בדיקת אימונוהיסטוכימיה לגילוי אנטיגן ליסוירוס מרקמות קבועות פורמלין

כאן, אנו מציגים פרוטוקול בדיקת אימונוהיסטוכימיה לגילוי אנטיגן וירוס כלבת כמבחן אבחון חלופי לרקמות קבועות פורמרין.

אחת מאפשרויות האבחון העיקריות לכלבת היא זיהוי של קומפלקס ריבונוקליאופרוטאין ויראלי (RNP) (אנטיגן) בדגימות הרקמה הנגועות. בעוד שבדיקת הנוגדן הפלואורסצנטי הישיר (DFA) או הבדיקה האימונוהיסטוכימית המהירה הישירה (DRIT) משמשות בדרך כלל לגילוי אנטיגן, שתי הבדיקות דורשות רקמות טריות ו/או קפואות להתרשמות בשקופיות לפני גילוי האנטיגן באמצעות נוגדנים. אם דגימות נאספות ומתוקנות בפורמלין, אף אחת מהבדיקה אינה אופטימלית לזיהוי אנטיגן, עם זאת, הבדיקות יכולות להתבצע על ידי אימונוהיסטוכימיה קונבנציונלית (IHC) לאחר הטמעה בבלוקים ופרפין וחתך. בשיטת IHC זו, רקמות מוכתמות בנוגדנים נגד כלבת, חלקים הם deparaffinized, אנטיגן אחזור על ידי פרוטאוליזה חלקית או שיטות אחרות, ודגורה עם נוגדנים ראשוניים ומשניים. אנטיגנים מוכתמים באמצעות peroxidase חזרת / אמינו אתיל קרבזול ומוכתם עם המטוקסילין להדמיה באמצעות מיקרוסקופ אור. בנוסף לגילוי אנטיגן ספציפי, קיבוע פורמלין מציע יתרונות אחרים כמו קביעת שינויים היסתולוגיים, תנאים רגועים לאחסון ותובלה של דגימה (בטמפרטורות הסביבה), יכולת לבדוק מקרים רטרוספקטיביים ובטיחות ביולוגית משופרת באמצעות אי-החלמה של חומרים זיהומיים.

כלבת היא דלקת המוח מתקדמת חריפה הנגרמת על ידי וירוסי RNA תחושה שלילית השייכים לסוג lyssavirus¹. כמעט 99% מכלל מקרי המוות האנושיים הנגרמים על ידי זיהום בנגיף הכלבת (RABV), סוג הסוג, מועבר על ידי כלבים². אבחון כלבת של בעלי חיים חשודים מסתמך על גילוי אנטיגן (בעיקר נוקלאופרוטאין מקודד ויראלי, חלבון N) בקומפלקס עם RNA גנומי (קומפלקס ריבונוקליאופרוטאין, RNP) ברקמת המוח³. גילוי אנטיגן על ידי בדיקת נוגדן פלואורסצנטי ישיר (DFA) נחשב תקן הזהב לאבחון כלבת⁴. השיטה משתמשת בחומר מוח קפוא טרי או טרי, רושם מגע על שקופית, קיבוע אצטון, כתמים באמצעות איזוטיוציאנט פלואורסצנטי זמין מסחרית (FITC) שכותרתו נוגדנים חד שבטיים או פוליקלונליים (mAbs / pAbs) ונקרא על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית⁵. בדיקת DFA מהירה, רגישה וספציפית לזיהוי אנטיגן כלבת ברקמת מוח טרייה. לאחרונה, בדיקה אימונוהיסטוכימית מהירה ישירה (DRIT), טכניקה אימונוהיסטוכימיה שונה (IHC), הודגמה להפגין רגישות דומה DFA אבל מציע את היתרון של מיקרוסקופיה אור להדמיה⁶. בעוד שיטת הזיהוי המשמשת DRIT, דומה IHC, השלב הראשוני משתמש ברקמות טריות או קפואות כדי ליצור רשמי מגע של המדגם ואחריו קיבעון פורמלין.

IHC היא טכניקה נפוצה לקביעת שינויים היסתולוגיים וזיהוי חלבונים באמצעות נוגדנים ספציפיים ברקמות קבועות פורמלין המוטמעות בלוקים פרפין. IHC הוא בדיקה חלופית הוקמה לגילוי אנטיגן כלבת בסעיפים⁷רקמה . IHC נוצל במיוחד לאבחון מקרים רטרוספקטיביים שהפגינו מחלות נוירולוגיות כדי לקבוע את נטל הכלבת⁸. רקמות קבועות פורמרין מוטבעות פרפין לשמר את החלבונים לגילוי גם לאחר מספר שנים כאשר מאוחסנים בטמפרטורת^{הסביבה 9}. טיפול פורמלין משנה חלבונים על ידי הצלבה ושינוי שרשראות הצד של חומצות האמינו, מה שעלול לגרום לאפיטופים כבר לא להגיב נגד נוגדנים¹⁰. בעוד שבדיקת IHC לזיהוי אנטיגן נגד כלבת כוללת mAbs או pAbs, האחרון הוא יתרון כמו epitopes מרובים ו lyssaviruses מפוצלים ניתן לזהות¹¹.

השלבים הסטנדרטיים המעורבים ב- IHC הם קיבוע פורמלין של רקמות, הטמעה בבלוקים פרפין, חלוקת רקמות, דפראפיזציה והידרציה, התאוששות אפיטופה, תגובתיות נגד נוגדנים ראשוניים ומשניים, והתפתחות באמצעות מצעים כרומוגניים. כתב יד זה מתאר תיאור מפורט של הפרוטוקול לאבחון כלבת. לגילוי אנטיגן כלבת, סרום עכבר מחוסן עם RABV (pAbs) המיוצר במרכזים לבקרת מחלות ומניעתן בארה"ב (CDC) אטלנטה, ג'ורג'יה, בשילוב עם נוגדנים משניים נגד עכבר ביוטיניל מנוצלים. שרירי בטן ביוטינילאט מזוהים על ידי תוספת של קומפלקס peroxidase סטרפטאבידין-חזרת (HRP) ואחריו התפתחות הצבע עם מצע אמינו-אתילקרבאזול.

בעוד פרוטוקול IHC בוצע על רקמות קבועות פורמלין, אשר מנטרל RABV אם קיים, פרוטוקולים בטיחות ביולוגית מתאימים יש לעקוב כראוי. כל נהלי הבטיחות הביולוגית מתוארים בבטיחות הביולוגית במעבדות מיקרוביולוגיות וביו-רפואיות (BMBL) מהדורה 5 (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm), כולל לבישת ציוד מגן אישי מתאים (PPE) ודרישת חיסון כמתואר¹². בנוסף, יש לעקוב אחר בלימה וטיפול נאותים בכימיקלים מסוכנים (כמו פורמלין, AEC וקסילן), (למשל, ברדסים אדים).

1. קיבוע פורמלין של רקמות

1. מניחים רקמות מוח 3-5 מ"מ שנאספו לאחר נמק¹³ לתוך 10% תמיסת פורמרין חוצץ פוספט (1:20 עד 1:50 יחס רקמות / פורמלין) עבור 24-72 שעות.
   זהירות: פורמלין הוא קיבעון רעיל.
2. להקליט את משקל הרקמה המשוער (גודל), סוג הרקמה (אזורי המוח) ואת נפח הפורמלין. חשוב שמעבדות יתעדו ויתחזקו רשומות בזמני הקיבעון.
3. לאחסון רקמות ארוך יותר לאחר קיבוע פורמלין ולפני העיבוד, מניחים את הרקמה ב-70% אתנול.

2. עיבוד רקמות

1. לאחר קיבוע הדגימה, לנתח את הרקמה כדי לכלול את אזורי המוח החשובים כגון, חתכים צולבים של גזע המוח, המוח הקטן (3 אונות), או ההיפוקמפוס (שניהם היפוקמפי) כל לחתוך 3 עד 5 מ"מ עובי להציב לתוך קלטות עיבוד.
2. לעבד את קלטות הרקמה עבור חדירת שעוות פרפין, מוטבע לתוך בלוקים פרפין מחולק (3 עד 6 מיקרומטר) על microtome.

3. הכנת חומרים / כלים מכתימים

1. הגדר את צלחת הכתמים¹⁴ (שולחן החומרים)כפי שמוצג באיור 1. ממלאים כל מנה ב-250 מ"ל של הפתרון.
2. הכנת פתרון מלאי מצע 3-Amino-9-אתילקרביזואל (AEC)
   1. ממיס טבליה אחת של 20 מ"ג של 3 אמינו 9-אתילקרבאזול (AEC) לתוך 5 מ"ל של N,N, דימתילפורמיד באמצעות פיפטה זכוכית.
      זהירות: AEC הוא מסרטן.
3. הכנת פתרון המניות של הפרוטאז (למשל, פרונאז) לאחזור האנטיגן
   1. להמיס 7 מ"ג של פרוטאז ב 200 מ"ל של PBS.
4. הכנת חיץ השטיפה PBS-T
   1. הוסף 10 מ"ל של Tween 80 עד 990 מ"ל של PBS. מערבבים אותו היטב כדי ליצור פתרון הומוגני.

4. דפראפיזציה והידרציה מחדש של רקמות

1. הפוך 5 מיקרומטר סעיף פרפין באמצעות microtome, לצוף אותו על אמבט מים ב 38 °C (5 °F) ולאסוף על מגלשות זכוכית. סמן את השקופיות באמצעות עט/סמן עמידים לריגנט.
2. מניחים את השקופיות על מגש וממיסים בתנור 55-60 מעלות צלזיוס למשך שעה. אין להעלות את הטמפרטורה מעל 60 °C (60 °F) כפי שהוא יכול להרוס את האנטיגן הנגיפי.
3. מוציאים מגלשות מהתנור ומיד מסירים ב-3 שטפונות קסילן רצופות של 5 דקות כל אחת בכלים 1, 2 ו-3.
4. Rehydrate את החלקים על השקופית על ידי טבילה רציפה בהפחתת דילול של אתנול למים deionized: (4 עד 11 הוא לשטוף לטבול) צלחת 4: קסילן / 100% אתנול (1:1); מנה 5: 100% אתנול; מנה 6: 100% אתנול; מנה 7: 95% אתנול; מנה 8: 95% אתנול; מנה 9: 80% אתנול; מנה 10: 70% אתנול; מנה 11: מים דה-יוניים (איור 1). הגדרת צלחת).
   זהירות: קסילן הוא כימיקל מסוכן ועבודה צריכה להתבצע במכסה אדים.

5. אחזור אנטיגן פרוטאוליטי

1. לטפל שקופיות עם פרוטאז (2.5 מיקרוגרם / מ"ל של PBS) במשך 30 דקות עבור אחזור אנטיגן פרוטאוליטי בצלחת 12.
2. לאחר מכן לשטוף PBS-T במשך 10 דקות (צלחת 13).
3. לטפל עם 3% מי חמצן במשך 10 דקות (צלחת 14).
4. שוב, לשטוף עם PBS-T במשך 10 דקות (צלחת 15).

6. הליך הכתמת

1. טפל בשקופיות אחת בכל פעם תוך שמירה על השקופיות הנותרות שקועות במאגר (אל תסיר את כל מחזיק השקופיות - שמור שקופיות רטובות). הסר שקופית אחת ולהכתים את חוצץ עודף (באמצעות מגבת נייר) מסביב לאזור הרקמה נזהר לא להפריע סעיף הרקמה. דגירה מחליקה בתא לחות, שנעשו על ידי הצבת מגבות נייר לחות, על ספסל המעבדה^{העליון 14} בטמפרטורת החדר עם סרום עזים רגיל (חסימה) במשך 15 דקות.
2. דגירה עם נוגדן דילול ראשוני אופטימלי שנקבע מראש נגד כלבת (1:250 דילול של סרום נגד כלבת עכבר, לא פורסם) (שליטה חיובית) ונוגדני שליטה שלילית בטמפרטורת החדר זהה לעיל (שלב 6.1.) במשך 60 דקות ללא שטיפה בין לבין.
3. לאחר 60 דקות, לשטוף עם PBS-T במשך 10 דקות (צלחת 16).
4. דגירה עם הנוגדן הביוטינילי (ספציפי למינים) בתא לחות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות (טיפול זהה לשלב 6.1).
5. לשטוף עם PBS-T במשך 10 דקות (צלחת 16).
6. דגירה עם מתחם סטרפטאבידין-HRP בתא לחות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות (טיפול זהה ל-6.1).
7. לשטוף עם PBS-T במשך 10 דקות (צלחת 16).
8. דגירה עם מצע פרוקסידאז, אמינו-אתילקרבזול (AEC), בתא לחות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. הפוך AEC ממש לפני השימוש. כדי לעשות זאת, להוסיף 1 מ"ל של פתרון מלאי AEC 14 מ"ל של 0.1M חוצץ אצטט, pH 5.2. הוסף 0.15 מ"ל של 3% H₂O₂. מסננים את התערובת ממש לפני השימוש (מסנן 0.45 מיקרומטר).
   הערה: פתרון העבודה של AEC יציב רק עבור 2-3 שעות. ניתן לאחסן את פתרון המלאי של AEC במקרר לתקופות ארוכות יותר.
9. לשטוף במים דה-יונו 10 דקות (מנה 17)
10. עם ההמטוקסילין של גיל מדולל 1:2 עם מים דה-יון במשך 2 דקות (מנה 18).
11. לשטוף עודף המטוקסילין עם שטיפת מטבל מים deionized (צלחת 19 ו 20).
12. יש לשטוף במי הברז של סקוט 30 s (תמיסת סומק) 21.
13. לשטוף במים דה-יונו 10 דקות (מנה 22)
14. הסר שקופיות אחת בכל פעם - הר עם מדיום הרכבה מסיס במים.
15. קרא שקופיות על מיקרוסקופ אור.

איור 2 מדגים תוצאות הכתמת IHC מייצגות של דגימות שליטה חיוביות ושליליות ברקמות מוח שונות שנבדקו. איור 2A,D,G מייצג דגימות חיוביות ב- 200x, ואילו איור 2B,E,H תואם להגדלה של פי 400, בהתאמה. איור 2A-C תואם לגזע המוח; איור 2D-F מתאים לתאי המוח הקטן והפורקיניה; ואיור 2G-I מתאים להיפוקמפוס. איור 2,אף, אני דגימות שליטה שליליות. הכתם האדום של המגנטה מדגים את התפתחות הצבע באמצעות מצע AEC ברקע הכחול (הנגדי המטוקסילין) בשל התגובה של נוגדנים נגד אנטיגן כלבת. AEC הוא מצע peroxidase, אשר על תגובת חמצון, מזורז על ידי HRP, תוצאות משקעים בלתי מסיסים מים נצפה תחת מיקרוסקופ אור.

תוצאה חיובית IHC מתאים מכתמים אדומים מגנטה בקטעי רקמות. הכתמת תכלילים ציטופלסמיים והכללים פרטניים בגדלים שונים מעידים על דגימות חיוביות לזיהומים RABV. דגימות נחשבות שליליות אם לא נצפתה כתם אדום ספציפי או רק הרקע הכחול עקב המטוקסילין. בנוסף להכתמה החיובית, התפלגות ההכללות יכולה לספק כימות עקיף של רמות האנטיגן של כלבת במדגם, אשר עשוי להתאים את העומס הנגיפי של דגימות הרקמה. ללא קשר לרמות ההפצה, כל כתם ספציפי י לסווג את המדגם כחיובי לזיהוי אנטיגן RABV.

איור 1: תרשים זרימה המציין שלבים שונים לבדיקת IHC. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: כתמים אימונוהיסטוכימיים של רקמת מוח חיובית ושלילית של כלבת. (A)תכלילים ויראליים Intracytoplasmic וזיהוי אנטיגן וירוס כלבת בגזע המוח 200x הגדלה כוללת; (B) גזע מוח חיובי 400x; (C)גזע המוח שליטה שלילית 200x; (D)תכלילים וירוס כלבת בתוך המוח הקטן 200x; (E)תאי המוח הקטן והפורקיניה 400x; (F)שליטה שלילית במוח הקטן; (G)תכלילים ויראליים בתוך היפוקמפוס 200x; (H)היפוקמפוס 400x; היפוקמפוס שליטה שלילית 200x. הכתם האדום מציין את נוכחותו של אנטיגן וירוס כלבת באמצעות שיטת הכתמה קומפלקס סטרפטאבידין-ביוטין (מצע AEC). כתם נגד המטוקסילין (כחול). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

בשל שיעור התמותה הגבוה של כלבת לאחר הופעת הסימפטום, האבחנה של בעלי חיים חשודים לזיהום RABV היא קריטית ביותר לטיפול מניעתי מתאים לאחר חשיפה. אבחון כלבת תלוי בעיקר בטכניקות DFA, DRIT ו- PCR באמצעות רקמות טריות או קפואות. לבדיקת רקמות קבועות פורמרין, בדיקת IHC מספקת שיטה חלופית לזיהוי רגיש וספציפי של אנטיגן RABV. בעוד הרקמות קבועות פורמלין יש חלבונים התייצבו עקב שינוי של שרשראות צד כמו קישור צולב, הדגימות צריך להיות מעובד לפני גילוי אנטיגן. בפרוטוקול זה, האפיטופים נמצאו באמצעות העיכול הפרוטאוליטי החלקי על ידי הפרוטאז (למשל, פרונאז) כדי לאפשר את כריכת הנוגדנים העיקריים לתסביך RNP. בעוד mAbs תגובתי נגד חלבון N מסתמכים בעיקר על DFA ו- DRIT, pAbs כי הם מגיבים נגד epitopes מרובים על חלבון N יועדף לבדיקת IHC. בנוסף, תגובתיות או pAbs יכול להיות רחב יותר נגד גרסאות RABV שונות נגד lyssaviruses שאינם כלבת לעומת mAbs.

אחת המגבלות העיקריות של מבחן IHC היא הפרוטוקול כרוך במספר צעדים רציפים ולוקח כ 6 שעות להשלמה. אם הרקמה צריכה להיות קבועה בפורמלין ומוטמעת בלוקים פרפין, זה דורש 1 - 2 ימים נוספים לפני הרקמה יכול להיות מוכתם. מגבלה נוספת היא אי זמינות של נוגדנים מסחריים ראשוניים נגד כלבת לבדיקת IHC. עם זאת, IHC מספק אפשרות לבצע אבחון כלבת כאשר רק רקמות FF זמינים לבדיקה. בדיקת IHC חשובה במיוחד לבדיקת מקרי כלבת אם מחצית מהרקמות מאוחסנות בפורמלין (ורקמות לא מנוצלות אחרות שנבדקו על ידי DFA) והיה צורך לבדוק חתך מלא של גזע המוח ורקמות אחרות, כנדרש לאבחון. גילוי אנטיגן כלבת על ידי בדיקת IHC יכול לשמש עבור דגימות מוח לאחר המוות אנושי לאבחון ו / או ניתוח רטרוספקטיבי של מקרים חשודים המבוססים על הסימפטומים הקליניים. בעוד IHC לא אושרה כמבחן ראשוני או מאשר לאבחון כלבת, כמו DFA, השיטה מזהה אנטיגן באמצעות נוגדנים ספציפיים לכלבת. השוואה של DFA באמצעות רקמות טריות / קפואות לעומת FF סיפקה רגישות^{וספציפיות דומות 15}. אלא אם כן נוגדנים מצומדים ישירות ל- FITC (הדרישה לבדיקת DFA), ניתן להשתמש בנוגדנים המסומנים על ידי HRP ב- IHC להכתמת אנטיגן כלבת. היתרון בזיהוי מבוסס HRP הוא היכולת להשתמש במיקרוסקופ אור לתצפית. ריאגנטים DFA זמין מסחרית הנוכחי, FITC מצומד כלבת נוגדנים ספציפיים (mAbs) אינו מזהה אנטיגן לאחר קיבוע פורמלין עקב שינוי של epitopes. עם זאת, אם FITC מצומד כלבת ספציפי pAbs זמינים, זה יכול לשמש כשיטת כתמים, כפי שהומלץ על ידי ארגון הבריאות העולמי¹⁶. בנוסף לגילוי אנטיגן, רקמות FF יכולות להיות כפופות לבידוד RNA ואחריו PCR ורצף באמצעות פריימרים ספציפיים לאישור נוכחות של RNA גנומי RABV.

היתרונות האחרים של רקמות קבועות פורמרין כוללים קביעת שינויים היסטואליים על ידי שיטת הכתמת המטוקסילין ואאוזין. בעוד הטיפול פורמלין משמר חלבון, זה לחלוטין מנטרל את רוב הפתוגנים במדגם בשל crosslinking נרחב של חלבונים השפלה או שינוי של חומצות גרעין. לכן, השיטה משפרת את הבטיחות של טיפול מדגם ביולוגי, משלוח ובדיקה בהשוואה DFA. שלב קיבוע אצטון ב- DFA אינו מושבת RABV ויש לטפל בו עם PPE^{17 המתאים}. הדגימות לאחר קיבוע הפורמלין יציבות וניתן לאחסן בטמפרטורת הסביבה, המתאימה לאזורים בעלי משאבים נמוכים שבהם הגישה לאחסון קר מוגבלת. באופן דומה, ניתן לשקול רקמות קבועות פורמרין מוטמעות פרפין לאחסון לטווח ארוך בטמפרטורות הסביבה מבלי לאבד את תגובתיות הנוגדנים נגד חלבונים.

למחברים אין מה לחשוף.

אנו מודים למעבדות, לאפידמיולוגים ולשותפים עם מחלקות בריאות הציבור על הגשת מדגמים למרכז לבקרת מחלות ומניעתן. הממצאים והמסקנות בדו"ח זה הם של המחברים ואינם מייצגים בהכרח את עמדתם הרשמית של המרכז לבקרת מחלות ומניעתן. השימוש בשמות מסחריים ומקורות מסחריים מיועד לזיהוי בלבד ואינו מרמז על תמיכה על ידי המרכז לבקרת מחלות ומניעתן.