Olağandışı Akdeniz Lignoselülozik Kalıntılarından Ultra Hızlı Lignin Ekstraksiyonu

Derin ötektik solvent bazlı, mikrodalga destekli ön işlem, lignoselülozik fraksiyonasyon ve yüksek saflıkta lignin geri kazanımı için yeşil, hızlı ve verimli bir süreçtir.

Ön işlem hala lignoselülozik biyorefinery proseslerinde en pahalı adımdır. Kimyasal gereksinimlerin yanı sıra güç ve ısı tüketimi en aza indirilerek ve çevre dostu çözücüler kullanılarak uygun maliyetli hale getirilmelidir. Derin ötektik çözücüler (DESs), sürdürülebilir biyorefineries'te anahtar, yeşil ve düşük maliyetli çözücülerdir. Bunlar, en az bir hidrojen bağı donörü ve bir hidrojen bağı alıcısından kaynaklanan düşük donma noktaları ile karakterize şeffaf karışımlardır. DES'ler çözücü vaat etse de, rekabetçi karlılık için mikrodalga ışınlama gibi ekonomik bir ısıtma teknolojisiyle birleştirmek gerekir. Mikrodalga ışınlama, ısıtma süresini kısaltmak ve fraksiyonasyonu artırmak için umut verici bir stratejidir, çünkü uygun sıcaklığa hızla ulaşılabilir. Bu çalışmanın amacı, düşük maliyetli ve biyobozunur bir çözücü kullanarak biyokütle fraksiyonasyonu ve lignin ekstraksiyonu için tek adımlı, hızlı bir yöntem geliştirmekti.

Bu çalışmada, 800 W'da 60 sn boyunca mikrodalga destekli bir DES ön işlem yapıldı ve üç çeşit DES kullanılmıştır. DES karışımları kolin klorür (ChCl) ve üç hidrojen-bağ donöründen (HBD) facile olarak hazırlandı: monokarboksilik asit (laktik asit), diyarboksilik asit (oksalik asit) ve üre. Bu ön işlem, deniz kalıntılarından (Posidonia yaprakları ve aegagropile), tarım-gıda yan ürünlerinden (badem kabukları ve zeytin pomace), orman kalıntılarından (çam kozalağı) ve çok yıllık lignoselülozik otlardan(Stipa tenacissima)biyokütle fraksiyonasyonu ve lignin geri kazanımı için kullanılmıştır. Geri kazanılan lignin verim, saflık ve moleküler ağırlık dağılımını belirlemek için daha fazla analiz yapıldı. Ayrıca çıkarılan lignin kimyasal fonksiyonel gruplar üzerindeki DES'lerin etkisi Fourier-transform kızılötesi (FTIR) spektroskopisi ile belirlendi. Sonuçlar, ChCl-oksalik asit karışımının en yüksek lignin saflığını ve en düşük verimi sağladığını göstermektedir. Bu çalışma, DES-mikrodalga işleminin lignoselülozik biyokütle fraksiyonasyonu için ultra hızlı, verimli ve uygun maliyetli bir teknoloji olduğunu göstermektedir.

Sürdürülebilir biyorefinery prosesleri biyokütle işlemeyi, fraksiyonasyonunu ilgi moleküllerine entegre eder ve katma değerli ürünlere dönüştürülmesi¹. İkinci nesil biyorefiningde, biyokütlenin ana bileşenlerine fraksiyone edilmesi için ön işlem şart olarak kabul edilir². Kimyasal, fiziksel veya biyolojik stratejiler kullanan geleneksel ön işlem yöntemleri yaygın olarak uygulanmıştır^3. Bununla birlikte, bu tür ön işlem biyorefiningde en pahalı adım olarak kabul edilir ve uzun işlem süresi, yüksek ısı ve güç tüketimi ve solvent safsızlıkları⁴gibi başka dezavantajları vardır. Son zamanlarda, özellikleri iyonik sıvılarınkine benzeyen DESS³, biyobozunurluk, çevre dostu olma, sentez kolaylığı ve tedaviden sonra iyileşme gibi avantajlar nedeniyle yeşil çözücüler olarak ortaya çıkmıştır⁵.

DESs, laktik asit, malik asit veya oksalik asit gibi en az bir HBD ve betain veya kolin klorür (ChCl) gibi bir hidrojen-bağ kabul edici (HBA)^{karışımlarıdır 6.} HBA-HBD etkileşimleri, kimyasal bağların bölünmesine izin veren, biyokütle fraksiyonasyonuna ve lignin ayrılmasına neden olan katalitik bir mekanizma sağlar. Birçok araştırmacı, mısır koçanı ve stover 7^,8, ChCl-urea üzerinde ChCl-gliserol gibi lignoselülozik hammaddelerin DES tabanlı ön işlemden önce rapor olduğunu bildirmektedir. ve buğday samanı üzerinde ChCl-oksalik asit⁹, Okaliptüs talaş¹⁰üzerinde ChCl-laktik asit ve ahşap üzerinde ChCl-asetik asit¹¹ ve ChCl-etilen glikol¹¹. DES verimliliğini artırmak için, ön işlem biyokütle fraksiyonasyonunu hızlandırmak için mikrodalga tedavisi ile birleştirilmelidir⁵. Birçok araştırmacı, kısa bir süre içinde kolay bir adımda lignoselülozik fraksiyonasyon ve lignin ekstraksiyonu için DES'lerin kapasitesi hakkında yeni bir fikir sağlayan odun⁸ ve mısır sobası, switchgrass ve Miscanthus^5'inböyle bir kombine ön işlemi (DES ve mikrodalga) bildirmektedir.

Lignin, biyopolimerlerin üretimi için hammadde olarak değerlenen fenolik bir makromoleküldür ve aromatik monomerler ve oligomerler gibi kimyasalların üretimi için bir alternatif sunar¹². Ek olarak, lignin antioksidan ve ultraviyole emilim faaliyetleri vardır¹³. Çeşitli çalışmalar kozmetik ürünlerde lignin uygulamaları^{bildirmiştir 14,15}. Ticari güneş koruyucu ürünlere entegrasyonu, ürünün güneşten korunma faktörünü (SPF) SPF 15'ten SPF 30'a sadece 2 wt % lignin ilavesiyle ve SPF 50'ye kadar % 10 wt lignin¹⁶ilavesiyle iyileştirdi. Bu makalede, Akdeniz biyomasseslerinin kombine DES-mikrodalga ön işlem ile desteklenen lignin-karbonhidrat bölünmesi için ultra hızlı bir yaklaşım açıklanmaktadır. Bu biyomasses, özellikle zeytin pomace ve badem kabukları olmak üzere tarım-gıda yan ürünlerinden oluşur. Araştırılan diğer biyomasses deniz kökenli olanlar (Posidonia yaprakları ve aegagropile) ve bir ormandan (çam kozalağı ve yabani otlar) kaynaklananlardı. Bu çalışmanın odak noktası, bu kombine ön işlemden elde edilenin hammadde fraksiyonasyonu üzerindeki etkilerini değerlendirmek, lignin saflığı ve verimi üzerindeki etkisini araştırmak ve çıkarılan lignindeki moleküler ağırlıklar ve kimyasal fonksiyonel gruplar üzerindeki etkilerini incelemek için düşük maliyetli yeşil çözücüleri test etmekti.

1. Biyomasses hazırlanması

1. Biyokütle kurutma
   1. Akdeniz plajlarından hasat edilen Posidonia yapraklarını ve aegagropile toplarını(Posidonia oceanica)72 saat boyunca 40 °C'de bir fırına yerleştirin.
   2. Gıda endüstrilerinden üretilen badem kabuklarını (Prunus dulcis) ve zeytinyağı fabrikalarından elde edilen zeytin pomacesini(Olea europaea L.)72 saat boyunca 40 °C'de bir fırına yerleştirin.
   3. Bir ormandan toplanan çamkozalağını ( Pinus halepensis) ve güney Akdeniz havzasından toplanan alfa yapraklarını (Stipa tenacissima), 72 saat boyunca 40 ° C'de bir fırına yerleştirin.
      NOT: Biyokütle kum içeriyorsa, fırına yerlenmeden önce damıtılmış su ile durulanmalıdır. Biyomasses Şekil 1A-F'degösterilmiştir.
2. Biyokütle taşlama
   1. Her biyokütleden 20 g'ını 1 mm elek ile donatılmış bir çekiç kesiciye yerleştirin. Elde eden tozu 0,25 L beherde toplayın ve 0,5 mm elek ile donatılmış bir çekiç kesiciye besleyin. Tozu 0.25 L beherde toplayın.

2. Mikrodalga destekli, ultra hızlı lignin ekstraksiyonu

1. Derin ötektik çözücü (DES) hazırlama
   1. DES1'i (ChCl-oksalik asit) 1:1 molar oranında, 174 g ChCl'yi 500 mL yuvarlak tabanlı bir şişede 126 g oksalik asit dihidrat ile karıştırarak ve homojen ve şeffaf bir sıvı oluşana kadar 70 °C'de bir banyoda 4 saat eriterek hazırlayın.
   2. DES2'yi (ChCl-laktik asit) 500 mL yuvarlak tabanlı bir şişede 90 g laktik asitle 174 g ChCl karıştırarak ve homojen ve şeffaf bir sıvı oluşana kadar 70 °C'de bir banyoda 4 saat eriterek 1:1 molar oranında hazırlayın.
   3. DES3'ü (ChCl-üre) 500 mL yuvarlak tabanlı bir şişede 120 g üre ile 174 g ChCl karıştırarak ve homojen ve şeffaf bir sıvı oluşana kadar 70 °C'de bir banyoda 4 saat eriterek 1:12 molar oranında hazırlayın.
      NOT: Bu karışımları 500 rpm'de bir karıştırma çubuğu ile sürekli karıştırın.
2. Kombine mikrodalga-DES tedavisi
   1. 5 g hammaddeyi kapalı bir politetrafloroetilen reaktöründe mikrodalga fırına yerleştirin. 50 mL DES ekleyin ve numuneye bir karıştırma çubuğu yerleştirin. Mikrodalga kabı uygun bir kapakla kapatın ve sıcaklık kapağını takın.
   2. Mikrodalga kabı pikap kenarına yerleştirin ve sürekli tedirgin olmasını sağlayın. Mikrodalga gücünü 1 dakika boyunca 800 W'a ayarlayın. Uygun eldivenler kullanarak kabı mikrodalga fırından çıkar ve karışımı soğumaya bırakın. Her biyokütle örneği için üç DES kullanarak bu tedaviyi tekrarlayın.
      NOT: Sıcaklık probinin doğru yerleştirildiklerden ve mikrodalga kabın homojen bir sıcaklığa sahip olduğundan emin olun.
3. Lignin izolasyonu
   1. Etanol:suyu 50:50 (v:v) oranında karıştırarak homojen bir antisolvent çözeltisi hazırlayın. İşlenmiş hammaddeye 50 mL antisolvent çözeltisi ekleyin, karışımı bir santrifüj kabına (250 mL) yerleştirin ve 3.000 × g'da5 dakika santrifüj.
   2. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı (lignin bakımından zengin fraksiyon) bir cam filtre potası (gözeneklilik 4, 10-16 μm, çap 10 mm) kullanarak filtreleyin. Santrifüjlemeden sonra toplanan kalan selüloz kalıntılarını antisolvent çözeltisinin 25 mL'si ile yıkayın.
   3. Her yıkamadan sonra 5 dakika boyunca 3.000 × g'da santrifüj. Tekrar yıkamalar 4x ve cam filtre potasından (gözeneklilik N 4, 10-16 μm, çap 10 mm) yıkamaları toplayın ve filtreleyin.
   4. Filtrelenmiş lignin bakımından zengin fraksiyonu 2.3.2 adımından filtrelenmiş yıkamalara 500 mL yuvarlak alt şişede 2.3.3 adımından ekleyin. 50 °C ve 110 mbar'da döner evaporatör kullanarak etanol buharlaştır.
   5. Konsantre liköre (lignin bakımından zengin fraksiyon) 150 mL deiyonize su ekleyin ve lignin santrifüjleme ile çökeltin. Lignin'i bir pelet olarak toplayın ve 25 mL damıtılmış su ile yıkayın; yıkamaları 4x tekrarlayın. Lignin'i liyofilize edin veya 40 °C'de bir fırında kurutun.
      NOT: Gerekirse, tuzları çözücülerden çıkarmak için lignin >4x yıkayın.
   6. Verimi belirlemek için aşağıdaki formülü kullanın:
      
      NOT: Lignin ekstraksiyonu diğer iki DES ile de gerçekleştirildi: kolin klorür + resorsinol ve kolin klorür + bütirik asit 1 dk. Bununla birlikte, bu DES'ler kullanılarak kurtarılan lignin miktarları, diğer üç DES kullanılarak elde edilen miktarlara kıyasla son derece küçüktü (ve kurtarılanın dışındaydı).

3. Klason tarafından çıkarılan lignin saflık tayini

1. Klason hidrolizi için numune hazırlama
   1. Filtre potasını (gözeneklilik 4, çapı 4,5 mm) 4 saat (2 saat rampası, 25°C'den itibaren) için 550 °C'de bir susturucu fırınına yerleştirin. Fırın 150 °C'ye kadar soğuduğunda potayı çıkarın, soğuması için bir kurutucuya yerleştirin ve tartın.
   2. Bir borosilikat cam tüpe yaklaşık 30 mg lignin ekleyin (Malzeme Tablosunabakın) ve numunenin ağırlığına dikkat edin. Numuneye 1 mL% 72 sülfürik asit (H₂SO₄₎ekleyin, numuneyi 60 dakika boyunca 30 ° C'lik bir banyoya yerleştirin ve her 10 dakikada bir girdapla karıştırın.
   3. Numuneyi çıkarın, 100 mL'lik bir cam şişeye aktarın ve asidi% 4 konsantrasyona seyreltmek için 28 mL damıtılmış su ekleyin. Cam şişeyi 60 dakika boyunca 121 °C'de bir otoklav içine yerleştirin. Cam şişeyi çıkarın ve soğumasını bekleyin.
2. Asit çözünmeyen lignin analizi
   1. Hidrolizatı vakum altında bir pota kullanarak filtreleyin. Tüm katıları deiyonize su içeren bir cam şişede toplayın. Potayı 50 mL deiyonize su ile durulayın.
   2. Katıları içeren potayı 105 °C'de 16 saat fırına koyarak kurulayın. Potayı fırından çıkarın, bir kurutucuya yerleştirin ve soğumasını bekleyin. Örneği tartın.
   3. Potayı 4 saat (2 saat rampa) için 550 °C'de bir susturucu fırınına yerleştirin. Çıkarın ve bir kurutucuya yerleştirin. Örneği tartın.
   4. Asit çözünmeyen kalıntının (AIR) yüzdesini hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın:
      
      WCSA: pota ağırlığı + fırından çıkardıktan sonra numune
      WC: pota ağırlığı
      WCSMF: muşta fırınından çıkarıldıktan sonra pota ağırlığı
      ODW: numunenin fırın kuru ağırlığı
3. Asitle çözünür lignin analizi
   1. Adım 3.2.1'de elde edilen filtratın emiciliğini kuvars cuvettes kullanarak 205 nm'de bir spektrofotometre ile ölçün. Damıtılmış suyu boş olarak kullanın.
   2. Asitle çözünen kalıntının (ASL) yüzdesini hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın:
      
      NOT: Absorbans 0.2 ile 0.7 arasında olmalıdır. Gerekirse numuneyi seyreltin.
      UVabs: 205 nm'de emicilik
      Pathlength: ölçüm hücresinin ışık yolu (cm olarak)
      ε: belirli bir dalga boyunda biyokütle emiciliği

4. Çıkarılan lignin azot içeriği

1. Alkali çözeltisinin hazırlanması
   1. 2,5 L hacimsel şişede, 1 kg sodyum hidroksit (NaOH) ağırlığında ve işarete kadar deiyonize su ekleyin. Şişeye manyetik bir çubuk yerleştirin ve NaOH tamamen çözünene kadar karıştırın.
2. Sülfürik asit çözeltisi hazırlama
   1. 5 L hacimsel şişeye_{0,1 N} H₂SO 4 alın (Malzeme Tablosunabakın), 5 L işaretine kadar deiyonize su ekleyin, manyetik bir çubuk yerleştirin ve içindekiler çözünene kadar karıştırın.
3. Alıcı çözümün hazırlanması
   1. 5 L hacimsel şişede, 100 g H₃BO₃ 'ü (borik asit) deiyonize suda çözün ve hacmi işarete getirin.
   2. 100 mL hacimsel şişede 100 mg bromocresol yeşili tartın ve işarete kadar teknik metanol ekleyin.
   3. 100 mL hacimsel şişede 100 mg metil kırmızısı tartın ve işarete kadar teknik metanol ekleyin.
   4. Adım_{4.3.1'den 5}L H 3 BO₃ çözeltisini, adım 4.3.2'den 100 mL bromocresol yeşil çözeltisini, 4.3.3 adımından metil kırmızı çözeltinin 70 mL'sini ve 5 L deiyonize suyu bir kaba dökün. Alıcı çözeltiyi 30 dakika boyunca iyi çalkalayın.
      NOT: Çözeltinin son rengi yeşil olmalıdır. Renk yeşil değilse, 50 mL 1 N NaOH çözeltisi ekleyin.
4. Numune hazırlama
   1. Bir Kjeldahl tüpüne, azotsuz bir kağıda tartılmış 100 mg lignin yerleştirin, bir tablet Kjeldhal (1,5 g potasyum sülfat (K₂SO₄) + 0,045 g bakır sülfat pentahydrat (CuSO_4,5H2O) + 0,045 g titanyum dioksit (TiO₂₎₎ekleyin ve 7,2 mL konsantre H₂SO₄ekleyin.
      NOT: Boşluk olarak sadece azotsuz kağıtlı (numunesiz) dört tüp kullanın.
5. Örnek sindirim
   1. 360 °C'de haznedeki termostatı 1 saat önceden kapatın.
   2. Numune tüplerini bir rafa yerleştirin, dört boş tüpü rafın dört köşesine yerleştirin ve rafın deliklerini (varsa) boş tüplerle doldurun.
   3. Rafı önceden ısıtılmış hazneye yerleştirin, emme sistemini örtün ve su pompasını açın.
      NOT: Dumandan kaçınmaya özenin; dumanlar ortaya çıkarsa su akışını artırın.
   4. 2 saat sonra, ısıtmayı kapatın, numuneleri çıkarın ve metal bir desteğe yerleştirin. Emme sistemi açıkken rafın yaklaşık 40 dakika soğumasını bekleyin.
6. Kjeldhal damıtma prosedürü
   1. Kjeldahl damıtıcısını aç. Seçim ekranda görünene kadar Kendi kendine testlerin çalışmasına izin ver. Manuel moda geçin, boş bir tüp takın ve süryen kapıyı kapatın.
   2. Titrant burette (0.02 N H₂SO₄₎(kapağı) alta ve üste birkaç kez bastırarak temizleyin ve H₂SO₄ şişesinin tüpünü sıkarak borulardaki hava kabarcıklarını ortadan kaldırın. Kaputu kapatın.
   3. H₃BO₃ alıcı çözeltisini 3x arındırın.
   4. 3x su ekleyin ve Aktif buhara (10 dk) geçin. Kjeldahl 1 analiz programına geçin. Sonuç çizgisi düzeyindeki okları kullanarak Blanco girin.
   5. Tüpü takın. Dört boşlukla başlayın ve ortalamalarını hesaplayın. Değeri Blanco satırına girin.
      NOT: Tüp takıldıktan sonra, cihaz otomatik olarak ve art arda 30 mL H₂O, 30 mL H₃BO₃ve 40 mL 10 N NaOH ekler.
   6. Sonuç satırında titrant mL'ye geçin. Tüpü takın ve kullanılan H₂SO₄ miktarını not edin.
      NOT: Kjeldahl damıtıcıyı test etmek için, 50 mg gliserin% 18.60'a ± % 5 N'ye karşılık geldiğini düşünün. Her titrasyonun sonunda, cihaz tüpü otomatik olarak boşaltır ve temizler.
   7. N yüzdesini hesapla
      
      V s.a: Sülfürik asit hacmi
      T s.a : 0.02 N H₂SO₄
      S: örnek kütle

5. Çıkarılan lignin kül içeriği

1. Seramik potaları 105 °C'de 1 saat kurutun. Onları bir kurutucuda soğumaya bırakın.
2. Bir potayı tartın ve numarasını not edin. Numune tozunun yaklaşık 1 g'ını ekleyin. Potayı aşağıdaki programla susturucu fırınına yerleştirin: 575 °C'ye kadar 2 saat rampası; 575 °C'de 4 saat plato.
3. Fırının 100 °C'ye kadar soğumasını bekleyin. Potaları çıkarın, kurutucuya yerleştirin ve tartın.

6. Karbonhidrat içeriği

1. Sodyum borohidrit (NaBH 4)/dimetilsüllfoksit (DMSO) çözeltisinin hazırlanması
   1. 100 mL hacimsel şişeye 2 g NaBH₄ yerleştirin ve DMSO ile işarete doldurun. Bir Belediye Başkanının banyosunda 100 ° C'ye ısıtın ve çözeltiyi tamamen çözünene kadar karıştırın.
2. MIX çözeltisinin hazırlanması
   1. 100 mL hacimsel bir şişeye ksiloz, arabinoz, rhamnoz, glikoz, galaktoz, mannoz ve 2-deoksiglucose'un her birini 20 mg yerleştirin ve deiyonize su ile 100 mL işaretine kadar doldurun.
3. Numunenin hidrolizi
   1. Bir borosilikat cam tüpte 50 mg'lık bir lignin örneğini tartın, 1 M H₂SO_{4'ün 3}mL'si ekleyin ve karışımı 100 ° C'de 3 saat ısıtın.
   2. Numuneyi soğutun, 1 mL 15 M amonyum hidroksit (NH₄OH) ekleyin ve pH'ı kontrol ederek nötr veya alkali olduğundan emin olun. Her numuneye tam olarak 1 mL iç standart (2-deoksiglucose) ekleyin.
      NOT: dahili standart olarak eklenen 2-deoksiglucose, numunede bulunan her doz miktarını ölçmeyi mümkün kılar.
4. Monosaccharides'in alditol asetat içine azaltılması ve asetilasyonu
   1. 6.3.2 adımından çözeltinin 400 μL'sini alın ve özel tüplere yerleştirin. Kontrol MIX çözeltisinin 400 μL'sini alın ve özel tüplere yerleştirin.
      NOT: MIX çözeltisinin kullanılması, yanıt faktörlerinin (RF' ler) ve monoakkarit yüzdelerinin hesaplanmasını kolaylaştırır.
   2. Bölüm 6.1'de hazırlanan NaBH₄/DMSO çözümünün 2 mL'lik kısmını ekleyin. Tüpü kapatın ve bir su banyosunda 40 ° C'de 90 dakika kuluçkaya yatırın. Tüpü su banyosundan çıkarın ve 0,6 mL buzul asetik asit ekleyin.
      NOT: Bu eksotermik bir reaksiyon olduğu için kabarcıklar ve duman görünecektir.
   3. Yaklaşık 0,4 mL 1-metlimidazol ve yaklaşık 4 mL asetik anhidrit ekleyin. 15 dakika sonra, 10 mL damıtılmış su ekleyin, soğutun ve ~3 mL diklorometan ekleyin (CH₂Cl_2).
   4. En az 2 saat sonra, alt (organik) fazın ~1 mL'sini toplayın ve alev iyonizasyon dedektörü kılcal sütun, HP1-metilsiloksamın (30 m (uzunluk) x 320 μm (iç çap), 0,25 μm (film kalınlığı) ile donatılmış bir gaz kromatografına enjekte edin. Verileri analiz edin.
   5. Yanıt faktörünü (RF) hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın.
      
      A m. p: MIX çözeltisinde monoakkarit zirvesinin alanının ortalaması
      M a. h of 2 - deoksi glikoz: Hidrolizden sonra 2-deoksiglucose kütlesi
      Bir 2dg. p: MIX çözeltisinde 2-deoksiglucose tepe alanının ortalaması
      Monoakkarit M a. h: Hidroliz sonrası monoakkarit kütlesi
      NOT: Anhidro düzeltmesi rhamnoz için 0.8, arabinoz ve ksilose için 0.88 ve mannoz, glikoz ve galaktoz için 0.9'dur. Hidroliz sonrası kütle = MIX çözeltisinde kullanılan monoakkaritin anhidro düzeltmesi x kütlesi (g).
   6. Monoakkarit kütlesini hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın.
      
      Ap. M: Analiz edilen numunede monosakkarit tepe alanı
      M. IS: İç standart kütlesi eklendi; burada, C SI=1 mg/mL
      AP.2: Numunedeki 2-deoksiglucose'un tepe alanı
      RF: yanıt faktörü
   7. Aşağıdaki formülü kullanarak her monoakkarit yüzdesini hesaplayın.
      

7. Çıkarılan lignin kimyasal fonksiyonlar (Fourier dönüştürülmüş kızılötesi)

1. Çıkarılan lignin kimyasal fonksiyonel gruplarını tanımlamak için, zayıflatılmış toplam yansıtıcı (ATR) modülü ile donatılmış bir FT-IR spektrometresi kullanın. Spektroskopi yazılımını açın ve parametreleri ayarlayın: çözünürlük 4 cm^-1, örnek tarama süresi 32, arka plan tarama süresi 16, verileri 4000 ila 400 cm^-1arasında kaydedin, sonuç spektrumu geçirgenliği.
2. Herhangi bir örnek eklemeyin; arka plana tek kanalabasın. Şimdi kristal üzerine numunenin 1 mg'ını yerleştirin ve numune tek kanalabasın. Elde edilen spektrumları işleyin.

8. Çıkarılan lignin moleküler ağırlığı (jel geçirgenlik kromatografisi)

1. %0,5 lityum klorür (LiCl) ile bir dimetilformamid (DMF) çözeltisi hazırlayın. 1 L hacimsel şişeye 5 g LiCl alın, gösterge çizgisine kadar DMF ekleyin ve homojen bir sıvı elde edilene kadar içeriği karıştırın.
2. Lignin örneğinin 3 mg'ını% 0.5 LiCl ile 3 mL DMF'de çözün. 10 mL santrifüj tüpünde santrifüj ve çözünür fraksiyonu bir şişeye ayırın.
3. %0,5 LiCl ile DMF çözeltisinde 3 mg polistiren standardı 1 kDa, 2 kDa, 3 kDa, 10 kDa, 20 kDa ve 30 kDa çözün. 10 mL borosilikat cam tüplerde santrifüj ve çözünür fraksiyonu bir şişeye aktarın.
4. Yüksek performanslı bir sıvı kromatografisi-ultraviyole (UV) sistemi hazırlayın.
   1. Veri sistemini açın ve UV dedektörünü kontrol edin.
   2. Sistemi damıtılmış suyla temizle. Pistonu sıvıya takın (%0,5 LiCl'li DMF). Temizleme vanasını açın ve hattı 15 dakika boyunca 1 mL/dk akış hızıyla arındırın. Akışı durdurun ve temizleme vanasını kapatın.
   3. Dedektöre giden elüent yolunu temizlemek için akış hızını 10 dakika boyunca 1 mL/dk olarak ayarlayın. Akış hızını durdurun.
   4. Bir koruma sütunundan önceki sütunu yükleyin (Bkz. Malzeme Tablosu). Kolon ısıtıcısını 45 °C'de aç, UV dedektörünü aç ve 0,6 mL/dk'lık bir akış hızına ulaşılana kadar akış hızını kademeli olarak ayarlayın.
   5. Her numunenin 30 μL'sını 270 nm dalga boyunda 40 dakika boyunca enjekte edin. Elde edilen verileri işleyin ve kalibrasyon hattını kullanarak kütle dağılımını hesaplayın.
   6. Ortalama moleküler ağırlık (Mn), ağırlık ortalama moleküler ağırlık (Mw) ve polidisperlik indeksini (PDI) hesaplayın.
      
      
      
      Mi: Bir zincirin moleküler ağırlığı
      Ni: bu moleküler ağırlık için zincir sayısı

9. Veri işleme ve istatistiksel analizler

1. Tüm analitik deneyleri üç taraflı olarak gerçekleştirin ve sonuçları kuru maddenin % 'si olarak ifade edin.
2. Varyansın (ANOVA) tek yönlü analizini yapın ve Tukey'in çoklu karşılaştırma testini kullanarak araçları karşılaştırın.
3. Asıl bileşen çözümlemesi (PCA) gerçekleştirin.

Şekil 2A-C, kombine mikrodalga-DES ön işleminden sonra Şekil 1A-F'de gösterilen altı hammaddeden ekstraksiyonun lignin verimini tasvireder. Sonuçlar, DES1 (ChCl-oksalik asit) (Şekil 2A) ile elde edilen lignin veriminin DES2 (ChCl-laktik asit) ve DES3 (ChCl-üre) (Şekil 2B,C)ile elde edilen verimden daha düşük olduğunu göstermektedir. Ayrıca pinecones (PC) ve zeytin pomace (OP) gelen lignin verimi DES1 tedavisi için sırasıyla %32,31 ve %26,04, DES3 için %48,72 ve 43,76 olarak gerçekleşmiştir. Alfa yapraklarından (A) lignin verimi, DES2 ile çıkarılan diğer tüm ligninlerin veriminden önemli ölçüde yüksekti. Şekil 3A-C, %65'lik bir lignin saflığı veren DES3 (ChCl-üre) tedavisinde alfa yaprakları (A), aegagropile (Ag) ve badem kabuklarının (AS) DES3 önktresi dışında, biyomasses'in üç ön işleminde lignin saflığının% 70'i aştığını göstermektedir. En yüksek lignin saflığı (> 90%) DES1 tedavisi ile elde edildi: alfa yaprakları (A) % 94, badem kabukları (AS) % 93, çam kozalağı (PC) % 90, Posidonia yaprakları (PL) % 92 ve zeytin pomace (OP) % 91.

Lignin saflığı ve verim verileri iki parametre (verim ve saflık) ve 18 tedavi göz önünde bulundurularak ana bileşen analizine (PCA) tabi tutulmuştır. Şekil 4 korelasyon çemberinin toplam varyasyonun %100'ünü açıkladığı göstermektedir. İlk bileşen olan PCA1 %58,09'unu, ikinci bileşen olan PCA2 ise toplam varyasyonun %41,91'ini açıkladı. Lignin saflığı DES1 (Ox) tedavisi ile pozitif korelasyona uğramıştır. Pearson korelasyon katsayıları (R) sırasıyla alfa (A Ox) 0.32, zeytin pomace (OP Ox) 0.27, pinecones (PC Ox) 0.2, Posidonia yaprakları (PL Ox) 0.35, badem kabukları (AS Ox) 0.32 ve aegagropile (Ag Ox) 0.05 olarak sıralandı. Bununla birlikte, DES3 tedavisi lignin verimi ile −0.37 ve −0.05 arasında salınan R değerleri ile negatif korelasyon gösterdi. Böylece, PCA sonuçları DES1 ile çıkarılan lignin en düşük verime sahip en saf olduğunu doğruladı.

Lignin şeker, azot ve kül içeriği ile karakterizedir (Şekil 5A-C). Toplam şeker içeriği gaz kromatografisi (GC) ile belirlendi. Lignin'deki karbonhidrat içeriği DES3 (ChCl-urea) kullanılarak çıkarıldı ve en yüksek (%6-15) oldu. Bunu% 3-12 karbonhidrat içeriğine sahip DES2 (ChCl-laktik asit) kullanılarak çıkarılan lignin izledi. Bununla birlikte, en düşük karbonhidrat içeriği (%1) DES1 (ChCl-oksalik asit) kullanılarak çıkarılan lignin için bildirilmiştir. Tanımlanan şekerlerin türü önemli ölçüde farklılık gösterdi(Şekil 6A-C); D-ksiloz ve D-glikoz en bol monoakkaritlerdi. Bu sonuçlar, DES1'in lignin ekstraksiyonunda, sadece lignin değil, aynı zamanda karbonhidratları da çıkaran diğer iki DES ile karşılaştırıldığında son derece seçici olduğunu göstermektedir. Başka bir deyişle, laktik asit ve üre DESs ile ekstraksiyondan sonra lignin saflığı daha düşüktü.

DES1'in lignoselülozik matrisi fraksiyone etmek ve saf lignin çıkarmak için yüksek seçiciliği muhtemelen hidrojen bağlarının yüksek asitliğinden dolayıdır (alfa = 1.3). Kolin klorür, hidrojen bağlarının intramoleküler etkileşimlerini kıran klorür iyonları içerir ve oksalik asitteki karboksilat grupları lignin polimerlerini eritmeye katkıda bulunur. Benzer şekilde, DES1 kullanılarak çıkarılan lignin azot içeriği, DES2 ve DES3 kullanılarak çıkarılan lignin azot içeriğinden daha düşüktü ve% 3'e kadar ulaştı (Şekil 5A-C). Alfa yapraklarından çıkarılan Lignin en yüksek azot içeriğine sahipti: SıRASıYLA DES1, DES2 ve DES3 için 2.70, 3.84 ve 3.40. Bu sonuçlar azotlu bileşiklerin çıkarıldığını ve lignin ile birlikte çöke gerildiğini kanıtlamaktadır. Ayrıca, tüm örneklerde lignin kalsinasyonu, DES2 ve DES3 kullanılarak çıkarılan lignin, DES1 kullanılarak çıkarılan lignin'den daha yüksek bir inorganik bileşen içerdiğini gösterdi.

Bu sonuçlar, DES1'in yüksek saflıkta, ancak düşük azot, karbonhidrat ve kül içeriği ile lignin ekstraksiyonu teşvik ettiğini göstermektedir. Başka bir deyişle, DES1 (ChCl-oksalik asit) kullanılarak çıkarılan lignin, daha düşük saflık ve yüksek azot, karbonhidrat ve kül içeriğine sahip DES2 (ChCl-laktik asit) ve DES3 (ChCl-urea) kullanılarak çıkarılandan daha saftı. Tablo 1, jel geçirgenlik kromatografisi (GPC) ile analiz edilen ve ortalama moleküler ağırlık (Mn), ağırlık-ortalama moleküler ağırlık (Mw) ve polidispersisite indeksi (PDI) ile temsil edilen lignin moleküler kütle dağılımını özetlemektedir. M_w değerleri 48.123 ila 147.233 g mol^-1arasında değişmektedir. DES2 tarafından alfa yaprakları, badem kabukları ve aegagropile'den çıkarılan lignin, DES1, DES3 ve alkali tarafından çıkarılan lignin yanı sıra ham lignin'den daha düşük bir PDI'ya sahipti. Buna karşılık, DES2 tarafından çam kozalağı, zeytin pomace ve Posidonia yapraklarından çıkarılan lignin daha yüksek PDI gösterdi. Aegagropile'den çıkarılan lignin alt PDI'sı, moleküler ağırlığının diğer biyomasseslerden çıkarılan ligninlerden daha homojen olduğunu gösterir.

Çıkarılan lignin içinde bulunan kimyasal fonksiyonel gruplar FTIR spektroskopisi ile araştırılmıştır (Şekil 7A-F). 3.441 ile 3.198 cm^-1 arasındaki güçlü ve geniş bant, hidrojen bağlanmasında rol oynayan alkollü ve fenolik hidroksil gruplarının OH germe titreşimlerine atfedildi. Dalga sayısı aralığı 2.963-2.852 cm^-1 olan sinyaller alkil C-H germe titreşimlerine atanmıştır. Zeytin pomace, alfa yaprakları ve badem kabukları diğer biyomasses daha yoğun bantlar gösterdi. 2.800 ila 1.800 cm^-1arasında bant gözlenmedi. DES1 ve DES2 tedavisi ile elde edilen lignin 1.708 cm^-1'deyükselen bir bandı vardı, bu da yargısız C=O gruplarının varlığını gösteriyordu. Ancak, bu sinyal çözücü spektrumunda yoktu (Şekil 8B). Laktik ve oksalik asit spektrası, 1.737-1.723 cm^-1 aralığında, yargısız C=O gruplarının varlığını gösteren bir bantla karakterize edilirken, üre spektrumu amid gruplarına atfedilen 1.660 cm^-1 ve 1.604 cm^-1 dalga sayısı aralığında iki sinyal ile karakterize edildi. 1.606-1.618 cm^-1'deki bantlar, halka konjuge C=C streç ile ilişkili DES1 ve DES2 tedavisi ile çıkarılan lignin'de gözlendi.

DES3 tarafından çıkarılan lignin^{1.640 cm -1'deki} sinyal, lignin konjuge karbonil gruplarında C=O germe titreşiminin varlığını gösterdi. 1516 cm^-1'deki sinyal lignin içinde bulunan aromatik halkaların titreşimlerinden ortaya çıkarken, 1200 cm^-1'deki bant eter gruplarının varlığını gösteriyordu. Nonaromatik alkollerin C-O gerilmesine 1.250-1.200 cm^-1 dalga sayısı aralığında bantlar atandı. 953 cm^-1'deki bant metil alt bölümlere atandı. Sonuçlar, DES-lignin fraksiyonları spektrumlarının sırasıyla 1.730-1.702 cm^-1 ve 1.643-1.635 cm^-1'desinyaller gösterdiğini göstermektedir. Bununla birlikte, bu bant aralıkları üç ticari ligninde yoktu: ham, soda işlenmiş ve alkali ekstrakte ligninler (Şekil 8A). Bu gözlem, ekstraksiyonu ve çözünmesi sırasında bazı fonksiyonel lignin gruplarının oksalik ve laktik asit ile konjuge edildiğini göstermektedir.

Şekil 1: Akdeniz biyomasses çalışılmış. (A) Badem kabukları, (B) Zeytin pomace, (C) Koni çam, (D) Aegagropile (Posidonia topları), (E) Posidonia yaprakları, (F) Alfa yaprakları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Lignin verimi. (A) Kolin klorür + Oksalik asit (DES1), (B) Kolin klorür + Laktik asit (DES2), (C) Kolin klorür + Üre (DES3). Tek yönlü ANOVA ve Fisher'ın post-hoc testi ile anlamlı farklar belirlenmiştir (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001). Kısaltmalar: A = Alfa yaprakları, AS = Badem kabukları, PC = Pinecones, PL = Posidonia yaprakları, OP = Zeytin pomace, Ag = Aegagropile; ns = önemli değil. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Lignin (%). (A) Kolin klorür + Oksalik asit (DES1), (B) Kolin klorür + Laktik asit (DES2), (C) Kolin klorür + Üre (DES3). Tek yönlü ANOVA ve Fisher'ın post hoc testi ile anlamlı farklar belirlenmiştir (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001). Kısaltmalar: A = Alfa yaprakları, AS = Badem kabukları, PC = Pinecones, PL = Posidonia yaprakları, OP = Zeytin pomace, Ag = Aegagropile; ns = önemli değil. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Akdeniz biyomassesinden çıkarılan lignin verim ve saflığının temel bileşen analizi. Hidrojen-bağ kabul eden (HBA) kolin klorürdür (ChCl) ve hidrojen-bağ donörleri (HBD) Ox = oksalik asit, Lac : laktik asit ve Üre'dir. PCA = ana bileşen analizi; A = Alfa yaprakları, AS = Badem kabukları, PC = Pinecones, PL = Posidonia yaprakları, OP = Zeytin pomace, Ag = Aegagropile. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Karbonhidrat (%), azot (%) ve kül içeriği (%) lignin örneklerinde. (A) Kolin klorür + Oksalik asit (DES1), (B) Kolin klorür + Laktik asit (DES2), (C) Kolin klorür + Üre (DES3). Tek yönlü ANOVA ve Fisher'ın post-hoc testi ile anlamlı farklar belirlenmiştir (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001). Kısaltmalar: A = Alfa yaprakları, AS = Badem kabukları, PC = Pinecones, PL = Posidonia yaprakları, OP = Zeytin pomace, Ag = Aegagropile; ns = önemli değil. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Lignin örneklerinde monoakkaritlerin tanımlanması (%). (A) Kolin klorür + Oksalik asit (DES1), (B) Kolin klorür + Laktik asit (DES2), (C) Kolin klorür + Üre (DES3). Tek yönlü ANOVA ve Fisher'ın post-hoc testi ile anlamlı farklar belirlenmiştir (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001). Kısaltmalar: A = Alfa yaprakları, AS = Badem kabukları, PC = Pinecones, PL = Posidonia yaprakları, OP = Zeytin pomace, Ag = Aegagropile; ns = önemli değil. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Lignin örneklerinin fourier-transform kızılötesi spektrumu. (A) Alfa yaprakları, (B) Badem kabukları, (C) Pinecones, (D) Posidonia yaprakları, (E) Zeytin pomace, (F) Aegagropile. Kısaltmalar: DES1 = Kolin klorür + Oksalik asit, DES2 = Kolin klorür + Laktik asit, DES3 = Kolin klorür + Üre. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: Fourier-transform kızılötesi spektra. (A) Lignin kontrolleri, (B) hidrojen bağı donörleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Ligninlerin moleküler ağırlıkları. Kısaltmalar: A = Alfa yaprakları, AS = Badem kabukları, PC = Pinecones, PL = Posidonia yaprakları, OP = Zeytin pomace, Ag = Aegagropile; Mn = sayı-ortalama moleküler ağırlık; Mw = ağırlık ortalaması moleküler ağırlık; PDI = polidisperlik indeksi; Öküz =oksalik asit; Lac = laktik asit.

Şekil S1: Lignin. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. 

Şekil S2: Otoklavlandıktan sonra numuneler (30 mg lignin + 1 mL% 72 sülfürik asit + 28 mL damıtılmış su). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. 

Şekil S3: Lignin peletleri. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. 

Şekil S4: Maksimum lignin içeriğini kurtarmak için katı kalıntı dört kez yıkandı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. 

Şekil S5: Lignin kontrollerinin jel geçirgenlik kromatogramları, ham ve alkali ekstraktlandırılmış ligninler. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. 

Şekil S6: Lignin örneklerinin jel geçirgenlik kromatogramları. Kısaltmalar: A = Alfa yaprakları, AS = Badem kabukları, PC = Pinecones, PL = Posidonia yaprakları, OP = Zeytin pomace, Ag = Aegagropile; DES1 = Kolin klorür + Oksalik asit, DES2 = Kolin klorür + Laktik asit, DES3 = Kolin klorür + Üre. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Şekil S7: Lignin ekstraksiyonu için derin ötektik çözücü (DES)-mikrodalga işleminin akış sayfası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.  

Bu çalışmanın birçok amacı vardı; bunlardan ilki, hem iyonik sıvıların hem de organik çözücülerin özelliklerine sahip düşük maliyetli yeşil çözücüler hazırlamak ve kullanmaktı. İkinci amaç, alkali çözücüler, temel veya termofizik teknikler kullanılarak Soxhlet veya hemiselüloz kullanılarak çıkarılabilirlerin çıkarılması gibi ön adımlar gerektirmeden biyokütleyi fraksiyone etmek ve lignin'i tek bir adımda çıkarmaktı. Üçüncü amaç, işlemden sonra basit filtrasyonla, pH ayarı olmadan, sadece damıtılmış su ekleyerek lignin geri kazanılmasıydı. Üç farklı DES kullanarak mikrodalga destekli, DES tabanlı proses kullanılarak altı farklı kaynaktan lignin ultra hızlı ekstraksiyonunun sonuçları, ekstraksiyon veriminin DES'in biyokütle ve doğasına bağlı olarak değişebileceğini göstermektedir. Örneğin, her üç DES arasında lignin ekstraksiyonunun en yüksek verimi zeytin pomace'dendi. Bunu alfa yaprakları, çam kozalakları ve badem kabuklarından elde edilen verim izledi. Ekstraksiyon verimleri Posidonia oceanicayaprakları ve topları için daha düşüktü.

Lignin saflığı Klason, Kjeldahl (azot), karbonhidrat (GC) ve kül yöntemleri kullanılarak değerlendirildi. Şekil 3 ve Şekil 5A-C'degösterildiği gibi, lignin saflığı, azot, karbonhidrat ve kül bileşenlerinin lignin ile birlikte çökeltme nedeniyle azaldı. DES1 ile lignin ekstraksiyonu için koşullar yüksek saflık sağladı, ancak düşük verim, lignin verimi ve saflığı arasındaki pozitif korelasyon için proses iyileştirmelerinin gerekli olduğunu gösteriyor. İşlem süresi daha uzunsa, mikrodalga gücü 800 W'tan 1200 W'a yükseltilirse veya solid:solvent (1:10) oranı azalırsa lignin verimi artırılabilir. Lignin moleküler ağırlık verileri, tedaviden sonra lignin parçalarının ayrışması veya repolimerizasyonu hakkında bir fikir sağlar. Mikrodalga-DES kullanılarak ekstraksiyondan sonra biyomasses için lignin Mw'sinde bir artış gözlendi, örneğin, Posidonia yaprakları söz konusu olduğunda (Mw, DES3 için 50093 ve DES1 için 70726'dır), bu da depolimerizasyonun lignin çıkarılması sırasında gerçekleştiğini ve DES'in etkisi altında karbon-karbon interunitinin hızlı bir şekilde yeniden depolimerizasyonu ile takip edildiğini göstermektedir. Bu, dağıtımı stabilize etmek için formaldehit gibi bir yakalama aracısının kullanılmasını gerektirir.

DES ön işlemlerinde, lignin ayrışması ve yoğuşması iki rakip reaksiyondur. Çıkarılan ligninlerin PDI'sı, literatürde bildirilen organik çözücüler (etanol / su / H₂SO₄) tarafından çıkarılan kayın lignininden daha düşüktür¹⁷. Bu, DES tedavisinin lignin'deki moleküler ağırlık homojenliğini organik çözücülerle tedaviye kıyasla iyileştirdiğini gösterir. FTIR spektrumu, lignin fonksiyonel gruplarının kullanılan DES çözücüden etkilendiğini gösterir. Spectra, 1.730-1.702 cm^-1'de, yargısız karbonil gruplarının germe titreşimine atanan sinyalleri gösterirken, 1.643-1.635 cm^-1'deki zirveler konjuge karbonil gruplarının germe titreşimini gösterir. Bu sonuçlar, Akdeniz biyomassesundan (şu anda düşük değerli olan ve yem veya toprak değişikliği olarak kullanılan) katma değerli lignin çıkarma olasılığını göstermektedir ve lignin saflığını sağlarken en uygun DES çözücünün belirlenmesine yardımcı olabilir. Örneğin, DES1 lignin en saf ekstraksiyonu gösterdi, ancak diğer iki DES kullanılarak gözlemlenenden daha düşük verimle.

Önerilen yöntem ucuz ve yeşil ChCl-oksalik asit derin ötektik solvent sistemi nedeniyle kolayca uygulanabilir. Kolin klorür organik bir tuzdur ve oksalik asit, düşük maliyetli bol miktarda bulunan bitkilerin doğal bir ürünü olarak mevcuttur. Bu teknik (bir adımda biyokütle fraksiyonasyonu ve yüksek saflıkta lignin geri kazanımı sağlayan ultra hızlı bir protokol), mikrodalga-DES işlemi kullanılarak laboratuvar ölçeğinde veya DES-ultrason işlemi kullanılarak pilot ölçekte veya konveksiyonel ısıtma ile çalışılana benzer bir kimyasal bileşime sahip her türlü lignoselülozik biyokütle için geçerlidir.

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını bildiriyor.

MK ve TB, istatistiksel analizler ve rakam hazırlama için Haitham Ayeb'e, Walloon Bölgesi'ne (Avrupa Bölgesel Kalkınma-VERDIR) ve Yükseköğretim ve Bilimsel Araştırma Bakanı'na (Taoufik Bettaieb) finansman için teşekkür ediyor.