione sperimentale tra campioni è altamente incoraggiato. Tali spike-in possono corrispondere a ibridi sintetici⁵³ o genomi di specie non imparentate⁵⁴.

I materiali DRIP e sDRIP possono essere sequenziati utilizzando strategie di sequenziamento a estremità singola o accoppiata. I dati possono essere estratti e analizzati in modo simile alla maggior parte dei dati ChIP utilizzando pipeline computazionali standard (vedere⁴⁵ per informazioni rilevanti per DRIP). Dopo il taglio dell'adattatore e la rimozione dei duplicati PCR, le letture possono essere mappate su un genoma di riferimento e caricate su un browser genomico. Un tipico output atteso di DRIP e sDRIP è mostrato nella Figura 2B. L'output DRIP è rappresentato dall'unica traccia verde in quanto non consente la specificità del filamento, mentre sDRIP mostra la mappatura R-loop ai filamenti positivi e negativi indicati rispettivamente in rosso e blu. Le tracce di controllo corrispondenti a un campione pre-trattato con RNasi H mostrano una chiara riduzione dei segnali, confermando la specificità della tecnica per i materiali derivati da ibridi RNA:DNA. I guadagni in termini di risoluzione consentiti da sDRIP sono chiaramente illustrati quando si confrontano le dimensioni del materiale di DNA in ingresso (Figura 2C). La riproducibilità di sDRIP-seq, insieme all'impatto globale del pretrattamento con RNasi H1 e la correlazione tra sDRIP-seq e DRIPc-seq sono rappresentati dai grafici XY nella Figura 2D.

Figura 1: Panoramica delle procedure DRIP-seq e sDRIP-seq. Entrambi gli approcci iniziano con le stesse fasi di estrazione del DNA sviluppate per preservare i loop R (i filamenti di RNA all'interno dei loop R sono rappresentati da linee ondulate). Per DRIP-seq, il genoma viene frammentato utilizzando enzimi di restrizione, spesso risultando in frammenti delle dimensioni di kilobasi all'interno dei quali sono incorporati anelli R più corti. Per sDRIP-seq, il genoma viene frammentato tramite sonicazione, che si traduce in frammenti più piccoli e nel taglio e nella perdita del singolo filamento spostato di anelli R (indicato da linee tratteggiate). Dopo l'immunoprecipitazione con l'anticorpo S9.6, DRIP porta al recupero di R-loop a tre filamenti incorporati all'interno di frammenti di restrizione, mentre sDRIP recupera ibridi RNA:DNA a due filamenti con poco DNA fiancheggiante, garantendo una risoluzione più elevata. Per sDRIP, è necessario includere una fase di costruzione della libreria per convertire gli ibridi RNA:DNA in DNA duplex. Come illustrato di seguito, questa è un'opportunità per creare librerie specifiche del filamento. Come dettagliato nel protocollo stesso, il trattamento esogeno con RNasi H rappresenta un controllo chiave per la specificità di entrambe le procedure; Non sono mostrati qui. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Risultato delle strategie di mappatura R-loop. (A) Risultati della qPCR ottenuti con successo dalle immunoprecipitazioni utilizzando il metodo DRIP e sDRIP (corrispondente alla fase 4.13 del controllo qPCR). I risultati provengono da due esperimenti indipendenti su cellule umane Ntera-2 in un locus negativo e due loci positivi, tra cui il locus RPL13A altamente incline all'R-loop e il locus TFPT moderatamente incline all'R-loop. L'asse y indica la resa dell'immunoprecipitazione come percentuale del DNA in ingresso. Si noti che il recupero è leggermente più robusto per DRIP rispetto a sDRIP. (B) I risultati della mappatura R-loop condotta in cellule umane di Ntera-2 sono mostrati su una regione centrata attorno al CCND1 e ai geni ORAOV1 vicini. Le prime due tracce corrispondono ai risultati di DRIP-seq, rispettivamente senza e con trattamento con RNasi H. La posizione degli enzimi di restrizione utilizzati per frammentare il genoma è mostrata in alto. Le successive sei tracce rappresentano i risultati di sDRIP-seq specifico del filamento, suddiviso tra filamenti (+) e (-) (due repliche ciascuno) e pre-trattato con RNasi H, o meno, come indicato. Le ultime quattro tracce rappresentano i risultati della mappatura R-loop tramite il metodo DRIPc-seq ad alta risoluzione specifico per il filamento (Sanz et al., 2016; Sanz e Chedin, 2019), in cui le librerie sono costruite dai filamenti di RNA dei loop R. Come si può vedere chiaramente, i geni CCND1 e ORAOV1 portano alla formazione di R-loop rispettivamente sui filamenti (+) e (-), coerentemente con la loro direzionalità. Il trattamento con RNasi H abolisce il segnale, come previsto. (C) I materiali di DNA in ingresso dopo la frammentazione dell'enzima di restrizione (a sinistra) e la sonicazione (a destra) sono mostrati dopo che i materiali sono stati separati mediante elettroforesi su gel di agarosio. La scala del DNA corrisponde a una scala di 100 bp e la banda di 500 bp è evidenziata da un asterisco. (D) I grafici di correlazione del segnale XY sono mostrati per illustrare la riproducibilità di sDRIP-seq (a sinistra), la sensibilità complessiva di sDRIP-seq al pre-trattamento con RNasi H1 (al centro) e la correlazione globale tra sDRIP-seq e DRIPc-seq (a destra). Tutti i dati provengono da cellule umane Ntera-2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Impostazioni del programma PCR. Vengono elencate le impostazioni di durata e temperatura per i cicli PCR. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Primer utilizzati per la validazione della qPCR in linee cellulari umane. Tutte le sequenze sono elencate nella direzione da 5' a 3'. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Qui sono descritti due protocolli per mappare le strutture R-loop in qualsiasi organismo che utilizza l'anticorpo S9.6. DRIP-seq rappresenta la prima tecnica di mappatura R-loop a livello di genoma sviluppata. È una tecnica semplice, robusta e riproducibile che consente di mappare la distribuzione dei loop R lungo qualsiasi genoma. La seconda tecnica, denominata sDRIP-seq, è anch'essa robusta e riproducibile, ma raggiunge una risoluzione e una specificità del filamento più elevate grazie all'inclusione di una fase di sonicazione e di un protocollo di costruzione della libreria di sequenziamento a filamenti. Entrambe le tecniche sono altamente sensibili al trattamento con RNasi H prima dell'immunoprecipitazione, confermando che il segnale deriva principalmente da veri ibridi RNA:DNA. Infine, quando si confrontano i rendimenti dell'immunoprecipitazione tra loci R-loop positivi e R-loop negativi, entrambe le tecniche offrono una differenza fino a 100 volte in diverse linee cellulari umane, fornendo un'elevata mappatura di specificità con un basso background.

Quando si considera quale metodo implementare, è utile considerare i rispettivi punti di forza e limiti. Come notato in precedenza, DRIP-seq produce mappe con una risoluzione inferiore e non fornisce informazioni sulla strandedness della formazione di R-loop. La risoluzione più bassa è principalmente un prodotto dell'uso di RE per frammentare il genoma. Questo metodo delicato è il migliore per preservare gli R-loop, consentendo così un recupero insuperabile di tali strutture e rendendo DRIP-seq molto robusto. Per aggirare il problema della risoluzione limitata preservando al contempo un elevato recupero, i cocktail RE possono essere adattati e/o le mappe risultanti da diversi cocktail RE possono essere combinate per migliorare la risoluzione¹⁶. È stata sviluppata una tecnica che utilizza taglierine a 4 bp per migliorare la risoluzione di DRIP-seq e può ottenere una mappatura specifica del filamento^22,55, sebbene i set di dati risultanti non siano ancora stati sistematicamente confrontati con altri set di dati umani. È importante notare che negli approcci basati su RE, i frammenti più grandi tendono ad essere recuperati in modo più efficiente perché possono trasportare più regioni di formazione del loop R. Questa distorsione deve essere presa in considerazione quando si analizzano i set di dati DRIP-seq. Allo stesso modo, la chiamata di picco per i dati DRIP-seq deve essere infine tradotta in frammenti RE R-loop-positivi, poiché sono questi frammenti che vengono immunoprecipitati e la posizione dei loop R all'interno di questi frammenti non può essere dedotta. In generale, si consiglia agli utenti di adottare prima DRIP-seq basato su RE per apprendere il metodo e acquisire fiducia nel raggiungimento dei rendimenti documentati nella Figura 2A. sDRIP-seq in genere si traduce in rendimenti inferiori, che potrebbero portare a mappe con rapporti segnale/rumore inferiori in mani non addestrate. L'uso della sonicazione come mezzo per frammentare il genoma offre in cambio un grande miglioramento della risoluzione, poiché le porzioni non R-looped che tipicamente costituiscono la maggior parte dei frammenti RE verranno spezzate, consentendo a S9.6 di recuperare principalmente le porzioni R-looped (Figura 1). Vale la pena notare che la sonicazione provoca la rottura del filamento ssDNA spostato dei loop R. È quindi essenziale aggiungere una sintesi di secondo filamento dopo l'immunoprecipitazione degli ibridi DNA:RNA sonicati, che riconvertirà questi ibridi in dsDNA, prima di costruire librerie di sequenziamento. Senza questo passaggio, gli unici frammenti che possono essere legati agli adattatori di dsDNA saranno frammenti di dsDNA di fondo; Pertanto, le mappe risultanti saranno prive di qualsiasi segnale. La specificità del filamento fornisce numerosi ulteriori vantaggi alla comprensione dei meccanismi di formazione dell'anello R, rendendo sDRIP-seq un metodo di scelta per lo studio degli anelli R.

È importante sottolineare che le mappe ottenute tramite DRIP-seq e sDRIP-seq rappresentano la distribuzione media dei loop R attraverso una popolazione cellulare; pertanto, la lunghezza e la posizione dei singoli R-loop non possono essere affrontate con tali tecniche. A tal fine, è possibile utilizzare un metodo indipendente e complementare, denominato impronta R-loop a singola molecola (SMRF-seq)¹², per rivelare singoli R-loop ad alta risoluzione in modo specifico per filamento. La valutazione della formazione di R-loop utilizzando SMRF-seq su 20 diversi loci, anche indipendentemente da S9.6, ha rivelato un forte accordo tra la raccolta delle singole impronte di R-loop e la distribuzione media della popolazione raccolta da approcci basati su DRIP¹², fornendo un forte supporto agli approcci basati su DRIP. È anche importante considerare che i dati di mappatura R-loop forniscono solo un'istantanea della distribuzione genomica R-loop e non forniscono informazioni sulla dinamica della formazione, stabilità e risoluzione di R-loop. Gli approcci DRRIP, combinati con trattamenti farmacologici specifici e una valutazione delle distribuzioni dell'R-loop attraverso serie storiche, possono comunque essere implementati per affrontare questi parametri^17,53. I limiti delle metodologie di profilazione R-loop sono particolarmente importanti da tenere a mente quando l'obiettivo è caratterizzare distribuzioni alterate di R-loop in risposta a perturbazioni genetiche, ambientali o farmacologiche. Oltre a quelli già descritti sopra, è fondamentale considerare qualsiasi possibile cambiamento nella trascrizione nascente poiché questi causeranno intrinsecamente cambiamenti del ciclo R a causa della natura co-trascrizionale di queste strutture. Questi problemi e le linee guida per lo sviluppo di rigorosi approcci di mappatura R-loop sono stati ampiamente discussi^48,56 e i lettori sono incoraggiati a fare riferimento a questi studi.

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Il lavoro nel laboratorio di Chedin è sostenuto da una sovvenzione del National Institutes of Health (R01 GM120607).