ホルマリン固定組織からのリサウイルス抗原検出のための免疫組織化学試験

ここでは、ホルマリン固定組織の代替診断試験として狂犬病ウイルス抗原の検出のための免疫組織化学試験プロトコルを紹介する。

狂犬病の主要な診断モダリティの1つは、感染した組織サンプル中のウイルス性リボヌクレオプロテイン(RNP)複合体(抗原)の検出である。直接蛍光抗体(DFA)試験または直接迅速な免疫組織化学検査(DRIT)は、抗原検出のために最も一般的に利用されるが、両方のテストは、抗体を使用して抗原検出前のスライド上の印象のために新鮮な組織および/または凍結組織を必要とする。サンプルをホルマリンで収集して固定する場合、いずれの試験も抗原検出に最適ではないが、パラフィンブロックおよび切除に埋め込んだ後に、通常の免疫検査(IHC)によって試験を行うことができる。このIHC法により、組織は抗狂犬病抗体で染色され、切片は脱パラフィン化され、抗原は部分タンパク質分解または他の方法によって取り出され、一次および二次抗体と共にインキュベートされる。抗原は、ホサビペルオキシダーゼ/アミノエチルカルバゾールを用いて染色され、光顕微鏡を用いた可視化のためにヘマトキシリンでカウンター染色される。特異的抗原検出に加えて、ホルマリン固定は、組織学的変化の決定、標本の貯蔵および輸送のための緩和された状態(周囲温度下)、遡及症例をテストする能力、および感染性物質の不活性化による生物学的安全性の向上などの他の利点を提供する。

狂犬病は、リサウイルス属に属するRNAウイルスの負の感覚によって引き起こされる急性進行性脳炎^である。狂犬病ウイルス(RABV)による感染によって生じた全人類の死亡のほぼ99%は、属の型メンバーである、犬²によって伝染する。疑わしい動物の狂犬病診断は、脳組織³におけるゲノムRNA(リボヌクレオタンパク質複合体、RNP)と複合体中の抗原(主にウイルスコード型核タンパク質、Nタンパク質)の検出に依存する。直接蛍光抗体(DFA)検査による抗原検出は狂犬病診断⁴のゴールドスタンダードと考えられている。この方法は、新鮮または新鮮な凍結脳材料を利用して、スライド上のタッチ印象、アセトンでの固定、モノクローナルまたはポリクローナル抗体(mAbs/pAbs)と蛍光顕微鏡^法5で読み取られる市販の蛍光イソチオシアネート(FITC)を用いて染色する。DFA試験は、新鮮な脳組織における狂犬病抗原検出に対して、迅速、感受性、および特異的である。最近、直接迅速な免疫構造化学検査(DRIT)、修飾免疫体化学(IHC)技術は、DFAと同様の感受性を示すことが実証されたが、可視化⁶のための光顕微鏡の利点を提供する。DRITで使用される検出方法は、IHCに似ていますが、最初のステップでは、新鮮な組織または凍結した組織を利用して、ホルマリンに固定されたサンプルのタッチインプレッションを生成します。

IHCは、パラフィンブロックに埋め込まれたホルマリン固定組織において、特定の抗体を用いて組織学的変化とタンパク質の検出を決定するために広く使用されている技術です。IHCは、組織切片⁷における狂犬病抗原検出のための確立された代替試験である。IHCは狂犬病の負担を決定するために神経疾患を呈した遡及症例の診断のために特に利用されてきた^。パラフィン埋め込まれたホルマリン固定組織は、周囲温度⁹で保存した数年後でも検出のためにタンパク質を保存する。ホルマリン処理はアミノ酸側鎖を架橋および改変することによってタンパク質を修飾し、エピトープが抗体¹⁰に対して反応しなくなる可能性がある。狂犬病抗原検出のためのIHC検査にはmAbsまたはpAbsのいずれかが含まれるが、後者は複数のエピトープおよび発散性リサウイルスが¹¹を検出できるとして有利である。

IHCに関与する標準的なステップは、組織のホルマリン固定、パラフィンブロックへの埋め込み、組織の切開、脱パラフィン化と水和、エピトープ回収、一次および二次抗体に対する反応性、および発色基質を用いた開発である。この原稿は狂犬病診断の議定書の詳細な説明を記述する。狂犬病抗原検出のために、米国疾病管理予防センター(CDC)アトランタ(ジョージア州)で発生したRABV(pAbs)で免疫されたマウス血清を、ビオチン化抗マウス二次抗体と組み合わせて利用する。ビオチン化腹筋は、ストレプトアビジン・ワサビペルオキシダーゼ(HRP)複合体の添加によって検出され、続いてアミノエチルカルバゾール基質を用いた色の発達が続く。

IHCプロトコルはホルマリン固定組織で実施されたが、RABVが存在する場合は不活性化するが、適切なバイオセーフティプロトコルに適切に従うべきである。すべてのバイオセーフティ手順は、適切な個人用保護具(PPE)を着用する、および¹²に記載されているワクチン接種要件を含む、微生物学および生物医学研究所(BMBL)第5版(https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm)におけるバイオセーフティに記載されている。さらに、有害化学物質(ホルマリン、AEC、キシレンなど)の適切な封じ込めと取り扱いが続く必要があります(例えば、ヒュームフード)。

1. 組織のホルマリン固定

1. 壊死¹³ の後に採取した3〜5mmの脳組織を10%リン酸緩衝ホルマリン溶液(1:20〜1:50組織/ホルマリン比)に24〜72時間置く。
   注意:ホルマリンは有毒な固定剤です。
2. おおよその組織重量(サイズ)、組織タイプ(脳領域)およびホルマリンの体積を記録する。研究所は、固定時間に記録を文書化し、維持することが重要です。
3. ホルマリン固定後および処理前に組織貯蔵を長くするために、70%エタノールに組織を入れる。

2. 組織処理

1. 標本固定に続いて、例えば、脳幹の断面、小脳(3つのローブ)、または海馬(両海馬)がそれぞれ3〜5mmの厚さをカットし、処理カセットに入れられる重要な脳領域を含むように組織を解剖する。
2. パラフィンワックス浸潤のための組織カセットを処理し、パラフィンブロックに埋め込み、ミクロトーム上で(3〜6μm)切断します。

3. 材料の調製/染色料理

1. 図1 に示すように、染色皿¹⁴ (材料表) を設定します。各皿に250mLの溶液を充填します。
2. 3-アミノ-9-エチルカルビゾール(AEC)基質ストック溶液の調製
   1. 3-アミノ9-エチルカルバゾール(AEC)の1つの20mg錠剤を5mLのN,Nに溶解し、ガラスピペットを用いてジメチルホルムアミドを溶解する。
      注意:AECは発がん性物質です。
3. プロテアーゼの調製(例えば、プロナーゼ)のストック溶液を抗原検索用
   1. プロテアーゼの7mgを200mLのPBSに溶解する。
4. リンスバッファー PBS-T の調製
   1. PBSの10 mLを80~990mL加えます。均質な溶液を形成するためによくそれを混ぜる。

4. 脱パラフィンと組織の再水和

1. ミクロトームを使用して5μmのパラフィンセクションを作り、38°Cの水浴に浮かべ、ガラススライドに集めます。試薬耐性ペン/マーカーでスライドにラベルを付けます。
2. スライドをトレイに置き、55〜60°Cのオーブンで1時間溶かします。ウイルス抗原を破壊する可能性がありますので、60°C以上の温度を上げないでください。
3. オーブンからスライドを取り出し、皿1、2および3の中で5分の3連続キシレンリンスですぐに脱パラフィン化する。
4. 脱イオン水へのエタノールの希釈を減少させる順次浸漬によってスライド上のセクションを水分補給:(4〜11はディップリンスである)皿4:キシレン/100%エタノール(1:1);皿5:100%エタノール;皿6:100%エタノール;皿7:95%エタノール;皿8:95%エタノール;皿9:80%エタノール;皿10:70%エタノール;皿11:脱イオン水(図1.ディッシュセットアップ)。
   注意:キシレンは有害な化学物質であり、作業はヒュームフードで行われるべきです。

5. タンパク質分解抗原の検索

1. 皿12の蛋白分解抗原の検索のために30分間プロテアーゼ(PBSの2.5 μg/mL)でスライドを扱う。
2. その後、PBS-Tで10分間洗いすみます(皿13)。
3. 過酸化水素3%を10分間お取りします(皿14)。
4. 再度、PBS-Tで10分間洗います(皿15)。

6. 染色手順

1. 残りのスライドをバッファに取り付けたままにして、スライドを一度に1つずつ取り扱います(スライドホルダ全体を取り外さない - スライドを濡らしてください)。1つのスライドを取り除き、組織セクションの周りから余分なバッファ(ペーパータオルを使用して)を消し、組織セクションを邪魔しないように注意してください。湿らせたペーパータオルを置くことによって作られた湿度室で滑り、通常のヤギの血清(ブロッキング)を15分間室温でラボベンチトップ¹⁴ にインキュベートします。
2. 最適な事前決定希釈原発性抗狂犬病抗体(マウス抗狂犬病血清の1:250希釈、未発表)および陰性対照抗体を上記と同じ室温(ステップ6.1)でインキュベートし、その間に洗剤を行いません。
3. 60分後にPBS-Tで10分間洗います(皿16)。
4. 室温で15分間の湿度室内でビオチン化抗体(種特異的)をインキュベートする(工程6.1と同様の取り扱い)。
5. PBS-Tで10分間洗浄します(皿16)。
6. 室温で15分間の湿度室にストレプトアビジン-HRP複合体をインキュベート(6.1と同じ処理)。
7. PBS-Tで10分間洗浄します(皿16)。
8. ペルオキシダーゼ基質をインキュベートし、アミノエチルカルバゾール(AEC)を、室温で10分間湿度室に入れます。使用する直前に AEC を作成します。これを行うには、0.1Mアセテートバッファー、pH 5.2の14 mLにAECストック溶液の1 mLを追加します。3%H₂O₂の0.15 mLを追加します。使用直前に混合液をフィルターします(0.45 μm フィルター)。
   注:AECの動作ソリューションは2-3時間だけ安定しています。AECストックソリューションは、冷蔵庫に長期間保存することができます。
9. 脱イオン水で洗浄 10分 (皿 17)
10. ジルのヘマトキシリンでカウンターを1:2希釈し、2分間脱イオン水(皿18)を用いた。
11. 脱イオン水ディップリンス(皿19と20)で過剰なヘマトキシリンを洗い流す。
12. スコットの水道水30s(ブルーイング溶液)皿21で洗い流す。
13. 脱イオン水で洗浄 10分 (皿 22)
14. スライドを一度に1つずつ取り外す - 水溶性取り付け媒体で取り付けます。
15. 軽い顕微鏡のスライドを読む。

図2 は、テストされた異なる脳組織における陽性および陰性対照サンプルの代表的なIHC染色結果を示す。 図2A,D,G は200xで陽性サンプルを表し、 図2B、E、H はそれぞれ400倍の倍率に相当します。 図 2A-C は 脳幹に対応します。 図2D-F は小脳細胞とプルキンイェ細胞に対応している。 そして図2G-Iは 海馬に対応している。 図2C,F,I は陰性対照サンプルである。マゼンタレッド染色は、狂犬病抗原に対する抗体の反応性による青色背景(ヘマトキシリンカウンタステイン)におけるAEC基質を用いた発色性の発達を示す。AECはペルオキシダーゼ基質であり、これは酸化反応の際にHRPによって触媒され、光顕微鏡下で観察可能な水不溶性沈殿物をもたらす。

IHCの陽性結果は、組織切片におけるマゼンタ赤染色に相当する。細胞質含有物の染色と様々なサイズの粒状の含み物は、RABV感染に陽性のサンプルを示しています。試料は、ヘマトキシリンによる特定の赤色染色または青色の背景のみが観察されなかった場合に陰性とみなされる。陽性染色に加えて、含包物の分布は、サンプル中の狂犬病抗原のレベルを間接的に定量化することができ、これは組織サンプルのウイルス負荷に対応する可能性がある。分布のレベルに関係なく、任意の特定の染色は、RABV抗原検出のために陽性としてサンプルを分類します。

図1:IHCテストの異なるステップを示すフローチャート。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:陽性および陰性狂犬病の脳組織の免疫組織化学的染色。(A)脳幹200x総拡大におけるイントラトプラズムウイルスインクルージョンおよび狂犬病ウイルス抗原検出。(B) 陽性脳幹 400x;(C)脳幹陰性対照 200x;(D) 小脳内の狂犬病ウイルスの含み込み 200x;(E)小脳細胞とプルキンエ細胞 400x;(F) 小脳陰性コントロール;(G) 海馬内のウイルス包括 200x;(H)海馬 400x;海馬陰性対照200x.赤色染色は、ストレプトアビジン-ビオチン複合体染色法(AEC基質)を用いた狂犬病ウイルス抗原の存在を示す。ヘマトキシリンカウンターステイン(青)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

症状の発症後の狂犬病の死亡率が高いため、RABV感染の疑いのある動物の診断は、適切な暴露後予防治療にとって極めて重要です。狂犬病の診断は、主にDFA、DRIT、および新鮮な組織または凍結組織を使用したPCRベースの技術に依存します。ホルマリン固定組織の検査では、IHC試験はRABV抗原の敏感かつ特異的な検出のための代替方法を提供します。ホルマリンに固定された組織は、架橋のような側鎖の改変によりタンパク質が安定化する一方、サンプルは抗原検出前に処理する必要がある。このプロトコルでは、エピトープをプロテアーゼによる部分タンパク質分解消化(例えばプロナーゼ)を介して回収し、RNP複合体への一次抗体の結合を可能にした。Nタンパク質に対して反応性mAbsはDFAおよびDRITにおいて主に依存しているが、Nタンパク質上の複数のエピトープに対して反応性を持つpAbsはIHC試験に好まれるであろう。さらに、反応性またはpAbsは、mAbsと比較して、異なるRABV変異体に対して、および非狂犬病リサウイルスに対して広くすることができる。

IHCテストの主な制限の1つは、プロトコルがいくつかの連続したステップを伴い、完了までに約6時間かかる点です。組織をホルマリンに固定し、パラフィンブロックに埋め込む必要がある場合は、組織が染色される前にさらに1〜2日を必要とします。もう一つの制限は、IHC試験のための市販の一次抗狂犬病抗体の非利用性である。しかし、IHCは、FF組織のみが検査に利用できる場合に狂犬病診断を行うオプションを提供します。IHC検査は、組織の半分がホルマリン(およびDFAによってテストされた他の未修正組織)に保存され、診断に必要な脳幹および他の組織の完全な断面をテストする必要がある場合、狂犬病症例を検査するために特に重要である。IHC試験による狂犬病抗原検出は、臨床症状に基づく疑わしい症例の診断および/または遡及分析のためにヒト事後脳サンプルに利用することができる。IHCは、DFAのような狂犬病診断の一次検査または確認検査として承認されなかったが、この方法は狂犬病特異的抗体を用いて抗原を検出する。新鮮/凍結対FF組織を用いたDFAの比較は、同様の感度と特異性¹⁵を提供した。抗体がFITCに直接結合されない限り(DFA試験の要件)、HRP標識抗体は、狂犬病抗原を染色するためにIHCで使用することができる。HRPベースの検出の利点は、観察のために光顕微鏡を使用する能力です。現在市販のDFA試薬としては、FITCコンジュゲート狂犬病特異的抗体(mAbs)は、エピトープの改変によるホルマリン固定後の抗原を検出しない。しかし、FITCコンジュゲート狂犬病特有のpAbsが利用可能であれば、世界保健機関¹⁶が推奨する染色法として使用することができる。抗原検出に加えて、FF組織は、RABVゲノムRNAの存在を確認するために特異的なプライマーを用いてPCRおよびシーケンシングを続けてRNA単離を行うことができる。

ホルマリン固定組織の他の利点は、ヘマトキシリンおよびエオシン染色法による組織学的変化の決定を含む。ホルマリン治療はタンパク質を保存する一方で、タンパク質の広範な架橋や核酸の分解や修飾により、サンプル中のほとんどの病原体を完全に不活性化します。したがって、この方法は、DFAと比較して生物学的サンプルの取り扱い、出荷および試験の安全性を向上させます。DFA のアセトン固定ステップは RABV を不活性化しないため、適切な PPE¹⁷で処理する必要があります。ホルマリン固定後のサンプルは安定しており、低温貯蔵へのアクセスが制限されている低資源領域に適した周囲温度で保存することができます。同様に、パラフィン埋め込まれたホルマリン固定組織は、タンパク質に対する抗体反応性を失うことなく、周囲温度での長期保存について考慮することができる。

著者らは開示するものは何もない。

私たちは、疾病管理予防センターへのサンプル提出のために公衆衛生部門を持つ研究所、疫学者、および関連会社に感謝します。この報告書の調査結果と結論は著者のものであり、必ずしも疾病管理予防センターの公式の立場を表すものではありません。商品名と商業ソースの使用は識別のためだけであり、疾病管理予防センターによる承認を意味するものではありません。