JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، نقدم بروتوكول اختبار الكيمياء المناعية للكشف عن مستضد فيروس داء الكلب كاختبار تشخيصي بديل للأنسجة الثابتة بالفورمالين.

Abstract

واحدة من الطرائق التشخيصية الأولية لداء الكلب هو الكشف عن الريبونوكليوبروتين الفيروسي (RNP) مجمع (مستضد) في عينات الأنسجة المصابة. في حين أن اختبار الأجسام المضادة الفلورية المباشرة (DFA) أو الاختبار المناعي السريع المباشر (DRIT) يستخدمان بشكل شائع للكشف عن المستضد ، فإن كلا الاختبارين يتطلبان أنسجة طازجة و / أو مجمدة للانطباعات على الشرائح قبل الكشف عن المستضد باستخدام الأجسام المضادة. إذا تم جمع العينات وإصلاحها في الفورمالين، لا يكون أي من الاختبارين الأمثل للكشف عن المستضد، ومع ذلك، يمكن إجراء الاختبار عن طريق الكيمياء المناعية التقليدية (IHC) بعد تضمينها في كتل البارافين والقسم. مع هذه الطريقة IHC ، تلطخ الأنسجة بالأجسام المضادة لداء الكلب ، ويتم إزالة الأقسام ، واسترجاع المستضد عن طريق انحلال جزئي أو طرق أخرى ، واحتضانها بأجسام مضادة أولية وثانوية. وتلطخ المستضدات باستخدام الفجل peroxidase / الأمينية إيثيل كاربازول ومضادة ملطخة hematoxylin للتصور باستخدام المجهر الخفيف. بالإضافة إلى الكشف عن مستضد محددة، تثبيت الفورمالين يقدم مزايا أخرى مثل تحديد التغيرات النسيجية، وظروف استرخاء لتخزين العينات والنقل (تحت درجات الحرارة المحيطة)، والقدرة على اختبار الحالات بأثر رجعي وتحسين السلامة البيولوجية من خلال تعطيل العوامل المعدية.

Introduction

داء الكلب هو التهاب الدماغ التدريجي الحاد الناجم عن الشعور السلبي فيروسات الحمض النووي الريبي التي تنتمي إلى جنس lyssavirus1. ما يقرب من 99٪ من جميع الوفيات البشرية الناجمة عن العدوى بفيروس داء الكلب (RABV)، وهو نوع عضو من جنس، وينتقل عن طريق ال2. داء الكلب تشخيص الحيوانات المشتبه به يعتمد على الكشف عن مستضد (في المقام الأول الفيروسية المشفرة نيوكليوبروتين, N البروتين) في مجمع مع الحمض النووي الريبي الجينومي (ريبونوكليوبروتين المعقدة, RNP) في أنسجة الدماغ3. يعتبر الكشف عن المستضد من خلال اختبار الأجسام المضادة الفلورية المباشرة (DFA) المعيار الذهبي لتشخيص داء الكلب4. تستخدم الطريقة مواد الدماغ المجمدة الطازجة أو الطازجة ، وانطباع اللمس على الشريحة ، والتثبيت في الأسيتون ، والتلطيخ باستخدام الأيزوثيوسيانات الفلورية المتاحة تجاريا (FITC) المسماة الأجسام المضادة أحادية النسيلة أو متعددة النسيلة (mAbs / pAbs) وقراءتها من قبل المجهر الفلوري5. اختبار DFA سريع وحساس ومحدد للكشف عن مستضد داء الكلب في أنسجة الدماغ الطازجة. في الآونة الأخيرة ، تم إثبات اختبار كيميائي مناعي سريع مباشر (DRIT) ، تقنية الكيمياء المناعية المعدلة (IHC) ، لإظهارحساسيةمماثلة ل DFA ولكنه يوفر ميزة المجهر الخفيف للتصور 6 . في حين أن طريقة الكشف المستخدمة في DRIT ، تشبه IHC ، فإن الخطوة الأولية تستخدم الأنسجة الطازجة أو المجمدة لتوليد انطباعات لمسة عن العينة تليها التثبيت في الفورملين.

IHC هو تقنية تستخدم على نطاق واسع لتحديد التغيرات النسيجية والكشف عن البروتينات باستخدام أجسام مضادة محددة في الأنسجة الثابتة الفورماتين جزءا لا يتجزأ من كتل البارافين. IHC هو اختبار بديل راسخ للكشف عن مستضد داء الكلب في أقسام الأنسجة7. وقد استخدمت بشكل خاص IHC لتشخيص الحالات بأثر رجعي التي أظهرت الأمراض العصبية لتحديد عبء داء الكلب8. البارافين جزءا لا يتجزأ من الأنسجة الفورملين الثابتة الحفاظ على البروتينات للكشف حتى بعد عدة سنوات عند تخزينها في درجة الحرارة المحيطة9. علاج الفورمالين يعدل البروتينات عن طريق ربط وتغيير سلاسل جانبية من الأحماض الأمينية، والتي قد تجعل epitopes لم يعد رد الفعل ضد الأجسام المضادة10. في حين أن اختبار IHC للكشف عن مستضد داء الكلب ينطوي إما على mAbs أو pAbs ، فإن هذا الأخير مفيد حيث يمكن اكتشاف العديد من الأسطح وفيروسات أليسا المتباينة11.

الخطوات القياسية التي ينطوي عليها IHC هي تثبيت الأنسجة ، وتضمينها في كتل البارافين ، وتقسيم الأنسجة ، وإزالة البارافينين والترطيب ، واستعادة الظهارة ، والتفاعل ضد الأجسام المضادة الأولية والثانوية ، والتطوير باستخدام الركائز الكروموجينية. تصف هذه المخطوطة وصفا مفصلا لبروتوكول تشخيص داء الكلب. للكشف عن مستضد داء الكلب، يتم استخدام مصل الفأر المحصن ب RABV (pAbs) المتولد في المراكز الأمريكية لمكافحة الأمراض والوقاية منها (CDC) أتلانتا، جورجيا، بالاشتراك مع الأجسام المضادة الثانوية المضادة للفأرة ذات المستويات الحيوية. يتم الكشف عن القيمة المطلقة البيوتينية بإضافة مركب البيروكسيديز (HRP) من البكتيريا العقدية الفجلية (HRP) تليها تطور اللون مع ركيزة أمينية إيثيلكاربازول.

Protocol

وفي حين أن بروتوكول IHC قد تم تنفيذه على الأنسجة الثابتة بالفورملين، والتي تبطل RABV إذا كانت موجودة، ينبغي اتباع بروتوكولات السلامة البيولوجية المناسبة بشكل صحيح. جميع إجراءات السلامة البيولوجية موصوفة في السلامة الحيوية في المختبرات الميكروبيولوجية والطب الحيوي (BMBL) الطبعة الخامسة (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm) ، بما في ذلك ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) ، ومتطلبات التطعيم كما هو موضح12. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي اتباع الاحتواء السليم للمواد الكيميائية الخطرة والتعامل معها (مثل الفورمالين، وال AEC، والزيلين) (مثل أغطية الدخان).

1. تثبيت الفورماليين من الأنسجة

  1. مكان 3-5 مم أنسجة الدماغ التي تم جمعها بعد necropsy13 إلى 10٪ الفوسفات العازلة حل الفورماتين (1:20 إلى 1:50 نسبة الأنسجة / الفورماتين) لمدة 24-72 ح.
    تنبيه: الفورماتين هو مثبت سام.
  2. سجل وزن الأنسجة التقريبي (الحجم) ونوع الأنسجة (مناطق الدماغ) وحجم الفورمالين. من المهم للمختبرات توثيق وحفظ السجلات الخاصة بأوقات التثبيت.
  3. لتخزين الأنسجة لفترة أطول بعد تثبيت الفورماتين وقبل المعالجة، ضع الأنسجة في الإيثانول بنسبة 70٪.

2. معالجة الأنسجة

  1. بعد تثبيت العينة، تشريح الأنسجة لتشمل مناطق الدماغ الهامة على سبيل المثال، المقاطع العرضية من جذع الدماغ، المخيخ (3 فصوص)، أو قرن آمون (كل من فرس النهر) كل قطع 3 إلى 5 مم سميكة ووضعها في أشرطة المعالجة.
  2. معالجة أشرطة الأنسجة لتسلل شمع البارافين، جزءا لا يتجزأ من كتل البارافين ومقسمة (3 إلى 6 ميكرومتر) على microtome.

3. إعداد المواد / أطباق تلطيخ

  1. إعداد طبقتلطيخ 14 (جدول المواد) كما هو موضح في الشكل 1. ملء كل طبق مع 250 مل من الحل.
  2. إعداد 3-أمينو-9-إيثيلكاربيزول (AEC) الركيزة الأسهم الحل
    1. حل قرص واحد 20 ملغ من 3 الأمينية 9-إيثيلكاربازول (AEC) في 5 مل من N, N, ثنائي ميثيلفورماميد باستخدام ماصة زجاجية.
      تنبيه: AEC مادة مسرطنة.
  3. إعداد البروتياز (مثل البروناز) حل المخزون لاسترجاع المستضد
    1. حل 7 ملغ من بروتياز في 200 مل من برنامج تلفزيوني.
  4. إعداد العازلة شطف PBS-T
    1. إضافة 10 مل من توين 80 إلى 990 مل من برنامج تلفزيوني. مزجها جيدا لتشكيل حل متجانس.

4. إزالة الترطيب والإماهة النسيجية

  1. جعل 5 ميكرومتر قسم البارافين باستخدام microtome، تطفو على حمام مائي في 38 درجة مئوية وجمع على الشرائح الزجاجية. تسمية الشرائح باستخدام قلم/علامة مقاومة للكواشف.
  2. ضع الشرائح على صينية وتذوب في فرن 55-60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. لا ترفع درجة الحرارة فوق 60 درجة مئوية لأنها يمكن أن تدمر المستضد الفيروسي.
  3. إزالة الشرائح من الفرن وعلى الفور deparaffinize في 3 شطف xylene متتالية من 5 دقائق لكل منهما في الأطباق 1 و 2 و 3.
  4. إعادة ترطيب المقاطع على الشريحة عن طريق الغمر المتتابع في تقليل تخفيف الإيثانول إلى الماء المؤين: (4 إلى 11 هو شطف تراجع) طبق 4: xylene/100٪ الإيثانول (1:1)؛ طبق 5: الإيثانول 100٪؛ طبق 6: الإيثانول 100٪؛ طبق 7: 95٪ الإيثانول; طبق 8: 95٪ الإيثانول; طبق 9: 80٪ الإيثانول. طبق 10: 70٪ الإيثانول. طبق 11: المياه deionized (الشكل 1. إعداد الطبق).
    تنبيه: Xylene مادة كيميائية خطرة وينبغي إجراء العمل في غطاء الدخان.

5. استرجاع مستضد بروتيوليك

  1. علاج الشرائح مع بروتياز (2.5 ميكروغرام / مل من برنامج تلفزيوني) لمدة 30 دقيقة لاسترجاع مستضد بروتيوليك في الطبق 12.
  2. ثم شطف في PBS-T لمدة 10 دقيقة (طبق 13).
  3. علاج مع بيروكسيد الهيدروجين 3٪ لمدة 10 دقيقة (طبق 14).
  4. مرة أخرى، يغسل مع PBS-T لمدة 10 دقيقة (طبق 15).

6. إجراء تلطيخ

  1. مقبض الشرائح واحدة في وقت واحد الحفاظ على الشرائح المتبقية غارقة في المخزن المؤقت (لا إزالة حامل الشريحة كله - إبقاء الشرائح الرطب). إزالة شريحة واحدة ولطخة قبالة العازلة الزائدة (باستخدام منشفة ورقية) من جميع أنحاء قسم الأنسجة مع الحرص على عدم تعكير صفو قسم الأنسجة. احتضان الشرائح في غرفة الرطوبة، التي أدلى بها وضع المناشف الورقية رطبة، على مقاعد البدلاء المختبر أعلى14 في درجة حرارة الغرفة مع مصل الماعز العادي (حجب) لمدة 15 دقيقة.
  2. احتضان مع المثلى المحددة مسبقا تخفيف الأولية المضادة لداء الكلب الأجسام المضادة (1:250 تخفيف مصل الماوس المضادة لداء الكلب، غير منشورة) (السيطرة الإيجابية) والأجسام المضادة للسيطرة السلبية في درجة حرارة الغرفة نفس أعلاه (الخطوة 6.1.) لمدة 60 دقيقة مع عدم وجود يغسل في ما بين.
  3. بعد 60 دقيقة، اغسل مع PBS-T لمدة 10 دقائق (طبق 16).
  4. احتضان مع الأجسام المضادة البيوتينية (الأنواع محددة) في غرفة الرطوبة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة (التعامل مع نفس الخطوة 6.1.).
  5. يغسل مع PBS-T لمدة 10 دقائق (طبق 16).
  6. احتضان مع مجمع ستريبتافيدين-HRP في غرفة الرطوبة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة (التعامل مع نفس 6.1.).
  7. يغسل مع PBS-T لمدة 10 دقائق (طبق 16).
  8. احتضان مع الركيزة البيروكسيديز، الأمينية إيثيلكاربازول (AEC)، في غرفة الرطوبة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. جعل AEC فقط قبل الاستخدام. للقيام بذلك، إضافة 1 مل من AEC الأسهم الحل إلى 14 مل من 0.1M خلات المخزن المؤقت، pH 5.2. إضافة 0.15 مل من 3٪ H2O2. تصفية الخليط قبل الاستخدام مباشرة (0.45 ميكرومتر مرشح).
    ملاحظة: حل العمل من AEC مستقرة فقط لمدة 2-3 ساعة. يمكن تخزين محلول مخزون AEC في الثلاجة لفترات أطول.
  9. غسل في الماء deionized 10 دقيقة (طبق 17)
  10. مضادة ملطخة Hematoxylin جيل المخفف 1:2 مع الماء deionized لمدة 2 دقيقة (طبق 18).
  11. شطف الهيماتوكسيلين الزائد مع شطف تراجع الماء deionized (طبق 19 و 20).
  12. شطف في المياه الحنفية سكوت 30 ق (حل الزرق) طبق 21.
  13. غسل في الماء deionized 10 دقيقة (طبق 22)
  14. إزالة الشرائح واحد في وقت واحد - جبل مع الماء للذوبان في تركيب المتوسطة.
  15. قراءة الشرائح على المجهر الخفيف.

النتائج

يوضح الشكل 2 نتائج تلطيخ IHC التمثيلية لعينات التحكم الإيجابية والسلبية في أنسجة الدماغ المختلفة التي تم اختبارها. ويمثل الشكل 2A,D,G عينات موجبة عند 200x، بينما يتوافق الشكل 2B,E,H مع التكبير 400x على التوالي. الشكل 2A-C تتوافق مع جذع الدماغ; الشكل 2D-F تتوافق مع المخيخ وخلايا بوركينجي; والشكل 2G-I تتوافق مع قرن آمون. الشكل 2C، F، أنا عينات التحكم السلبية. يوضح تلطيخ اللون الأحمر الأرجواني تطور اللون باستخدام ركيزة AEC في الخلفية الزرقاء (عدادات Hematoxylin) بسبب التفاعل بين الأجسام المضادة ضد مستضد داء الكلب. AEC هو ركيزة البيروكسيداز ، والتي عند تفاعل الأكسدة ، حفزتها HRP ، تؤدي إلى ترسب غير قابل للذوبان في الماء يمكن ملاحظته تحت المجهر الخفيف.

نتيجة إيجابية في IHC يتوافق مع تلطيخ أحمر أرجواني في أقسام الأنسجة. تلطيخ إدراج السيتوبلازمي وشوائب الحبيبية من حجم متفاوتة تدل على عينات إيجابية لالتهابات RABV. وتعتبر العينات سلبية إذا لم يلاحظ تلطيخ أحمر محدد أو فقط الخلفية الزرقاء بسبب الهيماتوكسيلين. بالإضافة إلى التلطيخ الإيجابي ، يمكن أن يوفر توزيع التضمينات قياسا كميا غير مباشر لمستويات مستضد داء الكلب في العينة ، والتي قد تتوافق مع الحمل الفيروسي لعينات الأنسجة. بغض النظر عن مستويات التوزيع، فإن أي تلطيخ محدد سيصنف العينة على أنها إيجابية للكشف عن مستضد RABV.

figure-results-1672
الشكل 1: مخطط تدفق يشير إلى خطوات مختلفة لاختبار IHC. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2025
الشكل 2: تلطيخ المناعي الكيميائية من أنسجة الدماغ داء الكلب إيجابية وسلبية. (أ) إدراجات الفيروسية داخل السيتوبلازمي والكشف عن مستضد فيروس داء الكلب في التكبير الكلي 200x جذع الدماغ؛ (ب) جذع الدماغ الإيجابي 400x; (C) جذع الدماغ السيطرة السلبية 200x; (د) إدراج فيروس داء الكلب داخل المخيخ 200x; (E) المخيخ وخلايا بوركينجي 400x; (F) السيطرة السلبية المخيخ; (G) إدراج الفيروسية داخل قرن آمون 200x; (H) قرن آمون 400x; الحصين السيطرة السلبية 200x. تشير البقعة الحمراء إلى وجود مستضد فيروس داء الكلب باستخدام طريقة تلطيخ مركبة Streptavidin-biotin (ركيزة AEC). مضاد الهيماتوكسيلين (أزرق). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

نظرا لارتفاع معدل الوفيات الناجمة عن داء الكلب بعد ظهور الأعراض ، فإن تشخيص الحيوانات المشتبه بها لعدوى RABV أمر بالغ الأهمية لعلاج وقائي مناسب بعد التعرض. يعتمد تشخيص داء الكلب في المقام الأول على تقنيات DFA و DRIT و PCR باستخدام الأنسجة الطازجة أو المجمدة. لاختبار الأنسجة المثبتة بالفورمولين، يوفر اختبار IHC طريقة بديلة للكشف الحساس والمحدد عن مستضد RABV. في حين أن الأنسجة الثابتة في الفورمالين لديها بروتينات استقرت بسبب تعديل السلاسل الجانبية مثل الربط المتبادل ، تحتاج العينات إلى معالجتها قبل الكشف عن المستضد. في هذا البروتوكول، تم استرداد epitopes من خلال الهضم الجزئي بروتيواليك بواسطة بروتياز (على سبيل المثال، Pronase) لتمكين ربط الأجسام المضادة الأولية لمجمع RNP. في حين يتم الاعتماد على mAbs رد الفعل ضد بروتين N في الغالب في DFA وDRIT، pAbs التي هي رد الفعل ضد epitopes متعددة على بروتين N سيكون المفضل لاختبار IHC. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يكون التفاعل أو pAbs أوسع ضد متغيرات RABV المختلفة وضد فيروسات أليسا غير داء الكلب بالمقارنة مع mAbs.

أحد القيود الرئيسية لاختبار IHC هو البروتوكول ينطوي على عدة خطوات متتابعة ويستغرق حوالي 6 ساعات لإكماله. إذا كان النسيج يحتاج إلى إصلاح في الفورماتين وجزءا لا يتجزأ من كتل البارافين، فإنه يتطلب 1-2 أيام إضافية قبل أن يمكن أن تكون ملطخة الأنسجة. وثمة قيد آخر هو عدم توافر الأجسام المضادة الأولية التجارية المضادة لداء الكلب لاختبار IHC. ومع ذلك، توفر IHC خيارا لإجراء تشخيص داء الكلب عندما تكون أنسجة FF فقط متاحة للاختبار. اختبار IHC مهم بشكل خاص لاختبار حالات داء الكلب إذا تم تخزين نصف الأنسجة في الفورمالين (والأنسجة الأخرى غير المثبتة التي تم اختبارها من قبل DFA) وكان من الضروري اختبار المقطع العرضي الكامل من جذع الدماغ والأنسجة الأخرى ، كما هو مطلوب للتشخيص. يمكن استخدام الكشف عن مستضد داء الكلب عن طريق اختبار IHC لعينات الدماغ البشرية بعد الوفاة لتشخيص و / أو التحليل الاستعادي للحالات المشتبه بها على أساس الأعراض السريرية. في حين لم تتم الموافقة على IHC كاختبار أولي أو تأكيدي لتشخيص داء الكلب ، مثل DFA ، فإن الطريقة تكشف المستضد باستخدام أجسام مضادة محددة لداء الكلب. مقارنة DFA باستخدام الأنسجة الطازجة / المجمدة مقابل FF قدمت حساسية مماثلة وخصوصية15. ما لم يتم اقتران الأجسام المضادة مباشرة ب FITC (شرط اختبار DFA) ، يمكن استخدام الأجسام المضادة المسماة HRP في IHC لتلطيخ مستضد داء الكلب. ميزة مع الكشف القائم على HRP هو القدرة على استخدام المجهر الخفيف للمراقبة. الكواشف DFA المتاحة تجاريا الحالية، FITC اقتران داء الكلب أجسام مضادة محددة (mAbs) لا يكشف مستضد بعد تثبيت الفورماتين بسبب تعديل epitopes. ومع ذلك، إذا كان FITC اقتران داء الكلب pAbs محددة متوفرة، فإنه يمكن استخدامها كوسيلة تلطيخ، على النحو الموصى به من قبل منظمة الصحة العالمية16. بالإضافة إلى الكشف عن المستضد، يمكن أن تتعرض أنسجة FF لعزل الحمض النووي الريبي تليها PCR والتسلسل باستخدام مبرمجينات محددة لتأكيد وجود الحمض النووي الريبي الجينومي RABV.

وتشمل المزايا الأخرى للأنسجة المثبتة بالفورماتين تحديد التغيرات النسيجية عن طريق طريقة تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوسين. في حين أن علاج الفورمالين يحافظ على البروتين ، فإنه يبطل تماما معظم مسببات الأمراض في العينة بسبب الروابط المتقاطعة واسعة النطاق من البروتينات وتدهور أو تعديل الأحماض النووية. وهكذا، فإن هذه الطريقة تحسن سلامة مناولة العينات البيولوجية والشحن والاختبار مقارنة ب DFA. خطوة تثبيت الأسيتون في DFA لا تعطيل RABV وينبغي التعامل مع PPE المناسبة17. العينات بعد تثبيت الفورماليين مستقرة ويمكن تخزينها في درجة الحرارة المحيطة ، والتي تناسب المناطق ذات الموارد المنخفضة حيث يكون الوصول إلى التخزين البارد محدودا. وبالمثل، يمكن النظر في الأنسجة المثبتة بالفورملين المضمنة في البارافين للتخزين على المدى الطويل في درجات الحرارة المحيطة دون فقدان التفاعل مع الأجسام المضادة ضد البروتينات.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

نشكر أخصائيي المختبرات وأخصائيي الأوبئة والشركات التابعة لإدارات الصحة العامة على تقديم عينات إلى مراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها. النتائج والاستنتاجات الواردة في هذا التقرير هي النتائج والاستنتاجات التي توصل إليها المؤلفون ولا تمثل بالضرورة الموقف الرسمي لمراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها. استخدام الأسماء التجارية والمصادر التجارية هي لتحديد الهوية فقط ولا يعني موافقة من قبل مراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3% hydrogen peroxidePharamacy brandsOff the shelf 3% H2O2
3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC)Millipore SigmaA6926
Acetate Buffer pH 5.2Poly Scientific R&D Corp.s140
Buffered Formalin 10% Phosphate BufferedFisher ScientificSF100-4Certified
Cover slips CorningFisher Scientific12-553-47124 X 50 mm
Ethanol 190 ProofPharmco-AAPER111000190
Ethanol 200 ProofPharmco-AAPER111000200
Gill's hematoxylin formulation #2Fisher ScientificCS401-1D
HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kitseracare71-00-18Mouse Primary Antibody 
ImmunoHistoMountMillipore Sigmai1161Mounting media
N,N, Dimethyl formamide GRFisher ScientificD119
Phosphate Buffered Saline HyCloneRR14440.0101M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6)
Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 ObjectiveMultiple vendors
Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 ObjectiveMultiple vendors
PronaseMillipore Sigma53702Protease, Streptomyces griseus
Scott's Tap Water Poly Scientific R&D Corp.s1887
Tissue-Tek Slide stain setFisher Scientific50-294-72
TWEEN-80 Millipore SigmaP1754
XyleneFisher ScientificX3S-4Histological Grade
Zeiss Axioplan 2 imaging - microscopeMultiple vendors

References

  1. Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies. F1000Research. 6, 184(2017).
  2. Fooks, A. R., et al. Current status of rabies and prospects for elimination. Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).
  3. Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles. Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).
  4. WHO. WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. 1012, 1(2018).
  5. Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).
  6. Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
  7. Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).
  8. Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies. Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).
  9. Inoue, S., et al. Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues. Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).
  10. Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
  11. Feiden, W., et al. Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections. Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).
  12. Manning, S. E., et al. Human rabies prevention--United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices. Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).
  13. WHO. Laboratory techniques in rabies. 1, 5th ed, 67-72 (2018).
  14. Patrick, E. M., et al. Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
  15. Whitfield, S. G., et al. A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens. Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).
  16. WHO. Diagnostic procedures for antigen detection. , https://www.who.int/rabies/about/antigendetection/en (2016).
  17. Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses. Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

176

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved