Verimli üretimi ve besleyici-Alerjik IPSCs CRISPR-Cas9 sistemini kullanarak insan pankreas hücreleri düzenleme

Bu iletişim kuralı koşullarda besleyici içermeyen insan pankreas hücreleri ayak izi-Alerjik İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) nesil ayrıntılı olarak anlatılmaktadır kullanarak CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins ve değiştirilmiş karakterizasyonu düzenleyerek takip tek hücre klonlar.

Embriyonik ve İndüklenmiş pluripotent kök hücreler kendini yenilemek ve vücudun birden çok hücre tipleri ayırt etmek. Pluripotent hücreler böylece rejeneratif tıp araştırmaları açgözlü ve şu anda göz hastalıkları, diyabet, kalp hastalıkları ve diğer hastalıklar için klinik denemeler vardır. Özel hücre tipleri teknolojik CRISPR/CA sistem dahil düzenleme genom son gelişmeler ile birleştiğinde içine ayırt potansiyeline sahip olmanız koşuluyla IPSC çeşitli uygulamalar için genom dikme için ek fırsatlar modelleme, gen tedavisi ve birkaç isim ayırt etme, yollar kutuplama hastalığı da dahil olmak üzere. Kullanılabilir düzenleme teknolojileri arasında CRISPR/Cas9 Streptococcus pyogenes üzerinden siteye özgü ökaryotik genomu düzenlemek için Seçim aracı olarak ortaya çıkmıştır. CRISPRs kolayca erişilebilir, ucuz ve yüksek verimli hedeflenen düzenlemeleri mühendislik. Cas9 nükleaz ve bir rehber sıralaması (20-mer) belirli bir 3-nükleotit "NGG" protospacer-bitişik-Cas9 evrensel bir Cas9 bağlama izleyici RNA (yanında istenen genomik locus hedefleme için motif (PAM) bitişik genomik hedef sistem gerektirir birlikte tek Kılavuzu RNA ya da sgRNA olarak bilinir). Burada adım adım mevcut protokol besleyici bağımsız ve ayak izi-Alerjik IPSC verimli üretimi için ve genom Cas9 Ribonükleoprotein (RNP) kompleksleri kullanarak IPSC düzenleme yöntemleri açıklanmaktadır. İletişim kuralı düzenleme genom etkilidir ve kolayca Cas9 protein ve aynı anda hücrelere teslim ile birden fazla hedef için pre-kompleks sgRNAs tarafından multiplexed. Son olarak, kimlik ve iPSCs istediğiniz düzenlemeleri ile karakterizasyonu için basitleştirilmiş bir yaklaşım açıklar. Birlikte ele alındığında, Seviyelendirilmiş stratejileri üretimi ve IPSC manifold uygulamalar için düzenlemeyi kolaylaştırmak için bekleniyor.

İnsan somatik hücreler pluripotent durumuna reprogramming faktörler yeniden programlama overexpression tarafından kök hücre araştırma hastalığı modelleme, rejeneratif tıp ve ilaç geliştirme uygulamaları ile devrim yarattı. Birkaç viral sigara programlama yöntem faktörler yeniden programlama ve iPSCs üreten teslimat için kullanılabilir, ancak emek yoğun ve çok verimli değil¹işlemidir. Viral yöntemleri etkili olsa da, virüs entegrasyon ve tumorigenicity^2,3,4sorunlar ile ilişkilidir. Bu makale, sitoplazmik Sendai virüs kullanımı sağlayan faktörler yeniden programlama ve entegrasyon içine onların genleri⁵herhangi bir viral vektör sıralarının eksikliği IPSC ayak izi içermeyen satırları oluşturmak için rapor. Sendai virüs hücre sitoplazma ~ 10 pasajlar dışarı enfeksiyon sonra seyreltilmiş ve bolluk, hızlı ve verimli^6,7yeniden programlama programlama faktörler üreten bir RNA virüsüdür. Kurulan iPSCs sonra kolayca besleyici hücreler⁸olarak fare embriyonik fibroblastlar (MEFs) kullanımı önlemek için orta besleyici ücretsiz geçiş.

Bu yayındaki Sendai aracılı yeniden programlama, virüs özetleyen ek olarak Ayrıca araştırma için istenen genetik değişiklikler ile sınırsız insan hücreleri tedarik potansiyeline sahiptir iPSCs düzenlemek için gelişmiş bir iletişim kuralı açıklar. Şimdi knock-ins ve altını gizleme, büyük ölçekli genomik silme, havuza alınan Kütüphane gen bulma, genetik mühendisliği için tarama dahil olmak üzere uygulamaların geniş bir yelpazesi için kullanılan iPSCs, değişiklik için CRISPR/Cas9 teknoloji kullanılmıştır çok sayıda model organizmalar ve gen terapisi^9,10,11. Streptococcus pyogeneskompleksleri oluşumu bu tekniği içerir-Kılavuzu genomik hedef sıra 3' nükleotit protospacer için bitişik bitişik hedef tanıma baz eşleşmesi yoluyla elde RNA'ların türetilmiş Cas9 nükleaz ve 20-mer motif (PAM) sıra. Cas9 nükleaz yanında (NHEJ) yolu eklemelerin veya silmelerin açık okuma çerçevesi içinde önde gelen katılmadan homolog son-ağırlıklı olarak daha sonra tamir ve böylece işlevsel PAM sitesinden bir çift telli ara ~ 3 nükleotid neden olmaktadır. nakavt genler¹².

Bizim geliştirilmiş iletişim kuralı kültür insan pankreas hücrelerinin ayrıntılarını içerir, onların üzerinde mitotically yeniden programlama inaktive fare embriyonik fibroblastlar yeniden programlama, besleyici-Alerjik kültür sonraki adaptasyon, daha yüksek verim elde etmek için (MEFs) Matrigel kurulan iPSCs, karakterizasyonu CRISPR destekli RNA tasarım ve hazırlık, RNP kompleksleri, tek hücre düzenlenen iPSCs klonal satırları oluşturmak için sıralama, kolay tarama ve düzenlemeleri tanımlaması ve karakterizasyonu olarak iPSCs içine teslim tek hücre klonlar. Genomik silme işlemlerini verimli bir şekilde bu çalışmada Cas9 protein ve iki CRISPR sgRNA RNP kompleksleri çift telli sonları (DSBs) ikna etmek için giriş tarafından üretilen ve müdahalede silme segmentlere ayırmak. Bu yöntem silme açık okuma çerçevesi oluşturmak için iki kılavuzları kullanımı capitalizes, yüksek verim için az sayıda önde gelen NHEJ, o lüzum-e doğru karakterize edilebilir ve kolay ön elemeyi klonların klonlar tarafından otomatik kılcal Elektroforez birimi, parça Çözümleyicisi. İnsan kök hücre tabanlı hastalık modelleri oluşturmak için yöntemleri düzenleme bu etkili genom yakında herhangi bir kök hücre laboratuvar standart ve rutin bir yaklaşım olacaktır. Son olarak, kesin genom düzenleme kök hücre hastalığı modelleme ötesine gitmek mümkün kılacak ve potansiyel hücre tabanlı terapiler katalizler yardımcı.

1. Protokolü yeniden programlama

1. birincil insan pankreas hücrelerinin insan IPSC nesil
   1. 6-iyi 1.5 mg/mL soğuk kollajen ile plaka ve 1 h için 37 ° C'de jel izin ceket
   2. Plaka erken geçiş Prigrow III ortamda (~ 1-1.5 × 10 ⁵ hücreleri) bir kollajen insan birincil pankreas hücrelerinde kaplı 6-şey plaka üzerinde gün yaklaşık 2.5 × 10 ⁵ hücreleri veya en az % 60'ı elde etmek için -2 gününde de başına confluency iletim (0 gün). İlk çalışma gününde 0 ile istenen confluency bir geçmiş olsun için en az 2-3 Kuyu plaka. Hücreleri saymak için bir denetim olarak en az bir şey kullanın.
   3. İletim (0 gün) günü, Prigrow III orta transduced her şey için bir su banyosunda 1 mL sıcak. Bir denetimde de 1 mL % 10 FBS orta tripsin/EDTA 1 mL 5 min için kullanarak hücrelerden hasat veya hücreleri hücre sayısı gerçekleştirmek için ayırmak kadar. % 10 FBS orta yapmak için DMEM, % 10 ekleyin FBS, %1 L-Glutamine, % 1 sodyum Pyruvate ve % 1 esansiyel olmayan amino asitler.
   4. Sayısı ve hücre sayaç hücre canlılığı kontrol ve hücre sayısı ve virüs titresi dayalı hedef ulaşmak için gereken her virüs hacmi hesaplamak. Enfeksiyon (MOI) İstanköy çokluğu kullanın = 5, hc-Myc = 5 ve hKlf4 = 3 pankreas hücreleri için.
   5. Tezcan Sendai kümesi vektör-80 ° C depolama buz tüplerde ve dikkatle her üç Sendai vektör tüplerinin hesaplanan miktarda Prigrow III orta, 1 mL için eklemek için 37 önceden ısınmış ° C. pipet çözüm karışımı yavaşça. 6-şey plaka bir kuyuda zaten yeterince Sendai viral Vektörler ile programlanmış hücreler üretmek için transducing.
   6. Hücreleri Prigrow III ortamından Aspire edin ve yavaş yavaş hücreleri içeren wells programlama virüs karışımı ekleyin. 37 ° C kuluçka %5 CO ₂ oksijen bir atmosfer ile bir gecede hücrelerde kuluçkaya.
   7. Dikkatle hücreleri üzerinde virüs karışımı atın ve ertesi gün, 24 saat sonra iletim ile taze Prigrow III orta yerine. 5 d için hücreleri kültür ve orta alternatif her gün değiştirin.
   8. 5 günde MEFs % 0.1 ön kaplamalı jelatin 10 cm kültür yemekleri (1.3 x 10 ⁶ hücreler/yemek) hazırlamak. MEFs 4 gün kadar T175 şişeler içinde büyümek ve hücreleri ¹³ veya ticari MEF kaynağı kullan tohum önce 5 günde 6000 rad hücrelere γ-radyasyon kaynağından sunarsınız.
   9. 6 günde 1 mL hücre dekolmanı çözeltisi 10 dakikadır transduced hücreleri ayırma, hepsini MEF yemekleri Prigrow III ortamda rock inhibitörü (5 mM hisse senedi, 10 µM son) plaka ve gecede 37 ° C kuluçka oksijen atmosphe ile kuluçkaya kullanmak Re % 5 CO ₂.
   10. Prigrow III orta ertesi gün hESC Orta olarak değiştirin. 500 mL hESC orta yapmak için DMEM/F-12, %20 (v/v) nakavt serumu değiştirme (KOSR), 5 ng/mL bFGF ekleyin; 1 mM l-glutamin; 100 µM önemli olmayan amino asitler ve 100 µM 2-mercaptoethanol. Orta yavaşça şimdi her gün değiştirin.
   11. Plakayı hücre kümeleri veya koloniler ortaya çıkması için düzenli olarak programlanmış hücre gösterge gözlemlemek. Dönüştürülmüş hücrelerin Arnavut kaldırımlı morfoloji ve büyük çekirdek ve nükleulus klonal toplamları oluşturur. Olası mark ' IPSC ' kolonileri ve onları düzenli olarak büyüme için kontrol edin.
   12. Yaklaşık dört hafta sonra iletim kolonileri için malzeme çekme ya da transfer, hazır olur olmaz hazırlamak 24-şey MEF plakaları 1.3 x 10 ⁶ hücreler/jelatin önceden boyalı tabak daha önce olduğu gibi tek kolonileri transferi için tarafından kaplama.
       1. Hazırla matris membran (örneğin, Matrigel) tarafından seyreltme faktörü analiz belgesi üzerinde temel aliquoting. Bir aliquot DMEM/F-12 25 mL dört 6-iyi (1 mL/de) tabaklar ve oda sıcaklığında (RT) kullanmadan önce en az 1 h için kuluçkaya kat için ekleyin. 12-24 kolonileri onları Aspire edin ve hESC orta 500 µL MEF levha aktarmak için steril bir pipet ucu kullanarak el ile seç.
       2. Yavaşça bozabilir veya koloniler parçalayın iyi medyada Aspire edin. Ayrıca 24-48 kolonileri matris membran kaplı 24-şey plakaları almak. Membran kaplı levha, mTeSR1 (10 µM rock inhibitörü ile desteklenmiş) 24 saat kullanın ve her gün değiştirin. D kolonileri malzeme çekme 6-10 içinde klonal genişleme için yeni 24-iyi ve/veya 12-şey zar plakaları transfer edilecek hazır mı.
   13. , Koloniler MEFs 1 mg/mL collagenase için 20 dk kullanarak üzerinde ayırmak gerekirse, yıkama iki kez hESC/mTeSR1 ve transfer membran için 12 veya 24 iyi plakaları kaplı. Adım 1.1.12 matris membran üzerinde büyüyen yeterince sağlam kolonileri varsa, koloniler MEFs medya üretici göre dondurma IPSC kullanarak üzerinde dondurma ' s yönergeleri.
   14. Adım dispase 500 µL için 20 dk kullanarak 1.1.12 membran kaplama sağlam kolonileri ayırmak ve plaka tekrar matris membran üzerinde 12-şey plakaları kaplı.. El ile herhangi bir farklılaşmış hücreler veya bulaşıcı MEF besleyici hücreler pluripotent membran üzerinde klonlar için zenginleştirmek için kapalı kazımak.
   15. 6-8 d membran üzerinde büyüyen tarafından daha önce dispase çözüm olarak ile dissociating tarafından plakaları kaplı ve küçük hücreli agrega taze membran üzerinde kaplama 6 veya 12 iyi plaka kaplı sonra klonlar genişletin. Değişiklik mTeSR1 orta günlük. Alkalen fosfataz boyama, Nanog işaretleri (OCT3/4 ve MİCRORNAS), FACS analiz pluripotent yüzey işaretleyicileri ve farklılaşma deneyleri için immunostaining tarafından programlanmış klonlar karakterize. Büyümek ve CRISPR diğer kaplama çözüm özellikle söz sürece yukarıda açıklandığı gibi düzenleme dahil olmak üzere tüm deneyleri için membran kaplı Tabaklarda klonlar kültür.
2. Karakterizasyonu insan iPSCs
   1. alkalen fosfataz boyama
      Not: ticari bir kit burada kullanılır. Malzemeler tabloya bakın.
      1. Günlük medya değişiklikle plaka 24-şey plaka ve kültür 4-5 d için sözde insan iPSCs.
      2. Boyama protokol başlayın, kültür orta Aspire edin ve 1 mL 1 x PBS % 0.05 ile hücrelerle yıkamak için ara 20 (PBST).
      3. Hücrelerde seti düzeltme çözüm 0.5 mL ekleyin ve 2-5 dk. aspiratı düzeltme çözüm için RT kuluçkaya ve sonra PBST sabit hücrelerle yıkayın. Kuyu kuru izin vermeyin.
      4. Çözüm A, B ve C. Incubate (folyo ile veya karanlık bir kap içinde sarılı) karanlık oda sıcaklığında 5-15 dakika süreyle hücrelerde karıştırılarak 0.5 mL taze hazırlanmış AP substrat çözeltisi iyi ücret ekleyin
         Not: Yakından renk değişikliği izleneceğini ve rengi belirsiz boyama önlemek için parlak dönüştüğünde tepki.
      5. AP substrat çözeltisi aspirating ve wells 2 mL 1 x PBS ile iki kez yıkama tepki uğramak.
      6. Mikroskop altında koloniler gözlemlemek ve esir alma imge 4 X veya herhangi bir parlak alan mikroskobu ile bir kamera ile 10 X büyütme.
   2. Immunostaining
      1. her gün medya değişiklikle plaka 24-şey plaka ve 4-5 d için kültür insan iPSCs.
      2. Yıkama hücreleri bir kez kısaca PBS ve % 4 paraformaldehyde (PFA) PBS ile 20 dk düzeltme.
      3. Yıkama RT. adlı PBS ile 10 dk (3 x, 10 dk) için üç kez
      4. Saturate non-spesifik siteleri (NS, hayvan ikincil antikor bağlı olarak içinde büyüdü) % 10 normal keçi veya eşek serum PBS içinde 40 dk RT. az için ile Yalnızca hücre içi epitopları için %0,3 dahil TX-100 PBS (TX/PBS) permeabilize.
      5. Yıkama RT. adlı PBS ile 3 x 5 dk
      6. % 5'lik taze bir çözümde OCT4, MİCRORNAS, TUJ1, NKX2-5 ve SOX17 antikor seyreltik PBS NS ve 2 h RT veya gecede 4 için kuluçkaya ° C.
      7. 3 x RT. adlı PBS ile 5 min için yıkama
      8. Seyreltik uygun ikincil Alexa Fluor 488 veya 568 antikorlar % 5 NS/PBS ve hücreler RT. 1 h için kuluçkaya
      9. 3 x 5 dk RT. az için yıkama
      1 için kuluçkaya DAPI PBS ile
      10. 0 dk ve yıkama RT. fotoğraf çekmek için kullanım floresan mikroskop vasıl 5 min için 2 x.
   3. Floresan aktif hücre sıralama (FACS)
      1. 6-şey plaka ve kültür kolonileri kadar insan iPSCs plaka haline % 80 birleşmesi (en az 10 ⁵ hücreleri /sample) günlük mTeSR1 orta değiştirmek ile.
      2. Deneme günü, hücreleri izole ve iletişim kuralında yukarıda açıklandığı gibi bir tek hücre süspansiyon ayırmak. % 10 FBS orta ile yıkama.
      3. Yüzey işaretler için 0.5-1'resuspend mL % 10 FBS orta ve buz devam
      4. Hücre içi işaretler için 1 mL % 4'lük resuspend İngiltere'de yılın/PBS ve oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya. % 10 FBS orta ile yıkayın. %0,1 resuspend TX/PBS ve 15 dakika buz üzerinde kuluçkaya. Tekrar % 10 FBS orta ile yıkayın. Resuspend 0.5-1 mL % 10 FBS orta ve buz devam
      5. Ekle 50 µL % 10 FBS orta içeren 50 µL için hücre süspansiyon TRA-1-60, TRA-1-81 veya SSEA-4 antikor miktarı tavsiye ve 1 h için 30 dk için kuluçkaya
      6. Yıkama ile iki kez % 10 FBS.
      7. %10 100 µL içinde FBS orta floresan ikincil antikor içeren resuspend ve iki kez %10 FBS ve resuspend uygun birimdeki % 10 ile 30 dk. yıkama için kuluçkaya FBS. Canlı hücreler ölü hücrelerden propidium iyodür boya ekledi tarafından ayrıştırılan < hücre apoptosis işlemi sırasında tahmin için 1 µg/mL.
   4. Tri-lineage farklılaşma
      1. iki 6-şey plaka ile 1.5-2 x 10 ⁶ iPSCs/iyi mTeSR1 orta 10 µM rock inhibitörü ile tohum.
      2. Hücreleri kuyuları % 80-90 kadar 2-3 d ile günlük mTeSR1 orta değiştirmek için Konfluent büyümeye izin.
      3. Sinir indüksiyon orta (NIM) üreticiye göre ektoderm indüksiyon için ekleyin ' 2-3 Kuyu s yönergelerinde 6-şey plakaların.
      4. Değiştirmek orta %2 B27 ek insülin eksi ve 12 µM içeren RPMI için CHIR99021 için 2-3 Wells mesoderm indüksiyon plakaları ¹⁴. IWP4 RPMI orta %2 B27 ile Ekle tek RPMI sonraki 24 h 5 ekleyin µM için insülin eksi %2 B27 ek içeren ek insülin sonraki 24 h eksi. 72 saat sonra RPMI cardiomyocytes 2-3 D'de yenerek üretimi için önde gelen %2 B27 ek içeren medya yerine
      5. Orta MCDB 1.5 g/L sodyum bikarbonat, 1 x Glutamax, 10 mM glikoz, % 0.5 BSA, 100 ng/mL GDF8 ve CHIR99021 için 24 h CHIR99021 olmadan aynı ortamda kültür 5µM ile takıma 131 için 6-şey plakaların Wells endoderm indüksiyon için değiştirin 2-3 d ¹⁵.
      6. İçin üç soy adım 2 immunostaining protokolü takip ve kontrol ilgili işaretleri ifade için.

2. Genom insan düzenleme IPSC kullanarak CRISPR-Cas9

1. Cas9 hazırlık protein ve sgRNA
   1. Aliquot Cas9 protein microcentrifuge tüpler steril koşullarda ve aliquots-80, tüpler dondurarak saklamak ° C.
   2. İki MIT (http://www.genome-engineering.org/crispr/) yazılım veya diğer CRISPR kılavuzu tasarım webtool RNA'ların gen başına temel Kılavuzu hedefleme tasarlayın. Renkleri çakıştırma oluşturmak için birinci veya ikinci exon (açık okuma çerçevesi üzerinde dayalı) gen hedefleyin. Böylece birbirine yakın kestiler iki kılavuzları seçin (~ 30-100 bp apart) ve astar eleme aynı kümesini kullanarak silme işlemini kolayca görselleştirebilirsiniz. Kılavuzları daha yüksek kalite puanı ve alt kapalı hedef site sayısı temelinde yazılım çıkış'ı seçin. Tasarım programı astar patlama (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) kullanarak astar eleme. Astar eleme-meli var olmak hiç olmazsa 100 bp Cas9 uzak siteleri kesme ve PCR ürün boyutu tercihen 400-700 bp için PCR tarafından daha kolay amplifikasyon arasında olmalıdır.
   3. İki tamamlayıcı sgRNA oligo DNA'lar (19-22 nükleotid uzunluğunda Kılavuzu sıra bağlı olarak) her iki ucu sitesinde kesilmiş bir Bsa1 ile tasarlayın. DNA'lar oligo ticari olarak sentezlenmiş ve iki iplikçikli DNA formu ona komplementer. Tavlama için 1 µL her 100 µM kılavuzları, arabellek (10 mM Tris, pH7.5-8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) tavlama 25 µL ekleyin ve su 23 µL. 2 dk ve sonra yavaş yavaş soğutma 25 ° C-45 dk. 95 ° C'de başlatmak için programlanmış bir thermocycler kuluçkaya
   4. Klon elde edilen parçasının Bsa1 restriksiyon enzimi içine 2 µL T4 DNA ligaz üretici göre kullanarak bir Cas9 bağlama site içi T7 organizatörü pCR2.1 vektör 1 µL sindirilmiş ' s protokolü.
   5. Klonlanmış DNA parçalarının sıra ve sadakat kurulduğunda, vitro uyarlamak tek Kılavuzu RNA'ları oluşturmak için bir T7 kit kullanarak klonlar. Ticari bir kit ile sgRNAs arındırmak ve RNase free suda elute. RNA konsantrasyonu kontrol.
2. HiPSCs transfection
   1. kültür hiPSCs mTeSR1 ortamda hücreleri % 40-50 birleşmesi kadar yukarıda açıklandığı gibi.
   2. İki saat önce nucleofection, yerine orta 10 µM rock inhibitörü içeren prewarmed mTeSR1 orta ile 2 mL.
   3. Bir saat sonra hazırlamak hedef kuyu nucleofected hücreler için alıyorum membran, yukarıda da belirtildiği gibi hazırlanan 12-şey plaka ve prewarmed 1 mL 10 µM rock inhibitörü ile mTeSR1 orta yerine tarafından. Kuluçka için 37 ° C'de devam.
   4. Hazırla nucleofection ana mix (ölçek örnekleri bağlı olarak uygun şekilde) P3 birincil hücre ekleme 16.4 µL tarafından her örnek için ek; ek 1 nucleofector kiti; Cas9 protein 0,5 µg üzerinden 3,6 µL ve her sgRNA 0,5 µg tepki birim başına 22 µL içinde. Değerleri GFP vektör yapıldı Ayrıca üretici göre nucleofected ' IPSC transfection verimliliğini kabaca tahmin etmek için s öneriler hücrelerdeki.
   5. Yıkama her RT PBS rock inhibitörü IPSC kuyulardan içeren orta aspirating sonra 2 mL ile iyi. PBS Aspire edin, hücre dekolmanı çözümü 1 mL ekleyin ve 10 dakika süreyle 37 ° C'de plaka kuluçkaya
   6. MTeSR1 orta 3 mL hücrelerde resuspend ve hafifçe yukarı ve aşağı bir tek hücre süspansiyon oluşturmak için pipet. 15 mL santrifüj hücrelere ayrışmış transferi tüp içeren 5 mL mTeSR1 orta.
   7. Hücreleri hücre sayacı ile saymak ve toplam hacimli 0.5 x 10 ⁶ hücreler/transfection için gerekli hesaplar. Hücre istenen miktar 15 mL santrifüj tüpü yerleştirin, santrifüj kapasitesi 200 x g RT, 5 min için de ve süpernatant Aspire edin.
   8. Adım 4'te hazırlanan transfection ana Mix 22 µL 10 ⁶ hücrelerde x 0,5 her birimi resuspend. Hızlı bir şekilde hücreleri bir nucleocuvette şerit bir kuyu Merkezi odanın içine aktarın. Şerit istimal bilgisayar programı CB150 nucleofector cihaz ve nucleofect hücre yerleştirin.
   9. Nucleofection sonra hızlı bir şekilde 10 µM rock inhibitörü nucleofected hücrelerinin her de içeren prewarmed mTESR1 orta 80 µL ekleyin. Karışımı yavaşça yukarı ve aşağı pipetting.
   10. Yavaşça hücreleri şerit wells membran önceden kaplanmış 12-şey plaka ile adım 3'te hazırlanan kaya inhibitörü mTeSR1 orta içeren transfer.
   11. Sonra 1 d, rock engelleyici olmadan taze mTeSR1 Orta'ya değiştirin. Hasat tek hücreli sıralama için nucleofection sonra 2-3 d hücreleri.
3. Tek hücreli izole edilmesi hedeflenen hiPSCs
   1. 2 x 10 ⁶ hücreler/jelatin-kaplı plaka % 10 FBS orta tohum tarafından 96-şey MEF plakaları sıralama önce bir gün hazırlamak. Yaklaşık 70-%80 klonların hayatta nucleofection sonra ve 2-3 MEF plakaları her düzenleme deneme için hazır olun.
   2. Gecede kuluçka takip değiştirmek 100 ile desteklenmiş orta (daha önce açıklandığı gibi) hESC orta ng /mL bFGF, 1 x SMC4 (yavaşlatıcılar) tek hücre canlılık geliştirmek için ortama eklenen ve yapışma teşvik etmek 5 mg/mL fibronektin.
   3. MTeSR1 12-şey plaka 1 ile desteklenmiş mTeSR1 orta hiPSCs orta yerine tek hücre sıralama önce en az 2 h için x SMC4.
   4. HiPSCs ortamından Aspire edin ve hücreleri nazikçe PBS ile yıkayın. Her kuyuda 500 µL hücre dekolmanı çözüm ekleyin ve PBS aspirating sonra 10 dk 37 ° C'de kuluçkaya. Her şey için 1 mL (unsupplemented) mTeSR1 ekleme ve yukarı ve aşağı birkaç kez hafifçe pipetting tek hücreli süspansiyon oluşturmak.
   5. 15 mL konik tüp ve santrifüj RT. aspiratı süpernatant de 200 x g, 5 min için hücre süspansiyon yerleştirin ve mTeSR1 1 mL hücrelerde resuspend.
   6. Tek hücreleri ile 100 mm meme 1. adımda hazırlanan 96-şey plakaların bireysel iyi bir hücre ile steril koşullarda bir hücre sıralayıcısı kullanarak hücreleri sıralamak.
   7. Dört gün sonra sıralama, koloni oluşumu belirgin; olmalıdır bu noktada kültür orta 1 ile desteklenmiş hESC orta yerine x SMC4.
   8. Sekiz gün sonra sıralama, orta hESC orta ve kültür 2 için eski yerine koymak ile ö
   9. 1 mg/mL collagenase için 20 dk kullanarak kolonileri ayırmak ve mTeSR1 kaya inhibitörü ile 24-şey zar kaplı levha için aktarabilirsiniz. Tek hücre klonlar büyümek ve genomik DNA'ları çoğaltma veya onları genişleyen sonra ayıklamak izin. Hedef DNA PCR tarafından yükseltmek için gen belirli astar kullanın.
   10. Kullanım parçası analyzer teçhizat PCR güçlendirilmiş hedef genomik bölgenin tüm klonların jel/boya ile them çalıştırarak başlangıç tarama için mix üretici göre ' s yönergeleri. Yazılım PROSize elde edilen parça boyutu ile numunelerinin çalışılabilmesi uygun merdiven ile karşılaştırarak tahmin ediyoruz. Beklenen sıralama ' düzenlenmiş ' kopyalar ve düzenleme onaylamak için sıralama veri veya silmeleri analiz.
   11. Monoallelic ve biallelic klonlar differentiating için PCR ve klon pJET1.2 vektör ile düzenlenen sıra yükseltmek. Sıralama için en az 8-10 klonlar gönderebilir ve bir veya her iki gen düzenleme onaylamak için işlem sırasını denetleyebilirsiniz.
   12. Bir kez başarıyla hedeflenen IPSC klonlar Genotipleme tespit edilmiştir, onlar değil kayıp pluripotency veya Kromozom anormallikleri sürecinde elde onaylamak için inceleyin.

Bu yayında, basit ama etkili bir iletişim kuralı IPSC üretimi için insan pankreas hücreleri entegrasyonu veya ayak izi-Alerjik Sendai virüs vektörler kullanarak takip ediyoruz. Şekil 1A programlama bu protokolü şematik gösterimi gösterir. İnsan pankreas hücreleri ticari olarak Prigrow III ortamda kültürlü ve Sendai yukarıda açıklandığı gibi virüs ile transduced satın alındı. Transduced iğ pankreas hücreleri şeklinde morfolojik değişiklikler sonra Sendai virüs iletim gün 0 ~ 5 gün boyunca belli etmedi ama sonra daha büyük bir çekirdeği ve nükleulus ile yuvarlak haline. Biraz erken kolonileri bir hafta sonrası iletim sonra görüldü ama onlar, bizim deneyim olduğu gibi tutuklandılar değil, bu koloniler hızlı bir şekilde ayırmak ve genellikle "erken kısmen programlanmış hücreler" Bu sağlam koloniler kurmak değil. Yaklaşık 10-15 gün sonrası iletim, küçük parlak kolonileri gözlendi ve büyüme (şekil 1B, sağ üst köşesinde) sonra tutuklandılar. İnsan IPSC kolonileri kompakt, açık kenarları ("tam olarak programlanmış hücreler" olarak kabul edilir) ile sıkı paketlenmiş (şekil 1B, gün 23 alt orta) ve "kısmen programlanmış hücreler" koloni (şekil 1B, boşluklar ile gevşek gün 23 sağ altta). Programlanmış pankreas hücresi kolonileri gün 18 (şekil 1Bsol alt) büyüyen edildi ve el ile gün 23 (şekil 1B, alt orta) tarafından çekilmesi için yeterince büyük. Kolonilerin membran kaplı Tabaklarda IPSC besleyici ücretsiz almak için malzeme çekme sonra gün 30-40 (şekil 2A, sol) kaplama. Bazı 'sağlam' bu Besleyici-Alerjik kolonileri genişletilmiş ve alkalen fosfataz, Nanog ve yüzey işaretleyicileri koşullarda besleyici-Alerjik bir ifade için karakterize. Test tüm klonlar parlak kırmızı tahlil (şekil 2A, sağ) sonra dönerken alkalen fosfataz için olumlu idi. Pluripotent işaretleri OCT4, MİCRORNAS, SSEA4, TRA-1-60 ve TRA-1-81 da son derece tüm klonlar immunostaining veya FACS analizi (şekil 2B ve şekil 3A) tarafından ifade edilecek tespit edildi.

Bu sonuçlar pankreas hücreleri oluşturulan insan IPSC kolonileri pluripotency işaretleri koşullarda besleyici-Alerjik ifade gösterilmektedir. Pluripotent aynı zamanda yönettiği üç germ katmanlara insan IPSC farklılaşma tarafından değerlendirildi: ektoderm, mesoderm ve endoderm. Klonlar membran üzerinde kuvvetli TUJ1 pozitif nöronlar (ektoderm), NKX2-5-pozitif dayak cardiomyocytes (mesoderm) ve SOX17-pozitif endodermal hücreleri (şekil 3B) farklı.

Ayrıntılı karakterizasyonu sonra 3 sağlam, besleyici-Alerjik IPSC klonal satırları genom çalışmaları düzenleme için seçilmiştir. BsaI ucunda kesme siteleri her gen birbirine yakın kesmek tasarlanmıştır ile iki kılavuzları (Yani, n daha az ~ 100 bp). Protokol şeması şekil 4' te gösterilmiştir. Bu silme işlemini strateji bize izin hedef genlerin için kolayca birinci veya ikinci exon bir genin bir bölümünü silmek için kullanılır. Bu strateji çok verimli ve her denemede düzenlenen klonlar ayırabilirsiniz. Kılavuzları içine sindirilmiş BsaI vektör ve yukarıda açıklandığı gibi transkripsiyonu vitro klonlanmış. Biz nucleofected kılavuzları (RNA) ve Cas9 protein RNP kompleksleri düzenleme hızlı ve etkili olarak. Hücre membran kaplı plakalar üzerinde tek başına göre hücreleri ile karşılaştırıldığında daha yüksek değildir aynı zamanda hücreleri tek hücre MEFs olarak sıralanır. Genomik DNA izole tüm klonlar, hedef bölümü PCR tarafından güçlendirilmiş ve parça Çözümleyicisi'hedef parçaları ile karşılaştırıldığında denetimleri boyutlarda değişiklikler için ekran üzerinde çözüldü. Parça boyutu 'düzenlenen' klonlar (şekil 4, alt) algılamak için örnekleri ile çalıştırmak merdivene karşılaştırıldı. Gidebiliriz gibi bu klonlar tarama kolay > bir tabak ve sonuçları 90 klonlar ± 3 bp doğruluk ile elde. Seçili klonlar sonra vahşi tipi ve mutasyona uğramış klonlar onaylamak için sıralı. Mutasyona uğramış klonlar wildtype göre sırayla ekleme ya da silme varken Wildtype klonlar hiçbir silme veya ek üslerinin vardı. Silme veya ek sıralama içinde gösterilen klonlar sıralama klonlama başına en az 8-10 kolonileri tarafından monoallelic ve biallelic klonlar tanımlamak için genişletilmiş ve klonlanmış içine pJET1.2 vektör vardı. Monoallelic klonlar silinmiş veya bir formda eklendi üsleri vardı ve diğer değiştirilmemiş ve wildtype alleli benzer. Biallelic klonlar silme işlemleri her iki gen vardı. Yaklaşık üç yüz klonlar için yaklaşık 9 monoallelic silme klonlar ve 3 biallelic silme klonlar her durumda tanımlanan tüm hedef genlerin gösterildi. Bu kabaca 3 kat azaltılması için sıklıkla monoallelic klonlar için karşılaştırıldığında biallelic klonlar nesil karşılık gelir. Heterojenite silme amplicons içinde kusurlu ve tutarsız NHEJ onarım yansıtıyordu. Gen ifadesinin sonunda RNA Hedef hücrelerden ayıklanması ve RT-PCR performans tarafından teyit edildi.

Şekil 1: Besleyici-Alerjik pluripotent hücreler (IPSC) için insan pankreas hücrelerinin yeniden programlama. (A) A şematik Protokolü IPSC insan pankreas hücreleri gelen nesil için gösterilir. Pankreas hücreleri kollajen kaplı Tabaklarda büyüdü ve sonra insan Sendai virüs vektörel çizimler ile iletim sonra MEFs için transfer. Tamamen yeniden programlanan kolonileri sonra nitelikli hESC membran için transfer ve ile karakterizedir. (B) Morphological Sendai virüs iletim sonra değiştirir. İletim önce pankreas hücreleri tipik iğ gibi Morfoloji (üst, sol gün 0) gösterir. Küçük, dar kolonileri insan pluripotent hücre kolonileri benzeyen gündüz 12, MEFs üzerinde görünür. Normalde tam olarak programlanmış insan IPSC kolonileri çok net sınırlar var ve gün 23-30 tarafından alınabilir. Gün 23 Disosiye Colony'de altta doğru gösterilir. Tüm görüntüleri 100 X büyütme (10 X objektif ve 10 X mercek) ele geçirildi. Ölçek çubuğu 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: insan IPSC karakterizasyonu. (A) A tipik faz kontrast görüntü sonra malzeme çekme ve kültür koşullarda besleyici-Alerjik bir IPSC koloninin (40 X, 4 X objektif ve 10 X mercek; sol) Sendai virüs pankreas hücrelerinin yeniden şekillendirmek için sonra. Alkalen fosfataz kırmızı IPSC koloni lekeli hakkıdır. Alkalen fosfataz boyama için IPSC kolonileri tespit edildi ve takımı'ndan substrat çözeltisi eklenmesi sonra kırmızı lekeli. Görüntüleri X 40 at ele geçirildi. (B) Immunostaining pluripotency işaretleri MİCRORNAS ve OCT3/4'te besleyici içermeyen insan pankreas hücre kaynaklı iPSCs. DAPI çekirdeği bir denetim olarak mavi leke için kullanıldı. Tüm görüntüleri 100 X büyütme oranında alındı. Ölçek çubuğu tüm görüntülerde 100 µm =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: CRISPR/Cas9 silme strateji şematik. SgRNA iki tane oldu tasarlanmış (işaretli kırmızı) vasıl belgili tanımlık son tercihen (F ve R gösterilen) kesme siteleri ilk exon hedefleme komplementer BsaI ile sıralı BsaI sindirilmiş değiştirilmiş vektörde (pCR2.1, BsaI sitesi vurgulanan gri), klonlanmış ve vitro tercüme. BsaI sindirim sonra silinmiş part vektör altı çizili dizisini gösterir. Astar eleme nokta mavi renkle belirtilmiş. Cas9 ve RNA'ların vardı nucleofected besleyici-Alerjik IPSC genomik silme işlemleri için bir kompleks olarak rehberlik. o zaman kültürlü, 96-şey MEF Tabaklarda, sıralanmış tek hücre membran için transfer, genişletilmiş ve parça Çözümleyicisi tarafından ekranlı iPSCs vardı. Çözümleyici üzerinde örnekleri çalıştırmak için genomik DNA'lar Cas9 ve transfected Kılavuzu klonlar membran üzerinde çıkarılan ve potansiyel 'düzenlenen' klonlar (alt orta) seçmek için Çözümleyicisi'ndeki jel/boya karışımı ile geçti. İlgili merdiven işaretleri, WT ve potansiyel düzenlenen klonlar işaretlenir. Ifade genin RNA ayıklanması ve Q-PCR ile analiz tarafından doğrulandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

İnsan somatik hücre iPSCs için yeniden programlama temel Biyoloji Araştırma, kişiselleştirilmiş tıp, hastalık modelleme, ilaç geliştirme ve rejeneratif tıp¹⁶alanlarında önemli bir destek sağlamıştır. Virüs ana bilgisayar genom entegrasyon riski olan insan IPSC üretimi birçok mevcut ve yaygın olarak kullanılan yöntem kullanması veya verimliliği yeniden programlama episomal Vektörler ile düşük. Burada, besleyici-Alerjik iPSCs 'ayak izi ücretsiz' ve verimli yeniden programlama yol açar Sendai-virüs ile insan pankreas hücreleri oluşturmak için verimli bir yöntem mevcut. Elde edilen insan iPSCs viral transgenes ücretsiz, Nanog korumak ve bilinmeyen eksojen etken kullanmaktan kaçının. İPSCs koşullarda besleyici-Alerjik nesil düşük programlama verimlilik, vardır, bu yüzden biz besleyici hücreleri üzerinde birincil pankreas hücreleri reprogrammed ve koloniler besleyici-Alerjik membran genişleme, kültür ve karakterizasyonu için taşındı. Bu tekniklerin füzyon kararlı, güvenilir ve daha verimli IPSC programlama sağlar.

Biz de iPSCs insan fibroblast ve diğer Primer hücre Sendai-virüs çeşitli hücre yeniden programlamak için kullanılabilir da anlaşılacağı bu yöntemle üretilen. Önemli dikkat edilmesi gerekenler şunlardır: verimliliği; yeniden programlama çok az ya da çok fazla hücre etkileri yeniden programlanan gerek Primer hücre en iyi confluency için Primer hücre hala en iyi şekilde bölünmesi zaman hücre bir önceki geçiş; o sonuçlarında az hücre Apoptozis ve kolay almak sağlam kolonileri için önde gelen bir yüksek verimlilik dikkatli titrasyon viral vektörler; PCR tarafından Sendai vektör transgene ifade iPSCs 'ayak izi ücretsiz'; emin olmak için 10-15 pasajlar kaybı doğrulanıyor ve IPSC membran üzerinde kültür için sıkı steril koşullar.

CRISPR genom değiştirme uygun ve verimli yöntemi IPSC genom düzenlemek için kullanılır. Bu teknik Cas9 protein ve sgRNA, RNP kompleksleri tanımak ve Tamamlayıcı DNA dizileri ayırmak için birleştirir. Genomik sürecini sadece 20 bp Kılavuzu RNA değiştirerek hedef kolayca adapte edilebilir. Bizim yöntem verimli ve tekrarlanabilir oldukları gibi daha emek yoğun, transduce zor insan iPSCs düzenleme ve diğer hücrelere korumak pahalı için kolay bir protokol sağlar. Biz her hedef gen için en az iki bitişik ama üst üste kılavuzları astar eleme tek bir dizi düzenlenen klonlar eleme için kullanılabilir tasarlayın. Buna ek olarak, iki kılavuzları ~ 30-100 bp ayrı kullanımı sırasında ön elemeyi kolayca görüntülenmeyecektir ve protein tükenmesi sağlar büyük bir silme işlemi oluşturur. Kılavuzları HEK-293 hücrelerdeki başlangıçta verimliliği IPSC içinde tahlil başlamadan önce tahmin etmek için test edilebilir. Ayrıca, reaktifler rutin transfection IPSC içine için parametreleri kurmak için önemlidir. PMAXGFP plazmid, transfection verimliliği kullanarak > % 80 ve gen hedefleme/bozulma verimliliği iPSCs % 3-10 rutin olarak elde edilir. Cas9 RNP kompleksleri doğrudan teslim bizim protokolündeki hücreye hızlı eylem ve hızlı devir oranı sağlar ve yüksek oranda hedeflenen değişiklik korur. Kılavuzları ve Cas9 protein nucleofection sıralama bizim yaklaşım istihdam tek hücre içinde gene hedefleme önemli bir engel aşmak IPSC nüfus karışık ve hücrelerin clonality sağlanması. Bu 'yeni' genel yaklaşımın doğru sözlü, multiplex kolay, sadece birkaç hafta sürer ve herhangi bir antibiyotik seçimi gerektirmez. Biz herhangi bir kayıp verimlilik sırayla içine bir hücre ya da iPSCs, CRISPRs silmeler tanıtan rağmen gözlemleme karyotip analizi genomik istikrarı sağlamak için bu gibi durumlarda yapılması gerekiyor. Klonlar da pluripotency işaretleri ifade için kontrol edilmelidir. Bu yayın, bu iletişim kuralı değil odak noktası kesin genetik değişiklik transfection kokteyl^17,18içinde onarım şablon içinde olmak üzere ikna etmek için ortak seçti olmasına rağmen.

Son olarak, bizim deneyime dayalı, iletişim kuralı düzenleme IPSC için önemli dikkat edilmesi gerekenler şunlardır: rasyonel tasarım kılavuzları tamamen hedef mutasyonlar bölgede özellikle "tohum" veya değiştirilen; PAM motifi yakın kapalı önlemek veya en aza indirmek için RNPs teslim edilmesini sağlamak için iPSCs nucleofection verimliliği en iyi duruma getirme; hazır kılavuzları; kalitesini doğrulama titrasyon Kılavuzu ve Cas9 protein konsantrasyonları ve faaliyetlerini içinde vitro biyokimyasal bölünme deneyi veya HEK olarak insan cellssuch bu makalede açıklandığı gibi bu hücreleri doğrulama kültür için daha kolay ve transfect; günlük büyüme ve ~ %50 confluency ulaşan aşamasındadır erken geçiş iPSCs kullanımı; dikkatli işleme nazik orta içeren hücrelerin hücre hayatta kalmasını sağlamak için tek hücre sıralama takip değiştirir.

Biz yeterli ayrıntılı olarak tarif yukarıda anahatları belirlenmiş iletişim kuralı okuyucuları üreten ve tekrarlanabilir bir moda IPSC düzenleme için bir yol haritası ile donatmak olacaktır inanıyorum.

BT yenilemek Biosciences Inc.'in kurucu üyesi olduğu

Laboratuvar çalışmalarında Dr Anjali Nandal için doktora sonrası bursu grant ve keşif grant tarafından desteklenen Maryland kök hücre araştırma fonu için BT (TEDCO).