Formalin-Sabit Dokulardan Lyssavirüs Antijen Tespiti için İmmünohistokiniti Testi

Burada formalin-sabit dokular için alternatif tanı testi olarak kuduz virüsü antijeninin tespiti için immünhistokinemya test protokolü sunuyoruz.

Kuduz için birincil tanı yöntemlerinden biri, enfekte doku örneklerinde viral ribonikleoprotein (RNP) kompleksinin (antijen) saptanmasıdır. Antijen tespiti için doğrudan floresan antikor (DFA) testi veya doğrudan hızlı immünohistokimyasal test (DRIT) en yaygın olarak kullanılırken, her iki test de antikorlar kullanılarak antijen tespit edilmeden önce slaytlardaki gösterimler için taze ve/veya dondurulmuş dokular gerektirir. Örnekler formalin içinde toplanır ve sabitlenirse, her iki test de antijen tespiti için uygun değildir, ancak test parafin bloklarına ve kesitlere gömüldikten sonra geleneksel immünhistokimya (IHC) tarafından yapılabilir. Bu IHC yöntemi ile dokular anti-kuduz antikorları ile lekelenir, bölümler deparaffinize edilir, kısmi proteoliz veya diğer yöntemlerle antijen alınır ve primer ve sekonder antikorlarla inkübe edilir. Antijenler yaban turpu peroksidaz / amino etil karbazol kullanılarak lekelenir ve hafif bir mikroskop kullanılarak görselleştirme için hematoksilin ile karşıtır. Spesifik antijen tespitine ek olarak, formalin fiksasyonu histolojik değişikliklerin belirlenmesi, numune depolama ve taşıma için rahat koşullar (ortam sıcaklıkları altında), retrospektif vakaları test etme yeteneği ve enfeksiyöz ajanların inaktivasyonu yoluyla biyolojik güvenliğin iyileştirilmesi gibi başka avantajlar sunar.

Kuduz, lyssavirus cinsine ait negatif duyu RNA virüslerinin neden olduğu akut ilerleyici bir ensefalittir¹. Cinsin tip üyesi kuduz virüsü (RABV) enfeksiyonundan kaynaklanan tüm insan ölümlerinin yaklaşık% 99'u köpekler tarafından bulaşır². Şüpheli hayvanların kuduz tanısı, beyin dokusunda genomik RNA (ribonikoprotein kompleksi, RNP) ile komplekste antijenin (öncelikle viral kodlanmış nükleoprotein, N proteini) tespit edilmesine dayanır³. Doğrudan floresan antikor (DFA) testi ile antijen tespiti kuduz tanısı için altın standart olarak kabul edilir⁴. Yöntemde taze veya taze dondurulmuş beyin materyali, slayt üzerinde dokunma izlenimi, asetonda fiksasyon, ticari olarak mevcut floresan izotiyosiyanat (FITC) etiketli monoklonal veya poliklonal antikorlar (mAbs/pAbs) kullanılarak boyama ve floresan mikroskopisi tarafından okunur⁵. DFA testi hızlı, hassas ve taze beyin dokusunda kuduz antijen tespiti için özeldir. Son zamanlarda, doğrudan hızlı immünohistokimyasal test (DRIT), modifiye immünhistokimya (IHC) tekniğinin DFA'ya benzer hassasiyet gösterdiği gösterilmiştir, ancak görselleştirme için ışık mikroskopisi avantajı sunmaktadır^6. DRIT'de kullanılan algılama yöntemi IHC'ye benzer olsa da, ilk adımda numunenin dokunma izlenimlerini oluşturmak için taze veya dondurulmuş dokular ve ardından formalin fiksasyonu kullanılır.

IHC, parafin bloklarına gömülü formalin-sabit dokularda spesifik antikorlar kullanarak histolojik değişiklikleri ve proteinlerin tespitini belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. IHC, doku bölümlerinde kuduz antijen tespiti için belirlenmiş bir alternatif testtir^7. IHC özellikle kuduz yükünü belirlemek için nörolojik hastalıklar sergileyen retrospektif vakaların tanısı için kullanılmıştır⁸. Parafin gömülü formalin sabit dokular, ortam sıcaklığında depolandığında birkaç yıl sonra bile proteinleri tespit için korur⁹. Formalin tedavisi, amino asit yan zincirlerini çapraz bağlayarak ve değiştirerek proteinleri değiştirir, bu da epitopların antikorlara karşı artık reaktif olmamasını sağlayabilir¹⁰. Kuduz antijen tespiti için IHC testi mAbs veya pAbs içerirken, ikincisi birden fazla epitop ve farklı lyssavirüsler tespit edilebildiğinden avantajlıdır¹¹.

IHC'de yer alan standart adımlar dokuların formalin sabitlenmesi, parafin bloklarına gömülmesi, dokuların bölümlenmesi, deparaffinizasyon ve hidrasyon, epitop iyileşmesi, birincil ve ikincil antikorlara karşı reaktivite ve kromojenik substratlar kullanılarak gelişimdir. Bu makalede kuduz tanısı için protokolün ayrıntılı bir anlatımı açıklanmaktadır. Kuduz antijen tespiti için, ABD Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (CDC) Atlanta, Georgia'da biyotinillenmiş fare karşıtı ikincil antikorlarla birlikte üretilen RABV (pAbs) ile aşılanmış fare serumu kullanılmaktadır. Biyotinilasyonlu Abs, streptavidin-yaban turpu peroksidaz (HRP) kompleksinin eklenmesi ve ardından amino-etilkarbazol substratı ile renk gelişimi ile tespit edilir.

Mevcutsa RABV'yi devre dışı bırakan formalin-sabit dokularda IHC protokolü yapılırken, uygun biyogüvenlik protokollerine uygun şekilde uyulmalıdır. Tüm biyogüvenlik prosedürleri Mikrobiyolojik ve Biyomedikal Laboratuvarlarda Biyogüvenlik (BMBL) 5th Edition (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm) içinde, uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) giymek ve açıklandığı gibi aşılama gereksinimi dahil olmak üzere açıklanmıştır^12. Ek olarak, tehlikeli kimyasalların (formalin, AEC ve ksilen gibi) uygun şekilde muhafaza edilmesi ve işlenmesi takip edilmelidir (örneğin, duman davlumbazları).

1. Dokuların formalin sabitlenmesi

1. Nekropsi sonrası toplanan 3-5 mm beyin dokularını^13% 10 fosfat tamponlu formalin çözeltisine (1:20 ila 1:50 doku/ formalin oranı) 24-72 saat yerleştirin.
   DİkKAT: Formalin toksik bir fiksatiftir.
2. Yaklaşık doku ağırlığını (boyutunu), doku tipini (beyin bölgelerini) ve formalin hacmini kaydedin. Laboratuvarların sabitleme sürelerine ilişkin kayıtları belgeleması ve tutması önemlidir.
3. Formalin fiksasyonundan sonra ve işlemden önce daha uzun doku depolaması için, dokuyu% 70 etanol içine yerleştirin.

2. Doku işleme

1. Örnek fiksasyonunu takiben, dokuyu beyin sapının kesitleri, beyincik (3 lob) veya hipokampus (her ikisi de hipokampi) gibi önemli beyin bölgelerini içerecek şekilde parçalara bölün ve her biri 3 ila 5 mm kalınlığında keser ve işleme kasetlerine yerleştirilir.
2. Parafin bloklarına gömülü ve bir mikrotom üzerinde bölümlenmiş (3 ila 6 μm) parafin balmumu infiltrasyon için doku kasetlerini işleyin.

3. Malzemelerin Hazırlanması / Boyama yemekleri

1. Şekil 1'de gösterildiği gibi boyama kabı¹⁴ 'i(Malzeme Masası) ayarlayın. Her yemeği 250 mL çözelti ile doldurun.
2. 3-Amino-9-etilkarbizol (AEC) substrat stok çözeltisinin hazırlanması
   1. Bir 20 mg tablet 3-amino 9-etilcarbazole (AEC) 5 mL N, dimetilformamid cam pipet kullanarak çözün.
      DİkKAT: AEC bir kanserojendir.
3. Antijen alımı için proteaz (örneğin, Pronaz) stok çözeltisinin hazırlanması
   1. 200 mL PBS'de 7 mg proteaz çözün.
4. Durulama tamponu PBS-T'nin hazırlanması
   1. 10 mL ara 80 ila 990 mL PBS ekleyin. Homojen bir çözelti oluşturmak için iyice karıştırın.

4. Deparaffinizasyon ve doku rehidrasyonu

1. Bir mikrotom kullanarak 5 μm parafin bölümü yapın, 38 ° C'de bir su banyosunda yüzdürün ve cam slaytlara toplayın. Slaytları reaktife dayanıklı bir kalem/işaretleyici ile etiketleyin.
2. Slaytları bir tepsiye yerleştirin ve 55-60 °C fırında 1 saat eritin. Viral antijeni yok edebileceğinden sıcaklığı 60 °C'nin üzerine yükseltmeyin.
3. Slaytları fırından çıkarın ve 1, 2 ve 3 yemeklerinde her biri 5 dakikalık ardışık 3 ksilen durulamada hemen deparaffinize edin.
4. Etanolün deiyonize suya seyreltilmesinde sıralı daldırmalarla slayttaki bölümleri yeniden sulandırın: (4 ila 11 bir daldırma durulamadır) çanak 4: ksilen / % 100 etanol (1:1); tabak 5: % 100 etanol; tabak 6: % 100 etanol; tabak 7: 95% etanol; tabak 8: 95% etanol; tabak 9: % 80 etanol; tabak 10: % 70 etanol; çanak 11: deiyonize su (Şekil 1. Çanak kurulumu).
   DİkKAT: Ksilen tehlikeli bir kimyasaldır ve duman kaputunda çalışma yapılmalıdır.

5. Proteolitik antijen alımı

1. Slaytları proteazla (PBS'nin 2,5 μg/mL'si) proteolitik antijen alımı için 30 dakika boyunca tedavi edin 12.
2. Ardından PBS-T'de 10 dakika durulayın (yemek 13).
3. 10 dakika boyunca% 3 hidrojen peroksit ile tedavi edin (tabak 14).
4. Yine PBS-T ile 10 dakika (bulaşık 15) yıkayın.

6. Boyama prosedürü

1. Kalan slaytları arabelleğe batırarak slaytları teker teker işleyin (slayt tutucusuna tam olarak çıkarmayın - slaytları ıslak tutun). Doku bölümünü rahatsız etmemeye dikkat ingerek bir kaydırağı çıkarın ve doku bölümünün etrafındaki fazla tamponu (kağıt havlu kullanarak) lekeleyin. Nem odasında, nemlendirilmiş kağıt havlular yerleştirilerek yapılan, laboratuvar tezgahının üst^{kısmındaki 14'te} oda sıcaklığında normal keçi serumu (blokaj) ile 15 dakika boyunca sürtün.
2. Önceden belirlenmiş en uygun seyreltme primer anti-kuduz antikoru (fare anti-kuduz serumunun 1:250 seyreltilmesi, yayınlanmamış) (pozitif kontrol) ve negatif kontrol antikorlarını oda sıcaklığında yukarıdakiyle aynı şekilde (adım 6.1.) 60 dakika boyunca kuluçkaya bırakın.
3. 60 dakika sonra PBS-T ile 10 dakika (tabak 16) yıkayın.
4. Biyotinillenmiş antikorla (türe özgü) oda sıcaklığında 15 dakika boyunca nem odasında kuluçkaya yatırın (adım 6.1 ile aynı şekilde işlenin).
5. PBS-T ile 10 dakika (bulaşık 16) yıkayın.
6. Streptavidin-HRP kompleksi ile oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir nem odasında kuluçkaya yatır (6.1 ile aynı işleme).
7. PBS-T ile 10 dakika (bulaşık 16) yıkayın.
8. Peroksidaz substratı, amino-etilkarbazol (AEC) ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bir nem odasında kuluçkalayın. Kullanmadan hemen önce AEC yapın. Bunu yapmak için, 14 mL 0,1M asetat tamponu olan pH 5,2'ye 1 mL AEC stok çözeltisi ekleyin. 0.15 mL% 3 H₂O₂ekleyin. Karışımı kullanmadan hemen önce filtreleyin (0,45 μm filtre).
   NOT: AEC'nin çalışma çözümü sadece 2-3 saat boyunca kararlıdır. AEC stok çözeltisi buzdolabında daha uzun süre saklanabilir.
9. İyonize suda yıkayın 10 dk (bulaşık 17)
10. Gill'in Hematoksilin ile karşıt 2 dakika boyunca deiyonize su ile 1:2 seyreltilmiş (çanak 18).
11. Fazla Hematoksilin'i deiyonize su daldırma durulama ile durulayın (tabak 19 ve 20).
12. Scott's Tap suyunda durulayın 30 s (bluing çözeltisi) yemek 21.
13. İyonize suda yıkayın 10 dk (bulaşık 22)
14. Slaytları birer birer çıkarın - suda çözünür montaj ortamıyla monte edin.
15. Işık mikroskopunda slaytları okuyun.

Şekil 2, test edilen farklı beyin dokularındaki pozitif ve negatif kontrol örneklerinin temsili IHC boyama sonuçlarını göstermektedir. Şekil 2A,D,G 200x'te pozitif örnekleri temsil ederken, Şekil 2B, E, H sırasıyla 400x büyütmeye karşılık gelir. Şekil 2A-C beyin sapına karşılık gelir; Şekil 2D-F beyincik ve Purkinje hücrelerine karşılık gelir; ve Şekil 2G-I hipokampusa karşılık gelir. Şekil 2C, F, ben negatif kontrol örnekleri vardır. Macenta kırmızı boyama, kuduz antijenine karşı antikorların reaktivitesi nedeniyle mavi arka planda (Hematoksilin kontrtain) AEC substratı kullanılarak renk gelişimini göstermektedir. AEC, HRP tarafından katalizöre edilen oksidasyon reaksiyonunda, hafif bir mikroskop altında gözlemlenebilen suda çözünmeyen çökelti ile sonuçlanan bir peroksidaz substratıdır.

IHC'de olumlu bir sonuç doku bölümlerinde macenta kırmızısı lekelemelere karşılık gelir. Sitoplazmik inklüzyonların ve farklı büyüklükteki granüler inklüzyonların lekelenmeleri RABV enfeksiyonları için pozitif örneklerin göstergesidir. Spesifik kırmızı lekelenme yoksa veya hematoksilin nedeniyle sadece mavi arka plan gözlenmişse numuneler negatif kabul edilir. Pozitif lekelenmeye ek olarak, inklüzyonların dağılımı, doku örneklerinin viral yüküne karşılık gelebilecek olan numunedeki kuduz antijen seviyelerinin dolaylı olarak nicelleştirilmesini sağlayabilir. Dağılım düzeylerinden bağımsız olarak, herhangi bir özel boyama, numuneyi RABV antijen tespiti için pozitif olarak sınıflandıracaktır.

Şekil 1: IHC testi için farklı adımları gösteren akış şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Pozitif ve negatif kuduz beyin dokusunun immünohistokimyasal lekelenimi. (A) Beyin sapında intrasitoplazmik viral inklüzyonlar ve kuduz virüsü antijen tespiti 200x toplam büyütme; (B) pozitif beyin sapı 400x; (C) beyin sapı negatif kontrol 200x; (D) beyincik 200x içinde kuduz virüs inklüzyonları; (E) beyincik ve Purkinje hücreleri 400x; (F) beyincik negatif kontrol; (G) Hipokampus 200x içinde viral inklüzyonlar; (H) hipokampus 400x; hipokampus negatif kontrol 200x. Kırmızı leke, Streptavidin-biotin kompleks boyama yöntemi (AEC substrat) kullanılarak kuduz virüsü antijeninin varlığını gösterir. Hematoksilin kontrastain (mavi). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Semptom başlangıcından sonra kuduzun yüksek ölüm oranı nedeniyle, RABV enfeksiyonu için şüpheli hayvanların tanısı uygun bir maruziyet sonrası profilaktik tedavi için son derece kritiktir. Kuduz tanısı öncelikle taze veya dondurulmuş dokular kullanılarak DFA, DRIT ve PCR tabanlı tekniklere bağlıdır. Formalin-sabit dokuların test edilmesi için, IHC testi RABV antijeninin hassas ve spesifik tespiti için alternatif bir yöntem sağlar. Formalin ile sabitlenen dokular çapraz bağlama gibi yan zincirlerin modifikasyonu nedeniyle stabilize proteinlere sahipken, numunelerin antijen tespitından önce işlenmesi gerekir. Bu protokolde epitoplar, birincil antikorların RNP kompleksine bağlanmasını sağlamak için proteaz (örneğin Pronaz) tarafından kısmi proteolitik sindirim yoluyla geri kazanılmıştır. N proteine karşı reaktif olan mAb'ler ağırlıklı olarak DFA ve DRIT'de güvenilirken, IHC testi için N proteini üzerindeki birden fazla epitopa karşı reaktif olan pAb'ler tercih edilecektir. Ek olarak, reaktivite veya pAb'ler farklı RABV varyantlarına ve kuduz olmayan lyssavirüslere karşı mAb'lere kıyasla daha geniş olabilir.

IHC testinin en önemli sınırlamalarından biri, protokolün birkaç sıralı adım içermesi ve tamamlanması yaklaşık 6 saat sürmektedir. Dokunun formalin olarak sabitlenmesi ve parafin bloklarına gömülmesi gerekiyorsa, dokunun lekelenabilmesi için 1 - 2 gün daha gerekir. Diğer bir sınırlama, IHC testi için ticari birincil anti-kuduz antikorlarının mevcudiyetidir. Bununla birlikte, IHC, test için sadece FF dokuları mevcut olduğunda kuduz tanısı koyma seçeneği sağlar. IHC testi, dokuların bir yarısı formalin (ve DFA tarafından test edilen diğer düzeltilmemiş dokularda) depolanıyorsa ve tanı için gerektiği gibi beyin sapının ve diğer dokuların komple kesitinin test etmek gerekliyse kuduz vakalarının testi için özellikle önemlidir. IHC testi ile kuduz antijen tespiti, klinik semptomlara dayalı şüpheli olguların tanı ve /veya retrospektif analizi için insan post-mortem beyin örnekleri için kullanılabilir. IHC, DFA gibi kuduz tanısı için birincil veya doğrulayıcı bir test olarak onaylanmamış olsa da, yöntem kuduz spesifik antikorları kullanarak antijeni tespit eder. Taze/dondurulmuş vs FF dokuları kullanılarak DFA karşılaştırması benzer hassasiyet ve özgüllük^{sağladı 15.} Antikorlar doğrudan FITC'ye (DFA testi gereksinimi) konjuge edilmediği sürece, HRP etiketli antikorlar IHC'de kuduz antijenini lekelemede kullanılabilir. HRP tabanlı algılamanın avantajı, gözlem için hafif bir mikroskop kullanma yeteneğidir. Mevcut piyasada bulunan DFA reaktifleri, FITC konjuge kuduz spesifik antikorları (mAbs), epitopların modifikasyonu nedeniyle formalin fiksasyonundan sonra antijeni tespit etmez. Bununla birlikte, FITC kuduz spesifik pAb'ler mevcutsa, Dünya Sağlık Örgütü¹⁶tarafından önerildiği gibi bir boyama yöntemi olarak kullanılabilir. Antijen tespitine ek olarak, FF dokuları RNA izolasyonuna ve ardından RABV genomik RNA varlığını doğrulamak için belirli astarlar kullanılarak PCR ve dizilemeye tabi tutulabilir.

Formalin-sabit dokuların diğer avantajları hematoksilin ve eozin boyama yöntemi ile histolojik değişikliklerin belirlenmesidir. Formalin tedavisi proteini korurken, proteinlerin kapsamlı çapraz bağlanması ve nükleik asitlerin bozulması veya modifikasyonu nedeniyle numunedeki çoğu patojeni tamamen devre dışı bırakmaktadır. Böylece yöntem, DFA'ya kıyasla biyolojik numune taşıma, nakliye ve test güvenliğini artırır. DFA'daki aseton fiksasyon adımı RABV'yi devre dışı bırakmaz ve uygun KKD¹⁷ile ele alınmalıdır. Formalin fiksasyonundan sonraki numuneler kararlıdır ve soğuk hava deposuna erişimin sınırlı olduğu düşük kaynak alanları için uygun olan ortam sıcaklığında saklanabilir. Benzer şekilde, parafin gömülü formalin-sabit dokular, proteinlere karşı antikor reaktivitesini kaybetmeden ortam sıcaklıklarında uzun süreli depolama için düşünülebilir.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Laboratuvar uzmanlarına, epidemiyologlara ve halk sağlığı departmanlarına bağlı kuruluşlara Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezlerine örnek gönderimler için teşekkür ederiz. Bu rapordaki bulgular ve sonuçlar yazarların bulgularıdır ve mutlaka Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezlerinin resmi konumunu temsil etmez. Ticari isimlerin ve ticari kaynakların kullanımı yalnızca tanımlama içindir ve Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri tarafından onay anlamına gelir.