Cartographie des R-Loops et des hybrides ARN :ADN avec des méthodes d’immunoprécipitation basées sur S9.6

Les R-loops constituent une classe prévalente de structures d’ADN non-B induites par la transcription qui se produisent dans tous les génomes en fonction de la séquence d’ADN et de la préférence topologique. Ces dernières années, les R-loops ont été impliqués dans une variété de rôles adaptatifs et inadaptés et ont été liés à l’instabilité génomique dans le contexte des troubles humains. Par conséquent, la cartographie précise de ces structures dans les génomes est d’un grand intérêt pour de nombreux chercheurs. Le DRIP-seq (DNA :RNA Immunoprecipitation followed by high throughput sequencing) est décrit ici. Il s’agit d’une technique robuste et reproductible qui permet une cartographie précise et semi-quantitative des R-loops. Une itération récente de la méthode est également décrite dans laquelle la fragmentation est réalisée à l’aide de la sonication (sDRIP-seq), ce qui permet une cartographie spécifique au brin et à haute résolution des boucles R. sDRIP-seq résout ainsi certaines des limitations courantes de la méthode DRIP-seq en termes de résolution et de strandedness, ce qui en fait une méthode de choix pour le mappage de boucle R.

Les R-loops constituent une classe prévalente de structures d’ADN non-B induites par la transcription qui se produisent dans tous les génomes en fonction de la séquence d’ADN et de la préférence topologique. Ces dernières années, les R-loops ont été impliqués dans une variété de rôles adaptatifs et inadaptés et ont été liés à l’instabilité génomique dans le contexte des troubles humains. Par conséquent, la cartographie précise de ces structures dans les génomes est d’un grand intérêt pour de nombreux chercheurs. Le DRIP-seq (DNA :RNA Immunoprecipitation followed by high throughput sequencing) est décrit ici. Il s’agit d’une technique robuste et reproductible qui permet une cartographie précise et semi-quantitative des R-loops. Une itération récente de la méthode est également décrite dans laquelle la fragmentation est réalisée à l’aide de la sonication (sDRIP-seq), ce qui permet une cartographie spécifique au brin et à haute résolution des boucles R. sDRIP-seq résout ainsi certaines des limitations courantes de la méthode DRIP-seq en termes de résolution et de strandedness, ce qui en fait une méthode de choix pour le mappage de boucle R.

Les R-loops sont des structures d’acide nucléique à trois brins qui se forment principalement lors de la transcription lors de l’hybridation de la transcription de l’ARN naissant avec le brin d’ADN matrice. Cela aboutit à la formation d’un hybride ARN :ADN et provoque le déplacement du brin d’ADN non matrice dans un état en boucle simple brin. La reconstitution biochimique ^1,2,3,4 et la modélisation mathématique⁵, en combinaison avec d’autres mesures biophysiques ^6,7, ont établi que les R-loops sont plus susceptibles de se produire sur des régions qui présentent des caractéristiques favorables spécifiques. Par exemple, les régions qui présentent une asymétrie de brin dans la distribution des guanines (G) et des cytosines (C) de sorte que l’ARN est riche en G, une propriété appelée asymétrie GC positive, sont favorisées pour former des R-boucles lors de la transcription en raison de la stabilité thermodynamique plus élevée de l’hybride ADN :ARN par rapport à l’ADN duplex⁸. Les régions qui ont développé une asymétrie GC positive, telles que les premières parties de nombreux gènes eucaryotes 4,9,10,11, sont susceptibles de former des boucles R in vitro et in vivo ^3,4,12. Le stress superhélicoïdal négatif de l’ADN favorise également grandement la formation de la structure^13,14, car les R-loops absorbent efficacement ces contraintes topologiques et ramènent la fibre d’ADN environnante à un état de relaxation favorable ^5,15.

Historiquement, les structures de la boucle R étaient considérées comme résultant d’intrications rares et spontanées de l’ARN avec l’ADN pendant la transcription. Cependant, le développement de l’immunoprécipitation ADN :ARN (DRIP) couplé au séquençage de l’ADN à haut débit (DRIP-seq) a permis la première cartographie à l’échelle du génome des R-loops et a révélé que ces structures sont beaucoup plus répandues que prévu dans les cellules humaines ^4,16. Les R-loops se produisent sur des dizaines de milliers de points chauds géniques conservés, transcrits et dans les génomes de mammifères, avec une prédilection pour les îlots CpG asymétriques par GC chevauchant le premier intron des gènes et les régions terminales de nombreux gènes¹⁷. Dans l’ensemble, les R-loops occupent collectivement 3 à 5 % du génome dans les cellules humaines, ce qui correspond aux mesures effectuées dans d’autres organismes, notamment les levures, les plantes, les mouches et les souris 18,19,20,21,22.

L’analyse des points chauds formant des boucles R dans les cellules humaines a révélé que ces régions s’associent à des signatures chromatiniennes spécifiques²³. Les R-loops, en général, se trouvent dans des régions où l’occupation des nucléosomes est plus faible et la densité d’ARN polymérase plus élevée. Au niveau des promoteurs, les R-loops s’associent à un recrutement accru de deux modifications d’histones déposées co-transcriptionnellement, H3K4me1 et H3K36me3¹⁷. Au niveau des terminaisons géniques, les R-loops s’associent à des gènes étroitement agencés qui subissent une terminaison de transcription efficace¹⁷, conformément aux observations antérieures²⁴. Il a également été démontré que les R-loops participent à l’initiation de la réplication de l’ADN aux origines de réplication des génomes des bactériophages, des plasmides, des mitochondries et des levures 25,26,27,28,29,30,31. De plus, 76 % des promoteurs humains de l’îlot CpG sujets aux boucles R fonctionnent comme des origines de réplication précoces et constitutives 32,33,34,35, renforçant encore les liens entre les boucles R et les origines de réplication. Collectivement, ces études suggèrent que les R-loops représentent un nouveau type de signal biologique qui peut déclencher des sorties biologiques spécifiques d’une manière dépendante du contexte²³.

Très tôt, il a été démontré que des R-loops se formaient au niveau des séquences de changement de classe au cours du processus de recombinaison de changement de classe d’immunoglobuline ^3,36,37. On pense que de telles boucles R programmées initient la recombinaison de commutation de classe par l’introduction de cassures d’ADN double brin³⁸. Depuis lors, la formation nocive de R-loop, généralement considérée comme résultant d’une formation excessive de R-loop, a été liée à l’instabilité génomique et à des processus tels que l’hyper recombinaison, les collisions transcription-réplication, la réplication et le stress transcriptionnel (pour revue 39,40,41,42,43). Par conséquent, l’amélioration de la cartographie des structures de la boucle R représente un défi passionnant et essentiel pour mieux déchiffrer la distribution et la fonction de ces structures dans la santé et la maladie.

L’immunoprécipitation ADN :ARN (DRIP) repose sur une forte affinité de l’anticorps monoclonal S9.6 pour les hybrides ADN :ARN⁴⁴. DRIP-seq permet un profilage robuste à l’échelle du génome de la formation de la boucle R ^4,45. Bien qu’utile, cette technique souffre d’une résolution limitée en raison du fait que des enzymes de restriction sont utilisées pour obtenir une fragmentation douce de l’ADN. De plus, DRIP-seq ne fournit pas d’informations sur la directionnalité de la formation de la boucle R. Ici, nous rapportons une variante de DRIP-seq qui permet de cartographier des R-loops à haute résolution d’une manière spécifique au brin. Cette méthode repose sur la sonication pour fragmenter le génome avant l’immunoprécipitation et la méthode est donc appelée sDRIP-seq (sonication DNA :RNA immunoprecipitation coupled with high throughput sequencing) (Figure 1). L’utilisation de la sonication permet une résolution accrue et limite les biais de fragmentation enzymatique de restriction observés dans les approches DRIP-seq⁴⁶. sDRIP-seq produit des cartes R-loop qui sont en fort accord avec les résultats du DRIP-seq et de la méthode DRIPc-seq haute résolution décrite précédemment, dans laquelle des banques de séquençage sont construites à partir des brins d’ARN des structures R-loop^{immunoprécipitées 45}.

Face à une pléthore de méthodes parmi lesquelles choisir, les utilisateurs peuvent se demander quelle approche basée sur le DRIP est préférable pour leurs besoins. Nous vous proposons les conseils suivants. Le DRIP-seq, malgré ses limites, est techniquement le plus simple et est la plus robuste (rendements les plus élevés) des trois méthodes discutées ici ; Il reste donc largement utile. De nombreux ensembles de données DRIP-seq ont été publiés, ce qui constitue un point de comparaison utile pour de nouveaux ensembles de données. Enfin, le pipeline d’analyse bioinformatique est plus simple car les données ne sont pas bloquées. Il est recommandé aux nouveaux utilisateurs de commencer à perfectionner leurs compétences en cartographie de la boucle R avec le DRIP suivi de la réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR) et du DRIP-seq. Le sDRIP-seq représente un degré de difficulté technique légèrement plus élevé : les rendements sont légèrement réduits en raison de la sonication (voir ci-dessous) et le processus de bibliothèque de séquençage est légèrement plus complexe. Pourtant, le gain de l’échouage et d’une résolution plus élevée est inestimable. Il est à noter que le sDRIP-seq capturera à la fois des hybrides ARN :ADN à deux brins et des boucles R à trois brins. En raison des étapes de construction de la bibliothèque, DRIP-seq ne capturera pas les hybrides ARN :ADN à deux brins. DRIPc-seq est le plus exigeant techniquement et nécessite une plus grande quantité de matériaux de départ. En retour, il offre la résolution et le toronnage les plus élevés. Étant donné que les banques de séquençage sont construites à partir de la fraction ARN des R-loops ou des hybrides, DRIPc-seq peut souffrir d’une possible contamination de l’ARN, d’autant plus que S9.6 possède une affinité résiduelle pour l’ARNdb 19,47,48. Le sDRIP-seq permet une cartographie haute résolution spécifique aux brins sans se soucier de la contamination par l’ARN, car les banques de séquençage sont dérivées de brins d’ADN. Dans l’ensemble, ces trois méthodes restent utiles et présentent des degrés de complexité différents et des mises en garde légèrement différentes. Cependant, tous les trois produisent des ensembles de données hautement congruents⁴⁸ et sont très sensibles au prétraitement de la RNase H, qui représente un contrôle essentiel pour garantir la spécificité du signal^45,49. Il est à noter qu’étant donné la sélection de taille imposée aux banques de séquençage, les petits hybrides (estimés <75 pb), tels que ceux qui se forment transitoirement autour des sites d’amorçage de réplication de l’ADN des brins retardés (amorces d’Okazaki) seront exclus. De même, étant donné que toutes les méthodes DRIP impliquent une fragmentation de l’ADN, les R-loops instables qui nécessitent un super-enroulement négatif de l’ADN pour leur stabilité seront perdues⁵. Ainsi, les approches DRIP peuvent sous-estimer les charges de la boucle R, en particulier pour les boucles R courtes et instables qui peuvent être mieux capturées en utilisant des approches in vivo ^45,48. Il est à noter que les R-loops peuvent également être profilés de manière indépendante de S9.6 à une couverture profonde, à haute résolution et d’une manière spécifique au brin sur des molécules d’ADN uniques après un traitement au bisulfite de sodium¹². De plus, des stratégies utilisant une enzyme RNase H1 catalytiquement inactive ont été employées pour cartographier les R-loops natifs in vivo, mettant en évidence des R-loops courtes et instables qui se forment principalement au niveau des promoteurs en pause 50,51,52.

Le protocole suivant est optimisé pour la lignée cellulaire humaine Ntera-2 cultivée en culture, mais il a été adapté avec succès sans modification à une gamme d’autres lignées cellulaires humaines (HEK293, K562, HeLa, U2OS), de cellules primaires (fibroblastes, cellules B) ainsi que dans d’autres organismes avec de petites modifications (souris, mouches).

1. Récolte et lyse cellulaires

1. Cultivez des cellules Ntera-2 à une confluence de 75 % à 85 %. Assurez-vous que le nombre optimal de cellules est de 5 à 6 millions de cellules avec un nombre de cellules viables à >90 % pour commencer toute procédure DRIP.
2. Lavez les cellules une fois avec 1x PBS, ajoutez 1,5 mL de Trypsine-EDTA 1x, puis incubez pendant 2 min à 37 °C jusqu’à ce que les cellules se dissocient de la boîte.
3. Ajouter 5 ml de milieu chaud et bien pipeter pour remettre les cellules en suspension dans une suspension unicellulaire. Transférez le contenu dans un nouveau tube de 15 ml et granulez doucement les cellules à 300 x g pendant 3 min.
4. Lavez les cellules une fois avec 5 mL de 1x PBS et granulez doucement les cellules à 300 x g pendant 3 min.
5. Remettre complètement les cellules en suspension dans 1,6 mL de tampon TE (10 mM Tris-Cl pH 7,5, 1 mM EDTA pH 8,0). Ajouter 5 μL de protéinase K (solution mère à 20 mg/mL) et 50 μL de SDS (solution mère à 20 %) et retourner doucement les tubes cinq fois jusqu’à ce que la solution devienne visqueuse. N’essayez pas de pipeter la solution, mélangez uniquement par inversion.
6. Incuber les tubes pendant la nuit à 37 °C.

2. Extraction de l’ADN

1. Versez le lysat d’ADN dans un tube de gel à verrouillage de phase haute densité pré-filé de 15 ml et ajoutez 1 volume (1,6 ml) d’alcool isoamylique phénol/chloroforme (25:24:1). Retournez doucement cinq fois et tournez à 1 500 x g pendant 5 min.
2. Ajoutez 1/10 volume d’acétate de sodium 3 M (NaOAc) (pH 5,2) et 2,5 volumes d’éthanol à 100 % dans un nouveau tube de 15 ml. Versez la phase aqueuse supérieure du tube de gel à verrouillage de phase et retournez doucement jusqu’à ce que l’ADN soit complètement précipité (jusqu’à 10 min).
3. Enroulez les fils d’ADN à l’aide d’une pointe de 1 000 μL à large alésage et transférez-les dans un tube propre de 2 mL en prenant soin de ne pas emporter le surnageant résiduel.
4. Lavez l’ADN en ajoutant 1,5 ml d’éthanol à 80 % et retournez doucement le tube cinq fois. Incuber pendant 10 min.
5. Répétez l’étape précédente deux fois. Ne pas centrifuger pendant les étapes de lavage. Retirez soigneusement autant d’éthanol que possible en pipetant après le dernier lavage tout en essayant de ne pas perturber l’ADN.
6. Laissez l’ADN sécher complètement à l’air libre tout en inversant le tube. Cette étape peut prendre 30 min à 1 h selon la quantité d’ADN.
7. Ajoutez 125 μL de tampon TE directement sur la pastille d’ADN pour fragmenter l’ADN par digestion enzymatique de restriction ou 100 μL de tampon TE pour cisailler l’ADN par sonication. Maintenez sur de la glace pendant 1 h et remettez doucement l’ADN en suspension en le pipetant plusieurs fois avec une pointe de 200 μL à large alésage. Laisser sur la glace pendant 1 h avant de commencer l’étape de fragmentation.

3. Fragmentation de l’ADN

REMARQUE : Pour le DRIP-seq à base d’enzymes de restriction, suivez l’étape 3.1. Pour le DRIP-seq basé sur la sonication, passez à l’étape 3.2.

1. Fragmentation de l’enzyme de restriction (ER)
   1. Digérer l’ADN génomique remis en suspension (très visqueux) à l’aide d’un cocktail d’ER selon les instructions du fournisseur.
      1. Ajouter 0,1 mM de spermidine à la réaction finale. Utilisez un cocktail de 4 à 5 enzymes avec 30 U de chaque enzyme dans un volume total de 150 μL.
         REMARQUE : Le cocktail initial pour DRIP-seq (HindIII, SspI, EcoRI, BsrGI, XbaI)⁴ a été développé pour générer une longueur moyenne de fragment de 5 kilobases. Évitez toute interférence avec la méthylation des CpG et épargnez les régions riches en GC du génome. D’autres cocktails sont également possibles¹⁶). Ces cocktails conviennent à la fois aux génomes de l’homme et de la souris, mais peuvent être ajustés selon les besoins.
      2. Incuber le mélange réactionnel pendant la nuit à 37 °C.
         REMARQUE : Le mélange d’ADN après la digestion ne doit plus être visqueux. Toute viscosité résiduelle à cette étape est le signe d’une digestion incomplète.
      3. Si vous observez, ajoutez 10 U supplémentaires de chaque enzyme et incubez pendant 2 à 4 h supplémentaires à 37 °C.
         REMARQUE : Les utilisateurs peuvent ne pas digérer la totalité de la pastille s’ils ont récolté plus de cellules que recommandé ici.
   2. Pipetez doucement l’ADN digéré pendant la nuit (150 μL) dans un tube lumineux en gel à verrouillage de phase pré-filé de 2 ml. Ajouter 100 μL d’eau et un volume (250 μL) d’alcool isoamylique phénol/chloroforme (25:24:1). Retournez doucement cinq fois et tournez à 16 000 x g pendant 10 min.
   3. Ajoutez 1,5 μL de glycogène, 1/10 volume de 3 M NaOAc (pH 5,2) et 2,5 volumes d’éthanol à 100 % dans un nouveau tube de 1,5 mL. Pipetez l’ADN du tube de gel à verrouillage de phase et mélangez en inversant cinq fois. Incuber pendant 1 h à -20 °C.
   4. Essorage à 16 000 x g pendant 35 min à 4 °C. Lavez l’ADN avec 200 μL d’éthanol à 80 % et essorez-le à 16 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
   5. Faites sécher la pastille à l’air libre et ajoutez 50 μL de tampon TE à la pastille. Laissez le tube sur de la glace pendant 30 minutes et remettez doucement l’ADN en suspension.
   6. Mesurer la concentration (OD₂₆₀) de l’ADN fragmenté à l’aide d’un spectrophotomètre.
   7. Facultatif mais recommandé : Chargez 1 μg d’ADN digéré sur un gel d’agarose à 0,8 % accompagné d’un marqueur de taille pour vérifier que la digestion est complète. Faites fonctionner le gel pendant une heure à 100 V.
      REMARQUE : S’il est incomplet, une enzyme supplémentaire peut être ajoutée. Une digestion incomplète peut entraîner une perte de résolution après l’immunoprécipitation.
   8. Après cette étape, traitez 10 μg d’ADN digéré avec 4 μL de ribonucléase H (RNase H) pendant 1 à 2 h à 37 °C pour vous assurer que le signal récupéré lors de l’immunoprécipitation provient d’hybrides ADN :ARN. Ensuite, passez à l’immunoprécipitation S9.6 (étape 4).
      REMARQUE : Les ADN digérés peuvent être conservés congelés à -80 °C jusqu’à un mois sans perte de rendement significative.
2. Sonication
   1. Sonicer la totalité ou une partie de l’ADN extrait dans un tube de microcentrifugation de 0,5 mL d’un volume total de 100 μL. Effectuez 15 à 20 cycles de 30 s ON / 30 s OFF sur un sonicateur (essorage après 5, 10 et 15 cycles pour assurer une sonication homogène).
   2. Mesurer la concentration (OD₂₆₀) d’ADN soniqué sur un spectrophotomètre.
      REMARQUE : À cette étape, la viscosité de l’ADN devrait avoir disparu.
   3. Exécutez un gel d’agarose pour confirmer la distribution granulométrique de l’ADN soniqué (300-500 pb).
      REMARQUE : Une sursonisation de l’ADN peut entraîner une réduction significative du rendement résultant de la rupture et de la dissociation des structures de la boucle R.
   4. Après cette étape, traitez 10 μg d’ADN soniqué avec 4 μL de RNase H pendant 1 à 2 h à 37 °C pour vous assurer que le signal récupéré lors de l’immunoprécipitation est dérivé d’hybrides ADN :ARN. Ensuite, passez à l’immunoprécipitation S9.6 (étape 4).

4. Immunoprécipitation S9.6

REMARQUE : Les étapes d’immunoprécipitation sont similaires, que l’ADN ait été fragmenté par RE ou par sonication.

1. Préparez trois tubes et aliquote 4,4 μg d’ADN fragmenté dans un volume final de 500 μL de tampon TE par tube. Conservez 50 μL (1/10 du volume) de chaque tube pour les utiliser plus tard comme ADN d’entrée.
2. Ajouter 50 μL de tampon de liaison 10x (100 mM NaPO4 pH 7, 1,4 M NaCl, 0,5 % Triton X-100) et 10 μL d’anticorps S9.6 (1 mg/mL) aux 450 μL d’ADN dilué.
3. Incuber toute la nuit à 4 °C sur un rotateur mini-tube à 7-10 tr/min.
4. Pour chaque tube, laver 50 μL de boue de billes d’agarose de protéine A/G avec 700 μL de tampon de liaison 1x en inversant les tubes sur un mini-rotateur à 7-10 tr/min à température ambiante pendant 10 min. Faites tourner les perles à 1 100 x g pendant 1 min et jetez le surnageant. Répétez cette étape une fois.
5. Ajouter l’ADN de l’étape 4.3 aux 50 μL de billes et incuber pendant 2 h à 4 °C tout en inversant à 7-10 tr/min sur un mini-rotateur.
6. Faites tourner les perles pendant 1 min à 1 100 x g et jetez le surnageant.
7. Lavez les billes avec 750 μL de 1x tampon de liaison en les inversant à 7-10 tr/min sur un mini-rotateur pendant 15 min. Tournez pendant 1 min à 1 100 x g et jetez le surnageant. Répétez cette étape une fois.
8. Ajouter 250 μL du tampon d’élution (50 mM Tris-Cl pH 8, 10 mM EDTA pH 8, 0,5 % SDS) et 7 μL de protéinase K (20 mg/mL de stock) dans les billes et incuber en tournant à 55 °C (12 tr/min) pendant 45 min.
9. Faites tourner les billes pendant 1 min à 1 100 x g. Transférez le surnageant dans un tube de gel à verrouillage de phase pré-filé de 2 mL et ajoutez un volume (250 μL) d’alcool isoamylique phénol/chloroforme (25:24:1). Retournez les tubes cinq fois et faites-les tourner pendant 10 min à 16 000 x g à température ambiante.
10. Ajoutez 1,5 μL de glycogène, 1/10 volume de NaOAc 3M (pH 5,2) et 2,5 volumes d’éthanol à 100 % dans un nouveau tube de 1,5 mL. Pipetez l’ADN du tube de gel à verrouillage de phase et mélangez en inversant cinq fois. Incuber pendant 1 h à -20 °C.
11. Essorage à 16 000 x g pendant 35 min à 4 °C. Lavez l’ADN avec 200 μL d’éthanol à 80 % et essorez-le à 16 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
12. Faites sécher les granulés à l’air libre et ajoutez 15 μL de 10 mM de Tris-Cl (pH 8) dans chaque tube. Laissez les tubes sur de la glace pendant 20 min et remettez doucement en suspension. Combinez le contenu des trois tubes en un seul tube (45 μL).
13. Vérifiez l’efficacité du goutte-à-goutte par qPCR en utilisant 5 μL des 45 μL d’ADN remis en suspension (voir Résultats représentatifs). Diluez les 5 μL dans 10 μL d’eau et utilisez 2 μL par réaction.

5. Étape de pré-bibliothèque pour l’ADN soniqué uniquement

REMARQUE : La sonication conduit le brin d’ADNsb déplacé des boucles R à se rompre. Ainsi, les structures à boucle R à trois brins sont converties en hybrides ADN :ARN à deux brins lors de la sonication. Par conséquent, ces hybrides ADN :ARN doivent être reconvertis en ADN double brin avant la construction de la banque. Ici, une deuxième étape de synthèse de brin est utilisée. Une autre approche qui a été utilisée avec succès consiste à effectuer une ligature d’ADN simple brin suivie d’une synthèse de second brin⁵³.

1. Aux 40 μL d’ADN goutte à goutte de l’étape 4.12, ajoutez 20 μL de tampon 5x second brin (200 mM Tris pH 7, 22 mM MgCl₂, 425 mM KCl), 10 mM de mélange dNTP (dATP, dCTP, dGTP et dTTT ou dUTP si l’utilisateur prévoit réaliser un séquençage DRIP spécifique au brin), 1 μL 16 mM NAD, et 32 μL d’eau. Bien mélanger et incuber 5 min sur glace.
2. Ajouter 1 μL d’ADN polymérase I (10 unités), 0,3 μL de RNase H (1,6 unités) et 0,5 μL d’ADN ligase d’E. coli . Mélanger et incuber à 16 °C pendant 30 min.
3. Nettoyez immédiatement la réaction à l’aide de billes paramagnétiques avec un rapport de 1,6x. Éluer l’ADN dans 40 μL de 10 mM de Tris-Cl (pH 8).

6. Étape de sonication préalable à la bibliothèque pour l’ADN RE uniquement

REMARQUE : Le goutte-à-goutte permet de récupérer des fragments d’ER qui ont souvent des kilobases de longueur et ne conviennent donc pas à la construction immédiate d’une bibliothèque.

1. Pour réduire la taille du matériau pour la construction de la bibliothèque, sonicez l’ADN immunoprécipité dans un tube de microcentrifugation de 0,5 ml. Effectuez 12 cycles de 15 s ON / 60 s OFF sur un sonicateur (essorage après six cycles pour assurer une sonication homogène). Passez à l’étape 7.
   REMARQUE : Le matériau immunoprécipité porte toujours les boucles R à trois brins qui répondent à la sonication différemment de l’ADN double brin flanquant.
2. Étape facultative : Pour égaliser les profils de goutte à goutte, traitez le matériau immunoprécipité avec 1 μL de RNase H dans 1 tampon RNase H pendant 1 h à 37 °C avant la sonication.

7. Construction de la bibliothèque

1. Effectuez la réparation d’extrémité en ajoutant aux 40 μL de l’étape 4.12 (fragmentation de l’ER) ou de l’étape 5.3 (cisaillement de sonication) 5 μL de tampon de 10 module de réparation d’extrémité, 2,5 μL d’ATP de 10 mM et 2,5 μL d’enzyme de module de réparation d’extrémité (50 μL au total). Bien mélanger et incuber 30 min à température ambiante. Inclure 1 μg d’ADN d’entrée RE-digéré et soniqué (DRIP) ou soniqué (sDRIP) pour créer des banques de séquençage de contrôle correspondant à l’ADN d’entrée.
2. Nettoyez la réaction à l’aide de billes paramagnétiques (rapport de 1,6x) et éluez dans 34 μL de 10 mM de Tris-Cl (pH 8).
3. Effectuez le A-tailing en ajoutant 5 μL de tampon 2, 10 μL de 1 mM de dATP et 1 μL d’exo- de Klenow (50 μL au total). Mélangez bien et laissez incuber le mélange pendant 30 min à 37 °C.
4. Nettoyez la réaction à l’aide de billes paramagnétiques (rapport de 1,6x) et éluez dans 12 μL de 10 mM de Tris-Cl (pH 8).
5. Adaptateurs Ligate en ajoutant 15 μL de 2 tampons de ligature rapide, 1 μL d’adaptateurs 15 μM et 2 μL de ligase rapide (30 μL au total). Bien mélanger et incuber 20 min à température ambiante.
6. Nettoyez la réaction à l’aide de billes paramagnétiques (rapport 1x) et éluez dans 20 μL de 10 mM de Tris-Cl (pH 8).
7. Si un cisaillement par sonication a été effectué et que le dUTP a été utilisé à l’étape 5.1, ajouter 1,5 μL (1,5 U) de N-glycosylase uracile et incuber pendant 30 minutes à 37 °C pour obtenir un DRIP spécifique au brin.
8. PCR amplifier 10 μL de la bibliothèque à partir de l’étape 6.6 ou 6.7. Ajouter 1 μL d’amorce PCR 1.0 P5 (voir le tableau des matériaux), 1 μL d’amorce PCR 2.0 P7 (voir le tableau des matériaux), 15 μL de mélange maître et 3 μL d’eau. Bien mélanger.
9. Dans un thermocycleur, exécutez le programme comme indiqué dans le Tableau 1.
10. Procédez à un nettoyage en deux étapes de la bibliothèque à l’aide de billes paramagnétiques. Utilisez d’abord un rapport de 0,65x pour éliminer les fragments de plus de 500 pb. Gardez le surnageant. Procéder à un ratio de 1x sur le surnageant pour éliminer les fragments en dessous de 200 pb. Éluer dans 12 μL de 10 mM de Tris-HCl (pH 8).

8. Contrôle de la qualité

1. Pour vérifier les enrichissements en boucle R par qPCR sur deux loci négatifs et trois loci positifs à l’aide de la méthode Pfaffl, utilisez 1 μL de la bibliothèque de nettoyage de l’étape 6.10. Diluer 1 μL de la bibliothèque dans 10 μL d’eau et utiliser 2 μL par locus.
2. Vérifiez la distribution de taille de la bibliothèque nettoyée à partir de l’étape 6.10 à l’aide d’un kit d’ADN haute sensibilité.

Le DRIP ainsi que le sDRIP peuvent être analysés par qPCR (Figure 2A) et/ou séquençage (Figure 2B). Après l’étape d’immunoprécipitation, la qualité de l’expérience doit d’abord être confirmée par qPCR sur des loci de contrôle positifs et négatifs, ainsi qu’avec des témoins traités par RNase H. Le tableau 2 fournit des amorces correspondant à des loci fréquemment utilisés dans plusieurs lignées cellulaires humaines. Les résultats de la qPCR doivent être affichés en pourcentage d’entrée, ce qui correspond au pourcentage de cellules portant une boucle R au moment de la lyse pour un locus donné. Dans une expérience de goutte à goutte réussie, le rendement des loci négatifs doit être inférieur à 0,1 %, tandis que celui des loci positifs peut varier de 1 % à plus de 10 % pour les loci hautement transcrits tels que RPL13A (figure 2A). Pour le sDRIP, les rendements sont généralement plus faibles (20 % à 50 %), comme en témoigne le DRIP-qPCR, mais semblent affecter la récupération de manière uniforme, de sorte qu’aucun sous-ensemble particulier de R-loops n’est plus affecté qu’un autre. Par conséquent, les cartes dérivées de DRIP, sDRIP et DRIPc sont en bon accord (figure 2B). Les données qPCR peuvent également être affichées sous forme d’enrichissement du pourcentage d’entrée pour les loci positifs par rapport aux loci négatifs, évaluant ainsi la spécificité de l’expérience. Les enrichissements des plis varient généralement d’un minimum de 10 à plus de 200 fois selon les loci choisis pour l’analyse. Lorsqu’une quantification précise sur plusieurs échantillons représentant des knockdowns de gènes, des knock-outs ou divers traitements pharmacologiques est requise, l’utilisation de contrôles de pointe pour normaliser la variation expérimentale entre les échantillons est fortement encouragée. De tels pics peuvent correspondre à des hybrides synthétiques⁵³ ou à des génomes d’espèces non apparentées⁵⁴.

Les matériaux DRIP et sDRIP peuvent être séquencés à l’aide de stratégies de séquençage à une extrémité ou par paires. Les données peuvent être extraites et analysées de la même manière que la plupart des données ChIP à l’aide de pipelines de calcul standard (voir⁴⁵ pour des informations pertinentes au DRIP). Après le découpage de l’adaptateur et la suppression des doublons de PCR, les lectures peuvent être mappées sur un génome de référence et téléchargées sur un navigateur de génome. La figure 2B illustre un résultat attendu typique de DRIP et de sDRIP. La sortie DRIP est représentée par la seule piste verte car elle ne permet pas la spécificité des brins alors que sDRIP montre le mappage de la boucle R aux brins positifs et négatifs indiqués respectivement en rouge et bleu. Les traces de contrôle correspondant à un échantillon prétraité avec la RNase H montrent une nette réduction des signaux, confirmant la spécificité de la technique pour les matériaux dérivés d’hybrides ARN :ADN. Les gains de résolution permis par le sDRIP sont clairement illustrés lorsque l’on compare les tailles de matériel d’ADN d’entrée (Figure 2C). La reproductibilité du sDRIP-seq, ainsi que l’impact global du prétraitement de la RNase H1 et la corrélation entre le sDRIP-seq et le DRIPc-seq sont représentés par des graphiques XY dans la figure 2D.

Figure 1 : Vue d’ensemble des procédures DRIP-seq et sDRIP-seq. Les deux approches commencent par les mêmes étapes d’extraction d’ADN développées pour préserver les R-loops (les brins d’ARN à l’intérieur des R-loops sont représentés par des lignes ondulées). Pour le DRIP-seq, le génome est fragmenté à l’aide d’enzymes de restriction, ce qui donne souvent des fragments de la taille d’un kilobase dans lesquels des R-loops plus courtes sont intégrées. Pour le sDRIP-seq, le génome est fragmenté par sonication, ce qui entraîne des fragments plus petits et le cisaillement et la perte du brin unique déplacé des R-loops (indiqués par des lignes pointillées). Après une immunoprécipitation avec l’anticorps S9.6, le DRIP conduit à la récupération de boucles R à trois brins intégrées dans des fragments de restriction, tandis que le sDRIP récupère des hybrides ARN :ADN à deux brins avec peu d’ADN flanquant, assurant une résolution plus élevée. Pour le sDRIP, une étape de construction de bibliothèque doit être incluse pour convertir les hybrides ARN :ADN en ADN duplex. Comme indiqué ici, c’est l’occasion de créer des bibliothèques spécifiques à chaque brin. Comme détaillé dans le protocole lui-même, le traitement exogène par la RNase H représente un contrôle clé de la spécificité des deux procédures ; Ils ne sont pas montrés ici. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Résultat des stratégies de cartographie de la boucle R. (A) La qPCR résulte d’immunoprécipitations réussies à l’aide des méthodes DRIP et sDRIP (correspondant à l’étape de contrôle qPCR 4.13). Les résultats proviennent de deux expériences indépendantes menées sur des cellules humaines Ntera-2 au niveau d’un locus négatif et de deux locus positifs, dont le locus RPL13A, très enclin aux boucles R, et le locus TFPT, modérément enclin aux boucles R. L’axe des y indique le rendement de l’immunoprécipitation en pourcentage de l’ADN d’entrée. Notez que la récupération est légèrement plus robuste pour le DRIP que pour le sDRIP. (B) Les résultats de la cartographie R-loop réalisée dans les cellules humaines Ntera-2 sont présentés sur une région centrée autour du gène CCND1 et des gènes ORAOV1 voisins. Les deux premières pistes correspondent aux résultats du DRIP-seq, respectivement sans et avec traitement à la RNase H. La position des enzymes de restriction utilisées pour fragmenter le génome est indiquée en haut. Les six pistes suivantes représentent les résultats d’un sDRIP-seq spécifique au brin, décomposé en brins (+) et (-) (deux répétitions chacun) et prétraité avec la RNase H, ou non, comme indiqué. Les quatre dernières pistes représentent les résultats de la cartographie de la boucle R via la méthode DRIPc-seq spécifique au brin à haute résolution (Sanz et al., 2016 ; Sanz et Chedin, 2019), où les banques sont construites à partir des brins d’ARN des R-loops. Comme on peut le voir clairement, les gènes CCND1 et ORAOV1 conduisent à la formation de boucles R sur les brins (+) et (-), respectivement, conformément à leur directionnalité. Le traitement par la RNase H abolit le signal, comme prévu. (C) Les matériaux d’entrée de l’ADN après la fragmentation de l’enzyme de restriction (à gauche) et la sonication (à droite) sont montrés après que les matériaux ont été séparés par électrophorèse sur gel d’agarose. L’échelle d’ADN correspond à une échelle de 100 pb et la bande de 500 pb est mise en évidence par un astérisque. (D) Des graphiques de corrélation de signaux XY sont présentés pour illustrer la reproductibilité du sDRIP-seq (à gauche), la sensibilité globale du sDRIP-seq au prétraitement de la RNase H1 (au milieu) et la corrélation globale entre le sDRIP-seq et le DRIPc-seq (à droite). Toutes les données proviennent de cellules humaines Ntera-2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Paramètres du programme PCR. La durée et les paramètres de température des cycles PCR sont répertoriés. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Amorces utilisées pour la validation de la qPCR dans les lignées cellulaires humaines. Toutes les séquences sont répertoriées dans la direction 5' à 3'. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Deux protocoles sont décrits ici pour cartographier les structures de la boucle R dans n’importe quel organisme utilisant l’anticorps S9.6. DRIP-seq représente la première technique de cartographie de la boucle R à l’échelle du génome développée. Il s’agit d’une technique facile, robuste et reproductible qui permet de cartographier la distribution des R-loops le long de n’importe quel génome. La deuxième technique, appelée sDRIP-seq, est également robuste et reproductible, mais permet d’obtenir une résolution et une spécificité de brin plus élevées grâce à l’inclusion d’une étape de sonication et d’un protocole de construction de bibliothèque de séquençage toronné. Les deux techniques sont très sensibles au traitement par RNase H avant l’immunoprécipitation, ce qui confirme que le signal est principalement dérivé d’hybrides ARN :ADN authentiques. Enfin, lorsque l’on compare les rendements d’immunoprécipitation entre les loci positifs et négatifs de la boucle R, les deux techniques offrent une différence allant jusqu’à 100 fois dans plusieurs lignées cellulaires humaines, fournissant une cartographie à haute spécificité avec un faible bruit de fond.

Lorsque vous réfléchissez à la méthode à mettre en œuvre, il est utile de tenir compte de leurs forces et de leurs limites respectives. Comme indiqué précédemment, DRIP-seq produit des cartes avec une résolution plus faible et ne donne pas d’informations sur l’inondation de la formation de la boucle R. La résolution inférieure est principalement le produit de l’utilisation d’ERs pour fragmenter le génome. Cette méthode douce est la meilleure pour préserver les R-loops, permettant ainsi une récupération inégalée de ces structures, et rendant le DRIP-seq très robuste. Pour contourner le problème de la résolution limitée tout en préservant une récupération élevée, les cocktails d’ENR peuvent être adaptés et/ou les cartes résultant de différents cocktails d’ENR peuvent être combinées pour améliorer la résolution¹⁶. Une technique utilisant des coupeurs de 4 pb a été développée pour améliorer la résolution du DRIP-seq et peut réaliser une cartographie spécifique au brin^22,55, bien que les ensembles de données résultants n’aient pas encore été systématiquement comparés à d’autres ensembles de données humaines. Il est important de noter que dans les approches basées sur l’ER, les fragments plus gros ont tendance à être récupérés plus efficacement car ils peuvent porter plusieurs régions formant des boucles R. Ce biais doit être pris en compte lors de l’analyse des ensembles de données DRIP-seq. De même, les pics d’appel pour les données DRIP-seq doivent finalement être traduits en fragments d’ERP positifs à la boucle R, car ce sont ces fragments qui sont immunoprécipités et la position des boucles R au sein de ces fragments ne peut pas être déduite. En général, il est recommandé aux utilisateurs d’adopter d’abord le DRIP-seq basé sur l’ER, afin d’apprendre la méthode et de renforcer leur confiance dans l’obtention des rendements documentés à la figure 2A. Le sDRIP-seq entraîne généralement des rendements plus faibles, ce qui peut entraîner des cartes avec des rapports signal/bruit plus faibles entre des mains non entraînées. L’utilisation de la sonication comme moyen de fragmentation du génome offre en retour une grande amélioration de la résolution puisque les parties non en boucle R qui constituent généralement la majorité des fragments d’ER seront brisées, ce qui permet à S9.6 de récupérer principalement les parties en boucle R (Figure 1). Il convient de noter que la sonication provoque la rupture du brin d’ADNsb déplacé des boucles R. Il est donc essentiel d’ajouter une synthèse de second brin après l’immunoprécipitation d’hybrides ADN soniqués :ARN, qui vont reconvertir ces hybrides en ADNdb, avant de construire des banques de séquençage. Sans cette étape, les seuls fragments qui peuvent être ligaturés aux adaptateurs d’ADNdb seront des fragments d’ADNdb d’arrière-plan ; Ainsi, les cartes résultantes seront dépourvues de tout signal. La spécificité des brins offre de nombreux autres avantages à la compréhension des mécanismes de formation des R-loops, faisant du sDRIP-seq une méthode de choix pour l’étude des R-loops.

Il est important de noter que les cartes obtenues via DRIP-seq et sDRIP-seq représentent la distribution moyenne des R-boucles à travers une population cellulaire ; ainsi, la longueur et la position des R-loops individuelles ne peuvent pas être abordées avec ces techniques. Pour cela, une méthode indépendante et complémentaire appelée empreinte de boucle R à molécule unique (SMRF-seq)¹² peut être exploitée pour révéler des boucles R individuelles à haute résolution d’une manière spécifique au brin. L’évaluation de la formation de la boucle R à l’aide du SMRF-seq sur 20 loci différents, y compris indépendamment de S9.6, a révélé une forte concordance entre la collecte des empreintes individuelles de la boucle R et la distribution moyenne de la population recueillie par les approches basées sur le DRIP¹², ce qui apporte un fort soutien aux approches basées sur le DRIP. Il est également important de considérer que les données de cartographie de la boucle R ne fournissent qu’un instantané de la distribution génomique de la boucle R et ne fournissent pas d’informations sur la dynamique de la formation, de la stabilité et de la résolution de la boucle R. Des approches DRRIP, combinées à des traitements médicamenteux spécifiques et à une évaluation des distributions de la boucle R à travers des séries chronologiques, peuvent néanmoins être déployées pour traiter ces paramètres^17,53. Il est particulièrement important de garder à l’esprit les limites des méthodologies de profilage de la boucle R lorsque l’objectif est de caractériser des distributions modifiées de la boucle R en réponse à des perturbations génétiques, environnementales ou pharmacologiques. En plus de ceux déjà décrits ci-dessus, il est essentiel de considérer tout changement possible de la transcription naissante, car ceux-ci provoqueront intrinsèquement des changements de boucle R en raison de la nature co-transcriptionnelle de ces structures. Ces questions et les lignes directrices pour l’élaboration d’approches rigoureuses de cartographie de la boucle R ont été largement discutées^48,56 et les lecteurs sont encouragés à se référer à ces études.

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Les travaux du laboratoire de Chedin sont soutenus par une subvention des National Institutes of Health (R01 GM120607).