Kortikal Fare Astrositlerini Bireyselleştirmek için Çok Elbiseli Genom Bütünleştirici Renk (MAGIC) İşaretçilerinin Utero Elektroporasyonunda

Astrositler serebral korteksi düzgün bir şekilde döşer ve karmaşık morfolojilerinin analizini hücresel düzeyde zorlaştırır. Burada sağlanan protokol, kortikal astrositleri ayırmak ve hacimlerini ve morfolojilerini kullanıcı dostu bir görüntü analizi ardışık düzeni ile analiz etmek için rahim elektroporasyonunu temel alan çok renkli etiketleme kullanır.

Fare serebral korteksinde bulunan protoplazmik astrositler (PrA) sıkıca yan yana getirilir ve yetişkin aşamalarında görünüşte sürekli üç boyutlu bir matris oluşturur. Şimdiye kadar, hiçbir immünostaining stratejisi onları ayıramaz ve morfolojilerini olgun hayvanlarda ve kortikogenezi boyunca segmentlere ayıramaz. Kortikal PrA, dorsal palyumda bulunan progenitörlerden kaynaklanır ve bütünleştirici vektörlerin utero elektroporasyonunda kullanılarak kolayca hedeflenebilir. Bu hücreleri, belirli hücre altı bölmelere hitap eden farklı floresan proteinleri (mavi, siyan, sarı ve kırmızı) stochastically ifade etmek için piggyBac / Tol2 transpozisyonuna ve Cre /lox rekombinasyonuna dayanan çok adresli genom bütünleştirici renk (MAGIC) İşaretleyici stratejisi ile etiketlemek için bir protokol sunulmaktadır. Bu çok renkli kader haritalama stratejisi, gliogenez başlamadan önce yakındaki kortikal progenitörleri renk belirteçlerinin kombinasyonlarıyla işaretlemeyi ve bireysel hücre düzeyinde embriyonikten yetişkin aşamalarına kadar astrositler de dahil olmak üzere soyundan gelenleri izlemeyi sağlar. Çok Elbiseli Genom Bütünleştirici Renk İşaretleyicileri (MAGIC Markers veya MM) tarafından sağlanan elektroporlu vektörlerin ve renk kontrastlarının konsantrasyonunu ayarlayarak elde edilen yarı seyrek etiketleme, yoğun anatomik düzenlemelerine rağmen astrositleri bireyselleştirmeyi ve bölgelerini ve karmaşık morfolojilerini ayırmayı sağlar. Burada sunulan, elektroporasyon prosedürünün ayrıntılarını, konfokal mikroskopi ile çok kanallı görüntü yığınlarının alımını ve deneycinin bireysel PrA hacmini ve morfolojisini değerlendirmesini sağlayacak bilgisayar destekli üç boyutlu segmentasyonu içeren kapsamlı bir deneysel iş akışı sunulmaktadır. Özetle, MAGIC Marker'ların elektroporasyon, çok sayıda astrositleri ayrı ayrı etiketlemek ve anatomik özelliklerine farklı gelişim aşamalarında erişmek için uygun bir yöntem sağlar. Bu teknik, transgenik muhabir çizgilerine sahip karmaşık haçlara başvurmadan çeşitli fare modellerinde kortikal astrosit morfolojik özelliklerini analiz etmek için yararlı olacaktır.

Astrositler beyin gelişiminde ve fizyolojisinde çok sayıda hayati fonksiyon oynar¹. Besin alımını ve kan akışını düzenledikleri kan-beyin bariyerindeki rollerinin yanı sıra, nöronal aktiviteyi ve davranışı değiştirebilecek nöromodülatörler üretirken sinaps oluşumuna ve işlevine aktif olarak katkıda bulunurlar². Ayrıca, astrosit disfonksiyonu çeşitli nörolojik bozukluklara katkıda bulunur³. Serebral kortekste bulunan astrositler, nöronal süreçlerle kapsamlı temas sağlayan ayrıntılı bir morfoloji gösterir. Devre fonksiyonu için gerekli olan bu kontaklar, hücre yapıştırma proteinleri aracılığıyla astrosit morfogenez ve sinaptogenez de kontrol eder⁴. Nörobilimciler, ilgi duydukları nörolojik modellerinde astrosit gelişimini ve morfogenezini araştırmak için uygun ve sağlam araçlara ihtiyaç duyarlar. Bununla birlikte, astrositlerin komşularına yakın apsesi ve tek tip üç boyutlu döşemeleri nedeniyle, kortikal astrositleri ayırt etmek ve immünobelerler kullanarak morfolojilerini kapsamlı bir şekilde değerlendirmek zordur.

Şu anda, iki ana genetik mühendislik stratejisi kortikal astrositlerin yerinde etiketlenmesini ve bireyselleştirilmesini sağlar: transgenik fare çizgilerinde seyrek muhabir aktivasyonu veya muhabir plazmidlerinin elektroporasyonunu kullanarak somatik transgenez. İlk strateji, tamoksifen teslimatında özellikle astrositlerde aktive edilen indükleyici bir Cre rekombinaz formunu ifade eden farelerle floxed bir muhabir fare hattının yetiştirilmesine dayanır (örneğin, Aldh1l1-CreERT2^5). Bu strateji ile çeşitli dezavantajlar ilişkilidir. İlk olarak, üreme transgenik fareler çok sayıda hayvan gerektirir ve kortikal astrositlerin yeterince seyrek etiketlenilmesini sağlamak için uygun tamoksifen dozunu belirlemek için tipik olarak çoklu testlere ihtiyaç vardır. Kortikal astrosit fenotiplerinin genetik bir fare modelinde analiz etmek daha da fazla üreme ve fare tüketimi gerektirecektir. Ayrıca, rahim tamoksifen enjeksiyonunun parturition'a müdahale etmesi bilinmektedir, bu da bu stratejinin astrosit gelişiminin en erken aşamalarının incelenmesine uygulanmasını zorlaştırır. In vivo DNA elektroporasyon, minimum sayıda hayvana dayanan alternatif bir tamoksifen içermeyen stratejidir⁶. Embriyonik veya postnatal evrelerde gerçekleştirilen bu yaklaşım, kemirgenlerin lateral ventriküllerine muhabir plazmidlerinin enjekte etmesi ve ardından hücre zarında gözenekler oluşturan elektrik darbelerinden oluşur, bu nedenle DNA'nın ventrikül astarlı progenitör hücrelere girmesini sağlar. Daha sonra, elektroporlu plazmidler tarafından taşınan muhabir transgenleri hedeflenen hücre makineleri tarafından işlenir ve⁷ifade edilir. Daha önce fare kortikal astrositlerini etiketlemek için iki elektroporasyon yöntemi tanımlanmıştır: 1) Doğum sonrası astrosit Etiketleme elektroporasyon (PALE), erken doğum sonrası aşamalarda 1-2 tek renkli epizomal muhabir plazmidlerinin elektroporasyona dayanır^4; 2) Birden fazla tek renkli bütünleştirici muhabir plazmidlerinin utero elektroporasyonunu (UUİ) temel alan StarTrack stratejisi^8,9,10. Bu iki teknik serebral kortekste PrA'yı verimli bir şekilde etiketlemekle birlikte, bazı sınırlamalar da sunar. İlk sürümlerinde, her iki yöntem de astrositlerde ifadeyi yönlendirmek için glial fibril asidik protein (GFAP) promotörüne dayanır, bu da etiketlemeyi radyal gliaya ve GFAP'ı normal dinlenme PrA^11,12'dendaha güçlü ifade eden pial ve reaktif astrositlere yönlendirebilir. PALE ile ilgili olarak, diğer dezavantajlar, erken doğan PrA'nın (veya erken delaminasyon progenitörlerinden kaynaklananların) etiketlenmesini ve astroglia gelişiminin erken aşamalarının analizini önleyen elektroporasyonun geç aşaması ve PrA'nın doğum sonrası ilk hafta^13,14sırasında geçirdiği büyük çoğalma sırasında ardışık bölünmelerle seyreltilen epizomal vektörlerin kullanımıdır. PALE'in aksine, StarTrack, hem embriyonik hem de postnatal progenitörlerin PrA'ya katkısını izlemeye izin veren bütünleştirici muhabir plazmidlerinin embriyonik elektroporasyonuna dayanmaktadır. Ubiquitin C promotörüne (UbC-StarTrack)dayanan güncellenmiş bir StarTrack şeması, nöral progenitörlerin hem nöronal hem de glial inişinde (astrositler dahil) floresan muhabirlerin daha geniş bir ifadesini elde eder^15,16,17. Bununla birlikte, mevcut versiyonunda, bu yaklaşımın uygulanması karmaşıktır, çünkü kısmi ekssitasyon ve emisyon spektrumu çakışması ile altı floresan proteini (FP) ifade eden 12 farklı plazmidden oluşan eşitlikçi bir karışıma dayanır.

Burada sunulan, kortikal astrositleri ayırmaya yönelik güçlü ve geniş ölçüde aktif bir promotör tarafından yönlendirilen bütünleştirici muhabir yapıları kullanılarak utero elektroporasyon tabanlı çok renkli etiketleme yönteminde basittir¹⁴. Buna ek olarak, astrosit bölgesel hacmini ve arborizasyonunu segmentlere ayrıştırmak için hem lisanslı (örneğin, imaris) hem de açık erişim (Vaa3D^18,19,20)görüntü analizi yazılımı kullanılarak kolay bir görüntü analizi ardışık düzeni sağlanır. Daha önce açıklanan yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu strateji yalnızca ifadesi sitomegalovirüs arttırıcıdan oluşan sentetik bir CAG promotörü tarafından yönlendirilen sitoplazmik ve (isteğe bağlı olarak) nükleer hücre bölmesine yönlendirilen^1-2çok renkli bütünleştirici transgenes Multiaddressable Genom Bütünleştirici Renk İşaretçilerine (MAGIC Markers veya MM 21) dayanır, tavuk β-actin promotörü ve tavşan β-globin splice kabul sitesi²². Bu, embriyonikten doğum sonrası evrelere kadar kortikal astrositlerin etiketlenmesini ve izlenmesini sağlar, GFAP ekspresyasyonundan bağımsız^{olarak 14,23}. Bu transjenlerin her biri aşağıdaki dört farklı FP'yi taşır: eBFP, mTurquoise2/mCerulean, EYFP ve tdTomato/mCherry, 1) Sıralı kanal alımı ile kolayca atlatılabilen minimal spektral çakışmayı gösterir; 2) Optimize edilmiş heyecan gücü ve toplama kazancı; ve 3) Dar FP emisyon pencerelerini toplamak için özel dikroik filtreler. MM stratejisi, hücresel bir popülasyonda FP'nin stokastik ifadesini yönlendirmek için kendiliğinden çıkarılabilir bir Cre rekombinaz (seCre) ile Cre /lox rekombinasyonunu kullanır. MM transgene'in tek bir kopyası FP'yi birbirini dışlayan bir şekilde ifade ederken, birden fazla transjen FP kombinasyonlarına yol açarak düzinelerce farklı ton oluşturur. Transgenes genomik entegrasyonu piggyBac (PB) veya Tol2 transpozisyon sistemi^24,25^,26tarafından tahrik edilir. Bu nedenle, rahim elektroporasyonunda, MM araç seti ve ürettiği çok renkli 'mozaik', birden fazla bitişik kortikal progenitörün aynı anda işaretlenmesini ve kortikal astrositler de dahil olmak üzere glial inişlerinin uzun süreler boyunca izlenmesini sağlar. PrA'nın konturunun farklı FP izin tanımlamasının ifade edilmesi ve daha sonra bölgesel hacimleri (IMARIS kullanılarak) ve karmaşık morfoloji (Vaa3D kullanılarak) hakkında önemli bilgiler çıkarılmasından kaynaklanan renk kontrastları. Burada ayrıntılı olarak sunulan çok renkli strateji, çeşitli gelişim aşamalarında vahşi tip farelerde kortikal astrosit yüzeyine ve morfolojisine hızlı ve kolay erişim sağlayan, transgenik muhabir çizgileri kullanmadan nörolojik hastalıkların fare modellerindeki astrosit anatomik özellikleri araştırmak için kolayca uyarlanabilen kullanışlı ve sağlam bir yöntemdir.

Burada açıklanan tüm hayvan prosedürleri kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Hayvan protokolleri Charles Darwin hayvan deney etik kurulu (CEEACD/N°5) tarafından onaylanmıştır.

1. Utero elektroporasyonda MAGIC İşaretleyiciler için endotoksin içermeyen plazmidlerin hazırlanması

1. Bakteriyel dönüşüm
   1. Buz üzerinde, -70 °C'de depolanan DH5 alfa yetkin hücrelerini çözün.
   2. Uygun antibiyotiği (100 μg/mL ampisilin veya 50 μg/mL kanamycin) içeren agar plakalarını 37 °C'de ısıtın.
   3. 10 μL çözülmüş DH5 alfa yetkin hücrelerinde 1 μL 5–50 ng MAGIC Markers plazmid DNA ekleyin ve karıştırmadan 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatın.
   4. Isı şoku dönüşümü için, aliquot'u 45 s için 42 ° C su banyosuna yerleştirin, ardından hemen buza yerleştirin ve 3-5 dakika bekleyin.
   5. Steril koşullar altında, 230 μL SOC ortamı ekleyin ve 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
   6. Aliquot içeriğini agar plakasının üzerine yayın ve 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yayın.
2. Plazmid kültürü
   1. Ertesi sabah, steril koşullar altında, agar plakasından bir koloni alın ve uygun antibiyotik ile 2 mL LB ortamı içeren 14 mL'lik bir tüpe koyun. 37 °C'de 300 rpm'de sallanan bir inkübatörde gün boyunca kuluçkaya yatmasına izin verin.
   2. Günün sonunda, adım 1.2.1'den 2 mL başlangıç kültürünü kullanarak antibiyotikli 300 mL LB tohumu ve 300 rpm'de sallanan bir inkübatörde 37 ° C'de bir gecede kuluçkaya yaslanın.
3. Plazmid DNA hazırlığı
   1. Ertesi sabah, üreticinin protokolünü takip eden endotoksin içermeyen bir maxiprep kiti kullanarak MAGIC Markers plazmid DNA'sının (örneğin, PB-CAG-Cytbow ve Tol2-CAG-Nucbow'un yanı sıra PB ve Tol2 transposases ve Cre recombinase'yi ifade eden CAG tahrikli plazmidlerin) saflaştırılmasına devam edin.
   2. DNA'yı 200 μL steril suda elute edin ve -20 °C'de depolamadan önce bir spektrofotometre kullanarak konsantrasyonunu tahmin edin.

2. Utero elektroporasyonunda MAGIC İşaretçilerine Hazırlık (MM IUE)

1. Çözüm hazırlama
   1. Bir su banyosunda 37 °C'de % 0,9 tuzlu su çözeltisinin 30 mL'sini ısıtın ve ameliyat süresince sıcak tutun.
   2. PB-CAG-Cytbow ve Tol2-CAG-Nucbow içeren bir plazmid karışımı hazırlayın (son konsantrasyon, Her biri 0,8 μg/μL), PB ve Tol2 transposazları (son konsantrasyon, her biri 0,4 μg/μL), CAG-seCre (son konsantrasyon, 0,16 μg/μL) ve PBS'de Ca 2+ ve Mg^{2+ olmadan %0,01} Hızlı Yeşil boya.
      NOT: Astrosit anatomik rekonstrüksiyon amacıyla Tol2-CAG-Nucbow yapısı atlanabilir. Bununla birlikte, bu plazmid, yakından yan yana astrositlerin çiftlerini ayırt etmek ve astrositler arasındaki klonal ilişkileri araştırmak için MAGIC İşaretleyicileri kullanırken^{yararlıdır 14}.
   3. 2 mL salin çözeltisinde seyreltilmiş 100 μL ketamin (100 mg/mL) ve 100 μL ksilazin (20 mg/mL) içeren anestezik çözelti hazırlayın.
   4. Salin çözeltisinde 0.3 mg/mL buprenorfin stok çözeltisi 1:10 seyrelterek analjezik çözelti hazırlayın.
2. Ameliyat malzemesinin hazırlanması
   1. Cerrahi aletleri (bkz. Malzeme Tablosu)bir cam boncuk sterilizatör veya eşdeğerinde yüksek sıcaklıkta sterilize edin.
   2. 35 mm'lik bir çanağa bir damla elektrot jeli yerleştirin.
   3. Mikropipti mikroenjektör tutucusuna yerleştirin, mikropiptenin ucunu kırın ve DNA çözeltisini arzulayın.
   4. 1 μL'lik bir Hızlı Yeşil çözelti damlası yerleştirin (%0,01) 3 cm'lik bir kabın kapağında ve referans olarak kullanarak, ucunu ince asalarla kırarak mikropipette ucunun çapını ayarlayın. Basınç parametresini, eşdeğer boyuttaki damlaların mikroenjektör tarafından üretilecek şekilde ayarlayın, böylece enjeksiyon başına yaklaşık 1 μL DNA çözeltisi verilmesini sağlar.
3. Hamile dişi farenin hazırlanması
   1. RjOrl:SWISS hamile faresini tartın.
   2. Anestezik çözeltinin gram vücut ağırlığı (BW) başına 12,5 μL ile intraperitoneal enjeksiyon gerçekleştirin. 5 dakika bekleyin ve farenin parmak ucunu kıstırarak uyuduğunu doğrulayın.
   3. Hayvan sıkıştırmak için tepkisiz olduğunda, 1.6 μL / g BW analjezik çözelti ile deri altından enjekte edin.
   4. Ameliyat sırasında kurumayı önlemek için her göze bir damla oküler jel ekleyin ve hayvan göbeğini ısınma yastığına yerleştirin.
   5. Karnını hafifçe tıraş edin, iyotla ıslatılmış bir ped ile temizleyin ve tıraş edilen bölgeyi bir alkol pedi ile sterilize edin.
   6. Tıraş edilmiş, temizlenmiş ve sterilize edilmiş alanın etrafına steril kompresler yerleştirerek bir çalışma alanı düzenleyin.

3. Rahim elektroporasyonunda (İEÜ)

1. İntraventriküler enjeksiyon
   1. Karnın alt kısmından başlayarak, deriden ve daha sonra alttaki kastan başlayarak orta hat boyunca 2 cm dikey bir kesi kesin. Embriyonik torbaları nazikçe manipüle ederek rahim boynuzlarını açığa çıkarın ve serviksin yerini ve serviksin her iki tarafındaki embriyonik torbaların sayısını değerlendirin.
   2. E15.5 embriyosunun beynini, konumu serebral çatlaklar boyunca uzanan üç ana kan damarının birleştiği yerle eşleştiği için kolayca tanınan bregmayı görmek için elektroporasyona yönlendirin.
   3. Bregma (kafatasından görülebilir) ve göz arasında sanal bir çizgi düşünün; sanal hat ile boyuna fissür arasındaki mikropipleti tanıtın, ardından hedeflenen yarımkürenin lateral ventrikülünde 1 μL DNA çözeltisi sunmak için enjektörün ayak pedalını basın.
      NOT: Uygun yere enjekte edildiğinde, doldurulan lateral ventrikül mavi görünür ve dna çözeltisi ile doldurulduğunu gösterir.
2. Elektroporasyon
   1. Elektrotları uygulayın (bkz. Malzeme Tablosu),daha önce elektrot jeline batırılmış, enjekte edilen embriyonun her iki tarafına enjekte edilen yarımküreyi kaplayan anot ile. Her biri 950 ms arayla ayrılmış 35 V'luk dört adet 50 ms darbe serisi sunmak için elektroporatörnün ayak pedalına basın.
   2. Embriyoyu ısıtılmış tuzlu su çözeltisi ile nemlendirin.
      NOT: Tüm cerrahi operasyon sırasında embriyolar ısıtılmış tuzlu su çözeltisi kullanılarak nemli tutulmalı ve rahim kurumamalıdır.
   3. Her embriyo için 3.1.2–3.2.2 adımlarını tekrarlayın.
   4. Hedeflenen tüm embriyolar elektropore edildikten sonra, karındaki rahim boynuzlarını yavaşça torpidolarla orijinal konumlarına geri iterek değiştirin. Dikişler yapılırken rahmin kurumasını önlemek için karın boşluğunu ısıtılmış tuzlu su çözeltisi ile doldurun.
   5. Önce sürekli emilebilir bir dikişle karın kasını ve ardından 4-0 dikiş kullanarak birden fazla bireysel dikişli (~10) cildi kapatın.
   6. Hayvanı temiz bir kafese koyun, temiz bir kağıt havlunun üzerinde yan yatın ve uyanıp kendi kendine hareket etmeye başlayana kadar hayvanı her 5-10 dakikada bir diğer tarafa çevirin.
   7. Özellikle bir yuva yapılmışsa, ertesi gün hayvanın durumunu değerlendirin.
      NOT: Postürji tedavisine gerek yoktur. Bir yuvanın yokluğunda, herhangi bir ağrı belirtisi (örneğin, secde, tüylü kürk) ve / veya ağır kanama, hayvan gecikmeden ötenazi yapılmalıdır.

4. Doku toplama ve bölümleme

1. Doku toplama
   1. İstenilen hasat zamanında terminal anestezi için fenobarbital (100 mg/kg BW) intraperitoneal enjekte edin. Bu durumda, hasat süreleri P4, P7 ve P21 doğum sonrası (P) günlerindeydi.
   2. Soğuk prematüre paraformaldehit bazlı çözelti kullanarak intra kardiyak perfüzyon gerçekleştirin.
   3. Beyni parçalara ayrıştırın ve gece boyunca 4 °C'de postfixasyon için paraformaldehit bazlı çözeltiye yerleştirin.
2. Histoloji
   1. Ertesi sabah beyni 1x PBS ile 10 dakika boyunca 3x durulayın.
   2. Beyni 1x PBS'de çözünmüş% 3 agarose içine gömün.
   3. Titreşimli bıçak mikrotom kullanarak 80 μm kesitler kesin.
   4. Bölümleri 1x PBS ile önceden doldurulmuş 24 kuyu plakasında toplayın.
   5. Slayt ve kapak arasına montaj ortamına bölümler monte edin (bkz. Malzeme Tablosu). Optimum floresan protein koruması ve uzun süreli depolama için monte edilmiş slaytları -20 °C'de tutun.

5. Çok kanallı konfokal görüntüleme

1. Mikroskop ayarları
   1. Sırasıyla 440, 515 ve 559 nm lazer hatları kullanarak mCerulean/mTurquoise2, EYFP, tdTomato/mCherry'yi ayrı ayrı heyecanlandıracak şekilde konfokal mikroskop konfigürasyonunun ayarını ayarlayın.
   2. 20x 0,8 NA (veya daha yüksek NA) hedefi kullanın ve XY örneklemeyi ve Z-adım boyutunu Nyquist kriterlerine göre ayarlayın.
      NOT: Daha yüksek çözünürlük (örneğin, 60x 1.4 NA yağ hedefi) ve dekonvolüsyon algoritmaları ile elde edilen görüntüler, astrosit çardaklarının daha ince ayrıntılarının yeniden yapılandırılmasını sağlayacaktır. Bununla birlikte, deneyci en iyi astrosit işlemlerinin geleneksel optik görüntüleme ile çözülmeyebileceğini akılda tutmalıdır.
2. Görüntü edinme
   1. Elektroporlu bölgedeki en parlak astrositleri bulun.
   2. Yüzeye yakın bulunan etiketli hücreler dilimde daha derin olanlardan daha parlak görünebileceğinden, görüntülerin doygunluğunu önlemek için yüzey hücrelerindeki edinme ayarlarını yapın.
   3. Sıfır değeri mavi, maksimum piksel değerlerini kırmızı olarak görüntüleyen HiLo LUT'u kullanarak piksel doygunluğunu önlediğinden emin olurken, üç kanalın her biri için alım ayarlarını ayrı ayrı ayarlayın.
      NOT: Yeterince dengeli bir görüntü yalnızca birkaç mavi ve neredeyse hiç kırmızı piksel görüntülememelidir.
   4. Mikroskobun motorlu aşamasını kullanarak karolu 1.024 x 1.024 piksel Z yığınları elde edin, daha sonra elektroporlu alanın veya ilgi alanının mozaik rekonstrüksiyonlarını etkinleştirmek için bitişik yığınlar arasında% 10 örtüşme.

6. Astrosit bölgesel hacim segmentasyonu

NOT: Bu, ticari bir yazılım programı (örneğin, imaris) kullanılarak gerçekleştirilir.

1. Veri kümesinin hazırlanması
   1. Etiketli astrositleri, tamamen görüntülenmiş doku bölümündeki hücreleri seçerek 3B rekonstrüksiyon (250 x 250 piksel) içinde kırpın.
      NOT: Kullanılan bilgisayar bunları işleyebiliyorsa, doğrudan daha büyük birimler üzerinde çalışmak da mümkündür.
   2. Her astrosit için yeni bir Yüzey oluşturmak üzere Geçmiş görünümünün Nesne araç çubuğundaki Mavi Yüzey düğmesini tıklatın.
   3. Daha iyi görselleştirme kontrastı elde etmek için, önce Düzenle | tıklayarak minimum ve maksimum renk kontrast değerlerini ayarlayın Görüntü Ayarlama seçeneğini gösterin ve her iki tutamacı da sürükleyin. Gerekirse, yeni bir renk seçmek için Görüntü Ayarı penceresinde doğrudan kanal adını tıklatarak kanal rengini değiştirin.
      NOT: Görsel sapmayı önlemek için tercihen her zaman aynı renkli ekranla çalışın.
   4. | Düzenle'ye tıklayın Mikrometrelerdeki voksel boyutunu manuel olarak belirtmek için Görüntü Özellikleri. Voksel boyutu doğru değilse, hacim hesaplamaları yanlış olacaktır.
   5. Yeni ayarları kaydedin.
2. Yüzey segmentasyonu
   1. Bir yüzey tanıtmak için Mavi Simge'yi kullanın. Sahne listesinde bir Yüzey simgesi ve kutusu görünecektir. Birim kutusu veri kümesini görmeye/gizlemeye izin verir.
   2. Yüzey çizgisini seçin ve Otomatik Oluşturmayı Atla | El ile Düzenle.
   3. Kontur | tıklayın Görünürlük ve Yok 'atıklayın. Ardından Seç görünümüne gidin ve Çiz düğmesine tıklayın.
   4. Çizim modunu seçmek için Mod'u tıklatın.
   5. Hızlı ve verimli Isoline yarı otomatik çizim aracını kullanın. Fare işaretçisini üzerine getirerek hücre anahattını tanımlayın. İzoline önizlemesi astrosit anahattıyla eşleşmiyorsa, fare işaretçisi konumunu ayarlayın. Önizlemeyi doğrulamak için seçimi sol tıklatın. Olası hataları düzeltmek için, Geçerli Z düzlemi konturlarını silmek için Pano penceresini kullanın veya Ctrl + Z tuşlarınabasın.
   6. Dilim | Kullanma Z-düzlemleri arasında gezinmek için konum, Z-düzlem numarasını değiştirerek bir sonraki düzleme hareket edin ve yeni bir kontur başlatın. Tercihen hücrenin ortasından başlayın ve sonra ekstremitelere geçin.
   7. Astrosit içeren tüm Z düzlemlerinde konturlar çizildiğinde, Yüzey Oluştur 'utıklatın. Yüzey oluşturmadan önce, tüm bileşenlerin bağlı olup olmadığını kontrol edin. Değilse, birim verilerini vermeden önce en büyükleri seçin veya ilgili olanları bağlayın.
   8. Veri Paneli'nde görüntülenen nicel verileri denetleyin ve istatistikleri elektronik tablo biçiminde dışa aktararak birim değerini ve birimini tasarruf edin.
   9. Yüzeye daha sonra erişmek için yeni bir adla kaydedin.

7. Astrosit arborizasyonunu izleme

NOT: Bu, açık erişim yazılım programı Vaa3D kullanılarak yapılır.

1. Veri kümesinin hazırlanması
   1. Görüntü yığınını yükleyin ve farklı renkler görüntüleyen yalıtılmış astrositleri veya yakındaki astrositleri arayın.
      NOT: Nesnel NA ve örnekleme artırılarak yeniden yapılandırmanın çözümü geliştirilebilir. Bununla birlikte, konfokal mikroskopinin çözünürlük sınırı nedeniyle, en iyi astrosit işlemleri doğru bir şekilde izlenemez. Elde edilen görüntülerin çözünürlüğünün ötesinde aşırıya kaçılmasını önlemeye özen göstermelisiniz.
   2. Fiji'yi kullanarak, her astrositin etrafına 250 x 250 piksel görüntü yığınlarını kırpin.
   3. Vaa3D izleme yalnızca bir renkte gerçekleştirilirken, bir kanal seçin ve diğer kanalları devre dışı bırakın.
   4. Görüntüyü RGB'ye dönüştürün ve .tiff biçimde kaydedin.
2. Arbor izleme
   1. RGB görüntüsünü Vaa3D'de açın. Resim | git Veri | Geometri daha sonra görüntü yeniden örneklemeve X/Y ve Z voxel boyut değerlerini ayarlayın.
      NOT: Astrosit çardakları yeniden yapılandırırken, görüntülerin sağladığı çözünürlükten daha ince ayrıntıları izlememeye dikkat edilmelidir.
   2. Görüntünün tamamı için Visualize | 3D görüntüleyiciyetıklayarak bir 3D pencere açın. Bir 3D görüntüye sağ tıklayın ve işaretleyici tanımlamak için 1 sağ tıklatmayıseçin. İmleçle astrositin ortasına gelin ve bir işaretleyici ayarlamak için sağ tıklatın.
      NOT: 3D görünüme tekrar erişmek için Escape'e tıklayın.
   3. Gelişmiş | 3D izleme | gidin Vaa3D-Neuron2-otomatik izleme.
   4. Yeni açılan pencerede, eklentinin uygulanacağı kanalı seçin.
   5. Bir arka plan eşiği seçin (genellikle 30 ile 90 arasında). Gerekirse bu değeri her astrosit için uyarla.
   6. Radius'un 2D'den işaretini kaldırın ve Otomatik aşağı örnekle ve otomatik yeniden örnekle işaretli tutun.
   7. cnn_type 3, length_thresh 1 ve SR_ratio 0,1 olarak ayarlayın.
   8. Tamam 'ı tıklatırktansonra, eklentinin otomatik olarak orijinal ada göre iki dosya oluşturduğundan emin olun. –ini.swc ve -coordinateX–coordinateY-coordinateZ-app2.swc soneki eklenecektir. Eklentiyi çalıştırmaya devam ederken üzerlerine yazmamak için bu ad dosyalarına el ile ayırt edici bir etiket ekleyin.
   9. Nesne Yöneticisi'neaçık , Neuron |'e gidin Çizgi yapısı, izlenen astrosit'i seçin, Görüntü Modu 'nutıklatın ve Her zaman satır modu 'nuseçin.
   10. Astrosit iskeletinin göründüğü 3B pencereye geri dönün.
       NOT: Segmentasyon ve sinyal eşleşmezse, 7.2.3–7.2.10 adımlarını yineleyin ve eş eşikleri eşleşene kadar ayarlayın. Eklenti yeniden başlatıldığında diğer parametreleri sıfırlandıklarında yeniden girdiğinizi unutmayın.
   11. İskelete sağ tıklayın ve ilk tercih nöron | satırı #1'i seçin... Yeni bir pencerede görünecek nicel ölçümlere erişmek APP2_Tracing Yüzey| Nesne Ek Açıklaması.
       NOT: Işık mikroskopisinin sınırlı çözünürlüğü nedeniyle, listelenen öğelerin altında görüntülenen ölçümler Dal sayısı ve Çatallanma sayısı, astrosit çardak karmaşıklığının sadece kaba bir tahminini sağlar.

Embriyonik kortikal progenitörlerde MAGIC İşaretleyicilerin elektroporasyonu, astrositlerin serebral korteks gelişiminin erken ve geç aşamalarından itibaren etiketlenmesini sağlar (Şekil 1). Bu astrositler tüm kortikal katmanlarda çeşitli postnatal evrelerde (P4, P7, P21) bulundu ve tüm serebral kortekse geniş bir şekilde dağıldılar. 20x 0.8 NA (veya daha yüksek NA) hedefiyle elde edilen ve Z-stack rekonstrüksiyonları olarak monte edilen karo konfokal görüntülerle değerlendirildiler (Şekil 2). MAGIC Markers kombinatoryal etiketleme, kortikal astrositlerin bireyselleştirilmesini ve hacimleri ve morfolojileri ile ilgili bilgilerin çıkarılmasını sağladı. Ticari görüntü analizi yazılımı kullanılarak, her bir astrosit tarafından işgal edilen bölgesel etki alanını segmentlere ayırıp yeniden oluşturmak için konfokal görüntü yığınlarının her bir optik bölümünde tek tek astrositlerin konturu tanımlanmıştır (Şekil 3). Aynı Z-görüntü yığınlarından, tekli kortikal astrositlerin dallı morfolojisi, ana astrosit işlemlerinin iskeletinin çıkarılmasına izin veren açık erişim yazılımı kullanılarak bölümlere ayrılmıştır (Şekil 4). Bu segmentasyon ve izleme araçları, erken ve geç postnatal evrelerden itibaren bireysel kortikal astrositler için meydana gelen bölgesel hacmin artışı (Şekil 3) ve morfolojik karmaşıklığın (Şekil 4) yarı yeterli bir değerlendirmesini sağlamıştır¹⁴. Bu yaklaşımlar ayrıca Şekil 2, Şekil 3ve Şekil 4'tegösterildiği gibi, gelişimin aynı aşamasında farklı kortikal astrositler tarafından görüntülenen hacim ve morfolojinin heterojenliğini ortaya koydu.

Şekil 1: Beyin gelişimi sırasında kortikal progenitörleri ve inişini etiketlemek için utero elektroporasyonunda (UUİ) MAGIC İşaretçilerinin (MM) şematik gösterimi. (A) MM araç seti PB-Cytbow, Tol2-Nucbow, PB ve Tol2 transposases ve kendinden heyecanlanabilir Cre rekombinaz (seCre) kodlayan çeşitli plazmidlerden oluşur. MM yapılarında, üç çift uyumsuz lox sitesi (loxN, lox2272ve loxP) dört farklı FP kodlama dizisini (EBFP2, mTurquoise2/mCerulean, EYFP, tdTomato/mCherry) yansır ve Cre rekombinasyonu üzerine karşılıklı olarak münhasır eksizyon olanakları yaratır. Cre eyleminden önce, sadece ilk gen (EBFP2) ifade edilir. seCre tarafından indüklenen Cre aracılı eksizyondan sonra, tdTomato/mCherry (kırmızı FP), EYFP (yeşil FP) veya mTurquoise2/mCerulean (siyan FP) ifade edilir. FP'nin birden fazla MAGIC İşaretleyici kopyasından birlikte ifade etmesi, etiketli hücrelerin sitoplazmasında (PB-CAG-Cytbow) veya çekirdeğinde (Tol2-CAG-Nucbow) renk kombinasyonları verir. MM kasetlerini çerçeveleyen PB ve Tol2 transpozisyon endfeetleri, MM yapıları PB ve Tol2 transposases kodlama plazmidleri ile birlikte koelektropize edildiğinde kortikal progenitörlerin genomuna entegrasyonlarına izin veriyor. (B–G) İEÜ'nün, uyuşturulmuş hamile farelerin laparotomisi (B),embriyoların lateral ventriküllerine MM plazmid karışımının (C) enjeksiyonu (D), iki beyin yarımküreden birinde(F)kortikal progenitörleri hedeflemek için dikkatlice yerleştirilmiş cımbıztrodlar (E) yoluyla elektrik darbelerinin verilmesi ve hamile fare karnının dikilmesini (G) içeren ardışık adımların grafik illüstrasyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: MAGIC Markers araç setinin utero elektroporasyonunda, doğum sonrası evrelerde tüm serebral kortekste dağılmış çok renkli astrositler bulunmuştur. E15.5 fare kortikal progenitörlerinde MM, seCre, PB ve Tol2 transposases ekspresyonlarını kullanan plazmidlerin IUE'si P4, P7 ve P21'de katman 2-3 nöronların ve astrositlerin etiketlenmesi ile sonuçlandı. ekspresyon seviyesi ve renk paleti kortikal progenitörlerin genomuna entegre edilen MM transgenes sayısına bağlı olarak ortaya çıkmıştır. 80 μm sagittal beyin kesitlerinde elde edilen karo konfokal görüntü yığınlarından maksimum yoğunluk projeksiyonlarının montajı. Ölçek çubuğu: 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Kortikal astrosit bölge etki alanının farklı gelişim aşamalarında segmentasyonu. Kırpılmış konfokal Z-yığını çerçeveleme bireysel astrositlerinin(A-F)ve ticari yazılımla(A'-F') ilişkili bölge etki alanlarının üç farklı gelişim aşamasında maksimum yoğunluk projeksiyonları: P4(A-B, A'-B'), P7 (C-D, C'-D') ve P21 (E-F, E'-F'). Ölçek çubuğu: 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Kortikal astrosit arborizasyonunun izlenmesi. Konfokal Z yığınlarından (A-D) kırpılan iki farklı astrosit örneği ve sırasıyla P7 (A-B, A'-B' )ve P21 (C-D, C'-D') olmak üzere iki farklı gelişim aşamasında toplanan Vaa3D (A'-D'ile bölünmüş arborizasyon kabalarının yeniden yapılandırılması. Ölçek çubuğu: 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Kortikal progenitörlerdeki MAGIC Marker'ların utero elektroporasyonunda (İEÜ) (Şekil 1) doğum sonrası serebral korteks boyunca astrositlerin farklı postnatal aşamalarda etiketlenmesini sağladı (P4-P7-P21, Şekil 2). İlginçtir ki, E13.5'ten E15.5'e gerçekleştirilen elektroporasyon kortikal astrositler¹⁴ile ilgili benzer etiketleme desenleri verdiğinden, İEÜ'nün aşaması kritik değildir. Bununla birlikte, etiketli piramidal nöronların kortikal parenkimdeki yeri elektroporasyon aşamasına göre değişir. Gerçekten de, İEÜ E15'te 2-3 nöron katmanını işaretlerken, İEÜ, katman 5'ten katman 2-3^6,27'yekadar tüm kortikal katmanlarda E13 etiketlerinde piramital nöronlarda gerçekleştirildi. MM IUE'yi takip eden kortikal piramidal nöronların bu eklem etiketlemesi, yoğun nöronal etiketlemenin astrosit süreçlerinin tanınmasını engellediği katmanlarda astrosit morfolojisinin yarı otomatik segmentasyonunu önlediği için bu yöntemin ana sınırlamasıdır. Bu bir sorun olursa, MM PALE'de olduğu gibi doğum sonrası aşamalarda elektropore edilebilir. P4'te, o aşamada hala mevcut olan radyal glia liflerinin etiketlenmesi de Vaa3D çardak segmentasyonuna müdahale edebilir. Hantal olsa da, bu aşamada astrosit arbor rekonstrüksiyonuna devam etmek isteyen bir çözüm, Adobe Photoshop kullanarak radyal fiber sinyalini ilgi çekici astrosit etrafında siyah piksellerle kademeli olarak değiştirerek radyal glial lifleri manuel olarak çıkarmaktır.

Bu sınırlamaya rağmen, MM IUE yeterince gerçekleştirildiğinde güçlü bir tekniktir. Birkaç kritik adımın özenle ele alınması gerekir: 1) embriyolar tüm ameliyat prosedürü sırasında nemli tutulmalı ve hayatta kalmalarını artırmak için dikkatlice manipüle edilmelidir; 2) büyük çaplı cam kılcal damarlar kullanmak veya embriyonik torbaları çok sıkı sıkmak torba yırtılmasına ve dolayısıyla embriyoların ölümüne yol açabilir; 3) DNA enjeksiyonu sırasında kanamayı önlemek için kan damarlarından kaçınılmalıdır; 4) embriyo sağkalımını en üst düzeye çıkarmak için anesteziden dikişe kadar tüm prosedür 40 dakikadan fazla sürmemelidir; 5) stres İEÜ başarısında kritik bir rol oynar ve bu nedenle kürtaj ve yamyamlığı önlemek için ameliyattan 5 gün öncesine, doğumdan 7 güne kadar kafes değişimi, ulaşım, gürültü ve titreşim gibi ekstra stres kaynaklarından kaçınılmalıdır.

Not olarak, belirli bir aşamada doğan hücreleri özellikle hedeflemek isteyen deneyciler, piggyBac ve Tol2 transpozazlarını eklemeden MM araç setini kullanabilirler, böylece sadece elektroporasyon zamanında doğan hücreler kombinatoryal etiketleri ifade eder. Yöntemin bir diğer avantajı, etiketli hücrelerin yoğunluğu ve çeşitli beyin bölgelerindeki konumları açısından sağladığı esnekliktir. Nitekim, kortikal astrositlerin daha yoğun etiketlenebilmesi, plazmid oranını sabit tutarken MM transgenes'in toplam konsantrasyonunun artırılmasıyla elde edilebilir (Cre rekombinaz/MM yapıları için 1:10 oranı ve transposazlar/MM yapıları için 1:2 oranı). Tek renkli transpozonların elektroporasyon veya Ai9 farelerde Cre elektroporasyon gibi tek renkli yaklaşımların aksine, bireysel astrositleri ayırt etme yeteneğinin seyrek etiketleme gerektirdiği durumlarda, MAGIC Markers stratejisi tarafından sunulan renk kontrastları, astrositlerin çok çeşitli etiketleme yoğunlukları üzerinde bireyselleştirilmesini sağlar. Ek olarak, elektrot problarının farklı yönelimlerde konumlandırılması, prospektif striatum (ventral pozisyonda anot, serebral kortekste elektroporasyon elde etmek için gereken dorsal pozisyonun karşısında anot) veya hipokampus (medial pozisyonda anot) gibi farklı beyin bölgelerini hedeflemeye izin vermektedir²⁸. Son olarak, İEÜ, transgenik hayvan hastalığı modellerinde MM araç setinin kullanılmasının yolunu açan, yetiştirilmiş (OF1, İsviçre) ve inbred (C57BL/6J veya N) fareler gibi farklı fare suşlarında gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, doğuştan farelerde İEÜ'yü başarıyla elde etmek için, bakliyat sayısını (C57BL / 6 fareler için İsviçre'de beş darbeye karşı üç darbe), voltajı (35 V yerine 30 V) ve analjezik dozu (0.15 mg / mL buprenorfin stok çözeltisi ve enjekte edilen hacim 0.8 μL / g BW) uyarlanmalıdır.

Transgenik hayvan yetiştiriciliği veya PALE ve StarTrack yaklaşımları ile karşılaştırıldığında, bu yöntem çeşitli avantajlar sunar. Başlangıç olarak, üreme stratejisinin aksine, az sayıda hayvan kullanır. Ayrıca, postnatal elektroporasyona dayanan PALE^4'ünaksine, embriyonik aşamalar da dahil olmak üzere gelişimlerinin ilk aşamalarından beri kortikal astrositlerin etiketlenerek etiketlanmasına izin verir. Ayrıca, StarTrack yaklaşımı^8'dekullanılan on iki muhabir yapısına kıyasla, bu strateji sadece iki çok renkli transgene dayanır, böylece DNA karışımı hazırlama ve görüntülemeyi daha basit hale getirir. Ayrıca, MM tarafından stochastically ifade edilen farklı renkler arasındaki denge özünde transgenes yapısı tarafından belirlenir ve deneyci tarafından farklı bileşenlerin karıştırılmasına bağlı değildir. Ek olarak, bu strateji basit anatomik değerlendirmenin ötesine uzanabilir ve daha önce yayınlanan çalışmada gösterildiği gibi astrosit gelişiminin çok kaval analizi için başarıyla uygulanabilir¹⁴. Kortikal astrosit klonlarını tanımlamak için sitoplazmik ve nükleer belirteçlerin nadir renk kombinasyonlarını kullanan bu çalışma, oluşturulan hücrelerin mekansal dağılımı, yapısal organizasyonu, sayısı ve alt tipi açısından geniş değişkenlik gösterdiklerini göstermiştir.

MM etiketli kortikal progenitörlerden doğan kortikal astrositler önemli renk kontrastı gösterdi ve tüm serebral korteks boyunca geniş bir şekilde dağıldı (Şekil 2). Konfokal mikroskopi kullanılarak basit çok kanallı Z-yığını kazanımları, bölgesel hacimleri (Şekil 3) ve morfolojik karmaşıklıkları (Şekil 4) gibi önemli astrosit özelliklerine birkaç doğum sonrası aşamada erişmek için kullanılmıştır. Astrositlerin ötesinde, bu metodoloji oligodendrositler gibi diğer glial hücrelerin morfolojisini incelemek için uyarlanabilir. Bununla birlikte, konfokal mikroskopinin sunduğu sınırlı çözünürlüğün sadece astrosit morfolojik karmaşıklığının kısmi bir şekilde işlenmesini sağlayabildiği unutulmamalıdır. Daha yüksek çözünürlükte elde edilen görüntüler (örneğin, 63x 1.4 NA yağ hedefi) ve dekonvolüasyon algoritmaları astrosit arbors^14'ündaha ince ayrıntılarını yeniden oluşturmak için kullanılabilirken, en iyi işlemler geleneksel optik görüntüleme ile çözülemez. Bununla birlikte, burada sunulan strateji, nörolojik hastalıkların fare modellerinde kortikal astrosit hacmini veya morfolojisini etkileyen potansiyel bir fenotip için verimli bir şekilde taranması ilgi çekici olacaktır.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

S. Fouquet'e ve Institut de la Vision ve Institut des Neurosciences de Montpellier'in (MRI ve RAM) görüntüleme ve hayvan çekirdeği tesislerine teknik yardım için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Région Ile-de-France ve Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer'dan S.C'a ve Université Paris-Saclay'dan (Initiatives Doctorales Interdisciplinaires) L.A.'ye burslarla, Avrupa Araştırma Konseyi'nden (ERC-SG 336331, PI J. Valette) - E.H., Agence Nationale de la Recherche tarafından ANR-10-LABX-65 (LabEx LifeSenses), ANR-11-EQPX-0029 (Equipex Morphoscope2), ANR-10-INBS-04 (Fransa BioImaging) sözleşmeleri kapsamında , Fondation pour la Recherche Médicale (Ref. DBI20141231328), Avrupa Araştırma Konseyi (ERC-CoG 649117, PI J. Livet) ve ATIP-Avenir programı (PI K. Loulier) tarafından.