Vivo Sirkadiyen saat gen ekspresyonu floresans gazetecilere kullanarak fare Suprachiasmatic çekirdeği olarak izlenmesi

Bu yeni geliştirilmiş floresans tabanlı teknoloji uzun vadeli, suprachiasmatic çekirdeği (SCN) sirkadiyen saat genlerde transkripsiyonu gerçek zamanlı olarak ve yüksek zamansal çözünürlükte fareler serbestçe hareket izleme sağlar.

Bu teknik aracılı fiber optik floresans kayıtları rekombinant adeno ilişkili virüs dayalı gen gazetecilere kesin teslim ile birleştirir. Bu yeni ve kullanımı kolay vivo içinde floresans izleme sistemi saat gene, Cry1, transkripsiyon ritmine fareler serbestçe hareket suprachiasmatic çekirdeğinde (SCN) kaydetmek için geliştirilmiştir. Bunu yapmak için bir Cry1 transkripsiyon floresans muhabir tasarlanmış ve Adeno ilişkili virüs paketlenmiş. Arıtılmış, konsantre virüs SCN (sahne) o zaman beynin yüzeyine tespit edildi bir optik kablo, ekleme ve ardından fare içine enjekte ettiler. Hayvanlar için ev onların kafes döndü ve bir 1 ay ameliyat sonrası iyileşme döneminde yeterli muhabir ifade emin olmak izin. Floresan sonra serbestçe fareler bir vivo içinde bizim kurum olarak inşa edilmiş sistem izleme yoluyla hareket kaydedildi. Kayıt sistemi içinde vivo için 488 nm lazer ile bir 1 × 4 ışın-kırık ışık eşit güç dört lazer uyarma çıkışları bölünmüş birleştiğinde. Bu kurulum bize aynı anda dört hayvanlardan kaydetmek etkin. Her biri verilmiş floresan sinyallerini bir photomultiplier tüp ve bir veri alma kartı toplanmıştır. Buna ek olarak önceki bioluminescence vivo içinde sirkadiyen saat kayıt tekniği için kayıt sistemi bu floresans in vivo sirkadiyen saat gen ekspresyonu ışık döngüsü sırasında kayıt izin.

Memelilerde, bütün vücudun sirkadiyen ritim eksojen çevresel değişiklikler (Örneğin, ışık, sıcaklık, stres, vb)¹bir kişinin yanıt koordine etmek suprachiasmatic çekirdeği (SCN) yönetir. Çekirdek saat bileşenleri Per1-3, Cry1-2, saatve Bmal1oluşur ve her hücrenin sirkadiyen saat düzenleyen merkezi bir rol oynamaktadır. Transkripsiyon harekete geçirmek, saat/BMAL1, başına ifade ikna etmek için heterodimerdir davranan SCN her hücrede ve CRY. PER / CRY karmaşık sonra 24 saat tam^2,3' e alır bir transkripsiyon çeviri geri besleme döngüsü oluşturmak için saat/BMAL1 işlevini engeller.

SCN önceki çalışmaları esas olarak ex vivo SCN dilim kültür Yöntem^4,5,6 istihdam ve bu yaklaşım değerli bilgileri sağlamış olması iken, kendi sınırlamaları yeteneğimizi inhibe eksojen uyaranlara (Örneğin, ışık) etkisi kritik bu bölgede ikamet eden hücrelerin yanı sıra diğer beyin çekirdekleri SCN üzerinde etkisi ile ilgili verileri alır. 2001 yılında Hitoshi Okamura'nın grup içinde vivo monitör sirkadiyen saat gen ekspresyonu bioluminescence sisteme serbestçe fare⁷hareketli SCN (sahne) kullanmak için ilkti. Ken-Ichi Honma'nın grup daha fazla kayıt sistemi SCN (sahne)⁸'^,9,10bioluminescence vivo içinde gelişmekte olan son birkaç yıl harcadı. Birlikte, bu çalışmalarda araştırmacılar ile sirkadiyen saat sürekli karanlık veya ışık nabız sonra izleme olanağı sağladı. Ancak, bioluminescence sürekli açık/koyu döngüsü sırasında ışık sirkadiyen saat¹¹, SCN-aracılı sürüklenme için gerekli baskın sinyal olması ile birleştiğinde izlenmesi için izin vermek için çok karanlık olduğu için yoktur bioluminescence kayıt ile ilgili sınırlamalar üstesinden deneysel Yöntem geliştirme için artan talebi. Geçerli raporu fareler serbestçe hareket SCN vivo içinde sirkadiyen saat izlemek için inşa edilmiş bir floresan tabanlı sistem açıklar. Bu kullanımı kolay yöntem sürekli açık/koyu döngüsü sırasında izleme izin verir ve gerçek zamanlı olarak ve yüksek zamansal çözünürlükte SCN sirkadiyen saat genlerin transkripsiyon uzun vadeli gözlenmesi için izin verir.

Bu iletişim kuralı tüm prosedürleri ile onayı kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Ulusal Biyolojik Bilimler Enstitüsü, Pekin, Çin'in devlet düzenlemelerine uygun olarak yapılmıştır.

1. Cry1 floresan muhabir inşaatı

Not: önceki sirkadiyen çalışmalarda bioluminescence sistem^2,12kullanarak^,13 ritmik dLuc ifade ikna etmek için sirkadiyen bir organizatörü bir hale luciferase (dLuc) ile sigorta. Bir floresan muhabir geliştirmek için bozulma luciferase ritmik dVenus ifade ikna etmek için istikrarsızlığın floresans protein ile (dVenus) değiştirildi. P (Cry1) nesil-dVenüs muhabir aşağıda açıklanmıştır, hangi yapı şu anda Addgene için teslim ediliyor ve yakında akademik kullanıma açık olacak.

1. İşlevsel fare Cry1 organizatörü (+328 Cry1 gen, transkripsiyon başlangıç sitesi ''-'' 1 belirlenmiş-1208 bp bölgesine) yükseltmek. PCR enzim (KOD Plus Neo) kullanın, astar F1 ve R1 (bkz. Tablo 2), fare genom Cry1 organizatörü DNA parçası yükseltmek için bir şablon ve üreticinin PCR protokolü gibi.
2. İntron 336 Cry1¹⁴sirkadiyen saat fonksiyonu için önemli olan Cry1 gen yükseltmek. PCR enzim astar F2 ve R2, fare genom bir şablon ve intron 336 DNA parçası yükseltmek için üreticinin PCR protokolü olarak kullanın.
3. Venüsyükseltmek. PCR enzim astar F3 ve R3, pVENUS-N1 plazmid bir şablon ve Venüs DNA parçası yükseltmek için üreticinin PCR protokolü olarak kullanın.
4. NLS-D2 DNA parçası yükseltmek. PCR enzim astar F4 ve R4, pcDNA3.3-d2eGFP plazmid NLS-D2 DNA parçası yükseltmek için üreticinin PCR Protokolü ve bir şablon olarak kullanın.
5. DNA parçası 1 exon 1 sentez.
6. DNA parçası 2 intron 336 ve Venüs DNA parçası arasındaki bağlayıcı olarak sentez.
7. PAAV-EF1a-çift floxed-hChR2 (H134R) kesme - mCherry - WPRE-HGHpA vektör plazmid MluI ve EcoRI enzimleri ile. Jel ekstraksiyon kiti daha büyük DNA parçası arındırmak için kullanın. Üreticinin iletişim kuralını kullanırlar.
8. Gibson derleme mix ve onun standart protokolü kullanarak, birlikte pAAV-P (Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA muhabir üretmek için DNA parçalarının hepsini topla. Üreticinin iletişim kuralını kullanırlar.

2. virüs Adeno ilişkili¹⁵ imalatı

1. Aşağıdaki plazmid DNA stokları hazırlamak: 31.25 µg, pRV1, pH21 31.25 µg, pFdelta6 125 µg ve pAAV-p (Cry1) - intron336 - 62.5 µg Venüs-NLS - D2-WPRE-HGHpA.
2. 293T hücre beş 15 cm yemekleri hazırlamak ve hücreleri % 90 birleşmesi olana kadar bekle.
3. Plazmid transfection reaktif protokol sonrası 297T hücrelere transfect. Her yemek için kullanın pRV1 6.25 µg, pH21, pFdelta6, 25 µg, pAAV-p (Cry1) 12.5 µg 6.25 µg-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA ve 120 µL transfection reaktif.
4. 72 h transfection sonra bir pipet silah kullanarak her plaka hücrelerden ayırmak; hücreleri iki 50 mL tüpler içine hasat.
5. Hücreleri 800 x g 10 dk de cips ve süpernatant atın. Hücreleri fosfat tamponlu tuz (PBS) 20 mL her tüpün içine yerleştirerek yıkayın; hücreleri 800 x g 10 dk de cips ve süpernatant atın.
6. Granül 150 mM NaCl ve 20 mM Tris çözüm, pH 8.0 resuspend; çözüm/tüp 25 mL kullanın. Taze hazırlanmış % 10 sodyum deoxycholate (içinde dH₂O) 1,25 mL her tüp için ekleyin. Benzonase nükleaz mL başına 50 adet son bir konsantrasyon ekleyin ve iyice karıştırın. 1s için 37 ° C'de kuluçkaya.
7. Hücresel enkaz 3000 x g 15dk için de centrifuging tarafından kaldırın. Daha fazla tüm enkaz 0,45 mikron şırınga filtreden karışımı iterek kaldırıldığından emin olmak; Bu adımı heparin sütunlarının engelleme engellemeye yardımcı olur.
8. Peristaltik pompa kullanarak heparin sütunlarını ayarlama; 1 mL/dk, yok hava kabarcıkları sütunlara tanıtıldı sağlanması için akış hızı ayarlayın.
9. Bir 150 mM NaCl, 20 mM Tris çözüm, pH 8,0 10 mL içeren sütunlar equilibrate. Her sütun için virüs içeren çözüm ekleyin. Bir 100 mm NaCl, 20 mM Tris çözüm, pH 8.0 20 mL sütunlarla yıkayın. Sonra 5 mL şırınga kullanarak, ardından 1 mL 300 mm NaCl ve 20 mM Tris çözüm, pH 8.0 sütunlar 1 mL 200 mm NaCl ve 20 mM Tris çözüm pH 8.0, ile yıkayın.
10. 450 mM NaCl, 20 mM Tris çözüm, faz 8.0, 4 mL tarafından takip 3 mL 400 mM NaCl, 20 mM Tris çözüm, faz 8.0, virüs elute için bir 5 mL şırınga kullanın ve son olarak 3 mL 500 mm NaCl tarafından , 20 mM Tris çözüm, faz 8.0. Ayıklanan malzemeleri toplamak.
11. Rekombinant adeno ilişkili virüs (rAAV) konsantrasyon için çıkarılan malzemeler, bir anda 4 mL santrifüj filtre cihazları 100.000 moleküler ağırlığı kesme yüklemek. Her 4-mL örnek akış yoluyla atarak oda sıcaklığında 5 min için 2000 x g, santrifüj kapasitesi.
12. Tüm çıkarılan malzemeler santrifüj filtre cihazları çalıştırdığınız zaman PBS 4 mL ekleyin ve karışımı yaklaşık 250 μL santrifüj kapasitesi. RAAVs Kaldır (viral titresi-meli var olmak hakkında 2-8 x 10¹² viral parçacıkların mL başına) santrifüj filtre cihazları, aliquot ve-80 ° C kadar kullanım mağazasında. Bu aşamada, virüs için birkaç ay depolanabilir.

3. rAAV enjeksiyon ve yetişkin fare SCN (sahne) içine Optik Fiber ekleme

1. Sirkadiyen floresans muhabir taşıyan rAAVs enjeksiyon SCN içine
   1. 5 µL rAAV yük (virüs titresi ilgili 2-8 x 10¹² virüs parçacıkları mL başına) mikro şırınga içine.
   2. Bir yetişkin fare (2 için 5-aylık, C57BL/6 arka plan) tedavisiydi (80 mg/kg) ile mayi enjeksiyon yolu ile anestezi. Yeterli bir ayak parmağı-çimdik yanıt eksikliği ile anestezi derinliği için kontrol edin.
   3. Kürk fare başından kaldırın ve sonra fareyi stereotaksik aparatı monte için makas kullanın. Yolu ile dolaşan sıcak su battaniye ya da başka bir ısıtma cihazı imzalat hayvanlar için bir ısı kaynağı sağlar.
      Not: Alternatif olarak, kürk kaldırmak için depilatory krem veya elektrikli saç kesme makineleri kullanın.
   4. Cerrahi sitesi uygun dezenfeksiyon ajanlar ile temizleyin. Örneğin, bu arasında steril su ya da alkol ve iyot, betadin veya klorheksidin scrubs alternatif olarak sulandırmak. En az 3 kere tekrar edin. Cerrahi sitesi asmak.
   5. Bir kesik kafa derisi içinde yapmak ve kafatası maruz makas kullanın.
   6. Bregma ve lambda aynı yatay düzlemde çoğu stereotaksik aparatı ayarlayın; bregma iki sathını aynı yatay düzlemde olun.
   7. Kullanım bir steril pamuklu çubukla H₂O2/h₂O beyin kapaklarini zarar için %4 oranında batırılmış. O zaman bir temiz, steril pamuklu çubukla temizleyin ve kafatası yüzeyini kuru için kullanın.
   8. Mikro bir matkap kullanarak, bir delik yaklaşık 1 mm çap 0,46 mm arka ve 0,25 mm bregma için yanal olun.
   9. _Fi Temiz pamuk steril bez fizyolojik serum çözüm ile kemik parçaları beynin maruz yüzeyinden temizlemek için kullanın.
   10. Beyin, mikro şırınga ucu 0,46 mm arka olduğunu kontrol ettikten ve kafatası yüzeyinden 0,25 mm lateral bregma ve 5.7 mm derin bir mikro şırınga takın.
   11. 500 enjekte rAAV (50 nL min^-1) mikro şırınga rAAV tam difüzyon sağlamak için enjeksiyon sonra 10 dk için yerinde bırakarak SCN (sahne), içine nL.
   12. Yavaş yavaş mikro şırınga geri alıyorum.
2. Fiber optik sahne alanı'na ekleyin.
   1. Bir fiber optik bıçak kullanarak, bir lif 17 mm uzunluğu, optik fiber her iki tarafında düzgün olduğundan emin kesti.
   2. Optik lif seramik yüksük yerleştirin ve fiber optik ve seramik hakla yüzeylerin floş sağlama optik fiber ile metil etil keton peroksit (AB tutkal), seramik hakla için düzeltin.
   3. Soğuk sterilant çözüm veya etilen oksit varlığımla temiz.
   4. Sonra rAAV enjeksiyon (adım 3.1.11), seramik hakla içeren optik fiber SCN (sahne) yerleştirin.
   5. Seramik hakla ve diş reçine kullanarak kafatası üzerine fiber optik düzeltmek ve kurumasını sağlar.
   6. Diş reçine yüzey ile arka oje sürün. 3.1.2 için 3.2.5, rAAV denetimi için gerçek enjeksiyon atlama özetlenen yordamları yineleyin.
3. Ameliyat sonrası bakım
   1. Fareler gibi buprenorfin 2 mg/kg vücut ağırlığı, ameliyat sonrası ağrı kesici sağlamak subkutan, günde iki kez.
   2. Anesteziden geliyorlar iken fare kurtarma kafese koyun.
   3. Tek tek bir koşulda 12 h açık/koyu (ışık şiddeti ~ 100 lux kafesin dibinde) gıda/su kullanılabilir ad libitumile ev fareler. Sekiz gün daha fazla deneme önce yeterli kurtarma süresi için izin vermek ve en uygun floresan muhabir ifade sağlamak için ayrılan.

4. in vivo floresans sinyal izleme ve veri toplama

1. Sekiz gün ameliyat sonra bağlanmak fare kafasına fiber floresans sinyal kayıt memurlar ile (Örn., Gene Observer). Arka plan sinyal kurmak için denetim fareler SCN floresans sinyal kontrol edin. Gözlem ve floresan sinyal İzleyicisi'ni kullanarak bu sinyal ölçümü yapmak.
2. Deneysel fare floresans sinyalinin kontrol fare aynı operasyonu ile değerlendirin. Bu büyük olasılıkla belgili tanımlık uç optik fiber SCN kaçırdı gösterir gibi olan viral vektör alınan ama hangi yalnızca arka plan sinyal analizi, görüntüler fare hariç. Bu ilk önlemleri sonra fareler floresans sinyal stabilize etmek için izin vermek başka bir 2 hafta için ev onların kafes dönün.
3. 3 hafta sonra farelerin floresans sinyal kayıt memurlar ile bağlayın. 15 floresans ölçmek s 100 Hz frekansta her 10 min. Bu ölçümler sırasında fareler yiyecek/su kullanılabilir ad libitumile onların kafes içinde serbestçe hareket ediyor. Bir ışık şiddeti ~ 100 lux, kafesin altındaki kullanın ve bir uç arasında 15-20 µW optik fiber lazer güç.
4. Tüm kayıtları tamamlanmasından sonra fare ile % 4 paraformaldehyde, sıvı ve kaldırmak ve optik fiber yerleşimini kontrol etmek için beyin dilim. Optik fiber uç doğru SCN implante değil Eğer fareler çözümleme dışı bırakmak.

5. veri analizi ve sunum

1. Ölçü floresans sinyal her 10 min 15 s, 100 Hz 1500 veri noktaları verim, bir frekansta. Bu 1500 puan ortalama floresans sinyal vasıl birisi tutkucun zaman nokta çevirir. Zaman içinde birden çok ortalamalar komplo Cry1 transkripsiyon ritmi altında serbestçe fare hareket eden bir denetim ışık koşulunda SCN (sahne) karşılık gelen bir sinyal zaman eğrisi oluşturur.

Floresans muhabir tasarımı Cry1 Şekil 1Agösterisinde idi. Yaklaşımı kullanarak ayrıntılı 500 yukarıda, nL rAAV-p (Cry1) - intron336 - Venüs-NLS-D2 başarıyla bir yetişkin fare SCN enjekte ettiler ve sağlam Venüs ifade (Şekil 1B, 1 C) sergilenmektedir. Floresan sinyallerini 12 h/12 h açık/koyu (LD) ve karanlık/koyu (DD) koşulları (Şekil 2) altında kaydedilen koşulların her ikisi de sağlam sirkadiyen ritim vermiştir. Son olarak, floresans sinyal uzun ve kısa photoperiod koşulları (Şekil 3) kaydedildi.

Şekil 1. Floresans muhabir tasarım ve SCN ifade
(A) Cry1floresan muhabir tasarımı. (B) Photomicrograph 8 gün sonra virüs enjeksiyon muhabir ifade gösterilen fare beyin. (B) gösterilen photomicrograph üzerinde kırmızı kutulu alanının (C) büyütme. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2. SCN LD ve DD koşullar altında kayıt floresans in vivo
(A)arka plan floresans tespit hiçbir ritmi LD ve DD koşullar altında gösterilen SCN (sahne) içinde. Beyaz ve gri alanlar ışık açma ve ışık kapatma dönemleri, sırasıyla gösterilir. (B) P (Cry1) - intron336 - Venüs-NLS-D2 ifade 7 gün 12-12 LD koşuldaki ve DD koşuldaki 7 gün boyunca. (C) analiz sirkadiyen ritim LD koşulu (~24.4 h); kırmızı çizgi (uygun sonucu sol bölmede gösterilir) sinüs eğrisi yaklaştırılmış uyum gösterir. (D) analiz sirkadiyen ritim DD koşulu (~23.25 h); kırmızı çizgi (uygun sonucu sol bölmede gösterilir) sinüs eğrisi yaklaştırılmış uyum gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3. Vivo floresans kayıtları SCN altında 20-4 uzun ve 4-20 kısa photoperiod koşulları
P (Cry1) - intron336 - floresan kaydı örneği Venus-NLS-D2 ifade SCN (sahne) bir 12-12 LD koşul altında 7 gün içinde bir koşulda 20-4 uzun photoperiod, 12-12 LD koşul altında 3 gün bir DD koşulda 3 gün 7 gün tarafından takip ve sonra 7 gün 4-20 kısa photoperiod koşul altında. Beyaz ve gri alanlar ışık açma ve ışık kapatma dönemleri, sırasıyla gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 1. Belirli reaktifler protokolü için gerekli ( Tablo malzemelerigörmek)

Tablo 2. İletişim kuralında kullanılan astar

Tablo 3. DNA dizisi iletişim kuralında kullanılan bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Dilim kültür^4,5, RT-PCR¹⁶ve in situ hibridizasyon¹⁷, hayvanların öldürülmesi gerektiren gibi ex vivo Yöntemler aksine kayıt yöntemi içinde vivo sağlar Müfettişler sirkadiyen gen ekspresyonu yaşayan hayvan çalışmaya. Bu nedenle, bu teknoloji farklı fiziksel tedirginlikler (Örneğin, uykusuzluk, stres, gıda alımı, vb) sinir sirkadiyen saat üzerinde etkisini değerlendirmek için yeteneği sağlar. Vivo bioluminescence^7,8,sadece sürekli karanlık koşullarda çalışabilir¹⁰ yöntemi aksine kayıt yöntemi floresans in vivo ışık altında uygulanabilir koşullar-a önemli avantajı teknoloji ışık olarak yeniden sürüklenme SCN sirkadiyen saat¹⁸sinyalleri. Nispeten sabit, sağlam sirkadiyen ritim bu yöntemi ile tespit edilebilir olsa da, o muhabir teknoloji nicel bilgi sağlamaz ve bu nedenle Gen transkripsiyonu düzeylerini ölçmek için kullanılabilir değil belirtilmelidir ve çeviri.

Bu protokol birçok kritik adımlar vardır. Konsantre rAAV titresi 2-8 x 10¹² viral parçacıkların mL başına olarak yüksek olmalıdır; daha düşük viral titreleri loş veya bile belirlenemeyen floresan sinyallerini verirdim. Ne zaman fare Başkanı stereotaksik aparatı fixing, kafatası için güvenli doğru konumlandırma virüs enjeksiyon ve fiber optik implantasyon için yatay olduğundan emin olun. Enjeksiyon virüs yavaş yavaş yapılmalıdır (virüs SCN içinde kalmasını sağlamak için ≤50 nL min^-1). Seramik hakla ve fiber optik kafatasında güvenli bir şekilde sabit olmalıdır ve diş reçine cilt ile değil. Seramik hakla ve fiber optik yeterince sabit değildir, onlar yavaş yavaş fare başından ayırmak.

Bu teknik diğer gen gazeteciler dahil etmek için uzatılabilir (Örneğin, Per2, Bmal1, c-Fos, Pomc, vb) düzenleyici ve karşılık gelen intron¹⁹değiştirerek. İki ters lox serileri ile bayrak-inton336-Venüs-NLS-D2 kaset geri ve muhabir Cre fare çizgi ile birleştirerek, bu teknoloji belirli nöronların etkinliklerini kaydetmek için kullanılabilir. Örneğin, bu yaklaşım bir VIP-cre fare çizgiyle birleştiren Cry1 transkripsiyon ritimler vazoaktif intestinal polipeptid ifade nöronların SCN kaydı için sağlayacak. Bu yöntem aynı zamanda Ca^{2 +} sirkadiyen ritim beyin ve kaydetmek için bir Ca^{2 +} göstergesi olarak GCaMP6 istihdam edebilirsiniz.

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Teknik yardım sağlamak için uyarıcı tartışmalar ve Üyeler Zhan laboratuarında sağlamak için Zhang laboratuarında üye teşekkür. Bu araştırma hibe NSFC, Çin ' in M.O.S.T. üzerinden 973 programının (için E.E.Z. ve C.Z.) 2012CB837700 31500860 (C.Z. için) ve Pekin Belediye hükümetten fon tarafından desteklenmiştir. E.E.Z. Çinliler "İşe alım programı küresel gençlik uzmanlar" tarafından desteklendi.