Prueba de inmunohistoquímica para la detección de antígenos de lisavirus en tejidos fijos de formalina

Aquí, presentamos un protocolo de prueba de inmunohistoquímica para la detección del antígeno del virus de la rabia como una prueba diagnóstica alternativa para los tejidos fijos con formalina.

Una de las principales modalidades diagnósticas para la rabia es la detección del complejo de ribonucleoproteína viral (RNP) (antígeno) en las muestras de tejido infectadas. Si bien la prueba de anticuerpos fluorescentes directos (DFA) o la prueba inmunohistoquímica rápida directa (DRIT) se utilizan con mayor frecuencia para la detección de antígenos, ambas pruebas requieren tejidos frescos y / o congelados para impresiones en diapositivas antes de la detección de antígenos con anticuerpos. Si las muestras se recogen y se fijan en formalina, ninguna de las pruebas es óptima para la detección de antígenos, sin embargo, las pruebas se pueden realizar mediante inmunohistoquímica convencional (IHC) después de incrustar en bloques de parafina y seccionamiento. Con este método IHC, los tejidos se tiñen con anticuerpos antirrábicos, las secciones se desparafinan, el antígeno se recupera mediante proteólisis parcial u otros métodos, y se incuba con anticuerpos primarios y secundarios. Los antígenos se tiñen con peroxidasa de rábano picante / amino etil carbazol y se contrateñen con hematoxilina para la visualización utilizando un microscopio de luz. Además de la detección específica de antígenos, la fijación de formalina ofrece otras ventajas como la determinación de cambios histológicos, condiciones relajadas para el almacenamiento y transporte de muestras (bajo temperatura ambiente), capacidad para probar casos retrospectivos y una mayor seguridad biológica a través de la inactivación de agentes infecciosos.

La rabia es una encefalitis progresiva aguda causada por los virus de ARN de sentido negativo pertenecientes al género lyssavirus¹. Casi el 99% de todas las muertes humanas causadas por la infección con el virus de la rabia (RABV), el miembro tipo del género, es transmitida por perros². El diagnóstico de rabia de animales sospechosos se basa en la detección de antígeno (principalmente nucleoproteína codificada viralmente, proteína N) en complejo con ARN genómico (complejo ribonucleoproteína, RNP) en el tejido cerebral³. La detección de antígenos mediante la prueba de anticuerpos fluorescentes directos (DFA) se considera el estándar de oro para el diagnóstico de la rabia⁴. El método utiliza material cerebral fresco o fresco congelado, una impresión táctil en una diapositiva, fijación en acetona, tinción utilizando anticuerpos monoclonales o policlonales (mAbs/pAbs) de isotiocianato fluorescente (FITC) disponibles comercialmente y leídos por la microscopía de fluorescencia⁵. La prueba DFA es rápida, sensible y específica para la detección de antígenos de rabia en tejido cerebral fresco. Recientemente, se demostró que una prueba inmunohistoquímica rápida directa (DRIT), técnica de inmunohistoquímica modificada (IHC), exhibe una sensibilidad similar a la DFA, pero ofrece la ventaja de la microscopía de luz para la visualización⁶. Si bien el método de detección utilizado en DRIT es similar al IHC, el paso inicial utiliza tejidos frescos o congelados para generar impresiones táctiles de la muestra seguidas de fijación en formalina.

IHC es una técnica ampliamente utilizada para determinar cambios histológicos y la detección de proteínas utilizando anticuerpos específicos en tejidos fijos con formalina incrustados en bloques de parafina. IHC es una prueba alternativa establecida para la detección del antígeno de la rabia en las secciones de tejido⁷. La IHC se ha utilizado particularmente para el diagnóstico de casos retrospectivos que exhibieron enfermedades neurológicas para determinar la carga de la rabia⁸. Los tejidos fijados en formalina incrustados en parafina preservan las proteínas para la detección incluso después de varios años cuando se almacenan a temperatura ambiente⁹. El tratamiento con formalina modifica las proteínas mediante la reticulación y alteración de las cadenas laterales de aminoácidos, lo que podría hacer que los epítopos ya no sean reactivos contra los anticuerpos¹⁰. Si bien la prueba IHC para la detección de antígenos de rabia involucra mAbs o pAbs, este último es ventajoso ya que se pueden detectar múltiples epítopos y lissavirus divergentes¹¹.

Los pasos estándar involucrados en la IHC son la fijación de formalina de los tejidos, la incrustación en bloques de parafina, la seccionamiento de los tejidos, la desparafinación y la hidratación, la recuperación del epítopo, la reactividad contra los anticuerpos primarios y secundarios, y el desarrollo utilizando sustratos cromogénicos. Este manuscrito describe una descripción detallada del protocolo para el diagnóstico de la rabia. Para la detección de antígenos de la rabia, se utiliza suero de ratón inmunizado con RABV (pAbs) generado en los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) de los Estados Unidos en Atlanta, Georgia, en combinación con anticuerpos secundarios biotinilados contra ratones. Los abs biotinilados se detectan mediante la adición del complejo estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (HRP) seguido del desarrollo del color con sustrato de amino-etilcarbazol.

Si bien el protocolo IHC se realizó en tejidos fijos con formalina, que inactiva el RABV si está presente, se deben seguir adecuadamente los protocolos de bioseguridad apropiados. Todos los procedimientos de bioseguridad se describen en la 5ª edición de Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm), incluido el uso de equipo de protección personal (EPP) adecuado y el requisito de vacunación como se describe¹². Además, se debe seguir la contención y el manejo adecuados de productos químicos peligrosos (como formalina, AEC y xileno) (por ejemplo, campanas extractoras).

1. Fijación de formalina de los tejidos

1. Coloque los tejidos cerebrales de 3-5 mm recolectados después de la necropsia¹³ en una solución de formalina tamponada con fosfato al 10% (proporción de 1:20 a 1:50 tejido/formalina) durante 24-72 h.
   PRECAUCIÓN: La formalina es un fijador tóxico.
2. Registre el peso aproximado del tejido (tamaño), el tipo de tejido (áreas del cerebro) y el volumen de formalina. Es importante que los laboratorios documenten y mantengan registros sobre los tiempos de fijación.
3. Para un almacenamiento de tejido más largo después de la fijación de formalina y antes del procesamiento, coloque el tejido en etanol al 70%.

2. Procesamiento de tejidos

1. Después de la fijación de la muestra, diseccione el tejido para incluir las áreas cerebrales importantes, por ejemplo, secciones transversales del tronco encefálico, el cerebelo (3 lóbulos) o el hipocampo (ambos hipocampos) cada uno cortado de 3 a 5 mm de grosor y colocado en casetes de procesamiento.
2. Procese los casetes de tejido para la infiltración de cera de parafina, incrustados en bloques de parafina y seccionados (3 a 6 μm) en un microtomo.

3. Preparación de Materiales / Platos de tinción

1. Configure el plato de tinción¹⁴ (Tabla de materiales)como se muestra en la Figura 1. Llene cada plato con 250 ml de la solución.
2. Preparación de la solución de sustrato de 3-Amino-9-etilcarbizol (AEC)
   1. Disuelva una tableta de 20 mg de 3-amino 9-etilcarbazol (AEC) en 5 ml de N,N, dimetilformamida usando una pipeta de vidrio.
      PRECAUCIÓN: AEC es un carcinógeno.
3. Preparación de la solución madre de proteasa (por ejemplo, Pronasa) para la recuperación de antígenos
   1. Disolver 7 mg de la proteasa en 200 ml de PBS.
4. Preparación del tampón de enjuague PBS-T
   1. Agregue 10 mL de Tween 80 a 990 mL de PBS. Mézclalo bien para formar una solución homogénea.

4. Desparafinación y rehidratación tisular

1. Haga una sección de parafina de 5 μm con un microtomo, flote en un baño de agua a 38 ° C y recójala en portaobjetos de vidrio. Etiquete las diapositivas con un bolígrafo/marcador resistente a los reactivos.
2. Coloque los toboganes en una bandeja y derrita en un horno de 55-60 °C durante 1 h. No eleve la temperatura por encima de 60 ° C, ya que puede destruir el antígeno viral.
3. Retira los portaobjetos del horno e inmediatamente desparafina en 3 enjuagues consecutivos de xileno de 5 min cada uno en los platos 1, 2 y 3.
4. Rehidratar las secciones en la diapositiva mediante inmersiones secuenciales en la dilución decreciente de etanol a agua desionizada: (4 a 11 es un enjuague por inmersión) plato 4: xileno / 100% etanol (1: 1); plato 5: 100% etanol; plato 6: 100% etanol; plato 7: 95% etanol; plato 8: 95% etanol; plato 9: 80% etanol; plato 10: 70% etanol; plato 11: agua desionizada (Figura 1. Configuración del plato).
   PRECAUCIÓN: El xileno es un producto químico peligroso y el trabajo debe realizarse en una campana extractora de humos.

5. Recuperación de antígenos proteolíticos

1. Tratar los portaobjetos con la proteasa (2,5 μg/ml de PBS) durante 30 min para la recuperación de antígenos proteolíticos en el plato 12.
2. Luego enjuague en PBS-T durante 10 minutos (plato 13).
3. Tratar con peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 min (plato 14).
4. De nuevo, lavar con PBS-T durante 10 min (plato 15).

6. Procedimiento de tinción

1. Maneje las diapositivas de una en una manteniendo las diapositivas restantes sumergidas en el búfer (no retire todo el soporte de la diapositiva, mantenga las diapositivas húmedas). Retire un portaobjetos y elimine el exceso de tampón (con una toalla de papel) de alrededor de la sección de pañuelos de papel teniendo cuidado de no perturbar la sección de pañuelos. Incubar diapositivas en una cámara de humedad, hecha colocando toallas de papel humedecidas, en el banco de laboratorio¹⁴ a temperatura ambiente con suero de cabra normal (bloqueo) durante 15 min.
2. Incubar con el anticuerpo antirrábico primario de dilución predeterminado óptimo (dilución 1:250 del suero antirrábico de ratón, no publicado) (control positivo) y anticuerpos de control negativos a temperatura ambiente igual que el anterior (paso 6.1.) durante 60 min sin lavados intermedios.
3. Después de 60 min, lavar con PBS-T durante 10 min (plato 16).
4. Incubar con el anticuerpo biotinilado (específico de la especie) en una cámara de humedad a temperatura ambiente durante 15 min (manipulación igual que el paso 6.1.).
5. Lavar con PBS-T durante 10 min (plato 16).
6. Incubar con el complejo Streptavidin-HRP en una cámara de humedad a temperatura ambiente durante 15 min (manipulación igual a 6.1.).
7. Lavar con PBS-T durante 10 min (plato 16).
8. Incubar con sustrato de peroxidasa, amino-etilcarbazol (AEC), en una cámara de humedad a temperatura ambiente durante 10 min. Haga AEC justo antes de su uso. Para hacerlo, agregue 1 ml de solución de stock AEC a 14 ml de tampón de acetato 0.1M, pH 5.2. Añadir 0,15 mL de 3% H₂O₂. Filtrar la mezcla justo antes de su uso (filtro de 0,45 μm).
   NOTA: La solución de trabajo de AEC solo es estable durante 2-3 h. La solución de stock AEC se puede almacenar en el refrigerador durante períodos más largos.
9. Lavar en agua desionizada 10 min (plato 17)
10. Contrateñido con hematoxilina de Gill diluida 1:2 con agua desionizada durante 2 min (plato 18).
11. Enjuague el exceso de hematoxilina con enjuague por inmersión con agua desionizada (platos 19 y 20).
12. Enjuague en Scott's Tap water 30 s (solución de azulado) plato 21.
13. Lavar en agua desionizada 10 min (plato 22)
14. Retire las diapositivas de una en una: monte con un medio de montaje soluble en agua.
15. Lea diapositivas en un microscopio de luz.

La Figura 2 muestra resultados representativos de tinción de IHC de muestras de control positivas y negativas en diferentes tejidos cerebrales analizados. La Figura 2A, D, G representa muestras positivas a 200x, mientras que la Figura 2B, E, H corresponde a un aumento de 400x, respectivamente. Figura 2A-C corresponden al tronco encefálico; Figura 2D-F corresponden al cerebelo y a las células de Purkinje; y la Figura 2G-I corresponden al hipocampo. Figura 2C, F, I son muestras de control negativas. La tinción de color rojo magenta demuestra el desarrollo del color utilizando sustrato AEC en el fondo azul (contratinción de hematoxilina) debido a la reactividad de los anticuerpos contra el antígeno de la rabia. AEC es un sustrato de peroxidasa, que tras la reacción de oxidación, catalizada por HRP, da como resultado precipitado insoluble en agua observable bajo un microscopio de luz.

Un resultado positivo en IHC corresponde a la tinción de rojo magenta en secciones de tejido. La tinción de inclusiones citoplasmáticas e inclusiones granulares de tamaño variable son indicativas de muestras positivas para infecciones por RABV. Las muestras se consideran negativas si no se observó ninguna tinción roja específica o solo el fondo azul debido a la hematoxilina. Además de la tinción positiva, la distribución de las inclusiones podría proporcionar una cuantificación indirecta de los niveles de antígeno antirrábico en la muestra, que podría corresponder a la carga viral de las muestras de tejido. Independientemente de los niveles de distribución, cualquier tinción específica clasificará la muestra como positiva para la detección de antígenos RABV.

Figura 1: Diagrama de flujo que indica diferentes pasos para las pruebas de IHC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Tinción inmunohistoquímica del tejido cerebral de rabia positiva y negativa. (A) Inclusiones virales intracitoplasmáticas y detección de antígenos del virus de la rabia en el tronco encefálico 200x aumento total; (B) tronco encefálico positivo 400x; (C) control negativo del tronco encefálico 200x; (D) inclusiones del virus de la rabia dentro del cerebelo 200x; (E) cerebelo y células de Purkinje 400x; (F) control negativo del cerebelo; (G) Inclusiones virales dentro del hipocampo 200x; (H) hipocampo 400x; control negativo del hipocampo 200x. La mancha roja indica la presencia de antígeno del virus de la rabia utilizando el método de tinción del complejo streptavidin-biotin (sustrato AEC). Contratinción de hematoxilina (azul). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Debido a la alta tasa de mortalidad de la rabia después del inicio de los síntomas, el diagnóstico de animales sospechosos de infección por RABV es extremadamente crítico para un tratamiento profiláctico adecuado después de la exposición. El diagnóstico de la rabia depende principalmente de técnicas basadas en DFA, DRIT y PCR que utilizan tejidos frescos o congelados. Para las pruebas de tejidos fijos con formalina, la prueba IHC proporciona un método alternativo para la detección sensible y específica del antígeno RABV. Mientras que los tejidos fijados en formalina tienen proteínas estabilizadas debido a la modificación de cadenas laterales como la reticulación, las muestras deben procesarse antes de la detección del antígeno. En este protocolo, los epítopos se recuperaron a través de la digestión proteolítica parcial por la proteasa (por ejemplo, Pronasa) para permitir la unión de anticuerpos primarios al complejo RNP. Mientras que los mAbs reactivos contra la proteína N se basan predominantemente en DFA y DRIT, los pAbs que son reactivos contra múltiples epítopos en la proteína N serían preferidos para una prueba de IHC. Además, la reactividad o pAbs podría ser más amplia contra diferentes variantes de RABV y contra lissavirus no rabianos en comparación con mAbs.

Una de las principales limitaciones de la prueba IHC es que el protocolo implica varios pasos secuenciales y tarda aproximadamente 6 horas en completarse. Si el tejido necesita ser fijado en formalina e incrustado en bloques de parafina, requiere de 1 a 2 días adicionales antes de que el tejido pueda ser teñido. Otra limitación es la no disponibilidad de anticuerpos antirrábicos primarios comerciales para la prueba IHC. Sin embargo, IHC proporciona una opción para realizar el diagnóstico de rabia cuando solo los tejidos FF están disponibles para la prueba. La prueba de IHC es particularmente importante para evaluar los casos de rabia si la mitad de los tejidos se almacenan en formalina (y otros tejidos no fijos probados por DFA) y fue necesario analizar la sección transversal completa del tronco encefálico y otros tejidos, según sea necesario para el diagnóstico. La detección de antígenos de rabia mediante la prueba IHC se puede utilizar para muestras de cerebro post mortem humano para el diagnóstico y / o análisis retrospectivo de casos sospechosos en función de los síntomas clínicos. Si bien la IHC no fue aprobada como una prueba primaria o confirmatoria para el diagnóstico de la rabia, como el DFA, el método detecta el antígeno utilizando anticuerpos específicos de la rabia. La comparación de DFA utilizando tejidos frescos/congelados vs FF proporcionó una sensibilidad y especificidad similares¹⁵. A menos que los anticuerpos se conjuguen directamente con FITC (el requisito para la prueba DFA), los anticuerpos etiquetados con HRP se pueden usar en IHC para teñir el antígeno de la rabia. La ventaja con la detección basada en HRP es la capacidad de usar un microscopio de luz para la observación. Los reactivos DFA actualmente disponibles comercialmente, los anticuerpos específicos de rabia conjugados FITC (mAbs) no detectan el antígeno después de la fijación de formalina debido a la modificación de los epítopos. Sin embargo, si se dispone de pAbs específicos específicos de rabia conjugada FITC, se puede utilizar como método de tinción, según lo recomendado por la Organización Mundial de la Salud¹⁶. Además de la detección de antígenos, los tejidos FF pueden ser sometidos a aislamiento de ARN seguido de PCR y secuenciación utilizando cebadores específicos para confirmar la presencia de ARN genómico RABV.

Las otras ventajas de los tejidos fijos con formalina incluyen la determinación de cambios histológicos por el método de tinción de hematoxilina y eosina. Si bien el tratamiento con formalina conserva las proteínas, inactiva completamente la mayoría de los patógenos de la muestra debido a la extensa reticulación de proteínas y la degradación o modificación de los ácidos nucleicos. Por lo tanto, el método mejora la seguridad del manejo, envío y prueba de muestras biológicas en comparación con DFA. El paso de fijación de acetona en DFA no inactiva RABV y debe manipularse con el EPI¹⁷adecuado. Las muestras después de la fijación de formalina son estables y se pueden almacenar a temperatura ambiente, lo que es adecuado para áreas de bajos recursos donde el acceso a un almacenamiento en frío es limitado. Del mismo modo, los tejidos fijos de formalina incrustados en parafina se pueden considerar para el almacenamiento a largo plazo a temperatura ambiente sin perder la reactividad de anticuerpos contra las proteínas.

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecemos a los laboratoristas, epidemiólogos y afiliados de los departamentos de salud pública por las presentaciones de muestras a los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades. Los hallazgos y conclusiones de este informe son los de los autores y no representan necesariamente la posición oficial de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades. El uso de nombres comerciales y fuentes comerciales son solo para identificación y no implican el respaldo de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades.