Immunhistochemischer Test für den Lyssavirus-Antigennachweis aus formalinfixierten Geweben

Hier stellen wir ein immunhistochemisches Testprotokoll zum Nachweis von Tollwutvirus-Antigen als alternativen diagnostischen Test für formalinfixierte Gewebe vor.

Eine der primären diagnostischen Modalitäten für Tollwut ist der Nachweis des viralen Ribonukleoprotein (RNP) -Komplexes (Antigen) in den infizierten Gewebeproben. Während der direkte fluoreszierende Antikörpertest (DFA) oder der direkte immunhistochemische Schnelltest (DRIT) am häufigsten für den Antigennachweis verwendet werden, benötigen beide Tests frisches und / oder gefrorenes Gewebe für Abdrücke auf Objektträgern vor dem Antigennachweis mit Antikörpern. Wenn Proben gesammelt und in Formalin fixiert werden, ist keiner der Tests optimal für den Antigennachweis, jedoch können Tests durch konventionelle Immunhistochemie (IHC) nach Einbettung in Paraffinblöcke und Schnitte durchgeführt werden. Bei dieser IHC-Methode werden Gewebe mit Anti-Tollwut-Antikörpern gefärbt, Abschnitte deparaffiniert, Antigene durch partielle Proteolyse oder andere Methoden entnommen und mit primären und sekundären Antikörpern inkubiert. Antigene werden mit Meerrettichperoxidase / Aminoethylcarboxazol gefärbt und mit Hämatoxylin für die Visualisierung mit einem Lichtmikroskop gegengefärbt. Neben dem spezifischen Antigennachweis bietet die Formalinfixierung weitere Vorteile wie die Bestimmung histologischer Veränderungen, entspannte Bedingungen für die Lagerung und den Transport von Proben (unter Umgebungstemperaturen), die Möglichkeit, retrospektive Fälle zu testen und die biologische Sicherheit durch die Inaktivierung von Infektionserregern zu verbessern.

Tollwut ist eine akute progressive Enzephalitis, die durch die RNA-Viren des negativen Sinnes der Gattung Lyssavirus¹verursacht wird. Fast 99% aller todesfälle beim Menschen, die durch die Infektion mit dem Tollwutvirus (RABV), dem Typmitglied der Gattung, verursacht werden, werden von Hunden übertragen². Die Tollwutdiagnose verdächtiger Tiere beruht auf dem Nachweis von Antigen (hauptsächlich viral kodiertes Nukleoprotein, N-Protein) im Komplex mit genomischer RNA (Ribonukleoproteinkomplex, RNP) im Hirngewebe³. Der Antigennachweis durch den direkt fluoreszierenden Antikörpertest (DFA) gilt als Goldstandard für die Tollwutdiagnose⁴. Das Verfahren verwendet frisches oder frisches gefrorenes Hirnmaterial, einen Berührungsabdruck auf einem Objektträger, Fixierung in Aceton, Färbung mit handelsüblichen fluoreszierenden Isothiocyanat (FITC) markierten monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern (mAbs/pAbs) und wird von der Fluoreszenzmikroskopie^{abgelesen 5.} Der DFA-Test ist schnell, empfindlich und spezifisch für den Nachweis von Tollwutantigen in frischem Hirngewebe. Vor kurzem wurde gezeigt, dass ein direkter immunhistochemischer Schnelltest (DRIT), eine modifizierte immunhistochemische (IHC) -Technik, eine ähnliche Empfindlichkeit wie DFA aufweist, aber den Vorteil der Lichtmikroskopie für die Visualisierung bietet⁶. Während die im DRIT verwendete Nachweismethode der IHC ähnelt, verwendet der erste Schritt frisches oder gefrorenes Gewebe, um Berührungsabdrücke der Probe zu erzeugen, gefolgt von einer Fixierung in Formalin.

IHC ist eine weit verbreitete Technik zur Bestimmung histologischer Veränderungen und zum Nachweis von Proteinen mit spezifischen Antikörpern in formalinfixierten Geweben, die in Paraffinblöcke eingebettet sind. IHC ist ein etablierter alternativer Test für den Tollwutantigennachweis in den Gewebeabschnitten⁷. IHC wurde insbesondere für die Diagnose von retrospektiven Fällen eingesetzt, die neurologische Erkrankungen aufwiesen, um die Belastung durch Tollwut zu bestimmen⁸. Paraffin-eingebettete formalinfixierte Gewebe bewahren die Proteine für den Nachweis auch nach mehreren Jahren, wenn sie bei Umgebungstemperatur^{9 gelagert}werden. Die Formalin-Behandlung modifiziert Proteine durch Vernetzung und Veränderung der Aminosäure-Seitenketten, wodurch die Epitope möglicherweise nicht mehr gegen Antikörper reaktiv sind¹⁰. Während der IHC-Test für den Nachweis von Tollwutantigen entweder mAbs oder pAbs umfasst, ist letzteres vorteilhaft, da mehrere Epitope und divergente Lyssaviren nachgewiesen werden können¹¹.

Die Standardschritte bei IHC sind die Formalinfixierung von Geweben, die Einbettung in Paraffinblöcke, die Sektionierung von Geweben, die Deparaffinisierung und Hydratation, die Epitoprückgewinnung, die Reaktivität gegen primäre und sekundäre Antikörper und die Entwicklung mit chromogenen Substraten. Dieses Manuskript beschreibt einen detaillierten Bericht über das Protokoll zur Tollwutdiagnose. Für den Nachweis von Tollwutantigenen wird Mausserum, das mit RABV (pAbs) immunisiert ist, das an den US-amerikanischen Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Atlanta, Georgia, in Kombination mit biotinylierten sekundären Anti-Maus-Antikörpern erzeugt wurde, verwendet. Biotinylierte Abs werden durch Zugabe von Streptavidin-Meerrettichperoxidase (HRP) -Komplex nachgewiesen, gefolgt von der Farbentwicklung mit Amino-Ethylcarbazol-Substrat.

Während das IHC-Protokoll an formalinfixierten Geweben durchgeführt wurde, die RABV inaktivieren, falls vorhanden, sollten geeignete Biosicherheitsprotokolle ordnungsgemäß befolgt werden. Alle Biosicherheitsverfahren sind in der Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 5th Edition (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm) beschrieben, einschließlich des Tragens geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) und der Impfpflicht wie beschrieben¹². Darüber hinaus sollte die ordnungsgemäße Eindämmung und Handhabung gefährlicher Chemikalien (wie Formalin, AEC und Xylol) (z. B. Abzüge) befolgt werden.

1. Formalinfixierung von Geweben

1. 3-5 mm Hirngewebe, das nach der Nekropsie¹³ gesammelt wurde, werden für 24-72 h in 10% phosphatgepufferte Formalinlösung (1:20 bis 1:50 Gewebe/Formalin-Verhältnis) gebracht.
   ACHTUNG: Formalin ist ein toxisches Fixiermittel.
2. Zeichnen Sie das ungefähre Gewebegewicht (Größe), den Gewebetyp (Hirnareale) und das Volumen von Formalin auf. Für Labore ist es wichtig, Aufzeichnungen über Fixationszeiten zu dokumentieren und zu führen.
3. Für eine längere Gewebelagerung nach der Formalinfixierung und vor der Verarbeitung legen Sie das Gewebe in 70% Ethanol.

2. Gewebeverarbeitung

1. Sezieren Sie nach der Probenfixierung das Gewebe, um die wichtigen Hirnareale einzubeziehen, z. B. Querschnitte des Hirnstamms, des Kleinhirns (3 Lappen) oder des Hippocampus (beide Hippocampi), die jeweils 3 bis 5 mm dick geschnitten und in Verarbeitungskassetten gelegt werden.
2. Verarbeiten Sie die Gewebekassetten für die Paraffinwachsinfiltration, eingebettet in Paraffinblöcke und schnitten (3 bis 6 μm) auf einem Mikrotom.

3. Zubereitung von Materialien / Färbeschalen

1. Richten Sie die Färbeschale¹⁴ (Materialtabelle) wie in Abbildung 1 dargestellt ein. Füllen Sie jede Schüssel mit 250 ml der Lösung.
2. Herstellung der 3-Amino-9-ethylcarbizol (AEC) Substrat-Stammlösung
   1. Eine 20 mg Tablette 3-Amino 9-ethylcarbazol (AEC) wird mit einer Glaspipette in 5 ml N,N,Dimethylformamid gelöst.
      ACHTUNG: AEC ist ein Karzinogen.
3. Herstellung der Protease (z.B. Pronase) Stammlösung für die Antigengewinnung
   1. 7 mg der Protease in 200 ml PBS auflösen.
4. Herstellung des Spülpuffers PBS-T
   1. Fügen Sie 10 ml Tween 80 bis 990 ml PBS hinzu. Mischen Sie es gut, um eine homogene Lösung zu bilden.

4. Entparaffinisierung und Geweberehydratation

1. Machen Sie 5 μm Paraffinschnitt mit einem Mikrotom, schwimmen Sie es auf einem Wasserbad bei 38 °C und sammeln Sie es auf Glasobjektträgern. Beschriften Sie die Dias mit einem reagenzienfesten Stift/Marker.
2. Die Dias auf ein Tablett legen und in einem 55-60 °C Backofen für 1 h schmelzen. Erhöhen Sie die Temperatur nicht über 60 °C, da dies das virale Antigen zerstören kann.
3. Dias aus dem Ofen nehmen und sofort in 3 aufeinanderfolgenden Xylolspülungen von je 5 min in den Geschirren 1, 2 und 3 entparaffinisieren.
4. Rehydrieren Sie die Abschnitte auf dem Objektträger durch sequenzielles Eintauchen in abnehmende Verdünnung von Ethanol zu entionisiertem Wasser: (4 bis 11 ist eine Tauchspülung) Schüssel 4: Xylol / 100% Ethanol (1: 1); Gericht 5: 100% Ethanol; Gericht 6: 100% Ethanol; Gericht 7: 95% Ethanol; Gericht 8: 95% Ethanol; Gericht 9: 80% Ethanol; Gericht 10: 70% Ethanol; Schale 11: entionisiertes Wasser (Abbildung 1. Dish Setup).
   ACHTUNG: Xylol ist eine gefährliche Chemikalie und die Arbeit sollte in einem Abzug durchgeführt werden.

5. Proteolytische Antigengewinnung

1. Behandeln Sie Objektträger mit der Protease (2,5 μg/ ml PBS) für 30 minuten zur proteolytischen Antigenentnahme in Schüssel 12.
2. Dann in PBS-T für 10 min abspülen (Schüssel 13).
3. Mit 3% Wasserstoffperoxid für 10 min behandeln (Schale 14).
4. Wieder mit PBS-T für 10 min waschen (Schale 15).

6. Färbeverfahren

1. Behandeln Sie die Folien nacheinander, wobei die verbleibenden Folien im Puffer versunken bleiben (entfernen Sie nicht den gesamten Folienhalter - halten Sie die Folien nass). Entfernen Sie einen Objektträger und flecken Sie überschüssigen Puffer (mit einem Papiertuch) aus dem Gewebeabschnitt ab, wobei Sie darauf achten, den Gewebeabschnitt nicht zu stören. Inkubieren Sie Dias in einer Feuchtigkeitskammer, die durch Legen von angefeuchteten Papiertüchern hergestellt werden, auf die Laborbank Top¹⁴ bei Raumtemperatur mit normalem Ziegenserum (Blockierung) für 15 min.
2. Inkubieren Sie mit dem optimalen vorbestimmten primären Verdünnungsanti-Tollwut-Antikörper (1:250 Verdünnung des Maus-Tollwut-Serums, unveröffentlicht) (Positivkontrolle) und negativen Kontrollantikörpern bei Raumtemperatur wie oben (Schritt 6.1.) für 60 min ohne Waschungen dazwischen.
3. Nach 60 min mit PBS-T 10 min waschen (Schale 16).
4. Mit dem biotinylierten Antikörper (speziesspezifisch) in einer Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur für 15 min inkubieren (Handhabung wie bei Schritt 6.1.).
5. Mit PBS-T 10 min waschen (Schale 16).
6. Mit Streptavidin-HRP-Komplex in einer Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur für 15 min inkubieren (Handhabung wie 6.1.).
7. Mit PBS-T 10 min waschen (Schale 16).
8. Mit Peroxidasesubstrat, Amino-Ethylcarbazol (AEC), in einer Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren. Machen Sie AEC kurz vor dem Gebrauch. Fügen Sie dazu 1 ml AEC-Stammlösung zu 14 ml 0,1 M Acetatpuffer, pH 5,2, hinzu. 0,15 ml 3%_{H2O2hinzufügen.} Filtern Sie die Mischung kurz vor Gebrauch (0,45 μm Filter).
   HINWEIS: Die Arbeitslösung von AEC ist nur für 2-3 h stabil. Die AEC-Lagerlösung kann länger im Kühlschrank aufbewahrt werden.
9. In entionisiertem Wasser 10 min waschen (Schale 17)
10. Gegenbefleckt mit Gill's Hämatoxylin 1:2 mit entionisiertem Wasser für 2 min verdünnt (Gericht 18).
11. Überschüssiges Hämatoxylin mit entionisiertem Wasser abspülen (Schale 19 und 20).
12. Spülen Sie in Scott's Leitungswasser 30 s (Bluing-Lösung) Schüssel 21.
13. In entionisiertem Wasser 10 min waschen (Schale 22)
14. Entfernen Sie die Schlitten nacheinander - montieren Sie sie mit wasserlöslichem Montagemedium.
15. Lesen Sie Dias auf einem Lichtmikroskop.

Abbildung 2 zeigt repräsentative IHC-Färbeergebnisse von Positiv- und Negativkontrollproben in verschiedenen getesteten Hirngeweben. Abbildung 2A,D,G stellen positive Proben mit 200x dar, während Abbildung 2B,E,H jeweils einer 400-fachen Vergrößerung entsprechen. Abbildung 2A-C entsprechen dem Hirnstamm; Abbildung 2D-F entsprechen den Kleinhirn- und Purkinje-Zellen; und Abbildung 2G-I entsprechen dem Hippocampus. Abbildung 2C, F, I sind Negativkontrollproben. Die magentarote Färbung zeigt die Farbentwicklung mit AEC-Substrat im blauen Hintergrund (Hämatoxylin-Gegenfleck) aufgrund der Reaktivität von Antikörpern gegen Tollwutantigen. AEC ist ein Peroxidasesubstrat, das bei Oxidationsreaktion, katalysiert durch HRP, zu wasserunlöslichen Niederscheidungen führt, die unter einem Lichtmikroskop beobachtet werden können.

Ein positives Ergebnis bei IHC entspricht einer magentaroten Färbung in Gewebeschnitten. Die Färbung von zytoplasmatischen Einschlüssen und körnigen Einschlüssen unterschiedlicher Größe weist auf Proben hin, die positiv auf RABV-Infektionen sind. Proben gelten als negativ, wenn keine spezifische rote Färbung oder nur der blaue Hintergrund durch Hämatoxylin beobachtet wurde. Zusätzlich zur positiven Färbung könnte die Verteilung der Einschlüsse eine indirekte Quantifizierung der Konzentrationen des Tollwutiquantigens in der Probe ermöglichen, die der Viruslast der Gewebeproben entsprechen könnte. Unabhängig von den Verteilungsgraden wird jede spezifische Färbung die Probe als positiv für den RABV-Antigennachweis klassifizieren.

Abbildung 1: Flussdiagramm, das verschiedene Schritte für IHC-Tests anzeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Immunhistochemische Färbung von positivem und negativem Tollwut-Hirngewebe. (A) Intrazytoplasmatische virale Einschlüsse und Nachweis von Tollwutvirus-Antigenen im Hirnstamm 200-fache Gesamtvergrößerung; (B) positiver Hirnstamm 400x; (C) Hirnstamm-Negativkontrolle 200x; (D) Tollwutviruseinschlüsse im Kleinhirn 200x; (E) Kleinhirn und Purkinje-Zellen 400x; (F) Kleinhirn-Negativkontrolle; (G) Virale Einschlüsse im Hippocampus 200x; (H) Hippocampus 400x; Hippocampus Negativkontrolle 200x. Der rote Fleck weist auf das Vorhandensein eines Tollwutvirus-Antigens unter Verwendung der Streptavidin-Biotin-Komplexfärbungsmethode (AEC-Substrat) hin. Hämatoxylin-Gegenfleck (blau). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Aufgrund der hohen Sterblichkeitsrate der Tollwut nach Symptombeginn ist die Diagnose verdächtiger Tiere für eine RABV-Infektion äußerst kritisch für eine angemessene prophylaktische Behandlung nach der Exposition. Die Tollwutdiagnose hängt in erster Linie von DFA-, DRIT- und PCR-basierten Techniken mit frischem oder gefrorenem Gewebe ab. Für die Untersuchung von formalinfixiertem Gewebe bietet der IHC-Test eine alternative Methode zum sensitiven und spezifischen Nachweis von RABV-Antigen. Während die in Formalin fixierten Gewebe Proteine haben, die durch die Modifikation von Seitenketten wie Vernetzung stabilisiert sind, müssen die Proben vor dem Antigennachweis verarbeitet werden. In diesem Protokoll wurden die Epitope durch die partielle proteolytische Verdauung durch die Protease (z. B. Pronase) gewonnen, um die Bindung primärer Antikörper an den RNP-Komplex zu ermöglichen. Während mAbs reaktiv gegen N-Proteine überwiegend in DFA und DRIT verwendt werden, wären pAbs, die gegen mehrere Epitope auf N-Protein reaktiv sind, für einen IHC-Test bevorzugt. Darüber hinaus könnte die Reaktivität oder pAbs gegen verschiedene RABV-Varianten und gegen Nicht-Tollwut-Lyssaviren im Vergleich zu mAbs breiter sein.

Eine der Haupteinschränkungen des IHC-Tests ist, dass das Protokoll mehrere aufeinanderfolgende Schritte umfasst und etwa 6 Stunden dauert. Wenn das Gewebe in Formalin fixiert und in Paraffinblöcke eingebettet werden muss, benötigt es weitere 1 - 2 Tage, bevor das Gewebe gefärbt werden kann. Eine weitere Einschränkung ist die Nichtverfügbarkeit kommerzieller primärer Anti-Tollwut-Antikörper für den IHC-Test. IHC bietet jedoch die Möglichkeit, eine Tollwutdiagnose durchzuführen, wenn nur FF-Gewebe zum Testen verfügbar sind. Der IHC-Test ist besonders wichtig für die Prüfung von Tollwutfällen, wenn die Hälfte des Gewebes in Formalin (und anderen unfixierten Geweben, die von DFA getestet wurden) gespeichert ist und es notwendig war, den vollständigen Querschnitt des Hirnstamms und anderer Gewebe zu testen, wie es für die Diagnose erforderlich ist. Der Tollwutigen-Nachweis durch IHC-Test kann für menschliche postmortale Gehirnproben zur Diagnose und / oder retrospektiven Analyse von Verdachtsfällen basierend auf den klinischen Symptomen verwendet werden. Während IHC nicht als Primär- oder Bestätigungstest für die Tollwutdiagnose zugelassen wurde, wie DFA, erkennt die Methode Antigen mit tollwutspezifischen Antikörpern. Der Vergleich von DFA mit frischem/gefrorenem vs. FF-Gewebe lieferte eine ähnliche Sensitivität und Spezifität¹⁵. Sofern Antikörper nicht direkt mit FITC (der Anforderung für den DFA-Test) konjugiert werden, können HRP-markierte Antikörper in IHC zur Färbung des Tollwutigens verwendet werden. Der Vorteil der HRP-basierten Detektion ist die Möglichkeit, ein Lichtmikroskop für die Beobachtung zu verwenden. Die derzeit kommerziell erhältlichen DFA-Reagenzien, FITC-konjugierte tollwutspezifische Antikörper (mAbs), erkennen antigene nach formalinfixierung aufgrund der Modifikation von Epitopen nicht. Wenn jedoch FITC-konjugierte Tollwut-spezifische pAbs verfügbar sind, kann sie als Färbemethode verwendet werden, wie von der Weltgesundheitsorganisation^{empfohlen 16}. Zusätzlich zum Antigennachweis können FF-Gewebe einer RNA-Isolierung unterzogen werden, gefolgt von PCR und Sequenzierung mit spezifischen Primern zur Bestätigung des Vorhandenseins von RABV-genomischer RNA.

Zu den weiteren Vorteilen formalinfixierender Gewebe gehört die Bestimmung histologischer Veränderungen mittels Hämatoxylin- und Eosin-Färbemethode. Während die Formalin-Behandlung Protein konserviert, inaktiviert sie die meisten Krankheitserreger in der Probe aufgrund der umfangreichen Vernetzung von Proteinen und des Abbaus oder der Modifikation von Nukleinsäuren vollständig. Somit verbessert die Methode die Sicherheit der biologischen Probenhandhabung, des Versands und der Prüfung im Vergleich zu DFA. Der Acetonfixierungsschritt in DFA inaktiviert RABV nicht und sollte mit entsprechender PSA¹⁷behandelt werden. Die Proben nach der Formalinfixierung sind stabil und können bei Umgebungstemperatur gelagert werden, was sich für ressourcenarme Bereiche eignet, in denen der Zugang zu einem Kühlhaus begrenzt ist. In ähnlicher Weise können paraffineingebettete formalinfixierte Gewebe für die Langzeitlagerung bei Umgebungstemperaturen in Betracht gezogen werden, ohne die Antikörperreaktivität gegen Proteine zu verlieren.

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Wir danken den Arbeitern, Epidemiologen und Verbundenen der Gesundheitsbehörden für die Probeneinreichungen an die Zentren für Krankheitskontrolle und Prävention. Die Ergebnisse und Schlussfolgerungen in diesem Bericht sind die der Autoren und stellen nicht unbedingt die offizielle Position der Zentren für Krankheitskontrolle und Prävention dar. Die Verwendung von Handelsnamen und kommerziellen Quellen ist nur zur Identifizierung und impliziert keine Billigung durch die Zentren für Krankheitskontrolle und Prävention.