Murin Nörogenezi Sırasında Çentik Sinyal Dinamiğinin Gerçek Zamanlı Biyolüminesans Görüntülemesi

Nöral kök/progenitor hücreleri, hücresel olayların farklı sonuçlarına yol açan Çentik sinyal bileşenlerinin çeşitli ifade dinamiklerini sergilerler. Bu tür dinamik ifade, gen ekspresyonlarında hızlı değişimlerin görselleştirilmesini sağlayan son derece hassas biyolüminesans görüntüleme sistemi kullanılarak statik analizle değil, gerçek zamanlı izleme ile ortaya çıkabilir.

Çentik sinyalizasyonu, nöral kök/progenitor hücrelerinin hücre-hücre etkileşimleri tarafından bakımını düzenler. Notch sinyalbileşenleri dinamik bir ifade sergiler. Çentik sinyal efektörü Hes1 ve Notch ligand Delta-like1 (Dll1) nöral kök/progenitor hücrelerinde salınımlı bir şekilde ifade edilir. Bu genlerin salınım lı ekspresyon süresi çok kısa olduğundan (2 saat), döngüsel ekspresyonlarını izlemek zordur. Gen ekspresyonundaki veya protein dinamiğindeki bu kadar hızlı değişimleri incelemek için hızlı yanıt muhabirleri gereklidir. Hızlı olgunlaşma kinetiği ve yüksek duyarlılığı nedeniyle, biyolüminesans muhabiri luciferase canlı hücrelerdeki hızlı gen ekspresyonu değişikliklerini izlemek için uygundur. Organizatör aktivitesini izlemek için dengesi bozulmuş bir luciferase muhabiri ve protein dinamiklerini tek hücre çözünürlükte görselleştirmesi için luciferase-erimiş bir muhabir kullandık. Bu biyolüminesans muhabirleri hızlı ciro göstermek ve çok zayıf sinyaller üretmek; bu nedenle, bu tür silik sinyalleri tespit etmek için son derece hassas bir biyolüminesans görüntüleme sistemi geliştirdik. Bu yöntemler, canlı hücre ve dokularda çeşitli gen ekspresyonu dinamiklerini izlememizi sağlar, bunlar gerçek hücresel durumları anlamamıza yardımcı olacak önemli bilgilerdir.

Memeli beyin nöronlar ve glial hücrelerin çeşitli çok sayıda oluşur. Tüm hücreler nöral kök / progenitor hücreleri (NPCs), ilk sayılarını genişletmek için çoğalır, sonra nöronlar içine ayırt etmeye başlar ve nihayet glial^hücrelereneden oluşturulur 1^,2,3,4,5. Hücreler nöronlara farklılaştıktan sonra çoğalamazlar veya sayılarını artıramazlar ve bu nedenle ndc'lerin daha sonraki aşamalara kadar sürdürülmesi önemlidir. Hücre-hücre etkileşimleri ile çentik sinyal6^,7NPCs korunmasında önemli bir rol oynar. Çentik ligandları, komşu hücrelerin yüzeyinde ki membran proteini Çentik ile etkileşime girer ve Çentik proteinini aktive eder. Aktivasyon dan sonra, Notch proteinproteozis oluşur, bu nedenle çekirdek^içinehücre zarından Notch (NICD) hücre içi etki alanı serbest 8^,9,10. Çekirdekte NICD, Hes1 ve Hes5 'in(Hes1/5)promotör bölgelerine bağlanır ve bu genlerin ekspresyonunu aktive eder. Hes1/5 pronöral genlerin ekspresyonunu bastırmak Ascl1 ve Neurogenin1 (Neurog1/2)^11,12,13,14. Pronörgenler nöronal farklılaşmayı indüklediği için, Hes1/5 NP'lerin korunmasında önemli rol oynar. Ayrıca, pronörgenler Notch ligand Delta-like1 (Dll1) ekspresyonunu aktive edebildiği için, Hes1/5 de Dll1ekspresyonunu bastırabilir. Bu nedenle, Dll1 ifadesi Komşu hücrelerin Notch sinyalizasyon yoluyla Dll1 için negatif olmasına yol açar. Bu şekilde, hücreler aynı kaderi takip komşu hücreleri inhibe, lateral inhibisyon olarak bilinen bir fenomen⁸. Gelişmekte olan beyinde, lateral inhibisyon çeşitli farklı hücre tipleri üreten bir rol oynar.

Tek hücre düzeyinde gerçek zamanlı görüntüleme NPCs^15,16,17Çentik sinyal bileşenlerinin dinamik ifadeler ortaya koymaktadır. Çentik sinyalhes1ifadesini aktive eder , ama Hes1 protein kendi organizatörü bağlanır ve kendi ifadesini bastırır. Ayrıca, Hes1 son derece kararsız bir proteindir, bu ubikitin-proteozom yolu tarafından bozulur; bu nedenle, kendi organizatörü baskı sadece kısa ömürlü ve daha sonra transkripsiyon tekrar başlar. Bu şekilde, Hes1 ifadesi 2 h döngüsü¹⁸hem transkripsiyon ve çeviri düzeylerinde salınımlar . Hes1 salınımlı ekspresyonu, sırayla, ascl1 gibi downstream hedef genlerin salınım ekspresyonu indükler, Ascl1gibi , Neurog2, ve Dll1, periyodik baskı yoluyla^15,16,17,19. Pronör genler nöronal farklılaşmaya neden olabilirken, salınımlı ekspresyonları nöronal farklılaşma için yeterli değildir; yerine onların sürekli ifade nöronal farklılaşma için gereklidir. Pronör genlerin salınımlı ekspresyonu nöronal farklılaşma yı neden olmaktan ziyade NCD'lerin korunması için önemlidir^14,15,16. Dll1 ekspresyonu nörogenez ve somitogenez gibi çeşitli morfogenez sırasında hem transkripsiyon hem de çeviri düzeyinde salınım lar. Dll1 dinamik ekspresyonu normal morfogenez ve Dll1 sürekli ekspresyonu için önemlidir nörogenez ve somitogenez¹⁷kusurları indükler. Bu bulgular, gen ekspresyonu ve protein kinetik dinamiklerinin çeşitli gelişimsel olayların düzenlenmesi nde sahip olduğu önemli işlevi göstermektedir (örneğin, farklı ifade dinamiği hücresel davranışlarda farklı çıkışlar üretir).

Çentik sinyalleme dinamiklerini analiz etmek için doku ve hücrelerin statik analizi sürekli değiştiği için yetersizdir. Tek hücrelerin gerçek zamanlı görüntüleme gen ekspresyonundaki dinamikleri ortaya çıkarmak için güçlü bir araçtır. Çentik sinyal moleküllerinin dinamik ekspresyonu 2-3 saat süre içinde hızlı döngüsel tepkilere uğrar. Bu hızlı periyodik ifade gerçek zamanlı izleme için iki zor sorun sunar: (1) moleküllerin ekspresyonu düşük seviyelere bastırılır ve (2) hızlı ciro hızlı yanıt muhabirleri gerektirir. Bu sorunların üstesinden gelmek için, daha önce bir biyolüminesans gerçek zamanlı görüntüleme yöntemi²⁰geliştirdi. Biyolüminesans muhabiri floresan muhabirlere göre daha yüksek duyarlılığa ve daha kısa olgunlaşma süresine sahip olduğundan, bu strateji canlı hücrelerdeki hızlı dinamikleri izlememizi sağlar. Gerçek zamanlı görselleştirmeyi kullanarak, daha önce düşündüğümüzden daha fazla genin dinamik ifade sergilediğini bulduk. Buna ek olarak, canlı hücrelerde ekspresyon ve protein dinamiklerini gösteren raporların sayısı ve çeşitli biyolojik olaylarda bu dinamiklerin önemi artmıştır, gen ifadelerinde dinamiklerin temel bir rolü düşündüren^21,22.

Bu raporda, notch ligand Dll1'in npt'lerde hem ayrıştırılmış kültürlerde hem de kortikal dilim kültürlerinde ifadesini görselleştirmenin bir yolunu açıklıyoruz. Dll1 transkripsiyonunun dinamiklerini tek hücre seviyelerinde izlemek için, dll1 organizatörü güdümlü dengesiz luciferase muhabiri pDll1-Ub-Fluc muhabiri nitransgenik farelerin embriyonik telensefalonundan elde edilen ndc'lerin ayrıştırılmış kültürlerini oluşturduk. Dll1 protein dinamiklerini vivo olarak izlemek için, Dll1-Fluc füzyon muhabirini korteksteki NPC'lere tanıttık ve kortikal dilim kültürlerinde NPC'lerde muhabirin ifadesini görselleştirdik. Gerçek zamanlı görüntüleme, yüksek zamansal çözünürlükte canlı hücrelerdeki gen ekspresyonu ve protein dinamiğinin çeşitli özelliklerini yakalamamızı sağladı.

Hayvan denekleri de dahil olmak üzere tüm prosedür, Kyoto Üniversitesi Frontier Life and Medical Sciences Enstitüsü'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Biyolüminesans muhabirleri

NOT: Luciferase muhabiri, bozulma sinyalini kaynaştırarak organizatör aktivitesinin hızlı dinamiklerini ölçmek için uygundur. Ayrıca, luciferase füzyon muhabiri tek hücredeki protein dinamiklerinin izlenmesini sağlar. Muhabirlerin her iki türü de mono katmanlı kültür (ayrışma kültürü) ve doku kültürü (dilim kültürü) deneyi için kullanılabilir.

1. Dll1 organizatör^aktivitesi17 izleme muhabiri
   NOT: Gen ekspresyonundaki hızlı değişimleri izlemek için hızlı tepki ve kararsız muhabir esastır. Firefly luciferase (Fluc) fluorescein muhabirleri ile karşılaştırıldığında hızlı olgunlaşma gösterir. Ubiquitin erimiş luciferase muhabiri (Ub-Fluc) hızlı bozulma ve hızlı ciro gösterir çünkü, çok canlı hücrelerde dinamik gen ekspresyonu izlemek için yararlıdır²⁰.
   1. Dll1 promotör odaklı dengesiz luciferase muhabiri, her yerde bulunan luciferase (pDll1-Ub-Fluc, Şekil 1A üst paneli), transkripsiyonel düzeyde Dll1 ifadesindeki hızlı değişiklikleri izlemek için^{kullanın 17}.
   2. Bu muhabirin kararlı ifadesi için pDll1-Ub-Fluc taşıyan transgenik bir fare hattı oluşturun.
2. Dll1 protein dinamiği^17'yiizlemek için muhabir.
   1. Knock-in farelerin üretimi için, Dll1 kodlama bölgesinin 3 'termini içine luciferase cDNA takın böylece Dll1-luciferase füzyon proteinifade edilir (Dll1-Fluc muhabiri, Şekil 1A, alt panel)¹⁷.
   2. Luciferase aktivitesini ölçerek Dll1'in ifade dinamiklerini protein düzeylerinde izleyin.
   3. Doku düzeylerinde Dll1 protein dinamiklerini izlemek için, dll1-Fluc muhabirini rahim elektroporasyonunda embriyonik telensefalondaki NPC'lere tanıyın.

2. Biyolüminesans görüntüleme sistemi

1. Son derece hassas, su soğutmalı CCD kamera ile yüklü ters bir mikroskop kullanarak bir biyolüminesans canlı görüntüleme sistemi kurun. Gürültüyü azaltmak ve yüksek hassasiyet elde etmek için kamerayı su sirkülasyonu tarafından sağlanan soğutulmuş su ile -90 °C'lik optimize edilmiş bir sıcaklıkta soğutun.
2. Canlı hücre/doku görüntülemesi için, mikroskop aşamasına sıcaklığı ve karışık gazı kontrol eden kuluçka sistemini kurun.
3. Kararsız luciferase muhabirinin ifadesini görüntülemek için yüksek sayısal açı (NA: 1.30) 40x yağ daldırma nesnel lens kullanın. Bu lensin çalışma mesafesi 0.2 mm, sadece mono katmanlı hücre kültürü için değil, aynı zamanda dilim kültür için kullanılabilir.
4. Luciferase ve floresan muhabir ifadesinin çift izlenmesi için LED aydınlatma cihazını mikroskobun ışık yoluna takın.
5. Mikroskopla ilişkili bir yazılımla (örneğin, MetaMorph yazılımının çok boyutlu satın alma programı) hızlandırılmış görüntülemeyi kontrol edin.
6. Kararsız luciferase muhabirinin sinyali çok zayıf olduğu için tüm sistemi karanlık bir odada hazırlayın ve gereksiz ışığın satın alınmasını önleyin.

3. Nöral Kök/Progenitor Hücre (NPC) dissociasyon kültürleri

1. NPC dissosyasyon kültürü için kültür ortamının, yemeklerinin ve reaktiflerin hazırlanması
   1. DMEM/F12 ortamlarında 1x N2, 1x B27, 1 mM N-asetilsistein, 10 ng/mL bFGF ve 50 U/mL Penisilin/Streptomisin konsantrasyonu olan nöral kök/progenitor hücrelerinin kültüre siniiçin N2/B27 ortam hazırlayın.
   2. EBSS medyada 7 U/mL papain, %0.006 DNase ve 1 mM N-asetilsistein içeren dissosilasyon için papain çözeltisini hazırlayın.
   3. Lüminesans görüntüleme için 100 mM luciferin sodyum çözeltisi hazırlayın. N2/B27 ortamlarında 100 mM luciferin çözeltisini 1 mM'lik son konsantrasyona seyreltin.
      NOT: Luciferin otomatik floresan kendisi gösterir. Luciferase-floresan çift görüntüleme durumunda, özellikle EGFP, 0.5 mM luciferin konsantrasyonu düşürücü daha iyidir.
   4. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca 40 μg/mL poli-L-l-lizin (PLL) çözeltisi ile 35 mm cam taban tabaklarını (cam çapı 27-mm) kaplayın. Kuluçkadan sonra, pbs ile plakaları 3x yıkayın ve kurumasına izin.
2. Embriyoların diseksiyonu ve NPC'lerin dissosiyasyonu
   1. Hamile bir pDll1-Ub-luc transgenik fare (embriyonik gün 12.5 (E12.5)) CO₂ boğulma ve servikal çıkış ile ötenazi sonra, karın yoluyla kesilmiş ve rahim çıkarmak.
      NOT: Araştırmacılar, kurumlarının hayvan araştırma komitesinin yönetmelik ve yönergelerine uymak zorundadır. Anestezi veya ağrı kesici ilaçlar kullanılırsa, bunları düzgün kullanın.
   2. 25 mL buz gibi PBS içeren 10 cm Petri kabında rahmi aktarın. Mikro makas ve ince çerkeskullanarak, buz gibi PBS rahim den embriyoları alın.
   3. Her embriyonun kafasını makasla kesin ve buz gibi DMEM/F12 içeren 10 cm Petri kabına aktarın. Beyni çevreleyen epidermisin ve kıkırdağı çıkarın ve beyni buz gibi 3 mL N2/B27 ortam içeren 35 mm Petri kabına aktarın.
   4. Diensefalon sağ ve sol telensefalon kesin (Şekil 1Ba-f, C,D). İnce forceps kullanarak telensefalon yüzeyini kaplayan menenjleri çıkarın(Şekil 1Bi). Tekrar ince çerkezlikler kullanarak, telensefalon korteksin dorso-lateral kısmını çıkarmak (Şekil 1Bg, h,j-l E).
   5. P1000 pipet kullanarak dokuları yeni 1,5 mL tüplere aktarın ve P200 pipetile herhangi bir ekstra ortamı çıkarın. Beyin dokusu (korteks bir çift) başına papain çözeltisi 0.1 mL ekleyin. 24 °C'de 15 dk kuluçkadan sonra numuneleri P1000 pipetile 10 kez hafifçe pipetleyin. 24 °C'de 15 dakika boyunca numuneleri tekrar kuluçkaya yatırın.
   6. P1000 pipet ile numuneleri 10 kez hafifçe pipetleyin. 400 x g ve oda sıcaklığında (RT) 3 dakika için numuneleri santrifüj. Supernatant atın.
   7. Pelete 1 mL DMEM/F12 ortamı ekleyin. P1000 pipet ile 10 kez hafifçe pipet. 400 x g ve RT 3 dakika için numunesantrifuge. Bunu en az 2 kez daha tekrarlayın.
   8. Pelet için, 1 mM luciferin içeren 0,5 mL N2/B27 ortam ekleyin ve iyice karıştırın. Hücreleri (1 x 10⁶ hücre) PLL kaplı cam alt tabağa tohumlayın. Co₂ kuluçka makinesindeki hücreleri 1 saat e kültür. Hücreler yemeğe yapışınca, 1 mM luciferin içeren 2 mL N2/B27 ortam ekleyin.
3. NPC dissosiyasyon kültüründe luciferase muhabirinin ifadesinin görselleştirilmesi
   1. Diseksiyonu yapmadan önce lüminesans canlı görüntüleme sistemini çalıştırın. NPC kültürü için, sahne kuluçka makinesinin sıcaklığını 37 °C olarak ayarlayın ve gaz karışımının ayarını %20 O₂, %5 CO₂olarak ayarlayın.
   2. Daldırma yağını objektif merceğe koyun. Örnek kabı mikroskop aşamasına yerleştirin. Alanı el ile görüntüleyin ve en iyi konumu ve ilgi hücrelerinin odağı seçin. Test görüntüsünü elde etmek için canlı'yı tıklatın.
   3. Çok Boyutlu Edinme programı ile 24 saat için 2 boyutlu (parlaklık ve parlak alan) satın almalar tarafından hızlandırılmış edinim çalıştırın. Çok Boyutlu Edinme programını seçin ve satınalma ayarını aşağıdaki gibi ayarlayın (adım 3.3.6).
   4. Parlaklık görüntü edinimi için aşağıdaki kamera ayarlarını kullanın: düşük aktarım hızı (50 kHz), 2 x 2/4 x 4 binning, 10 dk/5 dk pozlama süresi. Parlak alan görüntü edinimi için aşağıdaki ayarları kullanın: ara aktarım hızı (1 MHz), 1 x 1 binning ve 100 ms pozlama süresi.

4. Rahim elektroporasyonunda

NOT: Bu nöral progenitor hücrelerine Dll1-Fluc muhabirinin giriş için yapılır.

1. Elektroporasyon için alet ve reaktiflerin hazırlanması
   1. Embriyonik telensefalon ventrikül içine DNA enjeksiyonu için mikro kılcal damarlar hazırlayın. Isı ile bir çim kılcal germek ve kesme ve parlatma makinesi ile ucunu parlatmak.
   2. Boya ile DNA karışımı hazırlayın (örneğin, Trypan mavisi). Her DNA'nın konsantrasyonu PBS'de 1 μg/μL'dir ve boyayı %10'luk son konsantrasyona ekleyin.
      NOT: Dll1 protein dinamiğinin görselleştirilmesi için DNA karışımını aşağıdaki gibi kullanın: Dll1-Fluc (Dll1 protein muhabiri, Şekil 2E üst)ve pEF-EGFP (EF promotör güdümlü EGFP ekspresyon vektörü, Şekil 2Edaha düşük),transfected hücrelerin yerini ve morfolojisini izlemek.
   3. İki tür anestezi kiçin hazırlayın: steril 1x PBS'de pentobarbital 3.88 mg/mL ve ksilezinin %0.12'si.
   4. Operasyon sırasında steril aletleri ve cerrahi eldivenleri kullanın.
2. Rahim elektroporasyonunda
   1. Anesteziklerin intraperitoneal uygulaması ile 3.88 mg/mL pentobarbital ve 500 μL %0.12 xylazine ile anestezi eliyle anestetoneal anestezi kesterin.
      NOT: Araştırmacılar hayvan deneyleri yönetmeliğine uymak zorundadır. Bir anestezi veya ağrı kesici ilaçlar kullanmak gerekiyorsa, düzgün kullanın.
   2. Saç kırpın ve cerrahi scrub ile cilt dezenfekte.
   3. Parmak sıkıştırma yanıtı eksikliği olup olmadığını kontrol edin. Pedal refleksi gözlenmedikten sonra, orta hat boyunca karın dan 2-3 cm kesin. Kesiyi kurutmamak için gazlı bezleri parçalanmış kısmın etrafına koyun ve gazlı bezleri sıcak PBS ile ısıtın. Halka şeklindeki pütürlülerle sağ rahim boynuzunu hafifçe çıkarve embriyo sayısını sayın.
   4. Mikro kılcal damar ile yavaşça embriyoların telensefalon ventrikül içine karışık DNA 1-2 l enjekte.
      NOT: Enjeksiyon başarılı olduğunda, bir rahim yüzeyinde boya mavi rengini görebilirsiniz.
   5. Voltaj darbeleri sağlamadan önce rahim ve elektrot ıslak ve sonra yavaşça bir embriyo nun başını tutun. Pozitif yüklü elektrotu, DNA'nın enjekte edildiği yarımkürenin kenarına ayarlayın. Elektroporasyon nabzının 50 ms için 30-50 V, darbelerin aralığının 1 s (50 ms şarj ve 950 ms şarjsız) olduğundan emin olun. Bir embriyoya 5 darbe sağlayın ve negatif yüklü elektrottan kabarcıklar üretilip oluşturulmadığını kontrol edin.
      NOT: Elektrotun yönünün: DNA'nın pozitif elektrot tarafındaki hücrelere dahil olduğundan emin olun. Bu işlem sırasında elektrotun konumunu hareket ettirin.
   6. Diğer embriyolar için 4.2.3-4.2.4 adımlarını tekrarlayın ve rahim boynuzunu karın boşluğuna geri döndürün. Sol rahim boynuzu embriyolar için aynı işlemi yürütmek.
   7. Sol tarafı geri koyduktan sonra, bir iğne (17 mm) ile bir ipek sütür (4-0) ile kesi dikiş. Kesi tamamen kapatmadan önce, karın boşluğuna sıcak PBS koyun
      NOT: Dikişler arasındaki aralık 2 mm civarındadır.
   8. Ameliyatı bitirdikten sonra, anestezi sonrası iyileşme için fareyi bir ısıtma yastığına yerleştirin. Fareyi tek tek barındırın.
      NOT: Araştırmacılar hayvan deneyleri kendi yerel instiutional yönetmelik takip etmelidir. Bir ağrı kesici ilaçlar kullanmak gerekiyorsa, düzgün kullanın.

5. Gelişen korteksin dilim kültürlerinin hazırlanması ve kortikal dilimlerde luciferase muhabiri ifadesinin görselleştirilmesi

1. Korteksin dilim kültürleri için kültür ortamı ve reaktiflerin hazırlanması
   1. N2/B27 ortamlarında %5 fetal sığır serumu ve %5 at serumu içeren kortikal dilimlerin kültüre edilmesi için zenginleştirilmiş ortam hazırlayın.
   2. Kabarcık 100% O₂ gaz diseksiyon ve kortikal dilimler yapmak için DMEM/ F12 medya ile.
      NOT: Oksijen gazını güvenli bir şekilde kullanmak için, O₂ silindirini silindir dolabında saklayın ve havadaki oksijen konsantrasyonunu bir oksijen konsantrasyonölçeri ile izleyin.
   3. Zenginleştirilmiş ortamda 100 mM luciferin sodyum çözeltisini 1 mM'lik son konsantrasyona seyreltin.
      NOT: Luciferin otomatik floresan kendisi gösterir. Luciferase-floresan çift görüntüleme durumunda, özellikle EGFP, luciferin düşük konsantrasyonu (0.5 mM) daha iyidir.
   4. Çok gazlı kuluçka makinesini 37 °C'de %40 O₂ ve %5 CO₂olarak ayarlayın.
2. Embriyoların diseksiyonu ve floresan muhabirin ifadesinin incelenmesi
   1. Muhabirlerin (E13.5) rahim elektroporasyonunda (adım 4.2) tanıtıldığı hamile fareyi ötenaziden sonra karından kesip rahmi dışarı çıkarır.
      NOT: Araştırmacılar hayvan deneyleri yönetmeliğine uymak zorundadır. Anestezi veya ağrı kesici ilaçlar kullanıyorsanız, düzgün kullanın.
   2. Rahmi PBS içeren 10 cm'lik Petri kabına aktarın. Mikro makas ve ince çerkes kullanarak PBS rahim den embriyoları alın. Her embriyonun kafasını kesin ve %100 O₂ gazı ile kabarmış DMEM/F12 ortam içeren 10 cm'lik petri kabına aktarın. DMEM/F12 ortamlarında beyni çevreleyen epidermisin ve kıkırdağı çıkarın.
   3. Halka şeklindeki çifenler ile Petri kabının kapağına beyin koyun ve floresan stereoskopik mikroskop sahne kapağı ayarlayın. Uyarma ışığı altında floresan proteini ifade eden korteksin bölgesini kontrol edin (Şekil 2A,B).
   4. Beyni 30 mL DMEM/F12 ortamla dolu silikon kauçuk kesme tahtasına aktarın ve %100 O₂ gaz ile kabardırın. İnce forceps ile telencephalon yüzeyini kaplayan menenjler çıkarın.
   5. Dorsal telencephalon medial ve lateral kısmı arasındaki sınırı kesin ve mikro cerrahi bıçak veya ince çerkecikler kullanarak iki yarımküreye ayrı. Bir mikro cerrahi bıçak kullanarak, şeritler gibi korteks kesmek ve kortikal dilimler yapmak(Şekil 2C,D). Pipet li pipet dilimleri pipet kullanılarak orta ve 35 mm çanak zenginleştirilmiş ortama aktarın.
   6. Zenginleştirilmiş medya ile cam alt yemekleri kültür ekler üzerine dilimleri koyun. İnce forceps kullanarak dilimlerin yönünü düzeltin. Dilimlerin kesme yüzeyini kültür ekleme sinin yüzeyine ayarlayın. İlave ortamı pipetle çıkarın. Dilimleri 30 dakika boyunca 37 °C'de %40 O₂ ve %5 CO₂ olarak belirlenen çok gazlı kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.
   7. Cam alt çanağa kültür eklemek dışında 1 mM luciferin içeren zenginleştirilmiş medya 300 μL ekleyin.
3. Dilim kültürlerde luciferase muhabir ifadesinin görselleştirilmesi
   1. Diseksiyonu başlatmadan önce lüminesans canlı görüntüleme sistemini başlatın. Kortikal dilim kültürlerin aşağıdaki durumunu kullanın: 40% O_2,5% CO₂ ve 37 °C.
   2. 40x objektif lens daldırma yağı koyun. Örnek tabağı mikroskop aşamasına koyun. Floresan test görüntüsünü edinin ve uyarma ışığının aydınlatılması altında konumu ve odak düzlemini ilgi bölgesine ayarlayın.
   3. 24 saat(Şekil 2F-H)için 3-dimentional (parlaklık, floresan ve parlak alan) kazanımlar tarafından zaman atlamalı edinimi çalıştırın. Parlaklık görüntü edinimi için aşağıdaki kamera ayarlarını kullanın: düşük aktarım hızı (50 kHz), 2x2/4x4 binning, 10 dk/5 dk pozlama süresi. Floresan ve parlak alan görüntüsü edinimi için aşağıdaki ayarları kullanın: ara aktarım hızı (1 MHz), 1x1 binning ve 100 ms pozlama süresi.

6. Görüntü işleme ve analizi

1. Her görüntüyü bağlayın ve yığın görüntüleri olun. Dosya menüsünden Görüntü Dizisini Al'a tıklayın (Dosya | İthalat | Resim Sırası) ve edinilmiş görüntülerin kaydedildiği klasörü seçin. Dosya adı bulunan bazı sözcükleri File adısütununa koyun.
2. Biyolüminesans görüntülerindeki kozmik ışın gürültüsünü gidermek için ImageJ/Fiji'nin SpikeNoise Filtresi eklentisini uygulayın. Yığın görüntülerini açın ve SpikeNoise Filtresi'nitıklatın.
3. Muhabir ifadesinin net dinamiklerini elde etmek için Savitzky Golay Geçici Filtre eklentisi uygulayın. Yığın görüntülerini açın ve Savitzky Golay Geçici Filtre'yitıklatın.
4. Muhabir ifadesinin yoğunluğunu ölçmek için her bir hücreye Z Ekseni Profil Plus eklentisi uygulayın. Hücreleri seçin ve ROI'ları, ilgi çekici bölgeyi ayarlayın ve Z Ekseni Profil Plus'ı tıklatın.

Hes1/7 genlerinin ifadeleri çeşitli hücre hatlarında ve somitogenez sırasında 2 h salınım döngüsü sergiler. Ayrıca, salınım dönemi çok kısadır ve hem mRNA'ları hem de proteinleri yaklaşık 20 dk'lık yarı lanma süreleri ile son derece kararsızdır. Eğer yavaş tepkili bir muhabir kullanıyorsak, bu kadar hızlı dinamikleri takip edemeyiz ve istikrarlı bir muhabir kullanıyorsanız, gen ekspresyonu salınım yaparken yavaş yavaş birikir. Bu nedenle, muhabir hızla bu tür döngüsel ifade genlerin hızlı ciro izlemek için alçaltılmış olmalıdır. Bu sorunların üstesinden gelmek için, osilatörlerin dinamik ifadesini izlemek için luciferase muhabirini kullandık. Biyolüminesans muhabiri kısa olgunlaşma süresine ve yüksek duyarlılığa sahip olduğundan, ultradian osilatörlerin hızlı dinamiklerini izlememizi sağlar. Floresan muhabiri gibi, luciferase muhabiri gen kodlama dizisine kaynaşarak bir proteinin ifade dinamiklerini izleyebilir (Şekil 1A, Şekil 2E ve Şekil 3D). Luciferase-erimiş gen ürünleri endojen proteinler gibi hücrelerde aynı ifade, ciro ve translokasyon kinetiği sergiler. Ayrıca, salınımlı gen Dll1organizatörü etkinliğini izlemek için , biz her yerde luciferase kullanılan, bir kararsız luciferase muhabiri (Şekil 1A ve Şekil 3A)²³, olan yarı ömrü yaklaşık 10 dk²⁰. Luciferase muhabirleri çeşitli kullanarak, biz transgenik fareler veya knocked-in fareler nörogenez 1sırasında NPCs muhabirin istikrarlı ifade elde etmek için üretti¹⁷. Doku kültüründe tek hücre düzeyinde muhabir ifadesini görselleştirmek için, muhabirin dağınık giriş tercih edilir. Bu nedenle, muhabir genin rahim elektroporasyonu yoluyla NP'lere geçici olarak transfeksiyonu kullandık (Şekil 2F-H). Luciferase muhabir sistemi uzun bir süre için saat genlerinin dinamik ifadeleri izlemek için sirkadiyen ritimleri alanında kullanılmıştır (örneğin, 1 hafta), luciferin düşündüren (D-luciferin), ateşböceği luciferase enziminin substrat, çok kararlı ve canlı hücreler için hiçbir toksisite vardır^24,25. Biz genellikle bir gecede canlı hücre görüntüleme için yeterli olan medya, 1 mM konsantrasyonlarında luciferin kullanın. Ayrıca, mikroskop tabanlı görüntüleme sistemi bize çok boyutlu görüntüler, parlak alan görüntüleri, floresan görüntüleri ve kemilüminesans görüntüleri elde etmek için izin(Şekil 2F-H ve Şekil 3E).

Bu koşulları kullanarak Hes1, Ascl1, Neurog2 ve Dll1 (Şekil 2 ve Şekil 3) dahil olmak üzere çeşitli ultradian saat genlerinin ifadelerini görselleştirdik. Temsil sonuçları Şekil 3'tegösterilmiştir. Dll1 organizatör faaliyet muhabiri Dll1-Ub-Fluc muhabir farelerin telencephalon türetilen NP'lerde salınımlı ifade sergiledi. Kararsız luciferase muhabiri (Şekil 3A) promotör aktivitesi nin ekspresyonunun keskin yukarı ve aşağı regülasyonlarını göstermiştir ( Şekil3B,C). Bu durumda, tek nöral progenitor hücreleri yaklaşık 2.5 h salınım döngüsü 13 saat boyunca çeşitli genlikleri ile görüntülenir (Şekil 3C). Hızlı tepki luciferase muhabiri bize iki canlı hücreler arasında Çentik sinyal iletim dinamikleri yakalamak için izin verir(Şekil 3D-F ve Ek Film S1). İki tür DNA karışımı hazırladık: (1) Hes1 promotör muhabiri (pHes1-Ub-luc) ve EGFP ifade vektörü ve (2) Dll1 protein muhabiri (Dll1-Luc) ve mCherry ekspresyonu vektörü ve bunları ayrı ayrı NP'lere aktardık. Sonra iki tür hücre topladık ve canlı hücrelerdeki muhabirlerin ifadesini ölçmek için birlikte kültürlendik. Temsil sonuçları Şekil 3E,F'degösterilmiştir. Dll1 protein muhabirini ifade eden Hes1 muhabiri ve mCherry pozitif hücreleri taşıyan bitişik EGFP pozitif hücreler gözlem sırasında birbirleriyle temasa geçti. Yeşil bir hücrede Hes1 muhabiri ifade iki hücre temas sonra yaklaşık 60 dakika başlamak gibiydi(Şekil 3E,F). Bu bitişik hücreler arasında Çentik sinyal iletimi için zaman gecikmesi yaklaşık 1 saat olduğunu ileri sürdü. Ayrıca, sinyal iletimi sırasında Dll1 protein ekspresyonu kırmızı hücrede dinamik translokasyon gösterdi (Şekil 3E).

Şekil 1: Embriyonik fare beyninin diseksiyonu. (A) Luciferase muhabirlerinin, Dll1 organizatörü muhabirin ve Dll1 protein muhabirinin yapısı. (B) Diseksiyon prosedürü. (a) Fare embriyosu yanal görünümü. (b) Noktalı çizgi ile birlikte başı kesin. (c) Telensefalon ve orta beyin arasındaki boşluktan epidermis ve kıkırdak kaldırın. (d)Sağ ve sol hemisfer ler arasındaki orta hat boyunca çevredeki dokuyu kesin. (e) Her iki tarafa orta mola doku çıkarın. (f)Telensefalon ve orta beyin çevre doku alındıktan sonra. (g) Telencephalon (tel), orta beyin (orta) ve koku ampulü (OB) ayırın. (h) Telencephalon kesiti, noktalı çizgi gösterilir (g). (i) Telensefalon yüzeyini çevreleyen menenjleri çıkarın. (j) Telensefalon'u iki bölüme ayırın: medial ve lateral kısım. (k) Korteks ve ganglionik saygınlık (GE) sınırını kesin. (l) Korteksin dorso-lateral kısmı dissosasyon kültürü için kullanılır. (C) Embriyonik gün 14 (E14), sol oluşan beyin (a) ve sağ (b) telensefalon ve orta beyin(c). (D) Telensefalik hemisferler orta beyinden ayrılır. (E) Telensefalon bir parçalanmış hemisfer: ganglionik saygınences de dahil olmak üzere telencephalon ventrolateral parçası (d), ayrışmış kültürler ve dilim kültürler için kullanılan telencephalon dorsolateral parçası (e), telensefalon medial parçası (f) ve beyin yüzeyini kapsayan menenjler (g). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Embriyonik telensefalinin kortikal dilimlerinin yapılması ve kortikal dilim kültürlerinde Dll1 protein dinamiğinin görselleştirilmesi. (A) Floresan stereoskopik mikroskop kullanarak EGFP ekspresyonunun kontrol edilmesi. Kırmızı ok korteksin EGFP ifade bölgesini gösterir. Sol hemisfer (a), sağ hemisfer (b) ve orta beyin (c). (B) Noktalı çizgiler (A)olarak gösterilen beyin bölgelerinin ana hatlarını gösterir. (C) Dorsolateral telensefalon diseksiyon korteks. Beyaz ok uçları kesme kenarlarını gösterir. (D) Dorso-lateral telensefalon kortikal dilimleri. (E) NCD'lerde Dll1 protein dinamiklerini görselleştirmek için muhabirlerin gen yapıları. Dll1 protein muhabiri, Dll1-Fluc (üst) kortikal dilimlerde hücrelerin morfolojisi ve göçünü izlemek için bir EGFP ekspresyon vektörü (alt) ile NCD'lere tanıtıldı. (F-H) Kortikal dilimde parlak alan(F), GFP ekspresyonu (GFPekspresyonu ) ve biyolüminesans(H)üç boyutlu görüntüler. Biyolüminesans görüntüleme sistemi aynı anda luciferase ve floresan muhabiri ifadeleri izlemek için izin verdi. Ölçek çubukları: 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: NPC kültüründe Dll1 geninin dinamik ekspresyonunun görselleştirilmesi ve analizi için temsili veriler. (A) Muhabir transkripsiyonel düzeyde Dll1 ifade görselleştirmek için, bir kararsız luciferase muhabiri kullanarak yapı (Ub-luciferase, ubiquitinated luciferase). (B) Dll1 ifadesinin tek bir NPC'de biyolüminesans muhabiri ile görüntülenmesi. Paneldeki sayılar, C. (C) Dll1'dekisayılara karşılık gelen Dll1 salınımlı ifadesinin tepe noktalarını gösterir. (D-F) Hes1 organizatörü muhabir ve Dll1 protein muhabiri ifade görselleştirme komşu hücrelerde ifade. (D) Hes1 organizatör aktivite muhabiri (pHes1-Ub-luc) ve Dll1 protein muhabiri (Dll1-Luc) yapısı. (E ve F) Hes1 muhabirini taşıyan EGFP pozitif hücre (Cell1) ve Dll1 protein muhabiri (Cell2) taşıyan mCherry pozitif hücre eş kültürlü ve her iki muhabir in lüminesans ölçüldü. Yeşil hücre (hücre1) Hes1 muhabirinin ifadesi iki hücre temas sonra yaklaşık 60 dakika başlamak gibiydi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Film S1: Şekil 3D-3F ile ilgili komşu hücrelerde ifade Hes1 organizatörü muhabir ve Dll1 protein muhabiri ifade görselleştirme. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Notch sinyalin bileşenleri somitogenez sırasında senkronize ama nörogenez sırasında senkronize salınımlı ifadeler göstermek, ikinci durumda statik analiz ile ifade dinamikleri yakalama zorluklara yol açan. Bu nedenle, Hes1 ve Dll1gibi Çentik sinyal bileşenlerinin ifade dinamiklerini ortaya çıkarmak için gerçek zamanlı izleme gereklidir. Hes1 ve Dll1 salınımlarının ifadeleri dönemleri son derece kısa olduğundan, ifade dinamiklerini izlemek için yaklaşık 2-3 saat hızlı tepki ve kararsız muhabirler gereklidir. Bu amaçla biyolüminesans muhabiri ve görüntüleme sistemini geliştirdik. Biyolüminesans muhabiri luciferase bu tür döngüsel gen ifadelerinin hızlı ciro izlemek için hızlı olgunlaşma kinetik ve yüksek duyarlılık gösterir. Gazetecilerin hızlı cirosu çok zayıf sinyaller inmelerine yol açar. Biyolüminesans muhabirleri tarafından üretilen bu tür sönük sinyalleri tespit etmek için, yüksek hassasiyetli, ultra düşük okuma hızına (50 kHz) sahip su soğutmalı CCD kamera da dahil olmak üzere optimize edilmiş biyolüminesans görüntüleme sistemi kullanıyoruz ve bu da gürültüyü minimuma indirir. Ayrıca, yüksek sayısal diyafram (N.A.) objektif lens bize tam olarak istikrarsız luciferase muhabiri serbest ışık toplamak için olanak sağlar. Daha yüksek bir hassasiyet elde etmek için genellikle daha yüksek binning (örneğin, 2 x 2, 4 x 4, 8 x 8) kullanırız ve deklanşörü uzun süre açık tutarız (örn. 5-20 dk). Luciferase muhabirlerinden gelen sinyal son derece zayıf olduğundan, çevreden gelen ışığın paraziti de zayıf sinyalin algılanmasında bir sorun teşkil eder: bu nedenle mikroskop odası tamamen karanlık olmalıdır. Bu sistem, NP'lerdeki Hes1 ve Dll1 genlerinin hem transkripsiyonel hem de protein düzeylerinde dinamik ifadelerini ölçmemizi sağlar(Şekil 3). Buna ek olarak, biz luciferase erimiş protein muhabirleri ile hücre içi translokasyon protein dinamikleri görselleştirebilirsiniz. Ayrıca, hızlı tepki luciferase muhabiri kullanarak, Çentik sinyal iletim dinamikleri yakalamak ve iki canlı hücreler arasında sinyal iletimi için zaman gecikmesi ölçmek(Şekil 3D-F ve Ek Film S1). Ayrıca, organizatör muhabir (Ub-luciferase muhabiri) ve protein muhabiri (luciferase füzyon) tek bir gen kombinasyonu bize transkripsiyon ve genin çevirisi arasındaki zaman gecikmesini ölçmek için olanak sağlar. Bu şekilde, biyokimyasal reaksiyonlar için zaman gecikmesi/oranını ölçmek için çeşitli lüminesans muhabirlerinin ve floresan muhabirin çoklu görüntülemesi mevcuttur.

Gen ekspresyonlarının tek hücre çözünürlüğünde gerçek zamanlı olarak izlenmesi, aynı genin ifade dinamiğinde farklılıklar olduğunu ortaya koymuştur. Bazı hücreler Dll1/Neurog2'yi salınımlı şekilde ifade eder, ancak diğerleri sürekli desenler gösterir. Ayrıca, farklı ifade dinamikleri (salınımlı karşı sabit) hücrelerin durumunda farklı çıkışlar neden. Ne farklı ifade dinamikleri farklı şekillerde hücre davranışlarını etkilemek, ifade dinamikleri daha fazla bilgi²¹,^22,26, 27^{,28,29,30,31,32}kodlar düşündüren açık gibi görünüyor . Statik analizler gen ekspresyonundaki dinamikleri yakalayamaz ve hücresel olaylardaki ifade dinamiklerini ortaya çıkarmak için biyolojik olguları anlamak için gerçek zamanlı analizler gereklidir. Burada sunduğumuz yaklaşım, yüksek zamansal çözünürlükte nöral gelişim sırasında ultradian osilatörlerin dinamiklerini izleyebilir. Bu yöntemi kullanarak, daha önce düşündüğümüzden çok daha fazla genin dinamik olarak ifade edildiğini bulduk ve sadece protein ekspresyonunun dinamiklerini değil, aynı zamanda hücredeki protein lokalizasyonundaki dinamikleri de yüksek zamansal çözünürlükte izleyebiliyoruz. Bu tür dinamik ifade kalıpları henüz açıklığa kavuşturulmuş biyolojik öneme sahip olabilir.

Biyolüminesans muhabirleri floresan muhabirleri ile karşılaştırıldığında zamansal çözünürlük ve canlı hücrelere düşük toksisite büyük bir avantaja sahip³³. Ancak, floresan muhabirlerde renk varyasyonları aksine, biyolüminesans muhabirleri sadece birkaç renk vardır, aynı anda izlenebilir genlerin sayısı bir sınırlama empoze. Bununla birlikte, değişken luciferase artan sayıda izole ediliyor ve çeşitli canlılardan klonlanmış^34,35, ve luciferases gibi çeşitli kullanarak, aynı anda yüksek zamansal çözünürlükte tek bir hücrede birden fazla gen ekspresyonu dinamikleri izlemek mümkün olacak. Ateş böceği luciferase moleküler boyutu floresan muhabirler daha büyüktür, hangi protein dinamikleri izlemek için muhabir erimiş proteinler inşa bazı zorluklar sunar, ama son zamanlarda, yeni, daha küçük ve parlak luciferase klonlanmış olmuştur³⁶, bize protein dinamikleri görselleştirmek için izin verecek her zamankinden daha kolay. Raporların giderek artan sayıda son zamanlarda çeşitli biyolojik^olaylar21,22,^{26,27,28,29,30,31,32}gen ekspresyonu ve protein translokasyonu dinamikleri farklı göstermiştir . Gerçek zamanlı bir izleme sistemi kullanarak spatiotemporal düzenlemede bu tür dinamiklerin analiz edilmesi, hücrelerin gerçek durumlarını yakalamak ve hücresel sistemlerin düzenlenmesini ortaya çıkarmak için giderek daha önemli hale gelir.

Yazarların çakışan bir mali çıkarları yok.

Yumiko Iwamoto'ya videonun yapımını desteklediği için teşekkür ederiz. Biz de tartışma ve görüntü analizi destekler için Akihiro Isomura için müteşekkiriz, Hitoshi Miyachi transgenik hayvanların üretimi için teknik destekler için, Yuji Shinjo (Olympus Tıp Bilimi), Masatoshi Egawa (Tıp Bilimi), Takuya Ishizu ( Olympus Tıp Bilimi) ve Ouin Kunitaki (Andor Japonya) biyolüminesans görüntüleme sisteminin teknik destek ve tartışmaları için. Bu çalışma Evrimsel Bilim ve Teknoloji Için Çekirdek Araştırma (JPMJCR12W2) (R.K.), Yenilikçi Alanlar Bilimsel Araştırma Hibe(MEXT 24116705 H.S. ve MEXT 16H06480 R.K.), Grant-in-Aid Bilimsel Araştırma (C) (JSPS) tarafından desteklenmiştir 18K06254) (H.S.), Takeda Vakfı (R.K. ve H.S.) ve Eğitim, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı,Japonya'dan Yaşam Sistemine Dinamik Yaklaşımlar Platformu.