Vivo에서 형광 기자를 사용 하 여 마우스 Suprachiasmatic 핵에서 Circadian 시계 유전자 발현의 모니터링

이 새로 개발된 된 형광 기반 기술을 통해 자유롭게 이동 하는 쥐 실시간 및 높은 시간 해상도 suprachiasmatic 핵 (SCN)에서 circadian 시계 유전자의 녹음 방송을의 장기 모니터링 됩니다.

이 기술을 기반으로 하는 재조합 형 adeno 관련 바이러스 유전자 기자 들의 정확한 납품 광섬유 중재 형광 녹음을 결합합니다. 이 새로운 및 사용 하기 쉬운 vivo에서 형광 모니터링 시스템 개발 되었다 자유롭게 마우스를 이동의 suprachiasmatic 핵 (SCN)에서 시계 유전자, Cry1의 transcriptional 리듬을 기록 하. 이렇게 하려면, Cry1 전사 형광 기자 설계와 Adeno 관련 바이러스로 포장. 정제, 집중 바이러스 SCN 광케이블은 두뇌의 표면에 고정 후 삽입 하 여 다음 마우스에 주입 했다. 동물 자신의 집 새를 반환 하 고 충분 한 기자 식 되도록 1 개월 수술 회복 기간을 허용 했다. 형광 다음 자유롭게는 vivo에서 우리의 기관에서 만들어진 시스템 모니터링을 통해 마우스를 이동에 기록 되었다. 대 한 vivo에서 녹화 시스템, 488 nm 레이저는 동등한 힘의 4 개의 레이저 구동 출력으로 빛을 분할 한 1 × 4 빔-스플리터와 결합 했다. 이 설치 프로그램 4 동물에서 동시에 레코드를 사용할 수 있습니다. 각 내보낸된 형광 신호 광 전 증폭 관 관 및 데이터 수집 카드 통해 수집 되었다. 반면 이전 생물 발광 vivo에서 circadian 시계 기록 기술,이 형광에서 vivo에서 녹화 시스템 허용 빛 주기 circadian 시계 유전자 발현의 기록.

포유류에서 suprachiasmatic 핵 (SCN) 외 인 환경 변화 (예를 들면, 빛, 온도, 스트레스, 등)¹개인의 응답을 조정 전체 신체의 circadian 리듬을 제어 합니다. 코어 클록 구성 요소 Per1-3, Cry1 2, Clock, Bmal1의 구성 하 고 각 셀의 circadian clock을 조절에 중추적인 역할. 각 셀은 SCN에 transcriptional 활성 제, 시계/BMAL1, 당의 표현을 유도에 heterodimer 역할 포함 및 외침. 당 / 울 복잡 한 다음 시계/BMAL1 완료^2,3약 24 h는 녹음 방송 번역 피드백 루프를 형성 하기의 기능을 억제.

이전 연구는 SCN에 비보 전 SCN 슬라이스 문화 방법^4,,56 주로 고용 하 고, 한계가 우리의 능력을 저해는 동안이 접근은 귀중 한 정보를 제공 하 고, SCN에 다른 뇌 핵의 영향 뿐만 아니라이 중요 한 영역에 있는 셀에 외 인 자극 (예를 들면, 빛)의 효과 대 한 데이터를 가져옵니다. 2001 년에, 히토시 오카무라의 그룹 자유롭게 이동 마우스⁷에서 SCN에 vivo에서 모니터 circadian 시계 유전자 발현을 생물 발광 시스템을 사용 하는 첫번째 이었다. 켄 이치 혼 마의 그룹은 지난 몇 년 동안에는 생물 발광에서 vivo에서 SCN^8,,910녹화 시스템 개발 지출 했습니다. 함께, 이러한 연구는 지속적인 암흑 또는 빛 펄스 후 circadian 시계를 모니터링 하는 기능 연구를 제공 합니다. 그러나, 때문에 생물 발광 너무 희미 한 명암 주기 동안 지속적인 모니터링 사실 빛 circadian 시계¹¹, SCN 중재 진입에 필요한 주된 신호 함께 있도록입니다. 생물 발광 녹화와 관련 된 한계를 극복 하는 실험 방법의 개발에 대 한 수요 증가. 현재 보고서는 circadian 시계는 SCN에서 vivo에서 자유롭게 이동 하는 쥐에서의 모니터링을 건립 되었다 형광 기반 시스템을 설명 합니다. 이 사용 하기 쉬운 메서드 명암 주기 동안 지속적인 모니터링을 허용 하 고 실시간 및 높은 시간 해상도에서 SCN에 circadian 시계 유전자의 녹음 방송의 장기 관찰에 대 한 허용.

이 프로토콜의 모든 절차는 중국의 정부 규정에 따라 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 국립 연구소의 생물학, 베이징의 승인을 실시 했다.

1. 건설 Cry1 형광 기자

참고: 이전 circadian 연구 생물 발광 시스템^2,12를 사용 하 여^,13 퓨즈 리듬 dLuc 식 유도를 정한 luciferase (dLuc)와 circadian 발기인. 개발 하기 위해 형광 기자, 정한 luciferase 리듬 dVenus 식 유도를 정한 형광 단백질 (dVenus)로 대체 되었다. P (Cry1)의 생성-d금성 기자 아래 설명의 구조는 현재 Addgene에 제출 되 고 학문적 인 사용을 위해 곧 유효할 것 이다.

1. 증폭 기능 마우스 Cry1 발기인 (-1208 bp 지역 전사 시작 사이트 '-1'로 지정, Cry1 유전자의 +328). PCR 효소 (로그인 플러스 네오)를 사용 하 여, 뇌관 f 1와 r 1은 ( 표 2참조), 서식 파일 및 제조업체의 PCR 프로토콜 Cry1 발기인 DNA 파편을 증폭으로 게놈을 마우스.
2. Intron 336 Cry1¹⁴의 circadian 시계 기능을 위해 중요 하다, Cry1 유전자의 증폭. 사용 하 여 PCR 효소 뇌관 f 2와 r 2, 서식 파일 및 제조업체의 intron 336 DNA 파편을 증폭 하기 위하여 PCR 프로토콜 마우스 게놈.
3. 금성을 증폭. 뇌관 f 3와 R3, 템플릿과 제조업체의 금성 DNA 파편을 증폭 하기 위하여 PCR 프로토콜으로 pVENUS N1 플라스 미드 PCR 효소를 사용 합니다.
4. NLS-D2 DNA 파편을 증폭. 뇌관 f 4와 R4, 서식 파일 및 NLS D2 DNA 파편을 증폭 하는 제조 업체의 PCR 프로토콜 pcDNA3.3 d2eGFP 플라스 미드 PCR 효소를 사용 합니다.
5. Exon 1로 DNA 조각 1을 음성 합성.
6. Intron 336와 금성 DNA 파편 사이 링커로 DNA 조각 2를 음성 합성.
7. 잘라 두 번 pAAV-EF1a floxed-hChR2 (H134R)-mCherry-WPRE-MluI 및 EcoRI 효소 HGHpA 벡터 플라스 미드. 젤 추출 키트를 사용 하 여 더 큰 DNA 파편을 정화. 제조 업체의 프로토콜을 사용 합니다.
8. Using 깁슨 어셈블리 혼합 및 그것의 표준 프로토콜, 모두 함께-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA pAAV-P (Cry1) 기자를 생산 하는 DNA 파편의 조립. 제조 업체의 프로토콜을 사용 합니다.

2. 생산 Adeno 관련 바이러스¹⁵

1. 준비 다음 플라스 미드 DNA 주식: 31.25 µ g의 pRV1, pH21의 31.25 µ g, pFdelta6의 125 µ g 및 62.5 µ g (Cry1)-intron336-pAAV-P의 금성-NLS-d 2-WPRE-HGHpA.
2. 293T 세포의 5 15 cm 요리를 준비 하 고는 세포가 90% 합칠 때까지 기다립니다.
3. Transfection 시 프로토콜을 따르고 297T 셀에는 플라스 미드를 transfect. 각 요리에 대 한 사용 하 여 pRV1의 6.25 µ g, pH21, pFdelta6의 25 µ g, pAAV-P (Cry1)의 12.5 µ g의 6.25 µ g-transfection 시 약의 intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA, 그리고 120 µ L.
4. transfection, 후 72 h 피 펫 총;를 사용 하 여 각 접시에서 셀 분리 2 50 mL 튜브에 세포를 수확.
5. 10 분 동안 800 x g에서 셀 작은 고는 상쾌한 삭제. 각 관;에 20 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)를 배치 하 여 세포를 씻어 10 분, 800 x g에서 셀 펠 렛 하 고는 상쾌한 삭제.
6. 150 mM NaCl에 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0; 펠 릿 resuspend 솔루션/튜브의 25 mL를 사용 합니다. 각 튜브를 갓된 10% 나트륨 deoxycholate (dH₂O)에서 1.25 mL를 추가 합니다. Benzonase nuclease mL 당 50 단위의 최종 농도에 추가 하 고 철저 하 게 혼합. 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.
7. 15 분 동안 3000 x g에서 centrifuging 세포질 파편을 제거 합니다. 0.45 μ m 주사기 필터;를 통해 혼합물을 추진 하 여 모든 파편 제거 되었습니다 확인 이 단계는 덤플링 열 차단 방지 하는 데 도움이 됩니다.
8. 연동 펌프;를 사용 하 여 헤 파 린 열 설정 1 mL/min, 아무 공기 방울 열에 소개 된다 보장에 흐름 속도 설정 합니다.
9. 150 mM NaCl, 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0의 10 mL와 함께 열 equilibrate 각 열에 바이러스를 포함 하는 솔루션을 추가 합니다. 100 mM NaCl, 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0의 20 mL의 열을 씻어. 그런 다음 5 mL 주사기를 사용 하 여 300 mM NaCl의 1 mL와 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0 200 m m NaCl의 1 mL와 20 mM Tris 솔루션 pH 8.0, 열 세척.
10. Elute 400 m m NaCl, 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0의 3 mL와 함께 바이러스 4 mL 450 m m NaCl, 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0의 뒤에 5 mL 주사기를 사용 하 여 마지막으로 500 m m NaCl의 3 mL로 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0. 추출 된 자료를 수집 합니다.
11. 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (rAAV) 농도 대 한 100000 분자량 컷오프와 원심 필터 단위를 추출 된 자료를 한 번에 4 mL를 로드 합니다. 실내 온도에, 흐름을 통해 삭제 5 분 x g 2000에서 각각 4 mL 샘플 원심
12. 모든 추출된 물질을 원심 필터 단위를 통해 실행 하는 경우 PBS의 4 mL를 추가 하 고 약 250 μ로 혼합물을 원심. RAAVs 제거 (바이러스 titer에 관하여 이어야 한다 2-8x mL 당 10¹² 바이러스 성 입자) 원심 필터 단위, 약 수와 사용까지-80 ° C에서 저장소에서. 이 단계에서 바이러스는 몇 달 동안 저장할 수 있습니다.

3. rAAV 주입 및 성인 마우스 SCN에 광학 섬유 삽입

1. Circadian 형광 기자 들고 rAAVs는 SCN에 주입
   1. RAAV의 5 µ L 로드 (바이러스 titer에 대 한은 mL 당 10¹² 바이러스 입자 x 2-8) 마이크로 주사기로.
   2. Nembutal (80 mg/kg)을 복 주입을 통해 성인 마우스 (2에 5-달-오래 된, C57BL/6 배경)를 anesthetize. 발가락-핀치 응답의 부족에 의해 마 취의 충분 한 깊이를 확인 합니다.
   3. 가 위를 사용 하 여 마우스의 머리에서 모피를 제거 한 다음 stereotaxic 장치에 마우스를 탑재. 순환 온수 담요 또는 다른 난방 장치를 통해 마 취 동물에 열 소스를 제공 합니다.
      참고: 또는, 모피를 제거 하려면 depilatory 크림 또는 전기 머리 깍을 사용 합니다.
   4. 적절 한 소독 작용 외과 사이트를 청소. 예를 들어 포함 살 균 물 또는 알코올 및 요오드 화물, betadine, 또는 스크럽을 번갈아에 액체를 희석 수이. 3 번 이상 반복 합니다. 수술 사이트 드러 워 진.
   5. 가 위를 사용 하 여 두 피에 절 개 하 고 두개골을 노출 시킵니다.
   6. 있도록 bregma 및 람다; 동일한 가로 평면에서 stereotaxic 장치 조정 동일한 가로 평면에서 bregma의 두 개의 대칭 포인트를 확인 합니다.
   7. 멸 균 면봉을 사용 하 여 H₂O2/H₂O 뇌과 부식에 4%에 배어. 다음 깨끗 한 멸 균 면봉을 사용 하 여 명확 하 고 두개골의 표면 건조.
   8. 마이크로 드릴을 사용 하 여, 게 구멍 약 1 m m 0.46 m m 후부와 0.25 m m 직경에서 측면 bregma.
   9. _fi 생리 염 분 해결책으로 깨끗 한 멸 균 면봉을 사용 하 여 두뇌의 노출 된 표면에서 뼈 파편을 취소.
   10. 마이크로 주사기의 팁 후부 0.46 m m 되도록 두뇌 및 두개골의 표면에서 bregma, 및 깊은 5.7 m m 0.25 m m 옆에 마이크로 주사기를 삽입 합니다.
   11. 500 주사 rAAV의 완전 한 보급을 보장 하기 위해 주사 후 10 분에 대 한 장소에서 마이크로 주사기를 떠나 SCN에 rAAV (50 nL 분^-1)의 nL.
   12. 천천히 마이크로 주사기를 철회 한다.
2. SCN 지역에 광섬유를 삽입 합니다.
   1. 광섬유 나이프를 사용 하 여, 섬유 17 m m 길이, 눈 섬유의 양쪽이 부드러운 컷.
   2. 광학 섬유 세라믹 깃 봉으로 삽입 하 고 광학 섬유와 세라믹 아무의 표면 플러시 되는지 확인 메 틸 에틸 케 톤 과산화물 (AB 접착제)와 세라믹 아무에 광케이블을 수정.
   3. 차가운 sterilant 솔루션 또는 에틸렌 산화물과 섬유를 청소.
   4. RAAV 주입 (3.1.11 단계), 후는 SCN에 세라믹 깃 봉 포함 된 광학 섬유를 삽입 합니다.
   5. 세라믹 아무와 광섬유 치과 수 지를 사용 하 여 두개골에 해결 하 고 건조를 허용.
   6. 다시 매니큐어와 치과 수 지의 표면 얼룩. 3.2.5 하 3.1.2, 제어를 위한 rAAV의 실제 주입 생략에 설명 된 절차를 반복 합니다.
3. 수술 후 관리
   1. Buprenorphine 2 mg/kg 몸 무게, 같은 수술 후 진통제, 피하, 마우스 제공 하루에 두 번.
   2. 그들은 마 취에서와 서 하는 동안 복구에 마우스를 놓습니다.
   3. 음식/물 사용 가능한 광고 libitum와 12 h 명암 조건 (빛의 강도 감 금 소의 바닥에서 ~ 100 럭 스)에서 개별적으로 집 쥐. 8 일 더 충분 한 회복 시간을 허용 하 고 최적의 형광 기자 식 되도록 실험 하기 전에 할당 해야 합니다.

4. vivo에서 형광 신호 모니터링 및 데이터 수집

1. 수술 후 8 일 형광 신호 모니터와 마우스 머리에 섬유를 연결 (예., 유전자 관찰자). 배경 신호를 설정 하려면 컨트롤 마우스의 SCN에 형광 신호를 확인 하십시오. 관찰 및 형광 신호 모니터를 사용 하 여이 신호 측정을 수행 합니다.
2. 컨트롤 마우스의 동일한 작업과 실험 마우스의 형광 신호를 평가 합니다. 이 가능성이 광 섬유의 끝은 SCN을 놓친 있다 나타냅니다 마우스는 바이러스 성 벡터 받았지만 분석, 배경 신호 표시를 제외 합니다. 이러한 초기 조치 후 자신의 집 새 형광 신호를 안정 시킬 수 있도록 또 다른 3 주 동안에 쥐를 반환 합니다.
3. 3 주 후 형광 신호 모니터와 마우스를 연결 합니다. 15 형광 측정 s 100 Hz의 주파수에서 매 10 분. 이러한 측정 동안 쥐 음식/물 사용 가능한 광고 libitum와 그들의 감 금 소에 자유롭게 움직이는 있습니다. ~ 100 럭 스의 감 금 소의 바닥에는 빛의 강도 사용 하 여 그리고 15-20 µW 사이 광 섬유의 끝에 레이저 전원.
4. 모든 녹음 완료 후 4 %paraformaldehyde 마우스를 perfuse 및 제거 하 고 슬라이스는 광케이블의 위치를 확인 하는 머리. 광섬유 팁은 SCN에 제대로 이식 되지 경우에 분석에서 마우스를 제외 합니다.

5. 데이터 분석 및 프레 젠 테이 션

1. 측정 형광 신호 15 매 10 분 1500 데이터 포인트를 100 Hz의 주파수에서 s. 이 1500 점의 평균 주어진된 시간에서 형광 신호를 변환합니다. 시간이 지남에 따라 여러 평균 플로팅 transcriptional의 리듬에 맞춰 Cry1 자유롭게 마우스를 이동는 SCN에 제어 조명 조건 하에서 해당 신호-시간 곡선을 생성 합니다.

Cry1 의 형광 기자 디자인 그림 1A에 게재 했다. 500 이상 상세한 접근을 사용 하 여 (Cry1)-intron336-rAAV-P의 nL 금성-NLS-d 2는 성인 마우스의 SCN에 성공적으로 주입 했다 그리고 강력한 금성 식 (그림 1B, 1c) 전시. 12 h/12 h 명암 (LD)와 어둠/어두운 (DD) 조건 (그림 2)에서 기록 하는 형광 신호 두 조건에서 강력한 circadian 리듬 나왔고. 마지막으로, 형광 신호는 길고 짧은 photoperiod 조건 (그림 3)에 기록 되었다.

그림 1입니다. 형광 기자 디자인 및 그것는 SCN에 식
(A) Cry1의 형광 기자 디자인. 보여주는 기자 식 바이러스 주입 후 8 일 쥐의 뇌의 (B) Photomicrograph. (C) (B)에 표시 된 photomicrograph에 빨간색에서 박스 영역의 확대. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2입니다. 형광에서 vivo에서 LD와 DD 조건 하에서 SCN에 기록
(A) LD와 DD 조건 없음 감지 리듬을 보여주는 SCN에 형광 배경. 흰색과 회색 영역에 빛 및 빛-오프 기간, 각각 나타냅니다. (B) P (Cry1)-intron336-금성-NLS-12-12 LD 조건 및 DD 상태에서 7 한 일의 과정을 통해 d 2 식. LD 조건 (~24.4 h); circadian 리듬의 (C) 분석 빨간색 선은 수렴 (적응의 결과 왼쪽된 패널에 표시 됩니다) 사인 곡선에 맞는 것을 나타냅니다. DD 조건 (~23.25 h); circadian 리듬의 (D) 분석 빨간색 선은 수렴 (적응의 결과 왼쪽된 패널에 표시 됩니다) 사인 곡선에 맞는 것을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3입니다. Vivo에서 형광 녹음에서 SCN에 20-4 길고 짧은 photoperiod 조건 4-20
P (Cry1)-intron336-형광 녹음의 예 금성-NLS-12-12 LD 조건 7 일 SCN에 D2 식 뒤에 20-4 긴 photoperiod 조건, DD 조건, 12-12 LD 조건 3 한 한 일 고 4-20 짧은 photoperiod 조건 하에서 다음 7 일. 흰색과 회색 영역에 빛 및 빛-오프 기간 각각 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

표 1입니다. 프로토콜에 필요한 특정 시 약 ( 재료의 표참조)

표 2입니다. 프로토콜에 사용 되는 뇌관

테이블 3입니다. 프로토콜에 사용 하는 DNA 순서 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

Ex vivo 방법, 동물 살해는 요구, 슬라이스 문화^4,5, RT-PCR¹⁶, 제자리 교 잡¹⁷, 등 달리는 vivo에서 메서드를 기록 수 있습니다. 살아있는 동물에 circadian 유전자 발현 연구 조사. 따라서,이 기술은 신경 circadian 시계에 다른 물리적 섭 (예를 들어, 수 면 부족, 스트레스, 음식 섭취, 등)의 효과 평가 하는 능력을 제공 한다. Vivo에서 생물 발광^7,8,만 지속적인 어두운 조건에서 일할 수 있는¹⁰ 방법 달리는 형광 vivo에서 녹음 방법 적용 될 수 있다 빛에서 빛으로 기술의 주요 장점은 조건 한 SCN circadian 시계¹⁸의 재 유입 신호. 비교적 일정, 강력한 circadian 리듬이이 방법으로 검출 될 수 있다, 비록 그것은 언급 되어야 기자 기술 정량적 인 정보를 제공 하지 않습니다 및 따라서 사용할 수 없는 유전자 전사의 수준을 측정 하 고 번역입니다.

이 프로토콜의 많은 중요 한 단계가 있습니다. 집중된 rAAV titer; mL 당 10¹² 바이러스 성 입자 x 2-8로 높은 해야 낮은 바이러스 titers dim 또는 심지어 탐지 형광 신호 줄 것 이다. Stereotaxic 장치에는 마우스의 머리를 고정, 두개골 바이러스 주입 및 광섬유 이식에 대 한 보안 정확한 위치 수평 인지 확인 합니다. 바이러스의 주입은 천천히 이루어져야 한다 (≤50 nL 분^-1) 바이러스는 SCN에 남아 있도록. 세라믹 아무와 광섬유 안전 하 게 두개골에 고정 되어야 한다 그리고 치과 수 지에 문의 피부. 경우 세라믹 아무와 광섬유는 적절 하 게 고정 되어 있지 않으며, 그들은 점차적으로 마우스 머리에서 분리할 것입니다.

이 기술은 다른 유전자 기자를 포함 하도록 확장 될 수 있습니다 (예를 들어, Per2, Bmal1, c Fos, Pomc, 등) 발기인 및 해당 intron¹⁹변경 하 여. 두 반전된 lox 시퀀스 플래그-inton336-금성-NLS-D2 카세트 반전 Cre 마우스 선 기자를 결합 함으로써,이 기술은 특정 신경에 있는 활동을 기록 하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어 Vip-cre 마우스에이 접근을 결합 Cry1 polypeptide 표현 뉴런 vasoactive 창 자는 SCN에에서 transcriptional 리듬의 기록 하게된다. 이 메서드는 또한 두뇌에 Ca^{2 +} circadian 리듬을 기록 하기 위해 Ca^{2 +} 표시기로 GCaMP6 고용 수 있습니다.

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

우리는 기술 지원을 제공 하기 위한 자극 토론 및 Zhan 연구소에서 회원을 제공 하기 위한 장 연구소에서 회원을 감사 합니다. 이 연구는 NSFC, 중국의 M.O.S.T.에서 973 프로그램의 (E.E.Z. C.Z.)를 2012CB837700의 31500860 (C.Z.)를 부여 하 고 베이징 시 정부에서 자금에 의해 지원 되었다. E.E.Z.는 "채용 프로그램 글로벌 청소년 전문가" 중국 사람에 의해 지원 되었다.