في الوقت الحقيقي التصوير الضوئي التلالؤ من الدرجة ديناميات الإشارات اثناء التكوين العصبي Murine

الجذعية العصبية/الخلايا progenitor يحمل ديناميات التعبير المختلفة من الشق يشير المكونات التي تؤدي إلى نتائج مختلفه من الاحداث الخلوية. ويمكن الكشف عن مثل هذا التعبير الديناميكي عن طريق الرصد في الوقت الحقيقي ، وليس عن طريق التحليل الساكن ، وذلك باستخدام نظام تصويري حساس للغاية للتصوير الضوئي يمكن من تصور التغيرات السريعة في تعابير الجينات.

الشق الإشارات ينظم صيانة الخلايا الجذعية العصبية/السلف بواسطة التفاعلات خليه الخلية. مكونات اشاره الشق تظهر تعبير ديناميكي. يتم التعبير عن الشق اشاره Hes1 والشق يجند like1 (Dll1) بطريقه التذبذب في الخلايا الجذعية العصبية/progenitor. لان الفترة من التعبير يتذبذب من هذا مورثات جدا قصيرة (2 [ه]), هو يصعب ان يراقب هم دوريه تعبير. لفحص هذه التغيرات السريعة في التعبير الجيني أو ديناميات البروتين ، مطلوب مراسلي الاستجابة السريعة. وبسبب حركيه النضوج السريع والحساسية العالية ، فان المراسل لوسيفيرياز البيولوجي هو المناسب لرصد التغيرات السريعة في التعبير الجيني في الخلايا الحية. استخدمنا مراسلا لمراقبه النشاط المروج والمراسل المنصهر لإظهار ديناميكية البروتين عند دقه الخلية الواحدة. يظهر هذا مراسلات [بيوميننس] دوران سريعة ويلد إشارات ضعيفه جدا; لذلك ، قمنا بتطوير نظام التصوير الضوئي الحساس للغاية للكشف عن مثل هذه الإشارات الخافتة. هذه الطرق تمكننا من رصد مختلف ديناميات التعبير الجيني في الخلايا الحية والانسجه ، والتي هي معلومات هامه للمساعدة في فهم الدول الخلوية الفعلية.

ويتكون الدماغ الثدييات من عدد كبير من أنواع مختلفه من الخلايا العصبية والكريات الدليج. يتم إنشاء جميع الخلايا من الجذعية العصبية/الخلايا progenitor (npcs) ، والتي تتكاثر أولا لتوسيع اعدادهم ، ثم البدء في التفريق في الخلايا العصبية ، وأخيرا التي تؤدي إلى زنزانات الدبقيه^{1،2،3،4،5}. مره واحده وقد تميزت الخلايا في الخلية العصبية ، فانها لا يمكن ان تتكاثر أو زيادة اعدادهم ، التالي ، وصيانة NPCs حتى مراحل لاحقه أمر مهم. الشق يشير عن طريق التفاعلات خليه خليه يلعب دورا هاما في الحفاظ علي npcs^6،7. الشق يغاندس تتفاعل مع البروتين الغشاء ، الشق ، علي سطح الخلايا المجاورة وينشط البروتين الشق. بعد التنشيط ، يحدث التحلل البروتيني من البروتين الشق ، التالي الإفراج عن المجال داخل الخلايا من الشق (nicd) من غشاء الخلية في نواه^8،9،10. في النواة ، يرتبط NICD بالمناطق المروجة لHes1 و Hes5 (Hes1/5) وينشط التعبير عن هذه الجينات. Hes1/5 قمع التعبير عن الجينات proneural Ascl1 و Neurogenin1/2 (Neurog1/2)^11,12,13,14. لان الجينات proneural تحفز التمايز العصبية ، Hes1/5 تلعب أدوارا أساسيه في الحفاظ علي أجهزه الكمبيوتر الشخصية. وعلاوة علي ذلك ، كما الجينات proneural يمكن تفعيل التعبير من الشق ودلتا-like1 (Dll1) ، Hes1/5 أيضا قمع التعبير عن Dll1. ولذلك ، فان التعبير عن Dll1 يؤدي إلى الخلايا المجاورة السلبية ل Dll1 عن طريق اشاره الشق. وبهذه الطريقة ، تمنع الخلايا الخلايا المجاورة من اتباع مصيرها نفسه ، وهي ظاهره تعرف باسم التثبيط الجانبي⁸. في الدماغ النامية ، وتثبيط الجانبي يلعب دورا في توليد مختلف أنواع الخلايا المختلفة.

التصوير في الوقت الحقيقي علي مستوي خليه واحده يكشف عن تعبيرات ديناميكية من مكونات الإشارات الشق في npcs^15،16،17. الشق يشير ينشط التعبير عن Hes1، ولكن Hes1 البروتين يربط إلى المروج الخاصة به ويقمع التعبير الخاصة به. وعلاوة علي ذلك ، Hes1 هو بروتين غير مستقر للغاية ، والتي يتم المتدهورة من قبل المسار اوبيكويتين-بروتياسومي ؛ ولذلك ، فان قمع المروج الخاصة به قصيرة فقط عاش ومن ثم يبدا النسخ مره أخرى. بهذه الطريقة ، والتعبير عن Hes1 يتذبذب في كل من النسخ والمستويات الانتقالية في دوره 2 ح¹⁸. ويؤدي التعبير المتذبذب لHes1 ، بدوره ، إلى التعبير المتذبذب عن الجينات المستهدفة المصب ، مثل الAscl1والNeurog2 والDll1 ، عن طريق القمع الدوري^{15و16و17و19}. بينما الجينات proneural يمكن ان تحفز التمايز العصبية, التعبير الذبذبات غير كافيه لتمايز الخلايا العصبية; بدلا من ذلك التعبير المستدام ضروري لتمايز الخلايا العصبية. التعبير المتذبذب من الجينات proneural مهم للحفاظ علي npcs بدلا من حفز التمايز العصبية^14,15,16. التعبير عن Dll1 يتذبذب في كل من النسخ والمستويات الانتقالية خلال التكوينات المختلفة ، مثل تكوين الأعصاب والسمية. التعبير الديناميكي لل Dll1 هو المهم لتكوين المستنقعات العادية والتعبير الثابت من Dll1 يدفع العيوب في التكوين العصبي والتمدد¹⁷. وتبين هذه النتائج الوظيفة الهامه التي تقوم بها ديناميات التعبير الجيني وحركيه البروتين علي تنظيم مختلف الاحداث التنموية (اي ان ديناميات التعبير المختلفة تنتج مخرجات مختلفه في السلوكيات الخلوية).

لتحليل ديناميات الإشارات الشق ، وتحليل ثابت من الانسجه والخلايا غير كافيه لأنها تتغير باستمرار. التصوير في الوقت الحقيقي من خلايا واحده هو أداه قويه للكشف عن ديناميات في التعبير الجيني. التعبير الديناميكي لجزيئات اشاره الشق الخضوع لاستجابات دوريه سريعة في الفترة من 2-3 h. ويمثل هذا التعبير الدوري السريع مشكلتين صعبتين للرصد في الوقت الحقيقي: (1) يتم قمع التعبير عن الجزيئات إلى مستويات منخفضه ، و (2) دوران السريع يتطلب مراسلين سريع الاستجابة. للتغلب علي هذه المشاكل ، قمنا مسبقا بتطوير طريقه التصوير في الوقت الحقيقي التلالؤ²⁰. لان الصحفي الحيوي لديه حساسية اعلي ووقت النضج أقصر من الصحفيين الفلورسنت ، وهذه الاستراتيجية تمكننا من مراقبه الديناميكيات السريعة في الخلايا الحية. باستخدام التصور في الوقت الحقيقي ، وجدنا ان المزيد من الجينات أظهرت تعبيرا ديناميكيا مما كنا نظن سابقا. الاضافه إلى ذلك ، ازداد عدد التقارير التي تبين ديناميات التعبير والبروتين في الخلايا الحية واهميه هذه الديناميات في مختلف الاحداث البيولوجية ، مما يوحي بدور أساسي لديناميات تعابير الجينات^21و22.

في هذا التقرير ، ونحن وصف طريقه لتصور التعبير عن الشق يجند Dll1 في npcs في كل من الثقافات المنفصلة وفي الثقافات شريحة القشرية. لمراقبه ديناميات Dll1 النسخ علي مستويات خليه واحده ، ونحن ولدت الثقافات المنفصلة من npcs المستمدة من الدماغ الجنيني من الفئران المعدلة وراثيا التي تحمل مراسل PDll1-Ub-fluc ، وهو Dll1 المروج الذي يحركها المؤيد الذي زعزعه استقراره. لمراقبه ديناميات البروتين Dll1 في الجسم الحيوي ، قدمنا Dll1 مراسل الانصهار في NPCs في القشرة وتصور التعبير عن مراسل في NPCs في الثقافات شريحة القشرية. التصوير في الوقت الحقيقي مكننا من التقاط الخصائص المختلفة للتعبير الجيني وديناميكيات البروتين في الخلايا الحية في الدقة الزمنيه العالية.

وقد تمت الموافقة علي جميع الإجراءات بما في ذلك المواد الحيوانية من قبل لجنه الرعاية الحيوانية المؤسسية والاستخدام في معهد الحياة الحدودية والعلوم الطبية ، جامعه كيوتو.

1-الصحفيون المتعصبون

ملاحظه: المراسل لوسيفيراز مناسب لقياس الديناميكيات السريعة للنشاط المروج عن طريق دمج اشاره التحلل. وعلاوة علي ذلك ، فان مراسل الانصهار لوسيفيراز تمكن من رصد ديناميات البروتين في خليه واحده. كلا النوعين من المراسلين متاحه للثقافة أحاديه الطبقة (ثقافة التفكك) وثقافة الانسجه (شريحة الثقافة) التجربة.

1. مراسل لرصد نشاط المروج Dll1¹⁷
   ملاحظه: لمراقبه التغيرات السريعة في التعبير الجيني ، فان الاستجابة السريعة والمراسل غير المستقر أمر ضروري. يبدي [لوسيفيتاز] [لوفرييس] ([فلوك]) نضج سريعة يقارن مع فلوريسئين مراسلات. لان [اوبيقوتين] تنصهر [لوسيفيتاز] مراسله ([أوب-فلوك]) يبدي تدهور سريعة ودوران سريعة, هو جدا مفيده ان يراقب الديناميكية مورثه تعبير في يعيش خلايا²⁰.
   1. استخدم Dll1 الذي يحركه المروج والذي تمت زعزعه استقراره ،وهو عبارة عن "اللوحة العلوية" (pDll1 ، الشكل 1A) ، لرصد التغيرات السريعة في Dll1 تعبير عند مستوي التحويل¹⁷.
   2. توليد خط الماوس المحورة وراثيا تحمل pDll1 للتعبير مستقره من هذا المراسل.
2. مراسل لرصد ديناميات البروتين Dll1¹⁷.
   1. لجيل من الفئران تدق في ، ادراج cdferase في المنطقة الثالثة من Dll1 التشفير المنطق بحيث يتم التعبير عن البروتين الانصهار Dll1-لوسيفيراز (مراسل Dll1 ، الشكل 1ا، اللوحة السفلي)¹⁷.
   2. رصد ديناميات التعبير من Dll1 علي مستويات البروتين عن طريق قياس النشاط لوسيفيراز.
   3. لرصد ديناميات البروتين Dll1 علي مستويات الانسجه ، وتقديم مراسل Dll1-Fluc في NPCs في الدماغ الجنيني من قبل في الرحم الكهربي.

2. نظام تصوير التلالؤ

1. بناء نظام التصوير الحي التلالؤ باستخدام المجهر المقلوب مثبته مع حساسية عاليه ، والمياه المبردة كاميرا CCD. من أجل الحد من الضوضاء والحصول علي حساسية عاليه ، وتبريد الكاميرا مع المياه المبردة التي تقدمها الدائري المياه في درجه حرارة الأمثل من-90 درجه مئوية.
2. لتصوير الخلايا الحية/الانسجه ، وتثبيت نظام الحضانة ، والسيطرة علي درجه الحرارة والغاز المختلط ، إلى مرحله المجهر.
3. لتصوير التعبير عن زعزعه استقرار مراسل لوسيفيراز ، واستخدام زاوية عدديه عاليه (NA: 1.30) 40x النفط الغمر عدسه الهدف. مسافة العمل من هذه العدسة هو 0.2 مم ، وهو متاح للثقافة خليه أحاديه الطبقة ليس فقط ولكن أيضا شريحة الثقافة.
4. لمراقبه مزدوجة من لوسيفيراز والتعبير مراسل فلوريسئين ، تثبيت جهاز الاضاءه LED إلى مسار الضوء من المجهر.
5. السيطرة علي التصوير الفاصل الزمني مع برنامج المرتبطة المجهر (علي سبيل المثال ، برنامج الاستحواذ متعددة الابعاد للبرمجيات MetaMorph).
6. اعداد النظام بأكمله في غرفه مظلمة ، لان اشاره الصحفي الذي تزعزع استقراره هو خافت جدا ، وتجنب الضوء الدخيلة منع اكتساب.

3. الجذعية العصبية/Progenitor خليه (مجلس الشعب) الثقافات التفكك

1. اعداد وسائل الاعلام الثقافية ، والاطباق ، والكواشف للثقافة التفكك مجلس الشعب
   1. اعداد N2/B27 وسائل الاعلام لزراعه الجذعية العصبية/الخلايا progenitor مع تركيز نهائي من 1x N2 ، 1x B27 ، 1 مم N-اسيتيل ، 10 نانوغرام/مل bFGF و 50 U/mL البنسلين/ستربتومايسين في الاعلام DMEM/F12.
   2. اعداد الحل بابين لتفكك التي تحتوي علي 7 ش/مل بابين ، 0.006 ٪ dnase و 1 مم ن-اسيتيل في وسائل الاعلام ebss.
   3. اعداد 100 mM من محلول الصوديوم لوسيفرين للتصوير التلالؤ. تمييع 100 mm الحل لوسيفرين في N2/B27 وسائل الاعلام إلى تركيز نهائي من 1 ملم.
      ملاحظه: يظهر Luciferin تلقائيا فلوريسئين نفسه. في حاله التصوير المزدوج luciferase-فلوري ، وخاصه EGFP ، وخفض تركيز luciferase إلى 0.5 mM هو أفضل.
   4. معطف 35 الزجاج الاطباق السفلي (قطر الزجاج 27 ملم) مع 40 ميكروغرام/مل من بولي-L-يسين (PLL) حل ل 1 ح في درجه حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، وغسل لوحات 3x مع تلفزيوني والسماح لها الجافة.
2. تشريح الاجنه وتفكك NPCs
   1. بعد يوثانيزينج الحوامل pDll1 الماوس المحورة وراثيا (اليوم الجنيني 12.5 (E 12.5)) من قبل CO₂ اختناق وخلع عنق الرحم ، وقطع من خلال البطن وإخراج الرحم.
      ملاحظه: يجب علي الباحثين اتباع اللوائح والمبادئ التوجيهية للجنة البحوث الحيوانية من مؤسستهم. إذا تم استخدام المخدرات التخدير أو التخفيف من الم ، واستخدامها بشكل صحيح.
   2. نقل الرحم في صحن بيتري 10 سم تحتوي علي 25 مل من الجليد الباردة. إخراج الاجنه من الرحم في الجليد الباردة تلفزيوني ، وذلك باستخدام مقص الصغرى والملقط غرامه.
   3. قطع راس كل جنين باستخدام مقص ونقله إلى 10 سم بيتري الاطباق التي تحتوي علي الجليد الباردة DMEM/F12. أزاله البشرة والغضروف المحيطة بالدماغ ونقل الدماغ إلى 35 mm طبق بيتري التي تحتوي علي الجليد الباردة 3 مل من وسائل الاعلام N2/B27.
   4. قطع الدماغ الأيمن والأيسر من دينسيدون (الشكل 1Ba-f ، C ، D). أزاله السحايا التي تغطي سطح الدماغ باستخدام ملقط غرامه (الشكل 1Bi). باستخدام ملقط غرامه مره أخرى ، وإخراج الجزء دورسو الوحشي من القشرة من الدماغ (الشكل 1Bg ، h ، j-l E).
   5. نقل الانسجه إلى أنابيب 1.5 mL جديده باستخدام ماصه P1000 وأزاله اي وسيله اضافيه مع ماصه P200. أضافه 0.1 mL من محلول بابين في انسجه المخ (زوج من القشرة). بعد 15 دقيقه من الحضانة في 24 درجه مئوية ، ماصه برفق العينات 10 مرات مع ماصه P1000. احتضان العينات مره أخرى لمده 15 دقيقه في 24 درجه مئوية.
   6. ماصه برفق العينات 10 مرات مع ماصه P1000. الطرد المركزي العينات لمده 3 دقائق في 400 x ز ودرجه حرارة الغرفة (RT). تجاهل الخارقة.
   7. أضافه 1 مل من الوسائط DMEM/F12 إلى بيليه. ماصه برفق 10 مرات مع ماصه P1000. الطرد المركزي العينات لمده 3 دقائق في 400 x ز و RT. تجاهل سوبرناتانت. كرر هذا مرتين علي الأقل مره أخرى.
   8. إلى بيليه ، أضافه 0.5 mL من الوسائط N2/B27 التي تحتوي علي 1 مم لوسيفرين وتخلط جيدا. البذور الخلايا (1 × 10⁶ خلايا) إلى صحن أسفل الزجاج المغلفة pll. ثقافة الخلايا في الحاضنة₂ CO لمده 1 ساعة. مره واحده في الخلايا التمسك الطبق ، أضافه 2 مل من وسائل الاعلام N2/B27 ، التي تحتوي علي 1 mM luciferin.
3. التصور من التعبير مراسل لوسيفيراز في ثقافة التفكك مجلس الشعب
   1. بدء تشغيل نظام التصوير الحي التلالؤ قبل أداء تشريح. للثقافة مجلس الشعب ، تعيين درجه حرارة حاضنه المرحلة في 37 درجه مئوية وتعيين اعداد خليط الغاز 20 ٪ س₂، 5 ٪ CO₂.
   2. وضع النفط الغمر إلى عدسه الهدف. ضع طبق العينة علي مرحله المجهر. عرض الحقل يدويا واختيار أفضل موضع وتركيز الخلايا ذات الاهتمام. انقر علي live للحصول علي صوره الاختبار.
   3. تشغيل الاستحواذ الفاصل الزمني من قبل 2-الابعاد (التلالؤ وحقل مشرق) الاستحواذ علي 24 ح مع برنامج الاستحواذ متعدد الابعاد . اختر برنامج الاستحواذ متعدد الابعاد واضبط اعداد الاستحواذ علي النحو التالي (الخطوة 3.3.6).
   4. للحصول علي صوره التلالؤ ، استخدم إعدادات الكاميرا التالية: انخفاض معدل نقل (50 كيلوهرتز) ، 2 × 2/4 × 4 التسلق ، 10 دقيقه/5 دقيقه التعرض الوقت. للحصول علي صوره الحقل الساطع ، استخدم الإعدادات التالية: معدل النقل المتوسط (MHz 1) ، 1 × 1 التسلق و 100 ms الوقت التعرض.

4. في الرحم الكهربي

ملاحظه: يتم تنفيذ هذا لإدخال مراسل Dll1 في خلايا السلف العصبية.

1. اعداد الاداات والكاشفات للكهرباء
   1. اعداد الشعيرات الدموية الصغرى لحقن الحمض النووي في البطين من الدماغ الجنيني. تمتد الشعرية العشب مع الحرارة وقطع وتلميع غيض من ذلك مع اله تلميع.
   2. اعداد مزيج من الحمض النووي مع صبغه (علي سبيل المثال ، التركان الأزرق). تركيز كل الحمض النووي هو 1 ميكروغرام/μL في الاذاعه التلفزيونية وأضافه الصبغة إلى تركيز النهائي من 10 ٪.
      ملاحظه: استخدام خليط من الحمض النووي لتصور ديناميات البروتين Dll1 علي النحو التالي: Dll1 (Dll1 مراسل البروتين ، الشكل 2ه العليا) و PEF-egfp (EF المروج مدفوعة egfp ناقلات التعبير ، الشكل 2ه اقل) ، ورصد موقع وتشكل الخلايا المنقولة.
   3. اعداد نوعين من التخدير: 3.88 ملغ/مل من البنتوباربيتال و 0.12 ٪ من اكسيليازين ، في 1x العقيمة تلفزيوني.
   4. استخدم الاداات المعقمة والقفازات الجراحية اثناء التشغيل.
2. في الرحم الكهربي
   1. تخدير الوقت الحوامل الماوس الممثل الخاص (ه 12.5) بواسطة الاداره داخل الصفاق من التخدير مع 500 μl من 3.88 ملغ/مل بنتوباربيتال و 500 μl من 0.12 ٪ اكسيليازين.
      ملاحظه: يجب علي الباحثين متابعه تنظيم التجارب الحيوانية. إذا كان المرء يحتاج إلى استخدام التخدير أو المخدرات تخفيف الم ، واستخدامها بشكل صحيح.
   2. قص الشعر وتطهير الجلد مع فرك الجراحية.
   3. التحقق من عدم وجود استجابه قرصه اصبع القدم. مره واحده لا يلاحظ منعكس دواسة, جعل 2-3 cm قطع من خلال البطن علي طول خط الوسط. وضعت قماش حول الجزء تشريح والرطب قماش مع الدافئة التلفزيونية لا لتجف الشق. اخرج البوق الرحمي الأيمن برفق بملقط علي شكل حلقه واحسب عدد الاجنه.
   4. حقن 1-2 μL من الحمض النووي المختلط في البطين من الدماغ من الاجنه برفق مع الشعيرات الدقيقة.
      ملاحظه: عندما يكون الحقن ناجحا ، يمكن للمرء ان يري اللون الأزرق من الصبغة علي سطح الرحم.
   5. بلل الرحم والقطب قبل توفير نبضات الجهد ، ثم امسك راس الجنين برفق. تعيين القطب الكهربائي مشحونة إيجابيا إلى جانب نصف الكره الارضيه ، والتي تم حقن الحمض النووي. تاكد من ان حاله نبض الكهربي هو 30-50 V ل50 ms ، والفاصل الزمني للبقول هو 1 s (50 ms تهمه و 950 ms غير--تهمه). توفير 5 نبضات لجنين واحد والتحقق من ان يتم توليد فقاعات من القطب مشحونة سلبا.
      ملاحظه: تاكد من اتجاه القطب: يتم دمج الحمض النووي في الخلايا علي جانب القطب الموجب. خلال هذا الاجراء ، لا تتحرك موقف القطب الكهربائي.
   6. كرر الخطوات 4.2.4 لأجنه أخرى وأعاده قرن الرحم إلى تجويف البطن. تنفيذ نفس الاجراء علي الاجنه في القرن الرحمي الأيسر.
   7. بعد أعاده الجانب الأيسر ، خياطه الشق بواسطة خيط حريري (4-0) مع ابره (17 ملم). قبل إغلاق الشق تماما ، وضعت الدافئة التلفزيونية في تجويف البطن
      ملاحظه: الفاصل الزمني بين الغرز حوالي 2 ملم.
   8. بعد الانتهاء من الجراحة ، ضع الماوس علي وساده التدفئة للشفاء بعد التخدير. منزل الماوس بشكل فردي.
      ملاحظه: يجب علي الباحثين اتباع التنظيم المحلي المحرض علي التجارب الحيوانية. إذا كان المرء يحتاج إلى استخدام المخدرات تخفيف الم ، واستخدامها بشكل صحيح.

5. اعداد الثقافات شريحة من القشرة النامية والتصور من التعبير مراسل لوسيفيراز في شرائح القشرية

1. اعداد وسائل الاعلام الثقافية والكواشف لشرائح الثقافات من القشرة
   1. اعداد وسائل الاعلام المخصب لزراعه شرائح القشرية التي تحتوي علي 5 ٪ مصل الأبقار الجنينية و 5 ٪ مصل الحصان في N2/B27 وسائل الاعلام.
   2. فقاعه 100 ٪ O₂ الغاز من خلال dmem/F12 وسائل الاعلام لتشريح وصنع شرائح القشرية.
      ملاحظه: لاستخدام غاز الأكسجين بأمان ، تخزين O₂ اسطوانه في مجلس الوزراء اسطوانه ومراقبه تركيز الأكسجين في الهواء من قبل متر تركيز الأوكسجين.
   3. تمييع 100 mm محلول الصوديوم لوسيفرين في وسائل الاعلام المخصب إلى تركيز نهائي من 1 ملم.
      ملاحظه: يظهر Luciferin تلقائيا فلوريسئين نفسه. في حاله التصوير المزدوج luciferase-فلوري ، وخاصه EGFP ، وانخفاض تركيز luciferase (0.5 mM) هو أفضل.
   4. تعيين حاضنه متعددة الغاز في 37 درجه مئوية بنسبه 40 ٪ O₂ و 5 ٪ CO₂.
2. تشريح الاجنه وفحص التعبير عن مراسل الفلورسنت
   1. بعد يوثانيزينج الفاره الحامل التي يتم إدخالها للصحفيين (E 13.5) في الرحم الكهربائي (الخطوة 4.2) ، وقطع من خلال البطن وإخراج الرحم.
      ملاحظه: يجب علي الباحثين متابعه تنظيم التجارب الحيوانية. إذا كنت تستخدم مخدرات التخدير أو تخفيف الم ، استخدمها بشكل صحيح.
   2. انقل الرحم إلى صحن بيتري بطول 10 سم يحتوي علي الخدمات التلفزيونية. إخراج الاجنه من الرحم في تلفزيوني ، وذلك باستخدام مقص الصغرى والملقط غرامه. يقطع راس كل جنين وينقل إلى صحن بيتري بطول 10 سم يحتوي علي وسائط DMEM/F12 مع 100% O₂ غاز. أزاله البشرة والغضروف المحيطة بالدماغ في وسائل الاعلام DMEM/F12.
   3. وضع الدماغ علي غطاء طبق بيتري مع الملقط علي شكل حلقه وتعيين غطاء علي مرحله المجهر مجسمه مضان. تحقق من منطقه القشرة التي تعبر عن بروتين الفلورسنت تحت ضوء الاثاره (الشكل 2ا ، ب).
   4. نقل الدماغ إلى لوحه قطع المطاط سيليكون مليئه 30 مل من الوسائط DMEM/F12 فقاعات مع 100 ٪ O₂ الغاز. أزاله السحايا التي تغطي سطح الدماغ عن طريق ملقط غرامه.
   5. قطع الحدود بين الجزء الإنسي والجانب الجانبي من الدماغ الظهري وفصلها إلى نصفي الكره باستخدام سكين الجراحية الصغرى أو ملقط غرامه. باستخدام سكين الجراحية الصغرى ، وقطع القشرة مثل المشارب وجعل شرائح القشرية (الشكل 2ج ، د). شرائح ماصه مع متوسطه باستخدام الماصة ونقلها إلى الوسائط المخصبة في صحن 35 ملم.
   6. وضع الشرائح علي ادراج الثقافة في الاطباق أسفل الزجاج مع وسائل الاعلام المخصب. تصحيح اتجاه شرائح باستخدام ملقط غرامه. اعداد سطح قطع الشرائح إلى سطح الثقافة ادراج. قم بازاله الوسائط الاضافيه بواسطة ماصه. احتضان الشرائح في حاضنه متعددة الغازات التي وضعتها 40 ٪ O₂ و 5 ٪ CO₂ في 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
   7. أضافه 300 μl من الوسائط المخصبة التي تحتوي علي 1 مم لوسيفرين إلى خارج الثقافة ادراج في الطبق السفلي الزجاج.
3. التصور من تعبير مراسل لوسيفيراز في الثقافات شريحة
   1. بدء تشغيل نظام التصوير الحي التلالؤ قبل البدء في تشريح. استخدام الشرط التالي من الثقافات شريحة القشرية: 40 ٪ O₂، 5 ٪ CO₂ و 37 درجه مئوية.
   2. وضع النفط الغمر إلى 40x العدسة الموضوعية. وضع طبق العينة إلى مرحله المجهر. الحصول علي صوره اختبار الفلورسنت وتعيين الموقف والتركيز الطائرة إلى منطقه الاهتمام تحت أضاءه ضوء الاثاره.
   3. تشغيل الاستحواذ الفاصل الزمني من قبل 3-الابعاد (التلالؤ ، فلوري وحقل مشرق) المقتنيات ل 24 ساعة (الشكل 2F-h). للحصول علي صوره التلالؤ ، استخدم إعدادات الكاميرا التالية: انخفاض معدل نقل (50 كيلوهرتز) ، 2x2/4x4 التسلق ، 10 دقيقه/5 دقيقه التعرض الوقت. للحصول علي الصورة الميدانية المضيءه والساطعة ، استخدم الإعدادات التالية: معدل النقل المتوسط (MHz 1) ، 1x1 التسلق و 100 ms الوقت التعرض.

6-معالجه الصور وتحليلها

1. قم بتوصيل كل صوره وقم بعمل صور المكدس. انقر فوق استيراد تسلسل الصور من القائمة ملف (ملف | استيراد | تسلسل الصور) واختر المجلد ، حيث يتم حفظ الصور المكتسبة. وضع بعض الكلمات الواردة في اسم الملف إلى عمود File يحتوي علي اسم.
2. لأزاله ضجيج الاشعه الكونية علي الصور التلالؤ ، تطبيق فلتر Spikenoise المكونات في imagej/فيجي. افتح الصور المكدس ثم انقر فوق عامل تصفيه Spikenoise.
3. تطبيق Savitzky Golay تصفيه المؤقتة المكونات في للحصول علي ديناميات واضحة من التعبير مراسل. افتح الصور المكدس وانقر فوق التصفية المؤقتة Savitzky Golay.
4. لقياس شده تعبير المراسل ، قم بتطبيق التشكيل الجانبي للمحور Z بالاضافه إلى المكون الإضافي لكل خليه واحده. حدد الخلايا وتعيين ROIs ، منطقه الاهتمام وانقر فوق Z المحور الشخصي زائد.

تعبيرات من المورثات Hes1/7 معرض 2 h ذبذبه دوره في مختلفه خليه خطوط واثناء [سويتتيتولد]. وعلاوة علي ذلك ، فان فتره التذبذب قصيرة جدا وكلاهما mRNAs والبروتينات غير مستقره للغاية مع نصف حياه حوالي 20 دقيقه. إذا كنت تستخدم مراسل استجابه بطيئه ، لا يمكننا تتبع مثل هذه الديناميكيات السريعة ، وإذا كان استخدام مراسل مستقر ، فانه يتراكم تدريجيا في حين ان التعبير الجيني يتذبذب. التالي ، يجب ان يكون المراسل متدهورا بسرعة لمراقبه سرعه دوران هذه الجينات المعبر عنها دوريا. للتغلب علي هذه المشاكل ، استخدمنا مراسل لوسيفيراز لمراقبه التعبير الديناميكي لمؤشرات التذبذب. لان مراسل البريق لديه وقت النضج قصيرة وحساسية عاليه ، فانه يتيح لنا لرصد ديناميات السريعة من التذبذب ultradian. مثل مراسل الفلورسنت ، يمكن للمراسل لوسيفيراز رصد ديناميات التعبير من البروتين من خلال يجري تنصهر في تسلسل الترميز الجيني (الشكل 1ا، الشكل 2ه والشكل 3د). وتظهر منتجات الجينات المنصهرة في الخلايا نفس التعبير ، والدوران ، وحركيه الموقع في الزنزانات كما تفعل البروتينات الذاتية. وعلاوة علي ذلك ، لرصد النشاط المروج لDll1الجينات تتارجح ، ونحن استخدمت لوسيفيراز التي تزعزع الاستقرار ، وهو المراسل الذي لا يتزعزع (الشكل 1ا والشكل 3ا)²³، الذي نصف العمر حوالي 10 دقيقه²⁰. باستخدام أنواع مختلفه من المراسلين لوسيفيراز ، ونحن ولدت الفئران المحورة وراثيا أو طرقت في الفئران للحصول علي تعبير مستقر من مراسل في npcs خلال نيوروجينيسيس¹⁷. لتصور التعبير مراسل في مستويات خليه واحده في ثقافة الانسجه ، والتعريف المتناثرة من المراسل هو الأفضل. وهكذا ، استخدمنا ترانسكشن عابره من الجينات مراسل في NPCs عبر في الرحم الكهربي (الشكل 2F-H). وقد استخدم نظام مراسل لوسيفيراز في مجال إيقاعات الايقاعيه لمراقبه التعبيرات الديناميكية من الجينات علي مدار الساعة لفتره طويلة (علي سبيل المثال ، 1 أسبوع) ، مما يوحي بان لوسيفيراز (D-لوسيفيراز) ، والركيزة من انزيم لوسيفيراز اليراع ، هو مستقر جدا وليس^{لديه سميهللخلايا}الحي نحن عاده استخدام لوسيفرين في تركيزات من 1 ملم في وسائل الاعلام ، وهو ما يكفي للتصوير الخلوي الحي بين عشيه وضحيها. وعلاوة علي ذلك ، فان نظام التصوير القائم علي المجهر يمكننا من الحصول علي الصور متعددة الابعاد ، والصور الميدانية الساطعة ، والصور الفلورية والصور الكيميائية (الشكل 2F-H والشكل 3ه).

وباستخدام هذه الشروط ، تصورنا تعابير مختلفه من جينات الساعة ultradian ، بما في ذلك الHes1 والAscl1 والNeurog2 والDll1 (الاشكال 2 والشكل 3). وترد النتائج التمثيلية في الشكل 3. المراسل من Dll1 نشاط المروج عرضت التعبير الذبذبات في NPCs المستمدة من الدماغ عن بعد من الفئران مراسل Dll1-Ub-Fluc. وأشارت المراسلة التي تزعزع الاستقرار (الشكل 3ا) إلى التنظيم الحاد للتعبير عن نشاط المروج (الشكل 3ب ، ج). في هذه الحالة ، تعرض خلايا السلف العصبية واحده تقريبا 2.5 h دوره التذبذب مع السعات المختلفة علي مدي 13 ح (الشكل 3ج). مراسل لوسيفيراز الاستجابة السريعة تمكننا من التقاط ديناميات نقل الإشارات الشق بين اثنين من الخلايا الحية (الشكل 3مد-F والفيلم التكميلي S1). أعددنا نوعين من خلائط الحمض النووي: (1) مراسل المروج Hes1 (pHes1) و EGFP ناقلات التعبير ، و (2) Dll1 مراسل البروتين (Dll1 لوك) و mCherry التعبير ناقلات وتحويلها إلى NPCs بشكل منفصل. ثم جمعنا النوعين من الخلايا وشاركنا في الاستزراع لقياس التعبير عن المراسلين في الخلايا الحية. وترد النتائج التمثيلية في الشكل 3هاء ، واو. المتاخمة EGFP الخلايا الايجابيه التي تحمل مراسل Hes1 وخلايا ايجابيه mCherry التعبير عن Dll1 مراسل البروتين اتصلت مع بعضها البعض اثناء المراقبة. وبدا التعبير مراسل Hes1 في خليه خضراء لبدء حوالي 60 دقيقه بعد اتصال خليتين (الشكل 3E, F). وهذا يوحي بان التاخير الزمني لنقل الإشارات الشق بين الخلايا المجاورة كان حوالي 1 ساعة. وعلاوة علي ذلك ، اثناء إرسال الاشاره ، اظهر تعبير البروتين Dll1 النقل الديناميكي في خليه حمراء (الشكل 3ه).

الشكل 1: تشريح دماغ الفار الجنيني. (ا) هيكل مراسلي لوسيفيراز ، Dll1 مراسل المروج و Dll1 مراسل البروتين. (ب) اجراء التشريح. (ا) المنظر الجانبي لجنين الفار. (ب) قطع الراس إلى جانب الخط المنقط. (ج) أزاله البشرة والغضروف من الفجوة بين الدماغ الدماغي والمخ النصفي. (د) قطع الانسجه المحيطة علي طول الخط الأوسط بين نصفي اليمين واليسار. (ه) أزاله الانسجه من الفاصل المركزي إلى كلا الجانبين. (و) المخ الدماغي والدماغ النصفي بعد أزاله الانسجه المحيطة بها. (ز) فصل الدماغ الدماغي (الهاتف) ، المخ النصفي (منتصف) ولمبة حاسة الشم (OB). (ح) المقطع العرضي للدماغ الدماغي ، المبين في الخط المنقط في (ز). (ط) أزاله السحايا المحيطة بسطح الدماغ. (ي) فصل الدماغ إلى جزاين: الجزء الإنسي والجانب الجانبي. (ك) قطع الحدود من القشرة والسماحة العقديه (GE). (ل) ويستخدم الجزء الجانبي من القشرة dorso لثقافة التفكك. (ج) المخ في اليوم الجنيني 14 (E14) ، الذي يتالف من اليسار (ا) واليمين (ب) نصفي الدماغ الدماغي والمخ النصفي (ج). (د) نصفي الدماغ الدماغي يفصل عن المخ النصفي. (ه) نصف كره الدماغ الذي يتم تشريحه: الجزء الجانبي من الدماغ بما في ذلك العقول العقديه (d) ، والجزء المحدب من الدماغ الذي يستخدم للثقافات المنفصلة والثقافات الشريحة (E) ، والجزء الإنسي من الدماغ (f) والسحايا التي تغطي سطح المخ (ز). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: جعل الشرائح القشرية من الدماغ الجنيني وتصور ديناميات البروتين Dll1 في الثقافات شريحة القشرية. (ا) التحقق من التعبير عن egfp باستخدام المجهر مجسمه الفلورية. يظهر السهم الأحمر منطقه القشرة التي تعبر عن EGFP. نصف الكره الأيسر (ا) ، النصف الأيمن من الكره الارضيه (ب) والدماغ الأوسط (ج). (ب) الخطوط المنقطة تشير إلى الحدود الخارجية للمناطق الدماغية المبينة في (ا). (ج) تشريح قشره الدماغ الرباعي الأضلاع. تشير النصال البيضاء إلى حواف القطع. (د) الشرائح القشرية من الدماغ الجانبي الناتئ. (ه) الهياكل الجينية للصحفيين لتصور ديناميات البروتين Dll1 في الحواسيب الشخصية. وقدم مراسل البروتين Dll1 ، Dll1 (العلوي) في NPCs مع ناقلات التعبير EGFP (اقل) لرصد المورفولوجية والهجرة من الخلايا في الشرائح القشرية. (اف-اتش) الصور ثلاثية الابعاد للمجال الساطع (F) ، والتعبير Gfp (G) ، والتلالؤ الإحيائي (H) في الشريحة القشرية. ويسمح نظام التصوير الضوئي الإحيائي بتتبع تعبيرات المراسلات الصحفية والفلورية في وقت واحد. قضبان المقياس: 200 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: بيانات تمثيليه لتصور وتحليل التعبير الديناميكي لجين Dll1 في ثقافة المجلس الوطني لنواب الشعب. (ا) يبني المراسل لتصور تعبير Dll1 علي المستوي الخاص بالشلل ، وذلك باستخدام مراسل لزعزعه الاستقرار (Ub-لوسيفيراز ، وهو من الطراز الاوبيفيداز). (ب) تصور للتعبير عن DLL1 في مجلس وطني واحد مع مراسل التلالؤ البيولوجي. وتبين الأرقام الواردة في اللوحة نقاط الذروة في التعبير المتذبذب لDll1 المناظرة للأرقام في اللوحة c. (ج) مؤامرة زمنيه للدورة البيولوجية للمجلس الوطني لنواب الشعب الذي يظهر في (ب) ، ويعرض التعبير الديناميكي لDll1. (مد-واو) التصور للتعبير عن مراسل المروج Hes1 ومراسل البروتين Dll1 أعرب في الخلايا المجاورة. (د) هيكل مراسل النشاط المروج Hes1 (pHes1) ومراسل البروتين الDll1 (Dll1 لوك). (هاء وواو) الخلية الايجابيه EGFP التي تحمل مراسل Hes1 (Cell1) والخلية الايجابيه mCherry التي تحمل Dll1 مراسل البروتين (Cell2) كانت مشتركه في الاستزراع وتم قياس التلالؤ من كلا النوعين من المراسلين. وبدا التعبير عن مراسل Hes1 في الخلية الخضراء (cell1) للبدء حوالي 60 دقيقه بعد الخليتين الاتصال. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الفيلم التكميلي S1: التصور للتعبير عن مراسل المروج Hes1 ومراسل البروتين Dll1 المعرب عنها في الخلايا المجاورة ، المتعلقة بالشكل 3مد-3f. الرجاء الضغط هنا لمشاهده هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)

مكونات الإشارات الشق تظهر التعبيرات المتذبذبة في التزامن اثناء التوالد ولكن من التزامن اثناء التكوين العصبي ، مما يؤدي إلى صعوبات في التقاط ديناميات التعبير عن طريق تحليل ثابت في الحالة الاخيره. التالي ، مطلوب رصد في الوقت الحقيقي للكشف عن ديناميات التعبير من مكونات الإشارات الشق ، مثل Hes1 و Dll1. لان الفترات من التعبيرات من Hes1 و Dll1 ذبذبات جدا قصيرة, تقريبا 2-3 [ه], استجابه سريعة وغير مستقر مراسلات لازمه ل يراقب هم تعبير ديناميات. ولهذا الغرض ، قمنا بتطوير مراسل التالق البيولوجي ونظام التصوير. ويظهر المراسل لوسيفيرياز التلالؤ السريع حركيه النضج وحساسية عاليه لتتبع الدوران السريع لتعابير الجينات الدورية هذه. يؤدي الدوران السريع للصحفيين إلى إشارات خافته جدا. للكشف عن مثل هذه الإشارات الخافتة التي تنتجها الصحفيين التلالؤ ، ونحن نستخدم نظام التصوير الأمثل التالق ، بما في ذلك حساسية عاليه ، والمياه المبردة كاميرا CCD مع سرعه قراءات منخفضه جدا (50 كيلوهرتز) ، مما يقلل من الضوضاء إلى الحد الأدنى. وعلاوة علي ذلك ، عدسه الهدف الرقمية العالية (N.A.) يمكننا من جمع الضوء المنبعث من المراسل الذي تم زعزعه استقراره علي أكمل وجه. للحصول علي حساسية اعلي نستخدم عاده اعلي التسلق (علي سبيل المثال ، 2 × 2 ، 4 × 4 ، 8 × 8) والحفاظ علي مصراع لفتح لفتره طويلة (علي سبيل المثال ، 5-20 دقيقه). لان الاشاره من المراسلين لوسيفيراز خافت للغاية ، وتدخل الضوء من البيئة أيضا يطرح مشكله في الكشف عن اشاره خافته: التالي ، يجب ان تكون غرفه المجهر مظلمة تماما. ويتيح لنا هذا النظام قياس التعابير الديناميكية لHes1 والجينات الDll1ه في أجهزه الكمبيوتر الشخصية في كل من مستويات النقل العابر والبروتين (الشكل 3). الاضافه إلى ذلك ، يمكننا تصور ديناميات البروتين من ازفاء داخل الخلايا مع المراسلين البروتين تنصهر المنصهر. وعلاوة علي ذلك ، باستخدام مراسل لوسيفيراز الاستجابة السريعة ، يمكننا التقاط ديناميات الإرسال من الدرجة الإشارات وقياس تاخير الوقت لنقل اشاره بين خليتين الحية (الشكل 3مد-F والفيلم التكميلي S1). وعلاوة علي ذلك ، فان الجمع بين مراسل المروج (مراسل Ub-luciferase) ومراسل البروتين (الانصهار luciferase) من جين واحد يتيح لنا لقياس الوقت التاخير بين النسخ والترجمة من الجينات. بهذه الطريقة التصوير متعددة من أنواع مختلفه من الصحفيين التلالؤ ومراسل مضان متاح لقياس الوقت التاخير/معدل للتفاعلات البيوكيميائية.

وقد كشف رصد التعابير الجينية في الوقت الحقيقي في قرار خليه واحده ان هناك اختلافات في ديناميات التعبير من نفس الجين. بعض الخلايا تعبر عن Dll1/Neurog2 بطريقه متذبذبة ، ولكن البعض الآخر يظهر أنماطا مستدامه. وعلاوة علي ذلك ، فان ديناميات التعبير المختلفة (التذبذب مقابل الثبات) تحفز المخرجات المختلفة في حاله الخلايا. ما يبدو واضحا هو ان ديناميات التعبير المختلفة تؤثر علي سلوكيات الخلية بطرق مختلفه ، مما يوحي بان ديناميات التعبير بترميز المزيد من المعلومات^{21،22،26،27،28،29،30،31،32}. ولا يمكن للتحليلات الساكنة ان تلتقط الديناميات في التعبير الجيني ، ويلزم اجراء تحليلات في الوقت الحقيقي لفهم الظواهر البيولوجية للكشف عن ديناميات التعبير في الاحداث الخلوية. النهج الذي نقدمه هنا يمكن رصد ديناميات مؤشرات التذبذب ultradian خلال التنمية العصبية في القرار الزمني عاليه. باستخدام هذه الطريقة ، وجدنا ان العديد من الجينات التي يتم التعبير عنها بشكل حيوي مما كنا نظن سابقا ، ويمكننا تتبع ليس فقط ديناميات التعبير البروتين ولكن أيضا ديناميات في توطين البروتين في الخلية في القرار الزمني عاليه. وقد يكون لأنماط التعبير الديناميكية هذه الأخرى بيولوجية لم يتم توضيحها بعد.

ويتمتع الصحفيون الاحياء بميزه كبيره في الدقة الزمنيه والسمية المنخفضة للخلايا الحية مقارنه بالصحفيين^ال33ين. ومع ذلك ، وعلي النقيض من الاختلافات في ألوان في الصحفيين الفلورسنت ، لا يوجد سوي عدد قليل من ألوان في الصحفيين التالق ، وفرض قيود علي عدد من الجينات التي يمكن رصدها في وقت واحد. ومع ذلك ، يتم عزل اعداد متزايدة من لوسيفيراز متغير والمستنسخة من مختلف المخلوقات^34،35، وباستخدام هذه مجموعه متنوعة من لوسيفيراز ، وسوف نكون قادرين علي تتبع في وقت واحد ديناميات التعبير الجيني متعددة في خليه واحده في القرار الزمني عاليه. الحجم الجزيئي لل لوسيفيراز اليراع هو أكبر من الصحفيين مضان ، والذي يعرض بعض الصعوبات في بناء مراسل البروتينات تنصهر لرصد ديناميات البروتين ، ولكن في الاونه الاخيره ، وقد تم استنساخ لوسيفيراز جديده وأصغر وأكثر إشراقا³⁶، مما يسمح لنا لتصور ديناميات البروتين أسهل من اي وقت مضي وقد اظهر عدد متزايد من التقارير مؤخرا أنواعا مختلفه من الديناميات في التعبير الجيني ونقل البروتين في مختلف الاحداث^{البيولوجية21}،^{22،26،27،28،29،30،31،32}. ستزداد اهميه تحليل هذه الديناميات في التنظيم المكاني باستخدام نظام رصد في الوقت الحقيقي للتقاط الحالات الفعلية للخلايا والكشف عن تنظيم النظم الخلوية.

وليس لصاحبي البلاغ مصلحه مالية متضاربة.

نشكر يوميكو ايواموتو لدعم إنتاج الفيديو. ونحن ممتنون أيضا ل Akihiro ايسومورا لمناقشه ودعم تحليل الصور ، هيتوشي Miyachi لدعم التقنية لتوليد الكائنات المحورة وراثيا ، يوجي Shinjo (اوليمبوس العلوم الطبية) ، ماساتوشي غوته (اوليمبوس العلوم الطبية) ، تاكانيا ايميزو ( اوليمبوس العلوم الطبية) و Ouin Kunitaki (Andor اليابان) للحصول علي الدعم الفني والمناقشات من نظام التصوير الإحيائي. وقد دعم هذا العمل من قبل البحوث الاساسيه للعلوم والتكنولوجيا التطورية (JPMJCR12W2) (R.K.) ، والمنح في المعونة للبحوث العلمية في مجالات مبتكره (تربيه 24116705 لH.S. و تربيه 16H06480 ل R.K.) ، ومنحه المعونة للبحوث العلمية (ج) (JSPS 18K06254) (H.S.) ، مؤسسه تاكيدا (R.K. و H.S.) ، ومنصة للنهج الديناميكية لنظام المعيشة من وزاره التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا ، اليابان.