生体内で蛍光レポーターを使用してマウス視交叉上核における時計遺伝子発現のモニタリング

この新しく開発された蛍光ベースの技術は、リアルタイムで、高時間分解能でマウスを自由に移動を視交叉上核 (SCN) における概日時計遺伝子の転写の長期監視できます。

この手法では、遺伝子組換えアデノ随伴ウイルスを用いた遺伝子レポーターの正確な配信を介した光ファイバー蛍光録音を組み合わせたものです。自由行動マウスの視交叉上核 (SCN) のCry1、時計遺伝子の転写リズムを記録するこの新しい使いやすい体内蛍光監視システムが開発されました。これを行うには、 Cry1転写蛍光レポーターはように設計されアデノ随伴ウイルスにパッケージ化します。精製、濃縮されたウイルスは、マウスの脳の表面に固定し、光ファイバーの挿入に続いて SCN に注入されました。動物は彼らの家のケージに返され、記者表現を確保するため 1 月手術後の回復期間を許可しました。蛍光生体内で私たちの機関で構築されたシステムの監視を介してマウスを自由に移動で、記録されました。生体内で記録システム、488 nm のレーザー光を分割と同等の力の 4 つのレーザー励起出力 1 × 4 のビーム ・ スプリッターと結合されていました。このセットアップでは、同時に 4 匹の動物から記録することができました。放出される蛍光信号の各は、光電子増倍管とデータ集録カード経由で集められました。対照的に概日時計記録技術体内前生物発光にこの蛍光体内の記録システムにライト サイクルにおける概日時計遺伝子の発現の録音を許可します。

哺乳類の視交叉上核 (SCN) は外因性の環境の変化(例えば光、温度、圧力等)¹の個々 の応答を調整するための全身の概日リズムを支配します。時計のコア コンポーネントは、 Per1 3 Cry1 2、クロック、およびBmal1から成り、各セルの体内時計の調節に中心的な役割を果たします。SCN の各セルに転写活性化因子、時計/BMAL1 は、あたりの発現を誘導するヘテロダイマーとして機能が含まれていますと泣く。1 件/泣くコンプレックスは、時計/BMAL1 約 24 時間は、完全な^2,3転写翻訳フィード バック ループを形成するための機能を阻害します。

SCN に関する先行研究は主に前のヴィヴォSCN スライス培養法^4,5,6を採用しているし、このアプローチは、貴重な情報を提供して、一方その限界抑制する当社の能力この重要な地域に存在する細胞に及ぼす外因性刺激 (例えば、光) と同様に、SCN に他の脳の核の影響に関するデータを取得します。2001 年岡村仁グループ自由行動マウス⁷SCN のモニター時計遺伝子体内に発光システムを使用する第 1 だった。本間健一のグループは、生物発光、生体内でSCN^8,9,10の記録システム開発さらに過去数年間を費やしてきた。一緒に、これらの研究は、暗黒や光パルスの後、概日時計を監視する能力を持つ研究者を提供しています。ただし、発光は光が体内時計¹¹SCN を介した同調に必要な支配的な信号であるという事実と相まってダーク/ライト サイクル中に継続的な監視を可能にするのには暗すぎるためには生物発光の記録に関連付けられている制限を克服する実験法の開発のための需要が増加しています。現在のレポートでは、SCN は、生体内で自由行動マウスの体内時計を監視するため建設された蛍光ベースのシステムについて説明します。この簡単に使用できるメソッドは明暗サイクル中に継続的な監視が可能でき、高時間分解能のリアルタイムでの SCN における概日時計遺伝子の転写の長期観察のため。

このプロトコルのすべてのプロシージャは、中国の政府規制に従い機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、国立研究所の生物学、北京の承認を得て行った。

1. Cry1蛍光レポーターの建設

メモ: 発光システム^2,12を使用して以前の概日リズム研究^,13ヒューズ リズミカルなdLuc式を誘導するために不安定化ルシフェラーゼ(dLuc) と概プロモーター。蛍光レポーターを開発し、不安定化ルシフェラーゼは、リズミカルなdVenus式を誘導するために不安定化蛍光タンパク質 (dVenus) に置き換えられました。P (Cry1) の生成-d の金星記者には以下、構築する Addgene に現在提出されている学術の使用のためにすぐに利用できるでしょう。

1. 機能マウスCry1プロモーター (+328-1208 bp 地域Cry1遺伝子転写開始サイト '-1 ' として指定されたに) を増幅します。PCR 酵素 (KOD プラス Neo) を使用して、F1 と R1 のプライマー (表 2を参照)、マウスのゲノムのテンプレートおよび製造元の PCR プロトコルCry1プロモーター DNA のフラグメントを増幅します。
2. 336 Cry1¹⁴の概日時計機能にとって重要であるCry1遺伝子のイントロンを増幅します。F2 と R2 では、テンプレートとイントロン 336 DNA のフラグメントを増幅する PCR のプロトコルをメーカーのマウスのゲノムのプライマー PCR 酵素を使用します。
3. 金星を増幅します。F3 と R3、pVENUS N1 プラスミド テンプレートと金星の DNA のフラグメントを増幅する PCR のプロトコルをメーカーのプライマー PCR 酵素を使用します。
4. NLS D2 DNA のフラグメントを増幅します。F4 と R4、pcDNA3.3 d2eGFP プラスミド テンプレートと NLS D2 DNA のフラグメントを増幅する PCR のプロトコルをメーカーのプライマー PCR 酵素を使用します。
5. エクソン 1 として 1 の DNA のフラグメントを合成します。
6. イントロン 336 と金星DNA フラグメント リンカーとして DNA のフラグメント 2 を合成します。
7. PAAV-EF1a-ダブル floxed-hChR2 (H134R) をカット - mCherry - WPRE-HGHpA ベクトル プラスミド酵素 EcoRI と MluI を。大きい DNA のフラグメントを浄化するためにゲルの抽出キットを使用します。製造元のプロトコルを使用します。
8. ギブソン アセンブリ ミックスとその標準的なプロトコルを使用して、一緒に pAAV P (Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA レポーターを生成する DNA 断片のすべてを組み立てます。製造元のプロトコルを使用します。

2. アデノ随伴ウイルス¹⁵の生産

1. 準備の次のプラスミド DNA 株式: pRV1 の 31.25 μ g、pH21 の 31.25 μ g、pFdelta6、125 μ g、62.5 μ g (Cry1) - intron336 - pAAV-P の金星-NLS-D2 WPRE HGHpA。
2. 293 t 細胞の 5 の 15 cm の料理を準備し、セル 90% 合流になるまで待ちます。
3. トランスフェクション試薬のプロトコルに従う 297T 細胞へ、プラスミドを transfect します。各料理の使用 pRV1 の 6.25 μ g、pH21、pFdelta6 の 25 μ g、pAAV P (Cry1) の 12.5 μ g 6.25 μ g-トランスフェクション試薬の intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA、および 120 μ L。
4. トランスフェクション後、72 h デタッチ ピペット銃; を使用して各板からセル2 つの 50 mL チューブに細胞を収穫します。
5. 10 分間 800 x g で細胞のペレット、上澄みを廃棄します。各管にリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 20 mL を配置することによって、細胞を洗浄します。10 分間 800 x g で細胞のペレット、上澄みを廃棄します。
6. 150 mM の NaCl と 20 ミリメートル pH 8.0; トリス ソリューションでペレットを再懸濁しますソリューション/チューブ 25 mL を使用してください。各チューブに作りたて 10% デオキシ コール酸ナトリウム (dH₂O) での 1.25 mL を追加します。50 mL 単位の最終的な集中に benzonase ヌクレアーゼを加え、徹底的に混ぜます。37 ° C 1 時間インキュベートします。
7. 15 分間 3000 × g で遠心分離して細胞の残骸を削除します。さらに 0.45 μ m シリンジ フィルターを通して混合物を押すことによりすべての残骸を削除されていることを確認します。この手順は、ヘパリン列のブロッキング防止に役立ちます。
8. ペリスタ ポンプ; ヘパリン段組みを設定します。1 mL/分列に気泡が発生しないことを確認するには、フロー レートを設定します。
9. 150 mm NaCl、20 mM Tris ソリューション、pH 8.0 ml の 10 列を平衡します。各列にウイルスが含まれているソリューションを追加します。20 ml の 100 mM NaCl、20 mM Tris ソリューション、pH 8.0 の列を洗います。5 mL のシリンジを使用して、300 mM の NaCl の 1 mL と 20 mM Tris ソリューション、pH 8.0 その後 200 mM の NaCl の 1 mL と 20 mM トリス溶液 pH 8.0、列を洗います。
10. 溶出が 400 mM の NaCl、20 mM Tris ソリューション、pH 8.0、3 mL で 450 mm NaCl、20 mM Tris ソリューション、pH 8.0、4 mL に続いてウイルス 5 mL 注射器を使用、最終的に 500 mM の NaCl の 3 ml、20 mM Tris ソリューション、pH 8.0。抽出された材料を収集します。
11. 組換えアデノ随伴ウイルス (下さい rAAV) 濃度、100,000 分子量カットオフを持つ遠心フィルター ユニットに抽出された材料、一度に 4 mL を読み込みます。流れを破棄、室温で 5 分間 2000 x g で各 4 mL のサンプルを遠心します。
12. すべて抽出された材料は、遠心ろ過ユニットを介して実行されている、PBS の 4 つの mL を追加し、約 250 μ L に混合物を遠心分離機します。RAAVs を削除 (ウイルス力価についてする必要があります 2-8 × 10 mL あたり¹²ウイルス粒子) 遠心ろ過ユニット、因数および使用まで-80 ° C でストアから。この段階でウイルスを数ヶ月間保存できます。

3. 下さい rAAV 注入と光ファイバー挿入アダルト マウス SCN

1. SCN に概蛍光レポーターを運ぶ rAAVs の注入
   1. 下さい rAAV の 5 μ L を読み込む (ウイルス力価は約 1 mL あたり 10 の¹²ウイルス粒子 x 2 8) マイクロ シリンジに。
   2. ネンブタール (80 mg/kg) とアダルト マウス (2 に 5-ヶ月歳、C57BL/6 背景) を腹腔内注射で麻酔します。つま先ピンチ応答の欠如によって十分な麻酔深度を確認します。
   3. はさみを使用して、マウスの頭から毛皮を外し、脳定位固定装置にマウスをマウントします。循環温水毛布または別の暖房装置を介して麻酔下の動物に熱源を提供します。
      注: また、毛皮を削除するのに脱毛クリームや電動バリカンを使用します。
   4. 適切な消毒剤で手術部位をきれいに。たとえばは、滅菌水またはアルコールとヨウ素、betadine、またはスクラブを交互にクロルヘキシジン希釈これできませんでした。少なくとも 3 回を繰り返します。手術部位をドレープします。
   5. はさみを使用して頭皮の切開をするし、頭蓋骨を公開します。
   6. 脳定位固定装置を調整前とラムダは、同じ水平面;同じ水平面の前の 2 つの対称的なポイントを作る。
   7. 4% に浸した滅菌綿棒の使用 H₂O₂/H₂O 脳骨膜を腐食します。頭蓋骨の表面を乾燥をオフにきれいな、滅菌綿棒を使用しています。
   8. マイクロ ドリルを使用して、横になる穴約 1 mm 0.46 mm 後部と 0.25 mm の直径の前に。
   9. _fi生理食塩液クリーンな滅菌綿棒を使用すると、脳の表面からの骨の破片をクリアします。
   10. マイクロ注射器の先端が 0.46 mm 後方に, 脳と頭蓋骨の表面から前と 5.7 mm 0.25 mm 外側マイクロ シリンジに挿入します。
   11. 500 を注入下さい rAAV の拡散を確実に注入後 10 分位でマイクロ シリンジを残して、SCN に下さい rAAV (50 nL min^-1) の nL。
   12. マイクロ シリンジをゆっくりと引き出します。
2. SCN エリアに光ファイバーを挿入します。
   1. 光ファイバーのナイフを使用して、光ファイバーの両側がスムーズであることを確認して作り、長さは繊維の 17 mm をカットします。
   2. セラミック フェルールに光ファイバーを挿入し、光ファイバーとセラミック フェルールの表面を確実にフラッシュ メチルエチルケトン過酸化 (AB 接着剤)、セラミック フェルールに光ファイバーを修正します。
   3. 冷滅菌ソリューションまたはエチレン酸化物繊維をきれい。
   4. 下さい rAAV 投与 (ステップ 3.1.11) SCN にセラミック フェルールを含む光ファイバーを挿入します。
   5. セラミック フェルールと歯科用レジンを使用して頭蓋骨に光ファイバーを修正し、乾燥することができます。
   6. バックのマニキュアで歯科用レジンの表面を汚れ。3.2.5 3.1.2 へ下さい rAAV 制御のための実際の注入を省略することで説明されている手順を繰り返します。
3. 手術後のケア
   1. 術後鎮痛剤、ブプレノルフィン 2 mg/kg 体重、皮下、マウスを提供する 1 日 2 回。
   2. 麻酔から出てくる中、回復ケージにマウスを配置します。
   3. ハウス食品/水使用可能な自由で 12 h 光/暗い条件 (ケージの下部に 〜 100 ルクス光強度) の下で個別にマウス。8 日は、さらに実験を可能にする十分な回復時間と最適な蛍光レポーターの発現を確認する前に割り当てられるべき。

4.生体内蛍光信号モニタリングとデータ収集

1. 術後後 8 日目は蛍光信号のモニターとマウスの頭に光ファイバーを接続 (e.g。、遺伝子オブザーバー)。バック グラウンド信号を確立するマウスの SCN の蛍光信号を確認してください。観察・蛍光信号モニターを使用してこの信号の計測を行います。
2. コントロール マウスの同じ操作の実験マウスの蛍光信号を評価します。これは可能性が高い光ファイバーの先端が SCN を欠場していることを示します、マウスではウイルスのベクトルを受け取っているが、これはのみの分析からバック グラウンド信号を表示を除外します。これらの最初の措置後、マウスを安定させるために蛍光信号を許可する別の 3 週間のホーム檻に戻ります。
3. 3 週間後に、蛍光信号のモニターとマウスを接続します。15 の蛍光を測定 s 周波数 100 Hz で、10 分毎。これらの測定中に、マウスは食品/水使用可能な自由と檻の中で自由に動いています。〜 100 ルクスのケージの下部に光強度を使用して、15-20 μ の光ファイバーの先端にレーザー パワー。
4. すべての録音完了後 4% パラホルムアルデヒドでマウスを灌流し削除し、光ファイバーの配置をチェックする脳をスライスします。光ファイバー先端が SCN は、正しく注入されていないいる場合、マウスを解析から除外します。

5. データ分析とプレゼンテーション

1. メジャー蛍光信号 15 10 分毎 1500 のデータ ポイントを生成するための 100 Hz の周波数で s。これらの 1500 ポイントの平均は、任意の特定の時点で蛍光信号に変換します。自由行動マウスの SCN は、制御光条件下でCry1の転写リズムに対応する信号-時間曲線を生成時間をかけて複数の平均をプロットします。

Cry1の蛍光レポーターの設計は、図 1 aのショーだった。上記、500 の詳細なアプローチを使用して下さい rAAV P - intron336-(Cry1) の nL 金星-NLS-D2 アダルト マウスの SCN に正常に注入された、堅牢な金星式 (図 1 b、1 C) を展示します。12/12 h ライト/ダーク (LD) と暗い/暗い (DD) 条件 (図 2) の下で記録された蛍光信号は、両方の条件で堅牢なリズムをもたらした。最後に、蛍光シグナルは、長くて短い日長条件 (図 3) で記録されました。

図 1。蛍光レポーターのデザインとその SCN の式
(A) Cry1の蛍光レポーター デザイン。(B) ウイルス注入後 8 日レポーター発現を示すマウスの脳の顕微鏡写真。(C) (B) に示すように顕微鏡写真の赤で箱入り領域の拡大します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2。蛍光体内LD と DD の条件の下で SCN の記録
(A) 背景の LD と DD の条件下で検出可能なリズムを示さない SCN で蛍光します。白と灰色の領域は、それぞれ点灯と消灯の期間を示しています。(B) P (Cry1) - intron336 - 金星-NLS-12 12 LD 状態で DD の状態で 7 日間 7 日間のコース上の D2 式。(C) LD 状態 (~24.4 h); で概日リズムの解析赤い線は、正弦曲線 (フィットの結果は左のパネルに表示されます) の嗜好に合うことを示します。(D) DD 条件 (~23.25 h); で概日リズムの解析赤い線は、正弦曲線 (フィットの結果は左のパネルに表示されます) の嗜好に合うことを示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3。下 SCN のin vivo蛍光録音 20 4 ロングと 4-20 短日条件
P - intron336-(Cry1) の蛍光記録の例金星-NLS-DD 条件は、12-12 LD 条件下で 3 日間 3 日間 20 4 長日条件下で 7 日間続いて 12 12 LD 条件下で 7 日間の SCN に D2 の式と4-20 の短日条件下で、7 日の間。白と灰色の領域は、それぞれ点灯と消灯期間を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

テーブル 1。プロトコルに必要な特定の試薬(材料の表を参照)

表 2。プロトコルで使用されるプライマー

表 3。プロトコルで使用される DNA シーケンスこのファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

前のヴィヴォメソッドでは、スライス文化^4、5RT-PCR 法¹⁶の in situハイブリダイゼーション¹⁷動物が殺されることを必要とするなどとは対照的体内法を記録できます。生きている動物の概日遺伝子発現を研究する研究者。そのため、この技術は、ニューラル サーカディアン ・ クロックについて別の物理的な摂 (例えば、睡眠不足、ストレス、食物摂取など) の効果を評価する能力を提供します。体内の発光^7,8,一定の暗い状態でのみ動作することができます¹⁰メソッドと対照をなして、蛍光体内記録方式は適用できます光の下で光技術の優位条件の信号 SCN 時計¹⁸の再飛散。記者技術が定量的情報を提供しません、したがって、遺伝子のトランスクリプションのレベルを測定するは使用しないでできる特筆すべきこの方法で、比較的一定した、堅牢な概日リズムを検出できますが、翻訳。

このプロトコルの多くの重要なステップがあります。集中して下さい rAAV 価は 2-8 x 10 mL あたり¹²ウイルス粒子として高くする必要があります。低いウイルス抗体価は、薄暗いかも検出できなかった蛍光信号を与えるでしょう。脳定位固定装置の上にマウスの頭を修正するとき、頭蓋骨がウイルス注入と光ファイバーの注入の安全で正確な位置決めに水平を確認します。ウイルスの注入はゆっくり行う必要があります (≤50 nL min^-1) SCN は、ウイルスがあることを確認します。セラミック フェルール、光ファイバーが安全に頭蓋骨に修正され、歯科用レジンが皮膚に接触していません。セラミック フェルール、光ファイバーは十分に固定されていない場合、彼らは徐々 にマウスの頭からデタッチします。

この手法は他の遺伝子レポーターを含むように拡張できます (例えば、 Per2、 Bmal1、 C-fos、 Pomc等) プロモーターと対応するイントロン¹⁹を変更。逆 lox の 2 つのシーケンスを持つフラグ inton336 金星 NLS D2 カセットを反転して Cre マウス ラインと記者を組み合わせることで、特定のニューロンの活動を記録するこの技術を使用することができます。たとえば、Vip cre マウス線とを組み合わせることにより、SCN は、血管作動性腸管ポリペプチド発現ニューロンにおけるCry1転写リズムの録音のためなります。このメソッドは、脳における Ca^{2 +}概日リズムを記録する Ca^{2 +}インジケーターとして GCaMP6 を利用できます。

著者はある利益相反を開示します。

私たちはテクニカル サポートを提供する刺激的な議論と占研究室のメンバーを提供するため張研究室のメンバーに感謝します。この研究は、NSFC は、中国の M.O.S.T. から 973 プログラムの (E.E.Z. および C.Z.) に 2012CB837700 の補助金 (C.Z.) に 31500860 によって、北京市政府から資金援助によってサポートされていました。E.E.Z. は、中国「の募集プログラムのグローバル青年専門家」によって支えられました。