Roman pasif optik şeffaflık bütün sinir dokusunda hızlı üretim için yöntemleri Temizleme

Burada, iki roman metodolojisi, psPACT ve mPACT maksimal optik şeffaflık ve doku damarlara sağlam kemirgen sonraki mikroskobik analizi elde etmek için mevcut tüm CNS.

NETLİK geliştirme beri teknik temizleyerek bir bioelectrochemical bu üç boyutlu fenotip eşleme için şeffaf dokularda, roman Temizleme yöntemleri kübik (açık, engelsiz beyin görüntüleme dahil olmak üzere çok sayıda sağlar kokteyller ve sayısal analiz), anahtarı (etkileşim zaman sistemde kontrol) ve kimyasal kinetik, harita (Proteom büyütülmüş analizi) ve PAKTI (pasif netlik tekniği), kurulmuştur için varolan araç daha fazla genişletmek için biyolojik dokuların mikroskopik analiz. Üzerine iyileştirmek ve özgün PAKTI yordamı tüm merkezi sinir sistemi (MSS), böbrek, dalak ve tüm fare embriyo gibi sağlam kemirgen dokuların bir dizi için en iyi duruma getirme mevcut çalışma amaçlamaktadır. PsPACT (işlem-ayrı PAKTI) ve mPACT (değiştirilmiş PAKTI) olarak adlandırdığı, roman bu teknikler hücre devresi haritalama ve olduğu gibi normal ve patolojik dokularda hücre altı yapıları görselleştirme son derece etkili yol sağlar. Aşağıdaki iletişim kuralında, biz onların yapısal bütünlük psPACT ve mPACT üzerinden en az işgali ile maksimal doku izni elde etmek nasıl ayrıntılı, adım adım anahat sağlar.

Klinik ve bilimsel açıdan soruşturma temel amacı organ yapısı ve fonksiyonu tam bir anlayış ulaşmak içerir; Ancak, memeli organları son derece karmaşık doğası kez tamamen bu amaç¹ulaşmak için bir engel olarak hizmet vermektedir. Sağlam dokulara gelen bir hidrojel Akrilamid tabanlı melez inşa içerir, berraklık (açık Lipid değiş tokuş Akrilamid melezleşmiştir katı görüntüleme uyumlu Tisssue-hidrojel)^2,3,4, elde organ, beyin, karaciğer ve dalak, onların yapısal bütünlük⁵koruyarak dahil olmak üzere çeşitli optik geçiş izni. NETLİK böylece sadece görselleştirme ince karmaşık hücresel ağlar ve doku türleri Morfoloji kesit gerek kalmadan incelemek için bir fırsat aynı zamanda sağlamıştır.

Doku izni elde etmek için NETLİK örnek el altında lipit içeriğini kaldırmak için elektroforetik yöntemleri kullanır. NETLİK fiziksel olarak istikrarlı doku-hidrojel melez üretmek için kaydetti iken, elektroforetik doku takas (vb) yöntemleri kullanımı, esmerleşme epitope hasar, dahil olmak üzere, doku kalitesi açısından değişken sonuçlar verir çalışmalar göstermiştir ve protein kaybı^5,6. Bu sorunları gidermek için vb tedavi yerini alan bir pasif, deterjan iyonik bağlı delipidation tekniği ile anlaşma (pasif netlik tekniği), gibi değiştirilmiş protokolleri gelişmiş^7,8,9olmuştur. Sonuçlarında büyük bir tutarlılık ulaşmak rağmen ancak, PAKTI maksimal izni elde etmek için daha fazla zaman gerektirir. Ayrıca, bu teknikleri hiçbiri henüz tüm CNS formu veya fareler ve eskiden şiling şimdi pigs gibi daha büyük kemirgen modellerinde uygulandı.

Bu da çalışmanın roman metodolojileri, psPACT (işlem-ayrı PAKTI) ve mPACT (değiştirilmiş PAKTI), Bütün CNS ve iç organlar fare ve sıçan modelleri¹⁰hızlı Gümrükleme kolaylaştırmak için teklif tarafından bu sınırlamaları gidermek çalışmaktadır. Özellikle, psPACT % 4 Akrilamid ve % 0.25 dokulara işleyen VA-044 hidrojel oluşumu sırasında; iki ayrı adımda mPACT esasen aynı adımları içerir, ancak % 0.5 α-thioglycerol anahtar reaktifi olarak SDS tabanlı takas Çözümle takviyeleri. Her iki teknikleri endojen sistemik ve cerebrospinal dolaşım optik temizleme üretmek için gereken süreyi önemli ölçüde azaltmak için sistemleri koşum. İlke kanıtı olarak biz confocal mikroskopi kan damarı desenleri temizlenen doku¹⁰analiz kullanımını göstermektedir.

Tüm yordamları Yonsei Üniversitesi Tıp Fakültesi, uygun araştırma Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. Tüm deneysel hayvan laboratuvar hayvan bakımı Komitesi Yonsei Üniversitesi Tıp Fakültesi, kuralları uyarınca feda etti.

1. hazırlanması reaktifler

Dikkat: Paraformaldehyde (PFA), Akrilamid ve Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) toksik tahriş edici vardır ve böylece bir duman başlıklı uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE; önlük, eldiven, koruyucu gözlük) ile ele alınmalıdır.

1. %4 Akrilamid (AA) çözüm (A4P0): 20 mL % 40 Akrilamid çözüm için 180 mL 0.1 M fosfat tamponlu tuz (PBS) ekleyin.
2. % 0.25 VA-044 çözüm: 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane 0.5 g ekleyin] dihydrochloride (VA-044) toz 200 ml 0.1 M fosfat tamponlu tuz (PBS). VA-044 toz-ebilmek var olmak stok oda sıcaklığında iken, PBS solubilization üzerine 4 ° C'de depolanmalıdır. En iyi sonucu elde etmek için sadece deneme için gerekli çözüm miktarda hazırlamak.
3. ANLAŞMA kokteyl çözüm: 10 g Akrilamid 225 mL % 4 paraformaldehyde (PFA) çözeltisi ekleyin ve 200 ml % 4 ile ses seviyesini PFA. Kullanılmadan önce VA-044 tozu 100 mg 40 mL 50 mL konik tüp içinde karışımı ekleyin.
4. Çözüm arabelleği temizleyerek PAKTI: 40 g Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) 350 mL 0.1 M PBS ekleyin ve 500 ml 0.1 M PBS ile ses seviyesini. Çözüm takas mPACT için % 0,5 α-thioglycerol çözüm arabelleği temizleyerek PAKTI ekleyin.
5. Bu çalışmada kullanılan fareler 2-hafta-yaşlı BALB erkek fareler vardı; Bu çalışmada kullanılan fareler 2 hafta eski erkek SD-sıçan vardı.

2. anestezi ve perfüzyon cerrahi

Dikkat: PFA ve Akrilamid toksik tahriş edici ve böylece bir duman başlıklı uygun KKE ile ele alınmalıdır.

1. 30 mg/kg 1 mL şırınga ile 26'lik iğne kullanarak zoletil patojen-Alerjik bir odada hayvan anestezi. İzlemek hayvan için 5-10 dak.
2. Hayvan cerrahi anestezi uçağa ulaştı sonra anestezi derinliği belirlemek için ayak-çimdik yanıt yöntemini kullanın. Yanıt vermeyi durdurma sorununu onaylayın.
   Not: bir önceki çalışmada¹¹' kullanılan benzer bir iletişim kuralı fare ve sıçan cerrahi içeren aşağıdaki adımları izleyin.
3. Göğüs kafesi, deri ve karın duvarı altında 5-6 cm kesi yapmak.
4. Eğri, künt makas bir kesik kesik önceden siteyi bulmak için göğüs alan palpating diyafram içinde olun
5. Kesik göğüs kafesi plevral boşluğu ortaya çıkarmak için tüm uzunluğu boyunca uzanır.
6. Dikkatli bir şekilde akciğerlere yerinden. Köprücük kemiği kadar göğüs kafesi ile kesme yapmak. Iris makas kullanarak, küçük bir insizyon attım sol ventrikül arka bitene kadar dayanabilir. Bir 18'lik perfüzyon künt veya zeytin uçlu iğne kesilmiş ventrikül geçen artan aort içine yerleştirin.
7. İğne güvenli ve kalp bir hemostat ile sıkma tarafından kaçağı önlemek. Alternatif olarak, değiştirilmiş bir hemostat aorta iğne ucu etrafında kelepçe için kullanın.
8. Azalan aortaya en az hasar sağlamak için dikkat çekici sağ atriyumu büyük bir kesi yapmak. Fare şimdi perfüzyon için hazırdır.

3. bütün perfüzyon ve sıçan diseksiyon

Dikkat: PFA ve Akrilamid toksik tahriş edici ve böylece bir duman başlıklı uygun KKE ile ele alınmalıdır.

Not: Aşağıdaki tüm perfüzyon adımları bir önceki çalışmada Woo ve arktarafından kullanılan bir iletişim kuralı benzer. (2016) ^{10 , 11}.

1. Kalbin sağ atrium herhangi bir hava kabarcıkları tanıtmak değil dikkat çekici bir 18'lik iğne için ekleyin.
2. 50 mL şırınga kullanarak, hızlı bir şekilde ve eşit olarak 50 mL heparin (10 adet/mL) içeren soğuk 0.1 M PBS çözeltisi pompa.
3. 18'lik iğne Peristaltik pompa tüp takın.
4. 200 mL heparin (10 adet/mL) içeren soğuk 0.1 M PBS çözeltisi ile 10 mL/dak bir dolaşım hızda yıkayın.
5. 250 mL kan dolaşımı hızla 10 mL/dk soğuk % 4 İngiltere'de yılın çözeltisi ile düzeltmek. Fare bu aşamada sert olmalıdır.
6. Toplar ve kalan PFA çözüm bertarafı için saklarız.
7. ANLAŞMA için bir soğutulmuş PAKTI kokteyl çözüm %4 PFA, % 4 Akrilamid ve % 0.25 VA-044 toz kurcalayarak bir 18'lik iğne ile sıvı ve baş ve omurga kaldır. Kafatası bir ensizyon boyun burun yaparak ortaya çıkarmak. Bu ek perfüzyon adım psPACT ve mPACT yöntemleri için gerekli değildir; fiksasyon sonra hemen baş ve omurga yalıtmak ve kafatası bulaşmasına neden.
8. Kafatasının herhangi bir kalıntı boyun ve omurga kas kaldırarak maruz.
9. Peel away kafatası için rongeurs ve makas kullanın. Beyin ve omurilik kaldırın.
10. Dokuya %4 oranında depolamak PFA 4 ° c; doku 1 hafta kadar saklanabilir.

4. hidrojel Monomer infüzyon ve fare ve fare MSS polimerizasyonu

Dikkat: Akrilamid, SDS, α-thioglycerol ve İngiltere'de yılın tahriş edici ve böylece bir duman Hood ve uygun çiş ile ele alınmalıdır.

1. PAKTI (pasif Temizleme tekniği)
   1. İzole etmek ve tüm MSS (beyin ve omurilik) sabit fareler ve sıçanlar %4 PFA, % 4 Akrilamid ve % 0.25 VA-044 toz ve mağaza 24 h doku tamamen s içinde dalmış sağlamak için 4 ° C'de soğutulmuş PAKTI kokteyl solüsyon içeren bir 50 mL tüp için kültür olution.
   2. 10 dk mendil kullanarak bir azot tanka bağlı hibridizasyon sistem jel için örnek azot gazı içinde katıştırma: sistem 37 ° C'ye ayarla Dokuların taze soğuk (4 ° C) PAKTI içeren bir 50 mL tüp transferi kokteyl çözüm ve tüp kap ile bağlayın ve vakum üzerine açın.
   3. Hidrojel polimerize için örnek bir sallayarak kuluçka (150 d/d, 37 ° C) içeren tüp 3 h için veya polimerizasyon tamamlanana kadar koyun.
   4. Bloting kağıt kullanarak (bakınız Tablo malzemeler), Kaldır dokuları çevreleyen kalan polimerli hidrojel.
   5. Doku takas solüsyon (0.1 M PBS, pH %8.0 8 SDS) içeren bir 50 mL tüp aktarın.
   6. Örnek doku temizlenmiş oldu kadar 37 ° C ve 150 rpm için ayarla titreyen bir kuluçka makinesine koyun. Ortalama olarak, bu tam açıklığı elde etmek için yaklaşık 20 gün boyunca fareyi CNS alır.
2. psPACT (işlem ayrı pasif Temizleme tekniği)
   1. Bütün MSS (beyin ve omurilik) kemik kesici ve makas PFA-sabit fare ve sıçanlar temiz bir banka üzerinden ayırma.
   2. Doku transferi doku tamamen sabitleştirici dalmış PFA ve mağaza 24 h için 4 ° C'de % 4 içeren bir 50 mL tüp sağlamak.
   3. 1s için sabit doku 0.1 M PBS yıkama ve A4P0 çözüm (0.1 M PBS %4 Akrilamid) aktarın. Mağaza 24 h 37 ° C'de.
   4. 5 min için doku 0.1 M PBS içinde yıkayın.
   5. % 0.25 dokusunda bırakın VA-044 0.1 M PBS içinde. 6-24 h 37 ° C'de depolayın ve sonra taze % 0.25 VA-044/PBS çözüm için transfer.
   6. 10 dk mendil kullanarak hibridizasyon jel için örnek azot gazı embed sistemi ( Tablo malzemelerigörmek) bağlı bir azot tankı: Transfer dokuların taze soğuk (4 ° C) içeren bir 50 mL tüp % 0.25 VA-044/PBS çözüm ve tüp kap ile bağlamak. Vakum üzerine açın.
   7. Doku çözüm (0.1 M PBS, pH %8.0 8 SDS) temizlemek için transfer.
   8. Titreyen bir kuluçka doku temizlenmiş oldu kadar 37 ° C ve 150 rpm için ayarla örnek kuluçkaya. Ortalama olarak, yaklaşık 17 gün boyunca fare CNS tam açıklığı elde etmek için alır.
3. mPACT (değiştirilmiş pasif Temizleme tekniği)
   1. Bütün MSS (beyin ve omurilik) kemik kesici ve makas PFA-sabit fare ve sıçanlar temiz bir banka üzerinden ayırma.
   2. 4.2.2 - psPACT Protokolü'nün 4.2.8 adımları.
   3. Doku çözüm temizlenmesi için transfer. ANLAŞMA ve psPACT protokollerinden farklı olarak, mPACT % 0.5 α-thioglycerol ek olarak % 8 SDS 0.1 M PBS, pH 8.0 içinde oluşan bir takas çözüm gerektirdiğini unutmayın. Α-thioglycerol doku daha hızlı ve etkili bir şekilde temizlemek yardımcı olur un esmerleşme bir ajandır. Doku tam çözümde dalmış emin olun.
   4. Örnek doku temizlenmiş oldu kadar 37 ° C ve 150 rpm için ayarla titreyen bir kuluçka makinesine koyun. Ortalama olarak, fare CNS tam açıklığı elde etmek için yaklaşık 2 hafta sürer.

5. Kırılma indisi eşleme ve temizlenen MSS Immunostaining

Not: njantlar (Kırılma indisi eşleşen çözüm Nycodenz tabanlı) 0.8 g/mL Nycodenz toz içinde 30 mL temel tampon (% 0,01 sodyum azid ve ara-20 0.1 M PBS, pH 8.0) çözünmüş oluşur. Bu çözüm toz uygun solvasyon için izin vermek için kuluçka sallayarak 37 ° C yerleştirilir önerilir.

1. Kuluçkaya dokularda % 0.1 0.1 M PBS için 2 h, Triton X-100 sonra blok 0.1 M PBS 6 h için de %2 sığır serum albümin (BSA) ile.
2. Bölümlerde üç kez PBST yıkamak (% 0.1 0.1 M PBS ara-20) için 2 h. bölümleri (Bu durumda, kan damarlarının lekeleri bir anti-tavşan PECAM-CD31 antikor) birincil antikorlar ile 2 gün boyunca leke.
3. Bölümleri de %2 BSA (Bu durumda, bir keçi Anti-tavşan IgG Cy3 floresan eşlenik) ikincil antikor ile 2 gün boyunca leke.
4. Yıkama üç kez içinde PBST 2 h için doku ve mağaza 15 mL 2-10 gün boyunca njantlar etiketli.
5. Görüntüleme önce etiketli dokular njantlar küçük bir miktar için 35 veya 60 mm doku kültürü yemekleri üzerinde hareket ettirin. Silikon çevresinde çanak alt kenarı ile düzeltmek.
6. 1.5-2 mL taze njantlar ekleyin.

6. görüntü işleme

1. Kiremit bir confocal lazer tarama microscopewith 10 x büyütme kullanarak tarama ile temizlenmiş dokuların görüntüleri elde etmek ( Tablo malzemelerigörmek). Cy3 etiketli dokusunun 550-600 nm dalga boyu kullanın.

En iyi duruma getirilmiş pasif Temizleme teknikleri kullanarak tüm CNS şeffaf bir model nesil

Fare ve sıçan bütün CNS dokuların optik geçiş izni hızla çeşitli pasif Temizleme Teknikleri (şekil 1) kullanılarak sağlanır. Zaman içinde takas dokusunun bir şematik şekil 2Agösterilir. Özgün PAKTI yönteminden farklı olarak, % 4 Akrilamid (A4P0) ve % 0.25 VA-044 başlatıcı çözüm örnekleri hidrojel Melez oluşturmak üzere iki ayrı adımda tedavi psPACT (işlem-ayrı PAKTI) içerir. mPACT (değiştirilmiş PAKTI) çözüm % 0.5 α-thioglycerol ile takas % 8 SDS ilave psPACT daha da artırır. ANLAŞMA, psPACT ve mPACT gün 14 üzerinden işleme örnekleri karşılaştırılır ve şekil 2Bsundu.

Bir önceki çalışmada, bu süre orijinal anlaşma Protokolü 23 gün, psPACT optik geçiş izni elde ve mPACT tüm fare CNS sadece 20 ve 14 gün, sırasıyla¹⁰temizlenmiş bildirdi. Bu da çalışmanın, fare beyin örnekleri mPACT protokolü aracılığıyla tedavi ederken onlar 14 gün (2B rakam) sonra optik şeffaflık elde bulduk. Sıçan bütün CNS örnekleri psPACT yolu ile işlenen ve dokularda sırasıyla 30 ve 20 gün içinde silinmesinden gibi aynı zamanda bu mPACT maksimal izni en yüksek etkinlik ile elde gösterdi mPACT (şekil 3A, B). Yetişkin sıçan beyin tüm MSS aksine, tek başına bir sadece 5 gün içinde (4A rakam) mPACT ile temizlendi. Temizlenen sıçan beyin damar kalıpları ile ayirt psPACT ve mPACT işleme yardımcı programı (şekil 4B, mPACT veri beynin anatomik ve fonksiyonel analiz için bu takas yordamlardan göstermek için sonra analiz edildi Woo ve ark. 2016 gösterilen)¹⁰.

Pasif doku protokolleri temizleyerek bu kullanarak en iyi duruma getirilmiş, takas kez üç protokoller arasında farklılık olsa da biz bütün MSS, sağlam, şeffaf modellerinin görselleştirmek başardık. En iyi duruma getirilmiş pasif yöntemler temizlemek daha kısa bir süre içinde organ netlik elde. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar yöntemi takas mPACT açık CNS yöntemleri temizleyerek daha stabil ve hızlı önceki pasif oluşturabilirsiniz öneririz. Bu nedenle, mPACT memeli organların gelecekte yapısal ve anatomik analizleri kullanmak için büyük bir potansiyele sahiptir ve varolan yöntemleri etkinliği ve güvenliği açısından önemli bir avantaj sağlar.

Nesil optik temizlenen iç organlar ve embriyo mPACT kullanarak

Bütün CNS dokular yanı sıra, Yetişkin fare dalak ve böbrek mPACT ile 19 ve 23 gün içinde sırasıyla silinmesinden (şekil 5AB). Fare embriyo E10.5 ve E13.5 da mPACT iletişim kuralı üzerinden işlenmesi 3 gün sonra temizlendi. Şekil 5C -E fare embriyo, sıçan Kauda at ve sıçan dalak kuyruk bölgesi microvasculature yanı sıra tüm embriyo kan damarı desen canlandırmayı gösterilir. Bu sonuçlar bu mPACT çok çeşitli doku ve organların 3D anatomik analiz için şeffaf modelleri oluşturmak için kullanılan öneririz.

Şekil 1: en iyi duruma getirilmiş pasif Temizleme Teknikleri (anlaşma) şematik gösterim. Her üç anlaşma protokolü olarak bireysel adımlar bir taslağını her adım için gerekli reaktifler yanında sağlanır. Özgün PAKTI doku polimerizasyon hidrojel oluşumu %4 PFA, % 4 Akrilamid (AA) çözüm ve % 0.25 VA-044 başlatıcı çözüm soğuk karışımı ile gelen protokolüdür. Sonra doku azot gazı kullanarak polimerli, pasif çözüm Temizleme % 8 SDS ile temizlenir. PsPACT (işlem-ayrı PAKTI) % 4 AA çözüm ve % 0.25 VA-044 başlatıcı çözüm ayrı tedavi süreçleri doku hidrojel oluşumu için kullanır; Bu koşullar bu orijinal anlaşma protokolü farklı. MPACT (değiştirilmiş PAKTI) ek % 0.5 α-thioglycerol çözüm psPACT Protokolü'nün temizlenmesi % 8 SDS ekler. Üç tüm iletişim kuralları için sağlam doku, inkübe > = 37 ° C titreyen bir kuluçka elde maksimal izni ISS kadar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: optik fare tüm merkezi sinir sistemi (MSS) pasif doku takas tarafından saydamlığını. (A) PAKTI tabanlı yöntemleri ile zaman içinde temizleyerek tüm CNS doku Schematization. (B) karşılaştırma üç pasif Temizleme iletişim kuralları (orijinal PAKTI, psPACT, mPACT) 14 gün sonra işleme, fare tüm CNS. (C) optik geçiş izni mPACT 14 gün içinde işleme için tabi fare beyin. Bu rakam Woo vd. 2016¹⁰değiştirildi. 3 mm boyunda 2 c harflerdir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: optik şeffaflık sıçan bütün CNS doku post-psPACT ve mPACT. (A) yetişkin fare tüm CNS doku elde psPACT ile maksimal optik Gümrükleme 30 gün sonra. (B) yetişkin fare tüm CNS doku 20 gün sonra mPACT ile maksimal optik izni elde. Önce ve sonra diyagramları bütün CNS boyutunu işlemden, önce ve sonra göz tarafından ölçülen gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: kesitli yetişkin sıçan beyin mPACT işleme ve microvasculature görselleştirme. (A) 4-mm kalın yetişkin sıçan beyin karşılaştırılması bölümleri 3 ve 5 gün işleme mPACT sonra. (B) 3D projeksiyon ile anti-CD31 antikor psPACT işlendikten sonra görüntülenir yetişkin sıçan beyin damar kalıplarının. Ölçek çubukları, 1.500 µm ve 100 µm. Bu rakam Woo vd. 2016¹⁰değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5: mPACT işleme kemirgen organlar ve tüm fare embriyolar. mPACT, sırasıyla 19 ve 23 gün içinde yetişkin fare (A) dalak ve (B) böbrek optik şeffaflık elde etti. (C) mPACT şeffaf E10.5 ve E13.5 fare embriyo 3 gün sonra üretilen. Sonra mPACT ile takas microvasculature anti-CD31 fare embriyo kuyruk bölgesinde ile görselleştirme (D) . (E) 3D projeksiyon damarlara sıçan Kauda at ve (F) fare dalak ile anti-CD31, sonrasında işleme yolu ile mPACT. Bu rakam Woo vd. 2016¹⁰değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Pasif, elektroforetik sigara ekstraksiyon yöntemleri istihdam ederken PAKTI önceki doku NETLİK^2,3,4,7 gibi yöntemleri temizlenmesi ile elde tutarlılık önemli ölçüde geliştirilmiş ^{, 8}, teknik hala birkaç eksiklikler, maksimal doku netlik¹²ulaşmak için gereken süreyi en önemli biri olduğunu taşımaktadır. Mevcut çalışmada, biz önemli ölçüde doku hala doku bütünlüğü ve yapısı^6,10koruyarak temizlemek için gereken süreyi azaltmak değiştirilmiş PAKTI protokolleri mevcut. Ayrıca, ilk kez, biz uygulama protokolleri bütün CNS doku ve bir üst düzey kemirgen model, sıçan¹⁰takas doku göstermek.

Özellikle, psPACT örnek işleme %4 Akrilamid ve % 0.25 içerir VA-044 hidrojel oluşumu sırasında iki ayrı adımda mPACT daha da psPACT inşa ve çözüm % 0.5 α-thioglycerol¹⁰ile takas % 8 SDS ilave süre. Akrilamid ve sonraki VA-044 adım ayıran son doku bütünlüğü şeffaflık PAKTI ile elde sonra olumsuz etkileyebilir doku çevreleyen unpolymerized hidrojel monomerleri kalan kaldırmak için engeller; Ayrıca, bu Maksimum optik temizleme üretmek için gereken süreyi önemli ölçüde azaltır. α-thioglycerol daha da mPACT yöntemindeki ilavesi açıklığa hızlandırır işlemek¹³, α-thioglycerol orijinal anlaşma yönteminde sadece reaktifler kullanarak daha az erişilebilir doku bölgelerinde temizlemek yardımcı olur un esmerleşme bir ajan olduğu gibi ^{7 , 8 , 9}.

ANLAŞMA, psPACT ve mPACT kemirgen doku üzerinde karşılaştırma psPACT orijinal anlaşma protokolü göre optik saydamlığı artırır iken, mPACT en iyi şekilde Temizleme ve her iki bütünün sonraki yüksek çözünürlükte görüntüleme için izin verdiğini gösterdi memeli organ ve kesitli dilimler olarak Şekil 2, şekil 3, şekil 4' te gösterilmiştir. Şeffaflık, verimlilik ve doku istikrar diğer iki Temizleme yöntemleri ile karşılaştırıldığında farklılıkları mPACT ispat yöntemi anahtarı işlenmiş organlarda α-thioglycerol tabanlı lipid fiyasko. Bu işlenmiş organlar, kan damarlara Morfoloji, ayirt ve confocal mikroskobu (şekil 5 dE) ile ilgili olarak özellikle hızlı 3D analiz için izin verdi.

α-thioglycerol takas SDS tabanlı çözüm için ek optik şeffaflık hızlandırılması için kritik olmakla birlikte, bu da biraz doku kırılganlık artar ve daha sonrası işleme hasar bölgelerine duyarlı yapar. MPACT verimlilik açısından açık üstünlüğü bu sınırlama daha ağır basar; Yine de, iş şu anda maksimal takas ile elde edilebilir emin olmak için yapılıyor hiçbir masraftan doku bütünlüğü için en az.

Böylece, bizim sonuçlar bir 3D analiz dahil ancak bunlarla sınırlı nöronal ağlara, kan damarlara ve doku matris mimari memeli organlarının fonksiyonel ve anatomik özellikleri sağlamak için güçlü bir araştırmacı araç olarak mPACT kurmak. İleride, biz mPACT gibi doku yaralanması, gelişimsel malformasyonlar, kanser ve nörodejeneratif hastalığın patofizyolojisi katkıda üst düzey biyolojik mekanizmaları soruşturma özellikle yararlı olabileceğine inanıyor hastalık^14,15,16,17. İnce hücresel mekanizmaları hastalık içinde yer alan bir çalışma ile birlikte, mPACT daha kapsamlı bir çoklu ölçek ne kadar çeşitli farklı hastalığın ortaya çıkmasına neden gözlenen fenotip için mekanizmaları etkileşim anlama sağlamak potansiyeline sahiptir.

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu eser Tıp bilimi, Yonsei Üniversitesi beyin Kore 21 artı proje tarafından desteklenmiştir. Buna ek olarak, bu eser Ulusal Araştırma Vakfı Kore (NMK-2017R1D1A1B03030315) bir hibe tarafından desteklenmiştir.