Method Article
Dieses Protokoll beschreibt im Detail die Generation der Fußabdruck-freie induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse in den Feeder-freien Bedingungen, gefolgt von Bearbeitung mit CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins und Charakterisierung der geänderten einzellige Klone.
Embryonalen und induzierte pluripotente Stammzellen können selbst zu erneuern und in mehreren Zelltypen des Körpers differenzieren. Die pluripotenten Zellen sind somit für die Forschung in der regenerativen Medizin begehrt und werden derzeit in klinischen Studien für Augenerkrankungen, Diabetes, Herzkrankheiten und anderen Erkrankungen. Das Potential, sich in spezialisierte Zelltypen, gekoppelt mit der jüngsten Fortschritte im Genom Bearbeitung Technologien einschließlich der CRISPR/Cas-System differenzieren haben zusätzliche Möglichkeiten für die Anpassung des Genoms des iPSC für die verschiedensten Anwendungen zur Verfügung gestellt einschließlich der Krankheit Modellierung, Gentherapie, und Vorspannen Wege der Differenzierung, um nur einige zu nennen. Unter den verfügbaren Bearbeitungen Technologien hat CRISPR/Cas9 von Streptococcus Pyogenes als ein Werkzeug der Wahl für die standortspezifische Bearbeitung des eukaryotischen Genoms entstanden. Das CRISPR sind leicht zugänglich, kostengünstig und höchst effizient in technische gezielte Bearbeitungen. Das System benötigt einen Cas9-Nuklease und ein Führer-Sequenz (20-Mer) spezifisch für die genomische Ziel anschlagenden ein 3-Nukleotid "NGG" Protospacer-neben-Motiv (PAM) für die Ausrichtung der Cas9 auf die gewünschte genomischen Locus, neben einem universellen Cas9 Bindung Tracer RNA ( zusammengerufen einzelne Führer RNS oder SgRNA). Hier präsentieren wir Ihnen eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für die effiziente Erzeugung von Feeder-unabhängig und frei von Fußabdruck iPSC und beschreiben Methoden für die Genom-Bearbeitung der iPSC mit Cas9 Ribonucleoprotein (RNP) komplexe. Das Genom Bearbeitung Protokoll ist effektiv und kann leicht durch Pre-Komplexbildner SgRNAs für mehr als ein Ziel mit dem Cas9 Protein und gleichzeitig in die Zellen liefern gemultiplext werden. Schließlich beschreiben wir einen vereinfachten Ansatz zur Identifizierung und Charakterisierung von iPSCs mit gewünschten Bearbeitungen. Zusammengenommen dürften die skizzierten Strategien zur Erzeugung und Bearbeitung von iPSC für vielfältige Anwendungen zu optimieren.
Die Neuprogrammierung der menschlichen Körperzellen zu pluripotenten Zustand durch Überexpression der Neuprogrammierung Faktoren hat Stammzellenforschung mit Anwendungen in der Krankheit Modellierung, regenerative Medizin und Arzneimittelentwicklung revolutioniert. Mehrere nicht-viralen Neuprogrammierung Methoden sind lieferbar Umprogrammierung Faktoren und iPSCs zu generieren, aber der Prozess ist Arbeit intensiv und nicht sehr effizient1. Die virale Methoden sind zwar effizienter, mit Problemen der Virus Integration und Tumorigenität2,3,4. In diesem Manuskript berichten wir über die Verwendung von zytoplasmatischen Sendai-Virus für liefernde Umprogrammierung Faktoren und iPSC-Fußabdruck-freie Linien, die Integration von einer viralen Vektoren Sequenzen in ihre Genome5fehlt. Sendai-Virus ist ein RNA-Virus, wird aus der Zelle Zytoplasma ~ 10 Passagen nach Infektion verdünnt und produziert Neuprogrammierung Faktoren in Hülle und Fülle, führt zu schnellen und effizienten Umprogrammierung6,7. Die etablierten iPSCs können dann ohne weiteres Feeder-freies Medium zu vermeiden die Verwendung von Maus embryonalen Fibroblasten (MEFs) als Feeder Zellen8umgestellt werden.
In dieser Publikation neben umreißt das Sendai-Virus vermittelt Neuprogrammierung erläutern wir im folgenden eine verbesserte Protokoll zur Bearbeitung iPSCs, hat das Potenzial, unbegrenzte menschliche Zellen mit gewünschten genetischen Veränderungen für die Forschung zu liefern. Wir haben CRISPR/Cas9 Technologie zur Modifikation der iPSCs, verwendet, die nun für eine breite Palette von Anwendungen, einschließlich Knock-ins und Knockouts, groß angelegte genomische Deletionen, gepoolte Bibliothek screening für gen-Entdeckung, Gentechnik verwendet wird zahlreiche Modellorganismen, und Gen-Therapie9,10,11. Diese Technik beinhaltet die Bildung von komplexen von Streptococcus Pyogenes-abgeleitete Cas9 Nuklease und 20-Mer guide RNAs, die Zielerfassung über Basis-Paarung mit genomischen Zielsequenz angrenzend an 3' Nukleotid Protospacer angrenzenden erreichen Motiv (PAM) Sequenz. Die Cas9-Nuklease induziert eine gestrandete Doppelunterbrechung ~ 3 Nukleotide aus der PAM-Website, die vorwiegend durch nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ) Weg Insertionen oder Deletionen in den offenen Leserahmen anschließend repariert und damit funktionsfähig ist Ko von Genen12.
Unsere verbesserte Protokoll enthält die Details für die Kultur der menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse, deren Neuprogrammierung auf mitotically inaktiviert Maus embryonalen Fibroblasten (MEFs) höheren Wirkungsgrad der Neuprogrammierung, nachträgliche Anpassung an Feeder-freie Kultur auf Matrigel, Charakterisierung von etablierten iPSCs geführte CRISPR RNA Design und Vorbereitung, Lieferung in iPSCs als RNP-komplexe, einzelne Zelle Sortierung klonale Linien des bearbeiteten iPSCs generieren, einfach screening und Identifizierung von Bearbeitungen und Charakterisierung der einzelne Zelle klont. Genomische Deletionen wurden in dieser Studie effizient erzeugt, durch die Einführung von Cas9 Protein und zwei CRISPR SgRNA RNP komplexe induzieren doppelte gestrandete Pausen (DSB) und segmentieren Sie löschen die einzugreifen. Diese Methode nutzt die Verwendung von zwei Guides zur Erzeugung von Löschungen in den offenen Leserahmen, hohe Leistungsfähigkeit des NHEJ führt zu geringen Anzahl von Klone dieser Notwendigkeit charakterisiert werden und einfache Vorauswahl der Klone durch automatisierte Kapillar Elektrophorese-Einheit, Fragment Analyzer. Diese effektive Genom Bearbeitungsmethoden um menschliche stammzellbasierte Krankheitsmodelle generieren werden bald ein standard und Routine Ansatz in jedem Stammzell-Labor. Zu guter Letzt präzise Genom-Bearbeitung machen es möglich, über Stammzellen Krankheit Modellierung und potenziell könnte helfen, zellbasierte Therapien zu katalysieren.
1. Umprogrammierung Protokoll
2. Bearbeitung des menschlichen Genoms iPSC verwenden CRISPR-Cas9
In dieser Publikation haben wir eine einfache, aber effiziente Protokoll für die Generation der iPSC aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse mit Integration oder Fußabdruck-kostenlose Sendai Virus Vektoren verfolgt. Abbildung 1A zeigt eine schematische Darstellung dieses Neuprogrammierung Protokolls. Die menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüsen waren kommerziell, erworben in Prigrow III Medium kultiviert und ausgestrahlt mit Sendai-Virus wie oben beschrieben. Ausgestrahlt Spindel förmigen Zellen der Bauchspeicheldrüse zeigte keine morphologischen Änderungen für ca. 5 Tage nach Sendai Virus Transduktion am Tag 0, aber dann mit größeren Kern und Kernkörperchen abgerundet werden. Einige frühe Kolonien wurden nach einer Woche Post-Transduktion gesehen aber sie wurden nicht aufgenommen, wie in unserer Erfahrung, diese Kolonien schnell distanzieren und sind in der Regel die "frühen teilweise umprogrammierten Zellen" feststellen, dass nicht robustere Kolonien. Ca. 10-15 Tage nach dem Transduktion, kleine helle Kolonien wurden beobachtet und nach Wachstum (Abbildung 1 b, oben rechts) abgeholt wurden. Menschlichen iPSC Kolonien sind kompakt, dicht gepackt mit klaren Kanten (gilt nicht als "voll reprogrammierten Zellen") (Abbildung 1 b, Tag 23 unten in der Mitte) und 'teilweise reprogrammierte Zellen' sind locker mit Lücken in der Kolonie (Abbildung 1 b, Tag 23 unten rechts). Die umprogrammierten Pankreas Zelle Kolonien wuchsen am Tag 18 (Abbildung 1 bLinks unten) und waren groß genug, um manuell vom Tag 23 (Abbildung 1 b, unten in der Mitte) abgeholt werden. Die Kolonien wurden auf Membran-beschichteten Platten vernickelt nach der Ernte zu Feeder-freien iPSC von Tag 30-40 (Abbildung 2A, links). Einige dieser "robust" Feeder-freie Kolonien wurden erweitert und für den Ausdruck der alkalischen Phosphatase, Pluripotenz und Oberflächenmarker im Feeder-freien Bedingungen gekennzeichnet. Alle Klone getestet wurden positiv für alkalische Phosphatase, da sie leuchtend rot nach Assay (Abb. 2A, rechts) gedreht. Die Pluripotenz Marker OCT4, NANOG, SSEA4, TRA-1-60 und TRA-1-81 wurden auch beobachtet, um hoch alle Klone von Immunostaining oder FACS-Analyse (Abb. 2 b und Abbildung 3A) zum Ausdruck gebracht werden.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die menschlichen iPSC-Kolonien, die aus Zellen der Bauchspeicheldrüse erzeugt Pluripotenz Marker in den Feeder-freien Bedingungen ausgedrückt. Die Pluripotenz wurde auch durch gezielte Differenzierung der menschlichen iPSC, drei Mikrobeschichten beurteilt: Ektoderm, Mesoderm und Entoderm. Klone auf Membran differenziert potent TUJ1-positiven Neuronen (Ektoderm), NKX2-5-positiven schlagende Herzzellen (Mesoderm) und endodermische SOX17-positiven Zellen (Abb. 3 b).
Nach gründlichen Charakterisierung wurden 3-robust, Feeder-freie iPSC klonalen Linien für das Genom Bearbeitung Studien ausgewählt. Die beiden Führungen mit BsaI Schnitt Standorte an Enden für jedes Gen entwickelt wurden, nahe beieinander zu schneiden (z.B. n weniger als ~ 100 bp). Die schematische Darstellung des Protokolls ist in Abbildung 4dargestellt. Diese Löschung Strategie verwendet für die Zielgene erlaubt uns einen Teil der ersten oder zweiten Exon eines Gens problemlos löschen. Diese Strategie war sehr effizient und wir könnten bearbeitete Klone in jeden Versuch isolieren. Die Guides waren in BsaI verdaut Vektor- und in-vitro- transkribiert wie oben beschrieben geklont. Wir Nucleofected Führer (RNAs) und Cas9 Protein als RNP-komplexe für die schnelle und effektive Bearbeitung. Wir sortiert auch die Zellen als Einzelzellen auf MEFs, wie Wiederherstellung von Zellen höher im Vergleich zu den Zellen einzeln auf Membran-beschichteten Platten sortiert ist. Genomischer DNA wurde aus alle Klone isoliert, der Ziel-Teil war durch PCR verstärkt und Fragment Analyzer zum Bildschirm für Änderungen in den Größen von Ziel-Fragmente im Vergleich zu den Steuerelementen behoben. Die Fragmentgröße war im Vergleich zu der Leiter laufen mit den Proben zu "bearbeitete" Klone (Abbildung 4, unten) zu erkennen. Das Screening der Klone als wir, durch gehen konnte leicht gemacht > 90 Klone in einer Platte und die Ergebnisse wurden mit einer Genauigkeit von ± 3 bp erhalten. Die ausgewählten Klone wurden dann bestätigen Wildtyp und mutierte Klone sequenziert. Wildtyp-Klone hatte keine Löschung oder Zugabe von Basen mutierte Klone entweder hinzufügen oder löschen in der Sequenz im Vergleich zu den Wildtyp. Die Klone zeigten Streichung oder Ergänzung in der Sequenzierung erweitert und in geklonten pJET1.2 Vektor, monoallelisches und biallelische Klone durch Sequenzierung von mindestens 8-10 Kolonien pro Klonen zu identifizieren. Monoallelisches Klone hatten Basen in einem Allel hinzugefügt oder gelöscht und der andere war unverändert und ähnlich wie das Wildtyp-Allel. Biallelische Klone hatte Löschungen in beide Allele. Rund liefen drei hundert Klone für alle Zielgene, die etwa 9 monoallelisches Löschung Klone und 3 biallelische Löschung Klone in jedem Fall identifiziert. Dies entspricht in etwa zu einer Verringerung der 3-fold in der Frequenz der Generation biallelische Klone im Vergleich zu monoallelisches-Klone. Heterogenität innerhalb der Löschung Amplifikate reflektiert unvollkommen und inkonsistente NHEJ Reparatur. Die Expression des Gens wurde schließlich durch die Gewinnung von RNA von Zielzellen und die Durchführung der RT-PCR bestätigt.
Abbildung 1: Reprogrammierung von menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse, Feeder-freie pluripotente Zellen (iPSC). (A) A schematische Protokoll für die Generation der iPSC aus menschlichen Zellen in der Bauchspeicheldrüse wird angezeigt. Die Zellen der Bauchspeicheldrüsen wurden auf Kollagen-beschichteten Platten angebaut und dann auf MEFs nach Transduktion mit menschlichen Sendai Virus Vektoren übertragen. Die komplett neu programmiert Kolonien wurden dann auf hESC qualifiziert Membran übertragen und gekennzeichnet. (B) Morphological ändert sich nach Sendai Virus Transduktion. Bevor Sie die Signalweiterleitung zeigen Zellen der Bauchspeicheldrüse typische Spindel-ähnliche Morphologie (oben links, Tag 0). Kleine, enge Kolonien erscheinen auf MEFs tagsüber 12, ähnlich wie menschliche pluripotente Zelle Kolonien. Normalerweise vollständig umprogrammierten menschlichen iPSC-Kolonien haben sehr klare Grenzen und können durch Tag 23-30 abgeholt werden. Eine dissoziierte Kolonie am 23. Tag wird unten rechts angezeigt. Alle Bilder wurden bei 100 X Vergrößerung (10 X-Objektiv und 10 X Okular) aufgenommen. Maßstabsleiste = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Charakterisierung der menschlichen iPSC. (A) A typische Phase Kontrast Bild einer iPSC-Kolonie nach Kommissionierung und Kultur in den Feeder-freien Bedingungen (40 X, 4 X Objektiv und 10 X Okular; links) nach Sendai Virus Neuprogrammierung des Pankreaszellen. Alkalischer Phosphatase gefärbt rot iPSC Kolonie ist auf der rechten Seite. Für die alkalische Phosphatase Färbung, die iPSC Kolonien wurden behoben und rot gefärbt, nach Zugabe von Substratlösung aus dem Kit. Die Bilder wurden bei 40 X aufgenommen. (B) Immunostaining für Pluripotenz Marker NANOG und OCT3/4 Zoll Feeder-freien menschlichen pankreatischen Zelle abgeleitet iPSCs. DAPI wurde verwendet, um den Kern als Steuerelement blau färben. Die Bilder wurden bei 100 X Vergrößerung. Maßstabsleiste = 100 µm in allen Bildern. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Schematische CRISPR/Cas9 Löschung Strategie. Ein SgRNA paar war gestaltete (rot markiert) mit BsaI geschnittenen Seiten Ende (dargestellt als F und R) vorzugsweise Ausrichtung der erste Exon geglüht, geklont in BsaI verdaut modifizierte Vektor (pCR2.1, BsaI Seite hervorgehoben grau), sequenziert und in-vitro- übersetzt. Die unterstrichenen Vektor zeigt des Teil nach BsaI Verdauung gelöscht. Die Position von screening-Primer wird in blau angezeigt. Cas9 und RNAs zu führen, waren Nucleofected im Feeder-freien iPSC als ein Komplex für genomische Deletionen. iPSCs wurden dann einzelne Zelle auf 96-Well-MEF-Platten, kultiviert, sortiert auf Membran übertragen, erweitert und mit Fragment Analyzer durchleuchtet. Für die Proben auf der Analyzer ausgeführt, wurden genomische DNA Cas9 Führer transfizierten Klone auf Membran extrahiert und durchlaufen die Gel/Farbstoff-Mix in den Analyzer für potenzielle "bearbeitete" Klone (Mitte unten) auswählen. Die zuständigen Leiter Marker, WT und potenzielle bearbeitete Klone sind gekennzeichnet. Die Expression des Gens wurde durch RNA extrahieren und mit Q-PCR Analyse bestätigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Umprogrammierung der menschlichen Körperzellen zu iPSCs hat einen wichtigen Impuls für die Felder der Grundlagenbiologie Forschung, personalisierte Medizin, Krankheit Modellierung, Arzneimittelentwicklung und regenerative Medizin16zur Verfügung gestellt. Viele aktuelle und am weitesten verbreitete Methoden der menschlichen iPSC Generation erfordern den Einsatz von Virus mit dem Risiko einer Integration in das Wirtsgenom oder episomal Vektoren mit geringer Effizienz Umprogrammierung. Hier präsentieren wir Ihnen eine effiziente Methode zur Erzeugung von Feeder-freie iPSCs aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse mit Sendai-Virus, führt zu "Fußspur frei" und effiziente Umprogrammierung. Die daraus resultierenden menschlichen iPSCs sind frei von viralen transgene, Aufrechterhaltung der Pluripotenz und vermeiden Sie die Verwendung von unbekannten exogene Faktoren. Die Generation der iPSCs im Feeder-freien Bedingungen hat geringen Neuprogrammierung Effizienz, so dass wir die primäre Zellen der Bauchspeicheldrüsen auf Feeder-Zellen umprogrammiert und zog dann die Kolonien nach Feeder-freie Membran für Expansion, Kultur und Charakterisierung. Die Fusion dieser Techniken bietet stabile, verlässliche und effizienter iPSC-Programmierung.
Mit dieser Methode, was darauf hindeutet, dass Sendai-Virus verwendet werden, um die Vielzahl von Zellen neu zu programmieren wird auch iPSCs aus menschlichen Fibroblasten und andere primäre Zellen erzeugt. Wichtige Überlegungen sind: für optimale Konfluenz von Primärzellen müssen umprogrammiert werden, als zu wenige oder zu viele Zellen Auswirkungen Umprogrammierung Effizienz; eine frühere Passage von Primärzellen, wenn die Zellen noch optimal einteilen sind; sorgfältige Titration von der viralen Vektoren, dass die Ergebnisse bei minimalen Zellapoptose und einen hohen Wirkungsgrad zu einfach abholen der robuste Kolonien; überprüfen den Verlust von Sendai Vektor Transgene Ausdruck durch PCR an 10-15 Stellen um sicherzustellen, dass die iPSCs "Fußspur frei"; und streng sterilen Bedingungen für Kultur des iPSC auf Membran.
Wir verwendet eine komfortable und effiziente Methode der CRISPR Genom Änderung um das iPSC-Genom zu bearbeiten. Diese Technik kombiniert Cas9 Protein und SgRNA, RNP-komplexe zu erkennen und die komplementären DNA-Sequenzen zu Spalten. Ziel eine genomische Sequenz durch einfaches Ändern der 20 bp Guide RNA kann leicht angepasst. Unsere Methode bietet eine einfache Protokoll für effiziente und reproduzierbare Bearbeitung des menschlichen iPSCs sind arbeitsintensiver, schwer zu transduzieren und teuer im Unterhalt als andere Zellen. Wir entwerfen mindestens zwei benachbarte aber nicht überlappende Führer für jede Zielgen, sodass eine einheitliche Screening-Primer für das screening der bearbeiteten Klone verwendet werden kann. Verwendung von zwei Guides ~ 30-100 bp auseinander erzeugt darüber hinaus eine große Deletion, die leicht visualisiert werden, während der Vorauswahl und sorgt für Abbau des Proteins. Die Führungen können in HEK-293-Zellen zunächst auf Effizienz schätzen vor Beginn des Tests in iPSC getestet werden. Darüber hinaus ist es wichtig, die Parameter für die routinemäßige Transfektion von Reagenzien in iPSC zu etablieren. Mit pMAXGFP Plasmid, Transfektion Wirkungsgrade von > 80 % und Gene targeting/Störung Wirkungsgrade von 3-10 % iPSCs werden routinemäßig erreicht. Die direkte Zustellung der Cas9 RNP-komplexe in Zellen in unserem Protokoll sorgt für schnelles Handeln und schnelle Umsätze und hohe Rate der gezielten Veränderung unterhält. Unser Ansatz beschäftigt einzelne Zelle sortieren nach Nucleofection von Leitfäden und Cas9 Protein, Überwindung ein erhebliches Hindernis gen gezielt iPSC Bevölkerung vermischt und die Infektionsstaus der Zellen zu gewährleisten. Dieser "Roman" Gesamtkonzept ist unkompliziert, einfach, multiplex, dauert nur ein paar Wochen und erfordert keine antibiotische Auswahl. Wir waren nicht darauf bedacht den Verlust in Effizienz durch die Einführung von Löschungen von CRISPR sequentiell in eine Zelllinie oder iPSCs, obwohl Chromosomen Analyse muss in solchen Fällen um genomische Stabilität vorgenommen werden. Die Klone sollte auch für den Ausdruck der Pluripotenz Marker überprüft werden. Obwohl kein Schwerpunkt dieser Publikation, dieses Protokoll hinzugewählt genaue genetische Veränderung induzieren, indem unter anderem die Reparatur Vorlage in der Transfektion cocktail17,18sein kann.
Schließlich, basierend auf unserer Erfahrung, wichtige Überlegungen für iPSC bearbeiten Protokoll sind: rationales Design Guides zu minimieren oder ganz zu vermeiden aus Ziel Mutationen vor allem im Bereich"Samen" oder in der Nähe von PAM Motiv geändert wird; Optimierung der Effizienz der Nucleofection in die iPSCs um Lieferung von RNPs zu gewährleisten; Überprüfung der Qualität der vorbereiteten Guides; Titration der Führer und Cas9 Proteinkonzentrationen und Validierung ihrer Tätigkeit durch biochemische Spaltung in-vitro- Tests oder wie beschrieben in diesem Artikel im menschlichen Cellssuch als HEK Zellen, die sind einfacher zu Kultur und transfizieren; die Verwendung von frühen Durchgang iPSCs, die in der Log-Phase des Wachstums und der ~ 50 % Konfluenz zu erreichen sind; sorgfältiger Umgang mit Zellen mit sanften Medium ändert sich nach einzelnen Zelle sortieren um das Überleben der Zellen zu gewährleisten.
Wir glauben, dass die oben beschriebenen Protokoll abgegrenzt ausreichend detailliert die Leser mit einem Fahrplan zu erzeugen und Bearbeiten von iPSC in reproduzierbarer Weise ausstatten wird.
BT ist ein Gründungsmitglied der renovieren Biosciences Inc.
Arbeit im Labor wurde unterstützt von Postdoc Fellowship-Stipendium an Dr. Anjali Nandal und explorative Grant aus Maryland Stem Cell Research Fund zu BT (TEDCO).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Sendai viral vectors - CytoTune-iPS 2.0 Kit | Invitrogen | A16517 | Thaw on ice; S No: 1 |
Trypsin EDTA | Gibco Life Tech | 25300-054 | 0.05%, 100 ml; S No: 2 |
Rock inhibitor (Y-27632) | Milipore | SCM075 | Use 10 μM; S No: 3 |
DMEM/F-12 medium | Invitrogen | 11330-032 | S No: 4 |
Serum replacement (KSR) | Gibco | 10828028 | S No: 5 |
DMEM | Invitrogen | 11960069 | 1X; S No: 6 |
Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30071.03 | Aliquot; S No: 7 |
L-glutamine (Glutamax, 100X), liquid | Thermo Scientific | 35050061 | 1/100; S No: 8 |
Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | 1/100; S No: 9 |
2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 55 mM, 1/1,000; S No: 10 |
Hausser Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | S No: 11 |
0.1% Gelatin Solution | STEMCELL Technologies | 7903 | Incubate at 37º C for 1 hour; S No: 12 |
SSEA-4 antibody | Santacruz | sc-21704 | 1/100; S No: 13 |
TRA-1-81 antibody | Cell Signaling | 4745S | 1/200; S No: 14 |
OCT4 antibody | Santa Cruz | sc-5279 | 1/1,000; S No: 15 |
Collagen I, Rat Tail | Life Technologies | A10483-01 | Keep cold; S No: 16 |
Alexa Fluor fluorescent 488/ 568 (secondary antibodies) | Invitrogen | A21202/A10042 | 1/2,000; S No: 17 |
DPBS | Hyclone | SH30028LS | 1X; S No: 18 |
100-mm tissue culture dish | Falcon | 353003 | S No: 20 |
96-well tissue culture plate | Falcon | 353078 | S No: 21 |
6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | S No: 22 |
Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | S No: 23 |
Picking hood | NuAire | NU-301 | S No: 24 |
15 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 188271 | S No: 25 |
50 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 227261 | S No: 26 |
Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360 | S No: 28 |
β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | S No: 29 |
Prigrow III medium | ABM | TM003 | S No: 31 |
Countess™ Cell Counter | Invitrogen | C10227 | S No: 32 |
Faxitron X-ray system | Faxitron | CellRad | S No: 33 |
Accutase | Innovative cell Technologies | AT-104 | S No: 34 |
Collagenase | Life Technologies | 17104019 | 1mg/ml stock; S No: 35 |
Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | S No: 36 |
hESC qualified matrigel | BD Biosciences | 354277 | To dilute, use cold DMEM/F-12; S No: 37 |
bFGF | R & D | 233-FB | Stock 10 ug/ml; S No: 38 |
Paraformaldehyde | EMS | 15710 | 4% stock in PBS; S No: 39 |
TRA-1-60 | Santa Cruz | sc-21705 | 1/100; S No: 40 |
NANOG | ReproCELL | RCAB0004P-F | 1/100; S No: 41 |
Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | S No: 42 |
Alkaline Phosphatase kit | Stemgent | 00-0055 | S No: 43 |
Cas9 protein | PNA Bio | CP01-50 | Thaw and aliquot; S No: 44 |
Goat or donkey serum | Sigma | D9663/G9023 | S No: 45 |
Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | S No: 46 |
DAPI | Thermo Scientific | D1306 | S No: 47 |
Tris | Sigma | 9285-100ML | S No: 48 |
NaCL | Sigma | S7653-250G | S No: 49 |
EDTA | Sigma | BP2482-500 | S No: 50 |
T4 DNA ligase | NEB | M0202T | S No: 51 |
Mega Shortscript T7 kit | Thermo Scientific | AM1354 | S No: 52 |
Mega Clear kit | Thermo Scientific | AM1908 | S No: 53 |
SMC4 | BD Biosciences | 354357 | S No: 54 |
Fibronectin | STEMCELL Technologies | 7159 | S No: 55 |
CloneJET cloning kit | Thermo Scientific | K1232 | S No: 56 |
Fragment analyzerTM | Advanced Analytical | S No: 57 | |
mTeSR1 medium kit | STEMCELL Technologies | 5850 | Warm to room temperature; S No: 58 |
Freezing medium mFreSR™ | STEMCELL Technologies | 5855 | S No: 59 |
Freezing medium CryoStor® | STEMCELL Technologies | 7930 | S No: 60 |
MEFs | Globalstem | GSC-6301G | S No: 61 |
L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | S No: 62 |
Human pancreatic cells | ABM | T0159 | S No: 63 |
STEMdiff™ Neural Induction Medium | Stemcell Technologies | 5835 | S No: 64 |
RPMI | Thermofisher | 11875-093 | S No: 65 |
2% B27-insulin | Thermofisher | A1895601 | S No: 66 |
CHIR99021 | Stemcell Technologies | 72052 | S No: 67 |
IWP4 | Stemcell Technologies | 72552 | S No: 68 |
2% B27 | Thermofisher | 17504044 | S No: 69 |
MCDB 131 | Life Technologies | 10372019 | S No: 70 |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8761-100ML | S No: 71 |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | S No: 72 |
BSA | Proliant | 68700 | S No: 73 |
GDF8 | Pepro-Tech | 120-00 | S No: 74 |
TUJ1 antibody | EMD Milipore | AB9354 | S No: 75 |
NKX2-5 antibody | Santa Cruz | Sc-14033 | S No: 76 |
SOX17 antibody | R & D systems | AF1924 | S No: 77 |
Propidium iodide | Thermo Scientific | P3566 | S No: 78 |
Amaxa 4D-nucleofector™ | Lonza | AAF-1002 | S No: 79 |
FACSAria II (cell sorter) | BD biosciences | SORP UV | S No: 80 |
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