C. elegans Excretory kanal hücre içi Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek bir hücrede için bir Model olarak: etiketleme GFP-füzyon, RNAi etkileşimi ekran ve görüntüleme

C. elegans boşaltım kanalı görsel vivo içinde analiz polarize de novo membran dipnotlar için benzersiz bir tek hücreli modelidir. Bu iletişim kuralı standart genetik/RNAi ve yaklaşımlar, uyarlanabilir kimlik ve tek hücreli tubulogenesis ve apikal membran ve Lümen Biyogenez yönetmenlik molekülleri karakterizasyonu için Imaging birleşimidir açıklar.

Dört C. elegans boşaltım Kanallar kurmak ve Lümen bir membran ve submembraneous ile stabilize etmek hemen hemen eşit kadar genişletilmiş hücre içi endotubes ile tek bir hücreden hayvan uzunluğu ile genişletilmiş dar tüpler vardır sitoiskeleti apikal karakter. Boşaltım hücre uzunluğu yaklaşık 2.000 kez bu model de novo polarize membran dipnotlar, hücre içi Lümen morfogenez vivo içinde değerlendirilmesi için benzersiz yaparak bu kanalları oluşturmak için genişler ve tek hücreli tubulogenesis. Burada sunulan iletişim kuralı standart etiketleme, kazanç ve kayıp-in-fonksiyonlu genetik ya da RNA müdahale (RNAi) birleştirmek gösterilmiştir-ve görsel olarak incelemek ve işlevsel olarak bu işlemlerin moleküler düzeyde çözümlemek için bu modeli kullanmak için mikroskobik yaklaşımlar. Etiketleme bir yaklaşım örneği protokol Transjenik hayvanlar ile floresan füzyon protein üretimi canlı tubulogenesis çözümlenmesi için özetliyor. Genetik bir yaklaşım örneği, bu işlev kazanç Kistik kanal fenotip değiştirmek için tasarlanmış bir görsel RNAi tabanlı etkileşim ekran kilit noktaları vurgular. Belirli yöntemleri açıklanan nasıl yapılır: etiket ve floresan proteinler; ifade ederek Kanallar görselleştirmek hedeflenen RNAi kütüphane oluşturmak ve kanal morfogenez moleküler analiz için eleme RNAi strateji; Kanal fenotipleri değişiklikler görsel olarak değerlendirmek; Onları Floresans mikroskobu dissekan tarafından Puan edinildi; hücre altı kanal bileşenleri daha yüksek çözünürlükte confocal mikroskobu tarafından karakterize; ve görsel parametrelerini ölçmek. Belirlenmesi ve genler hücre içi Lümen filogenetik korunmuş süreçlerinde yer alan ve tek hücreli karakterize C. elegans boşaltım kanalı yararlanarak ilgilenen araştırmacı için yararlı bir yaklaşımdır morfogenez tüp.

Tüm iç organları tüpler, taşıma ve gazlar, sıvılar ve besin alışverişini ve metabolik atık atılımı gibi birçok farklı fonksiyonları için çok önemli oluşur. Onların polarize karakterle ayrı apikal ve lumenal membran, bu belirli işlevler için uyarlanmış ve dipnotlar endo - ve plazma membran sistemlerinin hatalarını insan hastalık^1,2sık bir nedenidir. Tüpler damarlara ve iç organlara çoğunluğu çok hücreli ve bir Lümen intercellularly oluşturur; Ancak, Lümen intracellularly oluşturan, tek hücreli tüpler, örneğin, insan kapiller yatak^%230-50'si kadar temsil edebilir. Onların microdomains göre tüp'ın belirli işlevi (örneğin, boşaltım kanalı kanalcık Caenorhabditis bağırsak microvilli karşı farklı olabilir polarize membranları ile multi - tek hücreli tüpler kompozisyon, benzer olmakla birlikte elegans; bkz. kağıt üzerinde C. elegans bağırsak tubulogenesis eşlik eden)³. Polarize membran dipnotlar ve tubulogenesis ilkelerine metazoans arasında korunmuş ve benzer bir moleküler makineler onları^1,2,4yönlendirir.

C. elegans boşaltım sistemi beş hücreleri oluşur: boşaltım hücre (EC), kanal hücre (DC), gözenek (PC) ve iki bezi hücreyi. Ablasyon EC, DC veya PC vücut boşluğu ve hayvanlar die erken bir larva sahne⁵sıvı birikimine neden olur. Bu üç tek hücreli tüpler intriguingly, onların Lümen üç farklı yöntemleri kullanarak oluşturmalısınız: hücre (EC) oymaya; Hücre kaydırma birleştiğinde autocellular junction oluşumu (PC); ve hücre kaydırma tarafından (DC); autofusion ile birleştiğinde Tüm filogenetik korunmuş^6,7olan farklı mekanizmaları Lümen morfogenez. Posterior faringeal ampul yanal sol kısmında bulunan EC, iki yanal uzantıları dışarı hangi dört Kanallar anteriorly genişletmek için dışarı şube ve özafagusu (tarafında her iki sağ ve sol) solucan'ın burun ve kuyruk ucuna gönderir , sırasıyla (şekil 1)^5,6,8. EC 2 x 1000 µm için yapım o büyük hücre içinde hayvan yaklaşık 1 µm kadar uzanır. Bir hücre altı düzeyde boşaltım kanalı bir Bazal membran doğru pseudocoelom yönettiği ve lumenal membran (endotube) tarafından tünel oluşturulmuş basit bir tüp var. Kanal lumenal membran kanal lumenal membran sadece hücreler arası kavşağında bağlanır; Kanallar aksi takdirde onların uzunlukları (şekil 1) junctionless. Boşaltım kanalı lumenal membran ve onun submembraneous sitoiskeleti apikal membran bileşimi ve submembraneous sitoiskeleti bağırsak gibi çok hücreli tüpler benzer moleküler onların kompozisyon tarafından tanımlanan apikal,, ve diğer (örneğin, düz) epiteli. Sitoplazmik organelleri, endomembranes kanal uzunluğu boyunca dağıtılır endosomal veziküler ve diğer (örneğin, Golgi) dahil olmak üzere. Ayrıca, birden çok canalicular veziküller - lumenal membran için bağlı ve/veya bağlı ya da izole - kanal sitoplazma^7,8,9' dan^{,10 dişli} . Bu dinamik plazma-membran/canalicular bağlantı daha fazla kanal'ın membran sistem genişletir ve her iki Lümen morfogenez ve ozmoregülasyon¹⁰için katkıda bulunur. Boşaltım kanalı böylece neredeyse tamamen endo - ve plazma membran, mükemmel bir model polarize membran dipnotlar çözümleme ve düzenleme, endo-plazma zarı arayüzü sağlayan oluşur. Apikal membran dramatik genişleme kanal morfogenez - bu tek hücreli sistemde Lümen uzantısıyla – çakışık sırasında da stabilize ve hücre içi lumenal membran Merkezi gerek tarafından kaynaklanan mimari sorunlarını analiz etmek için sağlar. . Bu iletişim kuralı kanal tüp ve Lümen'ın yapısal morfogenez ve bu işlemi için gereken hücre içi zar dinamiği analizi yerine AK 's konumda oluşturmak hücre hareketlerini doğrudan sinyalleri odaklanır boşaltım sistemi ve diğer hücresel öğelere (⁶' gözden), karmaşık bağlantıları oluşturun.

Bir daha fazla polarize membran ve hücre içi Lümen Biyogenez analizi için C. elegans tek hücreli kanal sistemi ayırmak, gelişimsel zaman içinde farklı bileşenleri, membran üretimi için onun yetenek avantajdır ve kavşak. EC ventral kapanış saatinde tarihi ve ventro-yanal sırasında zaman yanal kanal uzantısı ve dallanma ortaya orta embriyo^5,6,8sırasında yutak yerleşir. Bu geç embriyogenez, L1-larva sahne (şekil 1) devam ediyor bir işlem sırasında ön-arka kanal uzantısı tarafından takip ediyor. Yeni taranmış bir larva, arka kanal ucunu solucan yaklaşık yarısı ulaşır, kuyruk L1 aşamasının sonunda hangi süre sonra kanal tam genişletme ile birlikte solucan⁸uzatıyor. İlk larva aşamasında etkin kanal büyüme bu hayvanın büyüme böylece aşan bir hızda biter, ancak, daha fazla büyüme paralelinde bütün hayvan büyüme ek larva aşamaları (L2-4) sırasında oluşur. Bu ayar farklı adımları polarize de novo membran dipnotlar polarize hücre bölünmesi veya geçiş bağımsız analiz etmek için fırsat sağlar. Ayrıca, bu bu işlem ayrılması (hangi Lümen başlatma önce embriyo içinde meydana) kavşaklar derlemesinden izin verir; onların tam membran polarizasyon içinde hala bir açık soru polarite alanındaki gereksinimdir. Son olarak, benzersiz olarak apikal Bazal membran genişleme, eski boşaltım Kanallar¹⁰' önceki ikinci işlem üzerinden ayırır. C. elegans boşaltım kanalı modeli bu nedenle bu avantajları polarize membran Biyogenez analizi için bir dizi hisse ama çok hücreli bir ortamda (bkz: yürütür bağırsak modeli özellikle bilgilendirici bir tamamlayıcıdır eşlik eden kağıt üzerinde bağırsak tubulogenesis³).

Vahşi-türü kanallar bu küçük solucan ultrathin tübüllerin olmakla birlikte, onların Lümen VI olabilirNomarski optik bu şeffaf hayvan tarafından doğrudan sualized. Aslında, mutant Kistik kanal türleri Morfoloji düşük büyütme ileri genetik ekranlarda büyük etkisi genlerin tubulogenesis¹¹' de yer alan tanımlamak için kullanılmıştır mikroskobu dissekan kullanarak etiketsiz hayvanlarda karakterize edilebilir. Geliştirilmiş görsel Kanallar morfolojisi ve onların polarize membranlar, hücre iskeleti bileşenleri, farklı hücre içi organellerin ve diğer hücre altı yapıları, bir ayrım olarak ancak, etiketleme gerektirir ve daha yüksek güç floresan diseksiyon ve confocal mikroskobu. Etiketleme ve mikroskopi için zorluklar çok sayıda Kanallar fine yapısı pozlar rağmen belirli molekülleri her bölmesi için benzersiz üzerinden ayrılır membranlar ve hücre altı bileşenleri ve hayvanların güvenli bir şekilde mikroskopi için Eğer monte edilebilir (bkz: protokolü ve tartışma) eserler tanıtımı önlemek için bazı önlemler alındı. Etiketleme-ebilmek kılınmak sabit örnekler immünhistokimya veya transgenik solucanlar floresan füzyon protein kendi kontrolü altında ifade oluşturarak veya boşaltım kanalı özel Organizatör vivo içinde görüntüleme için. Bu iletişim kuralı ikinci etiketleme tekniği açıklar (eşlik eden kağıt³boyama antikor için bağırsak tubulogenesis bakınız).

Vivo kaybı veya kazanç-in-fonksiyonlu çalışmalar tek hücre analiz görüntüleme vivo içinde birleştirmek için yetenek düzey geliştirme yapar C. elegans boşaltım kanalı için moleküler özellikle güçlü bir model ve tek hücreli tubulogenesis hücresel analizi. İleriye veya geriye doğru genetik ekranlar gerçekleştirilen kanal morfogenez fenotipleri (örneğin, kistleri) tanımlamak için bir vahşi-türü veya etiketli transgenik hayvan ile başlayan ve onların temel gen kusurları. Alternatif olarak, bu tür ekranları mutant fenotip (örneğin, Kistik bir kanal) başlatmak ve bastırıcılarının veya bu fenotip arttırıcılar işlevsel olarak etkileşim genleri mutasyona uğramış fenotip neden gen ile tanımlamak için tanımlar. Mutant fenotip neden olan genetik bozukluk bir kaybı (örneğin, gen silme üzerinden ) ya da bir kazanç neden olabilir (örneğin, üzerinden aktive bir mutasyon ya da aşırı Gen kopya getirilmesi yolu ile) incelenen işlev. İleriye doğru mutagenesis ya da sistematik RNAi ekranlar önyargılarını gen işlevi olmadan ve genler faiz işlevinde yer tarafsız tanımlanmasına izin. Böyle ilgi herhangi bir gen veya gen (örneğin, hedeflenen ekranlar) herhangi bir grup da hızla probed genom çapında RNAi kitaplıkları besleme durumu göz önüne alındığında, hemen hemen her gen kolayca C. elegans, RNAi tarafından nakavt bir ters genetik yaklaşım kendi etki için. Yaklaşımlar olası birleşimini göstermek için biz burada bir hedeflenen RNAi etkileşimi ekran, bir işlev kazanç Kistik boşaltım kanalı mutant ile başlayan tarif sitoplazmik kanal yeşil flüoresan protein (GFP) ile Etiketlenmiş. Mutant fenotip erm-1, son derece korunmuş C. elegans overexpression tarafından oluşturulan ortholog membran-aktin bağlayıcı ailesinin Ezrin-Radixin-Moesin (ERM), lumen morfogenez ve membran karıştığı birçok tür¹²kuruluşta. C. elegans ERM-1 boşaltım kanalı ve bağırsak, gibi iç organların lumenal membranlar yerelleştirir ve her iki¹³Lümen oluşumu için gereklidir. ERM-1 overexpression fazla aktin ve akı Lümen artan ve kısa bir Kistik kanal ve bükük lumenal membran kalınlaşmış aktin astar boya⁹ile üreten kanal lumenal zar, veziküller acemi. Protokol transgenik suşları ile boşaltım kanalı ifade oluşturmak füzyon protein (veya diğer proteinler); etiketli açıklar nasıl bir kanal fenotip değiştiriciler tanımlamak için böyle suşları ile başlayan hedeflenen RNAi ekranlar gerçekleştirmek için; ve görsel olarak bilgilendirici tubulogenesis fenotipleri ölçmek için basit yollar dahil olmak üzere Floresans diseksiyon ve confocal mikroskobu tarafından bu tür ekranları sonuçlarını analiz etme. Etiketleme teknikleri ve öldürücü tubulogenesis genler için ayarlanmış RNAi ayrıntılarını alternatif bağırsak tubulogenesis³eşlik eden kağıda bulunabilir. Tüm yöntemleri çeşitli kombinasyonlarda kanal tubulogenesis diğer sorulara incelenmesi için kullanılabilir.

1. C. elegans Excretory Canal floresan füzyon protein ¹⁴ tarafından etiketleme

Not: eşlik eden kağıt üzerinde bağırsak tubulogenesis bkz: ³ in situ antikor yordamlar boşaltım kanalı uyarlanabilir boyama tarafından etiketleme için. Tablo 1 C. elegans boşaltım kanalı endo - ve plazma membran, Tablo 2 ifade boşaltım kanalı için sürüş rehberleri örnekleri için görüntülenmesi için yararlı kanıtlanmış molekülleri örnekleri için bkz: ve Tablo 3 işaretleri ve Organizatör daha kapsamlı koleksiyonları için kaynaklar için farklı fluorophores yelpazesi tartışırken başvurular da dahil olmak.

1. Doku belirli floresan marker plazmid restriksiyon enzimi tarafından inşası klonlama göre ¹⁵
   Not: alternatif teknikleri oluşturmak için tartışma görmek Floresan füzyon protein.
   1. Belirlenmesi (transkripsiyon füzyon için) düzenleyicinin veya WormBase ⁴⁴, organizatörü (için translasyonel füzyon) ile ilgi tüm Gen dizisi.
      Not: için Organizatör, yaklaşık 1 – 3 kilobaz (kb) çoğu C. elegans genler için yeterli. Translasyonel füzyon protein de inşa bir gen bir boşaltım kanalı belirli organizatörü altında ilgi yerleştirerek (bkz. Tablo 2).
   2. (İçin transkripsiyon füzyon) düzenleyici ve/veya tam bir gen amplifikasyon organizatörü (için translasyonel füzyon) ile ileriye ve geriye doğru astar tasarım. Saat 5'te restriksiyon enzimi bağlayıcı ekleme ’ ve 3 ’ astar biter.
      Not: vektör plazmid (örneğin, pPD95.79) ¹⁶ ' mevcut olan enzimleri seçin. Translasyonel füzyon, 3 için ’ bağlayıcı restriksiyon enzimi sindirim ve vektör ile tüp ligasyonu sonra kodon çerçeve Ekle-ecek var olmak fluorophore, örneğin, GFP kodon ile sürekli tasarlanmış. Bir tipik restriksiyon enzimi halkalı ¹⁴ ' e 1 veya 2 daha fazla üsleri eklemeniz gerekebilir; bir kodonu yaratmaması için özen gösterin.
   3. Gerçekleştir Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) organizatörü veya tam uzunlukta gen canlı solucan veya vahşi tipi genomik DNA veya cDNA şablon ¹⁵ kullanarak yükseltmek için.
      Not: solucanlar şablon olarak kullanırken, ilk solucanlar lizis arabellek (PCR arabellek artı İndinavir K) ¹⁷ parçalayıcı. Karışık sahne solucanlar şablon olarak kullanılabilir. Aç kurt-ebilmek var olmak kullanılmış-bakteriyel DNA ile kirlenmesini önlemek için.
   4. Gerçekleştir özel (% 1) Jel Elektroforez güçlendirilmiş ürün doğru boyutunu tanımlamak için PCR ürünleri.
      Not: Grup boyutu doğru ise, bir sonraki adımla devam edin. Birden çok grup oluşturursa, tek bant üretmek için amplifikasyon koşullarını iyileştirmek. Eğer bu does değil iş, jel doğru grubudur kesip DNA standart yöntemleri ¹⁵ tarafından arındırmak ve sonra bir sonraki adımla devam edin.
   5. Gerçekleştir kısıtlama Özet PCR ürünü ve standart yöntemleri ¹⁵ tarafından ayrı borular içinde (örneğin, pPD95.79) fluorophore içeren vektör plazmid.
   6. Jel Elektroforez tarafından sindirilmiş DNA'lar ayrı ve PCR ürünü elute ve ayrı tüpler bantlarında DNA vektör.
   7. Jel dilimleri üzerinden DNA'lar standart yöntemleri ¹⁵ tarafından arındırmak. Spektrofotometre tarafından DNA toplama ölçmek.
   8. PCR ürünü ligate ve DNA standart yöntemlerle vektör ve rekombinant DNA'lar standart yöntemleri ¹⁵ tarafından yetkili hücrelere dönüşümü.
   9. 10 yaymak μL, 50 μL ve 50 μg/mL Ampisilin ile desteklenen üç bireysel Luria suyu (LB) plakalar dönüştürülmüş hücrelerin 100 μL.
      Not: dönüşüm verimliliği bir spektrum için farklı tabak üzerine hücrelerinin farklı tutarlarda yayıldı. Dönüştürme verimli ise mesela çok yoğun kaplama yalıtım kolonileri izin veremezsiniz.
   10. Gecede 37 ° C'de plakaları kuluçkaya. Ertesi sabah, kuluçka makinesi gelen tabak çıkarın.
       Not: kolonilere çok küçük ise, birkaç saat daha kuluçkaya.
   11. Hazırlama plazmid DNA'lar standart yöntemleri ¹⁵ tarafından tek kolonilerden. Mix şablon DNA ve astar ve (genellikle bir çekirdek hizmet merkezinde yapılır) sıralama için göndermek.
   12. Dizileri okumak ve füzyon yapısı bütünlüğünü doğrulayın.
       Not: CRITICAL: eklenen gen floresan marker gen çeviri füzyon için arasında doğru kodon çerçevesi onaylayın. İdeal olarak, hiçbir mutasyon PCR ve ligasyonu işlemler sırasında tanıtıldı onaylamak için bütün gen sıra.
   13. (Adım 1.1.11 kullanarak) daha fazla plazmid DNA adım 1.2 için enjeksiyon için oluşturmak.
2. Mikroenjeksiyon DNA germline dönüşüm tarafından Transjenik hayvanlar nesil ¹⁸
   Not: transgenes tanıtmak için alternatif teknikleri için bkz. Anahatları belirlenmiş yordamları bir floresan füzyon protein veya ilgi diğer protein taşıyan Transjenik hayvanlar oluşturmak için kullanılabilir. Örneğin, bir eksojen protein Yeni tanıtılan (örneğin, kapaklı bir ortholog) olabilir veya endojen bir protein (örneğin, içine onun karşılık gelen germline mutant kurtarma için) yeniden girmesini veya bir fenotip (örneğin, enjeksiyon üretmek için overexpressed erm-1 / değişiklik için hedef olarak hizmet veren overexpression Kistik kanal fenotip oluşturmak için aşağıda açıklanan RNAi etkileşimi ekran tarafından kullanılan).
   1. Mix yapı DNA (1 – 50 ng/μL) işaretçisi plazmid DNA (genellikle 100 ng/μL), örneğin baskın marker rol-6 (su1006) ile (1.2.3 işaretçi seçenekleri için bkz:).
      Not: CRITICAL: enjekte DNA konsantrasyon ampirik olarak ne zaman artefactual fenotipleri (kistleri, uzantısı kusurları, ölümcül) giriş önlemek için belirlenen gerekir özellikle boşaltım kanallarında genlerin ifade duyarlı transgenes ifadesidir. Biri mesela yapabilirsiniz plazmid birkaç karışımları 1 ng/μL, 10 ng/μL, 50 ng/μL ve 100 ng/μL rol-6(su1006) ile 100 ng/μL konsantrasyonlarda konsantrasyonları bir dizi geçerli bir gerilme ile nesil sınamak için İstenen ifade veya fenotip (yüksek konsantrasyonda kanal morfogenez için özel olarak sigara zehirli olması muhtemeldir ve ölümcül olabilir).
   2. Filtre DNA karışımı bir 0,22-mikron (mikrometre) gözenek boyutu spin-x santrifüj tüpü filtreden.
      Not: tüpün kapağı mikroenjeksiyon iğneler engelleyebilirsiniz toz önlemek için açık bırakmak değil.
   3. Vahşi-türü veya mutant solucanlar germline dönüştürme için standart yöntemler tarafından erbezi içine rekombinant plazmid microinject (başvuru ¹⁸ yordamı Ayrıntılar için bakınız).
      Not: Standart marker plazmidleri vardır, örneğin: rol-6(su1006), dpy-20, unc-119, pha-1. Tahlisiye transgenes onların anılan sıraya göre mutantlar tanıtıldı ise rol-6(su1006) gibi baskın transgenes vahşi türü solucanlar tanıtıldı. Extrachromosomal transgenes hücre bölünmesi sırasında rasgele kayıp olduğundan marker plazmid transgenik çizgileri kolay bakım için ortak enjekte (1.2.8 bakın). Fluorophore füzyon için kodlama genler enjekte zaman, bir de fluorophore, GFP, işaretleyici olarak kendini kullanabilirsiniz. rol-6 sebep olur kendilerini genellikle morfogenez fenotipleri değerlendirme için avantajlı olan etrafında rulo için solucanlar.
   4. Enjekte transfer solucanlar Escherichia coli üzerine numaralı seribaşı Yuvarlak solucanlar büyüme orta (NGM) levhalar (örneğin, 5 kurt/plaka) (başvuru ¹⁹ standart C. elegans için bkz: Kültür ve bakım prosedürleri ve Tablo malzemelerin).
   5. Plakaları kuluçkaya ve yaklaşık 3 için 20 ° C'de geliştirmek döl izin ö
   6. F1 döl Rol (çalışırken) solucanlar (veya herhangi bir diğer belirli enjeksiyon marker, örneğin, GFP) diseksiyon mikroskop altında incelemek ve Silindirler t almako bireysel plakalar.
   7. Seçin F2 hayvanlar haddeleme ile tabaklar ve floresan diseksiyon floresan mikroskop altında varlığını doğrulamak (genellikle tüm silindir GFP olumlu hayvanlardır).
      Not: F2 Silindirler transgenik bir çizgi başarılı nesil belirtir. Tek tek satırlara-ebilmek var olmak farklı, örneğin, transgene iletim hızı ile ilgili olarak. Bu nedenle korumak ve birden fazla satır depolamak yararlıdır.
   8. İşareti pozitif hayvanlar için yeni tabaklar zenginleştirici tarafından transgenik satırları korumak.
      Not: Enjekte DNA germline extrachromosomal bir dizi olarak kurulmuştur. Extrachromosomal diziler için iletim hızları genellikle yaklaşık % ~ 50 ama değişkendir. Zorlanma kaybetmemek için bu nedenle el ile baskın işaretçileri (örneğin, negatif seçim tarafından güvenli değil satırları) olan satırları zenginleştirmek önemlidir.
   9. Tarafından-80 ° C ¹⁹ uzun süreli depolama için standart dondurma teknikleri transgenik satırları dondurmak.
      Not: Transgenes extrachromosomal diziler üzerinde de germline tarafından UV ışınlama homojen hatları ¹⁸ verim için ek bir adım de entegre edilebilir. Örneğin, erm-1 ERM-1 [++] gerilim elde etmek için UV ışınlama tarafından germline entegre edildi fgIs2[erm-1p::erm-1;rol-6p::rol-6(su1006)] nerede her hayvan taşıyan transgene, RNAi tabanlı kullanımı için bir gereklilik etkileşim ekran aşağıda açıklanmıştır. Bu zorlanma Ayrıca sitoplazmik boşaltım kanalı GFP üzerinden geçerken bir vha-1 p içeren bir yük etiketli oldu:: GFP transgene (yukarıda belirtildiği gibi aynı yordamlar tarafından oluşturulan; başvuru ²⁰ için temel genetik bakın haçlar gibi prosedürler) ve [++]; ERM-1 olarak adlandırılan vha-1 p:: GFP zorlanma aşağıda.

2. Bir hedef RNAi Kütüphane ve bir kanal fenotip değiştirmek için tasarım bir RNAi etkileşim ekranın inşaat

Not: hedeflenen RNAi tabanlı genetik etkileşimi ekran kullanan bir overexpression Kistik kanal fenotip anlatılan etkileşen boşaltım kanalı morfogenez genler için arama. ERM-1 [++] zorlanma (bkz. Adım 1.2.9 yükleme) örnek ⁹ olarak hizmet vermektedir. Bu yaklaşım sadece bir boşaltım kanalı Lümen morfogenez genetik analizi için birçok olası yaklaşımlar sunuyor (genetik diğer yaklaşımlar için bkz: giriş ve tartışma). Bağırsak tubulogenesis ³ ve başvurular ^{17 , 21 , 22} için geçmiş RNAi, RNAi ayrıntılarını üzerinde eşlik eden kağıt görmek yordamlar, modülasyonu'nu (öldürücü tubulogenesis genler için ayarlanabilir) RNAi güç ve teknik sorunların tartışılması RNAi için bağlı. Başvuru ¹⁹ standart solucan kültür ve bakım ve malzemelerin tablo için bkz:.

1. Veritabanları ve yayınlanmış makaleleri ERM-1 (veya diğer gen ilgi) ara etkileşen molekülleri.
   Not: Potansiyel ERM-1 interactors işlevsel olarak, genetik olarak veya fiziksel olarak herhangi bir tür ERM proteinler ile etkileşim deneysel olarak gösterilmiştir ve/veya herhangi bir silico tarafından yüksek üretilen iş yapmak için öngörülen tüm moleküller yer alacak veya sistemleri Biyoloji yaklaşım (Tablo 3 veritabanları ve kaynakları örnekleri için bkz:).
2. Tüm genler listesini oluşturmak ve C. elegans homologs bulmak gerektiğinde.
   Not: faiz gen fonksiyonu dikkate alır ve interactors belirlenmesi için net genişler gen sınıfları için tanımlanmış genler listesi genişleyen düşünün (tüm actins seçin, örneğin, membran-aktin bağlayıcı ERM-1, ve aktin ile ilgili moleküller).
3. Karşılık gelen RNAi klonlar piyasada bulunan genom çapında bakteriyel RNAi kütüphaneler tüm genler için besleme bakteriyel tanımlamak (örneğin, Ahringer genomik C. elegans RNAi Kütüphane ²¹ besleme; Tablo malzemelerin)
4. Tüm genler ve onların karşılık gelen RNAi plaka ve iyi numarası için bir elektronik tablo oluşturmak.
5. Al ve günlük LB/Ampisilin/tetrasiklin plakaları (antibiyotik seçimi Kütüphane İnşaat tarafından belirlenir) ~ 50 RNAi klonlar çizgi ve RNAi Kitaplığı tarafından üretilmesi hedeflenen kadar devam.
   Not: Kütüphane boyutu ve öngörülen iş akışı, bağlı olarak tam bir kütüphane oluşturma atlarsanız, doğrudan toplu iş çözümlemesi ile devam edin. Plakalar için artık (gerekirse, yeniden çizgi yeni plakalar üzerine bundan sonra) yaklaşık 2 hafta daha 4 ° C'de muhafaza edilebilir. Bunun tersi olarak, bir-80, uzun süreli depolama için Çoğalt 96-şey veya 384-şey biçimlerde daha büyük dondurulmuş kitaplıkları oluşturabilirsiniz ° C.
6. Gecede 37 ° C'de plakaları kuluçkaya. Ertesi sabah, tabak kuluçka ve mağaza kaldırmak 4'te ° C.
7. Steril bir kürdan bir plaka almak RNAi bakteri bakteriler ile 600 μL 1.5 mL microtube LB/Ampisilin (50 ng/μL) suyu karıştırın, tüpler 37 ° C'de kuluçkaya, sallamak için 6 h.
   Not: RNAi bakteri suyu çekme (ipucu kürdan veya micropipette) microtube kenarı boyunca sürtünme aşılamak.
8. Tohum 70 μL bakteri yinelenen veya onaylatılacak kümeleri içinde 6-şey RNAi plakaların her kuyuya kültürlü. RNAi tabak 22 ° C'de gecede kuluçkaya.
   Not: RNAi plakaları standart yordamlar (Malzemeler tablo başvuruları ^{3 , 17 ,} ve ²¹) tarafından oluşturulan ve burada bir 6-şey dokuda kullanılan kültür plaka biçimi hala kanal morfogenez plakalar üzerinde canlı hayvanlarda mikroskobik değerlendirilmesi için izin veren bir yüksek üretilen iş yaklaşım.
9. Sonraki sabah, çekme 3 L4 sahne ERM-1 [++]; vha-1 p:: GFP solucanlar RNAi plakaları her şey.
   1. (Bkz: başvuru ¹⁹) RNAi ile ilk müdahale OP50 bakteri ile kirlenmesini önlemek için solucanlar bakteri olmadan NGM plaka üzerine tohum ve yaklaşık 10 dakika için tarama hayvanlar izin. Sadece sağlıklı hayvanlar-hasret kullanın.
10. Plakayı hayvanların döl üretmek izin vermek 3 d 22 ° C'de kuluçkaya.
11. F1 döl diseksiyon floresan mikroskop altında incelemek kanal fenotipleri.

3. Vivo Floresans mikroskobu anatomi ve puanlama, Tubulogenesis fenotipleri C. elegans Excretory kanalının Imaging

1. hazırla bir fenotip skor levha (Tablo 4 ' te gösterilen örnek ve şekil 5 ).
2. Solucanlar doğrudan altında floresan dissectin agar plakalı yerleştiring mikroskop, değerlendirme, plaka açık kapak odaklanmak için daha düşük büyütme kullanın.
   Not: Bu protokol bir kapsam 1.5 X ve 10 X hedefleri ve 3,5 bir zum mesafesi 45 (Malzemeler tablo) ile açıklar.
3. Hayvanlar değerlendirmek de ayrı ayrı her üzerinde odaklanarak, iyi 1'den başlayarak ve iş plaka.
   Not: Her zaman denetimleri değerlendirilmesi ile başlar. Örneğin, bir sahte (boş vektör) olumsuz denetim ((bkz: başvuran ^{17 , 21}) HT115 RNAi bakteri bir ilişkisiz gen ekleme ile ya da olmadan) ve pozitif uygun kontrol eder, örneğin, içinde Bu etkileşim perde, erm-1 (bastırır ERM-1 [++] fenotip) RNAi ve sma-1 / spectrin (ERM-1 [++] kanal fenotip arttırır) RNAi.
4. Önce genel fenotipleri parlak ışık altında görünür denetleyin (örneğin: Let/öldürücü, Clr/işaretini kaldırın, Emb/embriyonik öldürücü, Ste/steril, Unc/koordinasyonsuzluk, Dpy/bodur, vb), hayvanlar ve numarasını toplam sayısını sayarak fenotip ölçmek fenotip ile hayvanların (bkz. Tablo 4) numaralarını kaydetmek.
   Not: Kanal fenotipleri (örneğin, Emb, Ste), değerlendirilmesi etkileyebilir kusurları neden genlerin nakavtlar koşullu ile deneme tekrar düşünün için embriyonik göndermek RNAi (bkz: yordamlar ³ kağıt, eşlik eden ).
5. İkinci, boşaltım kanalı fenotipleri floresan ışığı altında incelemek, ölçülebilir fenotipleri (örneğin, kanal uzunluğu, lumen, kistler genişliğini) puan, sayıları kaydetmek ve fenotipleri puanlama bir sayfada tarif (bkz. Tablo 4, < güçlü sınıfı "xfig" = > Şekil 5).
   Not: Daha yüksek büyütme zum mesafesine sahip daha fazla ince kanal fenotipleri değerlendirmek için gereklidir. İleri geri hareket kanal dikkatle değerlendirmek için düşük ve yüksek büyütme ’ s uzunluk ve genişlik ve başka bir kanal morfogenez fenotip. Miktar veya basit fenotipleri yarı miktar için 100 hayvan sayısı (örneğin, L4s bu hedeflenen RNAi ekrandaki; fenotipleri: Kanal 1/4, 1/2, 3/4 uzunluğunda ve tam arka kanalları uzatılması ve posterior kanallar, Lümen çapı küçük kistler (< 1/3 hayvan genişliği), büyük kistler (> 1/3 hayvan genişlikte); bkz. Tablo 4).
6. Baskın fenotipleri mikroskop tarafından en az 3 farklı hayvanlardan edinme görüntülerini monte dijital şarj kuplajlı cihaz (CCD) kamera ve ilgili düşsel bilgisayar yazılımı (bkz. Tablo reçetesi)
   görüntüleri,
   1. ilk fotoğraf makinesini açın, ekli bilgisayarı, görüntü yakalama yazılımı simgesini çift tıklatın, solucan kalıbının düşük büyütme altında el ile bir alanı odaklanmak ve kamera Deklanşör açın.
   2. Tıklayın “ canlı önizleme ” görüntü yakalama yazılımı bilgisayar ekranında, solucanlar görselleştirmek için bilgisayar ekranında simgesini ayarla el ile açıkça ekrandaki solucanlar görselleştirmek için tıklatın odak “ yapış ” simgesini, ardından ' ı tıklatın “ Kaydet ” simgesi.
      Not: Hayvanlar daha hızlı floresan ışığı altında hareket edecek bu nedenle bir yandan bilgisayar fare üzerinde diğer elinizle ilgi alanı içine plaka hareket ederken hazır tutun. Hemen ardından “ yapış ” simgesi görüntü elde etmek için. Birkaç deneme ile iyi bir görüntü elde etmek genellikle mümkündür.
   3. Kaydı alınan görüntüleri uygun dosya adı ile (soy adı, RNAi klon adı ve tarihi dahil).
      Not: İnce ve uzun kanalları daha hızlı hareketli vahşi tipi Kurtlarla mutantlar görüntü daha zordur. Kistik kanallar ve/veya diğer fenotipleri mutantlarla görüntüleme böylece kolaylaştırmak yavaş, hareket ettirmek muhtemeldir. Marker plazmid Rol gibi görüntüleme için yararlı olabilir hayvanları tutarak “ yerinde ” yerine hareketli ileri ve de kendi etrafında haddeleme hayvan ile fenotip üzerinde geliştirilmiş bir görünüm sağlayabilir.

4. C. elegans Excretory kanal tarafından lazer tarama Confocal mikroskobu yüksek çözünürlükte görüntüleme

1. bir pamuklu çubukla ucundaki veya ucundaki küçük bir miktar yağ veya vazelin koyun
   1. canlı hayvan montaj Dizin parmak ve çapı ile ultrathin bir daire oluşturmak için yağ yaymak ~ 6 – a temiz cam kaymak ortasında 8 mm.
   2. Yer 6 μL %5 lidokain çözüm (anestezik) bir micropipette tarafından çember içine.
      Not: Bir lidokain hisse senedi çözüm lidokain tozu suda çözülerek yapılabilir. M9 arabellek ¹⁹ (Malzemeler tablo) ile % 5 oranında seyreltin. Bu neden kistler rüptürü ve kanal fenotipleri teşvik ortak immobilizasyon çözümler (örneğin, sodyum azid) önlemek için boşaltım kanalı analiz için kritik.
   3. Birkaç hayvan--dan bir RNAi plaka almak ve çözüm içine solucan çekme ¹⁹ immerging tarafından lidokain çözüm içine koyun.
      Not: Tercihen bile montaj tarafından Tekdüzen kalınlığı kolaylaştıracaktır sahne özgü hayvan seç. Hayvanlar üzerinde diseksiyon floresan mikroskop önceden.
   4. 22 x 22 mm coverslip cam slayt üzerine yerleştirin; hafifçe gres daire yerleşmek izin.
      Not: Kanal Morfoloji, özellikle içinde mutantlar ya da tedavi RNAi Kurtlarla kanal ve muhtemelen diğer fenotipleri zarar verebilir coverslip üzerinde herhangi bir fiziksel Baskı uygulamayın. Bu nedenle bir kalın yağ daire önlemek için önemlidir; ideal olarak hayvanlar-hafifçe gözükeceksin cam slayt ve kapak kayma arasında.
   5. Buzlu cam slayt tarafında örnek adını yazın. Hemen analiz kanal fenotip ve görüntüleri elde etmek için confocal mikroskop için slayt olur.
      Not: Gecikmeler neden Kanal kistlerin zarar görmesine veya kanal Lümen Morfoloji değiştirmek.
2. Acquiring confocal görüntüleri
   1. Slayt confocal mikroskop örnek sahnesinde yerini, solucanlar (10 X) düşük büyütmede odaklan.
   2. Görünümü ve seçme hayvanlar 60 X ve/veya 100 X hedefleri, altında incelemek boşaltım kanalı ’ s cep ve hücre altı fenotipleri, örneğin, lumen şekli ve çapı, boyutunu ve şeklini kistleri; veya çözümleme için etiketli hücre altı bileşenleri Örneğin, apikal/lumenal membran, Bazal membran, sitoplazma, endosomal karşı canalicular veziküller, diğer organelleri (bkz: tartışma, Şekil 2 ve şekil 4).
   3. Edinme görüntülerini ilgi belirli fenotip.
      Not: Bu protokol bir lazer confocal mikroskop (Tablo reçetesi) tarama açıklar. Hücre altı ince C. elegans bileşenlerinde gidermek için boşaltım kanallar, daha yüksek büyütme hedefleri (60 X 100 X için) gereklidir. İplik-disk confocal mikroskop zaman atlamalı görüntüleri elde etmek için kullanılabilir ancak daha az confocality sağlar (konuya bakın).
      1. Confocal görüntüleri elde etmek için bilgisayarı, çift tıkırtı üstünde confocal mikroskop bilgisayar yazılımı ve lazer bir özel lazer simgesini tıklatarak seçin.
      2. Tıklama “ tarama ” bilgisayar ekranında odaklı solucan görselleştirmek için simgesini ayarla lazer yoğunluğu ile yazılım ve tıkırtı bir daha üstünde “ inceden inceye gözden geçirmek ” taramayı durdur, o zaman tıkırtı üstünde için simgesini “ yakalamak ” resim yakalama, o zaman tıkırtı üstünde için simgesini “ kurtarmak ” simgesi.
      3. Görüntüleri uygun dosya adı ile kaydetmek ve RNAi klon adı, soy adı ve tarih içerir.
         Not: Tek ve birden çok bölüm görüntüleri elde (örneğin, 10 – z ekseni boyunca 15 bölümler). Kesit 3D görselleştirme sağlar. Projeksiyon görüntüleri ve ayrı ayrı (mikroskop bağlı olarak) gerekirse kaydedin. En iyi çözünürlük için lazer ayarları ile düşük kazanç kullanın, değil çok fazla iğne deliği açmak ve birkaç ortalama başına görüntü eklemek (bkz: başvuran ^{23 , 24} confocal görüntüleme genel tartışma). Görüntüleri bir parlaklık tarafından düşsel bilgisayar yazılımı (tercihen değiştirilmemiş kullanım görüntüleri) gerektiğinde değiştirilmek üzere izin vermek için doygunluk seviyesinin altında kendine iyi bak.
      4. Çift - görüntüleri elde etmek veya birden fazla lazer simgelerini tıklatarak aynı şekilde etiketlenmiş kanallar (örneğin yeşil, kırmızı ve mavi) çarpın ama taşma payı üzerinden kanal (eş yerelleştirme çalışmaları için kritik) arasındaki önlemek için sıralı tarama kullanın.
         Not: Bir sıralı (Bu da bir karşılık gelen sonuçları ağartma fotoğrafta artış) taramak için gereken süreyi dikkate almak ve tarayıcı ayarlarını değiştirmeniz gerekebilir. Hayvanlar için daha--dan 30 dk kanal Morfoloji belirsiz etkileri önlemek için en fazla bir slayttan taramayın. Daha uzun tarama gerekiyorsa yeni slayt monte.
      5. Elde karşılık gelen farklı girişim optik (DIC) / Nomarski resimler, özellikle miktarının Eğer canal uzunluğu ve Lümen çapı ile ilgili olarak solucan ’ s gövde uzunluğu ve çapı. Yerleşimi Floresans ve Nomarski imge yanında tıkırtı üstünde “ yer paylaşımı ” işaretlerini göstermek için simgeyi ( şekil 1 d ve şekil 4A – D).
   4. Miktar için etiketli bir bileşeni ilgi yoğunluğunu Floresans ölçmek ImageJ yazılım ²⁵ tarafından ( şekil 5C).

Bu iletişim kuralı, görsel ve tatlı tek hücreli tubulogenesis ve tek bir hücrede hücre içi Lümen morfogenez çözümlemek için C. elegans boşaltım Kanallar kullanmayı açıklamaktadır. Onların uzantısı sırasında orta embriyogenez zaman yetişkinlik, dört boşaltım Kanallar onların demiri ve apikal/lumenal membranlar için benzersiz bir model sağlar onların canalicular ve endosomal endomembrane sistemi ile birlikte genişlemeye devam de novo vivo içinde analizini membran dipnotlar (şekil 1) polarize. Apikal membranlar gibi hücre altı bileşenleri, sitoplazma ve endosomal karşı canalicular veziküller belirli floresan füzyon protein (Bölüm 1 iletişim kuralında tanımlanan) ifade ederek görüntülenmeyecektir ve onlar birbirinden tarafından ayırt edici olabilir Çift veya tek bir transgenik hayvan (Şekil 2) içinde etiketleme üçlü. Bir apikal membran ilişkili molekül (ERM-1), overexpressing tarafından oluşturulan bir benzersiz boşaltım kanalı fenotip (şekil 3A-B) apikal membran işleyen genlerin tanımlamak için hedeflenen RNAi ekranı nasıl göstermek için kullanılır ve Lümen Biyogenez; Bu bir moleküler ve görsel analiz (Bölüm 2 iletişim kuralında tanımlanan) bu modelde polarize membran dipnotlar örneği olarak hizmet vermektedir. Bu ERM-1 [++] kanal fenotip Floresans mikroskobu (Bölüm 3 iletişim kuralında tanımlanan) anatomi görsel olarak değerlendirmek nasıl ve skor bastırma (şekil 3 c-D) ve geliştirme (şekil 3E-F) göstermek için kullanılır . Confocal mikroskobu (şekil 4) tarafından hücre altı düzeyde (Bölüm 4 iletişim kuralında tanımlanan) kusurları gidermek ve basit kanal fenotipleri (kanal uzunluğu ve kist ölçmek nasıl göstermek için kanal fenotipleri ERM-1 düzeyleri modülasyon tarafından indüklenen hizmet boyutu) ve apikal membran Biyogenez kusurları (şekil 5).

Resim 1 : Morfogenez C. elegans Excretory Canal ve hücre altı kanal yapıları
(A) şematik gösterimi boşaltım Kanalı uzantısı (mavi çizgiler) embriyo ve larva geliştirilmesi sırasında. Boşaltım hücre son ventro-lateral sol konumunda posterior faringeal ampul (gösterilmez) embriyo virgülle aşamada ulaşır. Embriyo uzatıyor gibi ilk iki kolu yanal sol ve sağ tarafında doğru genişletir; o zaman her kol bir anterior ve posteiror dalına bifurcates. Bu anterior ve posteiror dallardan daha da genişletmek hayvan dört larva aşamalarında uzama ilk hayvanın büyüme L2 aşamada yakalama, o zaman daha da büyümesini yetişkinliğe kadar eşlik eden. De novo polarize membran Biyogenez bu uzantı yetişkinliğe kadar destekler. (B) yetişkin hayvan anterior kanal dalları burun ucu ve posterior dalları, kuyruk (mavi çizgiler) ulaşmak. Boşaltım hücre Vücut posterior faringeal ampul (mavi) gösterilir. Polarize membran etki alanları yetişkinlik sırasında korunur. (C) sayısı bir kanal kol bölümünün büyütülmüş. Sol: 3D görüş-in kanal gösterir: Bazal membran (siyah), sitoplazma (mavi), lumenal membran (yeşil) ve Lümen (beyaz). Sağ: içinde kanal ve onun membranlar görünümünü: Bazal membran (siyah), sitoplazma (mavi), endosomes (sarı oval), canalicular veziküller (beyaz küreler, her diğer, lumen bağlı veya izole bağlı tek veziküller), apikal membran (yeşil) ve Lümen (beyaz). (D) Confocal/DIC bindirme filmler bir embriyo boşaltım hücreye ve tarafından etiketli bir larva, boşaltım kanalları sitoplazmik GFP karşı lumenal anılan sıraya göre. Sol görüntü: boşaltım hücreye (Yeşil ok) erm-1 organizatörü altında apikal ERM-1::GFP ifade ederek görselleştirildiği kanal Lümen ile 1.5-fold bir embriyo. Doğru görüntü: dört boşaltım kanalı L3 larva, sitoplazmik vha-1 ptarafından görüntülenmiştir (Yeşil ok) dallarında:: GFP. Ölçek çubukları 20 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 : Çift floresan Fusion proteinler ile etiketleme tarafından vahşi tipi boşaltım kanalı kollarında hücre altı bileşenleri görselleştirme
(A) apikal membran sitoplazma ayırt. GFP ifade sulp-5 organizatörü altında görüntüler kanal sitoplazma (yeşil, üst); ERM-1::mCherry ifadesi altında kendi organizatörü apikal membran (kırmızı, orta); görüntüler Bu görüntüler (alt) birleştirme sitoplazma ve aksi durumda tek bile yüksek büyütme oranında etiketleme tarafından ayırt edilemez olacak apikal membran ayırt eder. Ölçek çubuğu 5μm =. (B) endosomal veziküller Lümen için mekansal ilişki belirleme. Görselleştirme Lümen tarafından bir apikal membran ilişkili GFP füzyon proteini (sözde) kırmızı, en iyi renkli; mCherry::RAB-7 (sözde) mavi, orta renkli; ifade tarafından endosomal veziküller görselleştirme Bu görüntüler (alt) birleştirme endosomal veziküller Lümen için göreli uzamsal konumları gösterir. Ölçek çubuğu 5μm =. (C ve D) Kanal tüp şekillerin hücre altı kanal bileşenleri farklı büyüklüklerde, karşı çözümleniyor. L1 larva sitoplazma GFP sulp-5 organizatörü ve sitoplazmik canalicular veziküller altında su kanal AQP-8::mCherry aqp-8 organizatörü altında ifade ederek ifade ederek etiketlenir. (C) alt büyütme oranında alınan görüntüleri sahne-özel varicosities (varicosities canalicular veziküller ve kanal büyüme için gerekli diğer bileşenleri bol miktarda su depoları vardır) karşılık gelen bir "boncuk-a-dize üzerinde" deseni gidermek, ama yapmak sitoplazmik AQP-8 puncta çözemediğinizde kullanın. (D) daha yüksek büyütme oranında alınan görüntüleri için canalicular veziküller karşılık gelen kanal sitoplazmada AQP-8 puncta çözmek. Ölçek çubukları: 20 mikron c ve d 5 mikron Tüm panelleri 10-15 bölüm her confocal projeksiyonlar göster. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3 : Arttırıcılar ve bastırıcı puanlamaKistik kanal fenotip (ERM-1[++]) mikroskobu dissekan tarafından s
(A) ERM-1 [++]; rol-6(su1006) boşaltım Kanallar GFP vha-1 organizatörü altında ifade ederek görüntülenir. Posterior Kanallar genişletmek kadar vulva veya hayvan bedeni orta (oklar; 1/2 uzantısı olarak kabul) daha düşük büyütmede (1.5 X amaç ve düşük zum). (B) daha yüksek büyütme oranında imza ERM-1 [++] küçük Kistik bükük kanal, posterior kanallar (bir kol küçük okla gösterilen) ucu ile çözülebilir vulva veya biraz ötesine kadar uzanan (vulva büyük okla; gösterilen kanal Lümen panelinde D karşılaştırma için vahşi türü olarak kabul edilebilir). (C) bastırma, düşük büyütme: RNAi daha uzun ve ince Kanallar tedavi ERM-1 [++] hayvanlar. Neredeyse tamamen kuyruk (küçük oklar; karşılaştırmak-e doğru bu panel B gösterilen üst hayvanların); genişletmek için posterior Kanallar yüksek büyütme oranında görülebilir (D) büyük bir ok vulva konumunu gösterir. (E) geliştirme: daha fazla kısaltılmış kanallar daha büyük kistler RNAi ile tedavi ERM-1 [++] hayvanlar; düşük büyütme, zoom. (F) daha yüksek büyütme oranında arka kanal uzantısı olabilir daha az 1/2 (küçük ok) belirlenen veya (büyük okla gösterilen) vulva ve 1/3 (daha geniş gösterilen üst hayvan bundan hayvanın genişliğinin aşan olarak kist boyutu kadar genişletilmiş değil B). Ölçek çubukları 400 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4 : Görsel analiz boşaltım kanalı morfoloji ve Mutant/RNAi hayvanlar tarafından Confocal mikroskobu bileşenlerinde hücre altı kanal
(A-D) Bir katmaninin bir Kistik kanal fenotip (confocal/DIC bindirme Filmler gösterilir) ayırt. (A) sulp-5 organizatörü (ayrım apikal zar etiketleme, B panelinde gösterilen yeşil mavi olarak sözde bkz. colour) altında GFP ifade ederek sitoplazma bir vahşi tipi kanal görüntülenir. (B) bir vahşi tipi kanal apikal membran ERM-1::GFP ifade ederek görüntülenir; Not Lümen bu büyütme oranında görünür değil ve bu tek etiketleme sitoplazmik membran etiketleme dan ayırt edemez. (C) boşaltım kanalı fenotip indüklenen tarafından RNAi: sitoplazmik etiketleme intralumenal kistleri sitoplazmik çarpıtmalardan ayırt edemez. (D) boşaltım kanalı fenotip indüklenen tarafından RNAi: apikal ERM-1::GFP etiketleme (sitoplazmik) boşluklar (karşılaştırmak sitoplazmik boşluklar için şekil 4I) yerine (lumenal) kistleri tanımlayan Lümen içinde sıvı birikimi algılar. Ölçek çubuğu için A-D, A. (E-J) çözümleme kaybı ve kazanç-in-fonksiyonlu etkileri (tek kanal silah confocal görüntüleri gösterilir) hücre altı kanal bileşenleri üzerinde gösterilen 40 mikron =. (E-G) Erm-1 RNAi kanalcık hücre altı lokalizasyonu üzerinde etkisi. (E) vahşi tipi kanal sitoplazma; GFP dışlama gösteren Lümen unutmayın. (F) için canalicular veziküller karşılık gelen vahşi tipi sitoplazmik AQP-8::GFP puncta. (G) Cytoplasmic ve Bazal deplasman AQP-8::GFP puncta erm-1(RNAi) hayvan. (H) kesintili Lümen ve Lümen ipucu patoloji (kıvırma ve Lümen merkezleme kaybı) erm-1(mildRNAi) hayvan detayını (RNAi gücü oransal için³ bakınız); Not Bu kanal sitoplazma burada küçük kistler tarafından belirtilen lümen, ucu ötesine uzanır. (I) sitoplazmik çarpıtmalardan boşaltım kanalı vücudunda herhangi bir kanal uzantısı olmadan güçlü erm-1(RNAi) hayvan³etkilenen; ACT-5::GFP Lümen (dışında bazı boşluklar çevresinde birkaç küçük lekeleri) için işe değil unutmayın. (J) alımı aşırı ACT-5::GFP ve AQP-8::mCherry Lümen ERM-1 (Not kalın kemer ACT-5::GFP ve Kistik Lümen çevresinde örtüşen AQP-8::mCherry kümeleri) overexpressing Üç Kişilik transgenik hayvan için. Ölçek çubuğu E-J, E. içinde gösterildiği için 5 mikron = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5 : Miktar tarafından parçalanmış ve Confocal mikroskobu kanal kusurların örnekleri
Vahşi türü (üst paneli) ve mutant Kistik (alt panelleri) (A) şematik gösterimi için miktar kanal uzunluğu ve kist boyutu boşaltım kanallar. Arka kanal uzunluğu 0, 1/4, 1/2, 3/4 ve 1 sayılabilir. Kanal uzunluğu '0' uzantısı gösterir ve '1' tam uzunlukta uzantısı belirtir. Kist boyutu olarak sayısal < 1/3 (küçük) ve > 1/3 (büyük) gövde çapı. Brüt kanal Morfoloji kontrolü ve floresan mikroskopi dissekan hayvanlara ERM-1 [++](RNAi) , (B) miktar. Sahte(RNAi) ERM-1 [++] hayvanlarda yaklaşık %1/2 95 hayvanlarda (başvuru yansıması, şekil 3A-B) genişletilmiş arka kanal uzunluğudur. Bastırıcı ERM-1 [++](RNAi) hayvanlarda arka kanal'ın uzunluğu % 80 – 90 hayvanlarda (başvuru yansıması, şekil 3 c-D) neredeyse tamamen genişletilir. Artırıcı ERM-1 [++](RNAi) hayvanlarda büyük kistler ve kısa uzunluğu yaklaşık % 60-70 Kanallar hakkına sahiptir (< 1/2) (başvuru yansıması, şekil 3E-F). ± SD demek olarak sunulan veri (n > 3). ImageJ tarafından apikal/lumenal kanal sitoiskeleti confocal görüntülerden floresan yoğunluğu (C) miktar. Kanal'ın apikal membran ACT-5::GFP tarafından etiketlenir, vahşi tipi kanal kol sağ sol, ERM-1 [++] kanal kolu gösterilir. Panelleri yaptı: ACT-5::GFP vahşi türü membran kol yoğunluğu olan yaklaşık 50 (gri değeri/membran; siyah ve kırmızı okla gösterilen), görüntü altında gösterilen arsa. Sağ kapı aynası: ACT-5::GFP ERM-1 [++] yoğunluğunu 100 olduğunu (dorsal membran gri değeri yaklaşık 110 (siyah ok) ise ventral membran yaklaşık 140 (kırmızı ok)), görüntü altında gösterilen arsa. Ölçek çubukları 5 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

C. elegans genetik çok yönlülük, şeffaflık, basit vücut planı ve sabit hücre soyu morfogenez analizi için mükemmel bir model olun. Bu iletişim kuralı standart genetik manipülasyon ve görüntüleme birleştirmek açıklar 2 mikron yararlanmak için çalışmalar ince polarize membran ve hücre içi Lümen Biyogenez bir tek hücre tüp çalışmaya C. elegans boşaltım kanallar.

Etiketleme
C. elegans boşaltım kanalları canlı analiz (burada açıklanan) izin floresan füzyon proteinlerin ifade veya antikor veya kimyasal (bkz: kağıt üzerinde antikor boyama için bağırsak tubulogenesis eşlik eden boyama etiketli ³). iki veya daha fazla farklı fluorophores veya bunların birleşimini ifade teknikleri, etiketleme yüksek çözünürlüklü bir görsel diseksiyon bu ince tübüllerin (Şekil 2) için farklı sağlar. Kanallar için bir kanal belirli düzenleyici tarafından yönetmen floresan füzyon proteinlerdir aralarında çeşitli nedenlerden dolayı boşaltım kanalı etiketleme için ilk tercihi: (1) en düşük ifade düzey birçok kanal protein ve (2) kanal'ın güzel kolayca yapı nerede faiz protein de ifade edilebilir Kanallar dışında boyama tarafından boğulmuş. Öte yandan, kanallar eksojen proteinler için hassas ve kolayca belirsiz fenotipleri (örneğin, uzantısı hataları ve kistler veya hatta ölümcül) geliştirmek ne zaman böyle proteinler güçlü dile getirdi. Bu karar içine Transjenik hayvanlar oluşturmanın farklı yolları arasında seçim yaparken tartmak gerekir. Prensip olarak, transgenes extrachromosomal diziler (örneğin, plazmid DNA erbezi germline dönüşüm, burada açıklandığı şekilde içine direkt enjeksiyon tarafından), genellikle yüksek kopyalama sayı dizileri (kez ile yüksek üreten tanıttı olabilir ifade), ya da genellikle düşük veya tek kopya numarası (örneğin, bombardıman²⁶ ya da tek kopya Mos1-aracılı ekleme [MosSCI]²⁷yoluyla), genom içine entegre. Extrachromsomal diziler Ayrıca entegre olabilir içine ikinci bir adım (hala, ancak, yüksek kopya numaradan) genom¹⁸. Öte yandan, germline düşük konsantrasyon (örneğin, 1-2 ng/µL DNA, işaretleyici DNA daha yüksek bir konsantrasyon ile birlikte), içine enjekte edildiğinde düşük (hatta tek) kopya sayı dizileri kolayca oluşturulan²⁸olabilir. Bu senaryo için kanal etiketleme, en iyi ifade düzeyi çok düşük ne de çok yüksek (toksik) bulmak yardımcı olabilir DNA konsantrasyonları değiştirilebilir avantajı vardır. Enjekte DNA konsantrasyon ve ifade düzeyi arasındaki ilişki birden fazla faktöre (örneğin, düzenleyici) bağlıdır ve böylece ampirik olarak belirlenmelidir. Alternatif olarak, faiz gen doğrudan germline bir fluorophore ile kümelenmiş düzenli olarak serpiştirilmiş kısa palindromik yineler (alan CRISPR) etiketleme yordamlar^29,30' etiketli. Her ne kadar bu yaklaşım fluorophore en fizyolojik genomik bağlamı yerleştirir, bu her zaman gerekli ya da arzu (protein çok düşük seviyelerde ifade edilir zamanÖrneğin, ) değildir. Ancak, en iyi seçenek, örneğin olabilir gen ilgi çok büyükse.

Kanal görselleştirme kanal sitoplazma bir fluorophore tarafından vurgular kanal içine transkripsiyon yapıları yönlendirerek gerçekleştirilebilir. Buna ek olarak, hücre altı kanal bileşenleri etiketleme translasyonel bir füzyon tam uzunlukta gen gen kodlama fluorophore kareye bağlandığı gerektirir. Bir kanal belirli organizatörü (yerine ifade için gene kendi organizatörü) kullanırken, kendi seçtiği Düzenleyici'nın yoğun ve gelişimsel analizi için ifadesini zaman dayanmalıdır. Kanal'ın ozmotik işlevi kritik olacağı birçok boşaltım kanalı belirli genler larva sahne önce ifade değil; çok geç ve etkin uzantısı aşamasında analizi için (erm-1 ve profesyoneller-1 olan erken ifade genler)^10,13. Boşaltım kanalı endo - ve plazma zarı işaretleyicileri ve kanal belirli rehberleri örnek verilen Tablo 1 ve 2, sırasıyla ve ek kanal özgü molekülleri Tablo 3' te bulmak için kaynaklar. Bu kaynaklar Caenorhabditis genetik merkezi üzerinden kullanılabilir olan bir zaten yapılmış uygun floresan füzyon protein bulmak için de kullanılabilir (CGC; Ayrıca bkz. Tablo 1). Rekombinant plazmid böyle protein füzyon ifade oluşturmak için bir çeşitli klonlama yöntemleri, her biri belirli artılarını ve eksilerini kullanabilirsiniz (başka bir yerde tartışıldı¹⁴). Bunlar geleneksel restriksiyon enzimi dayalı dahil burada açıklanan yaklaşımlar, klonlama, modüler klonlama birden fazla site ağ geçidi sistem³¹, Gibson derleme³²veya muhabir gen inşaat "PCR dikiş" yöntemiyle^{14 kullanarak ,33}. Bu farklı yaklaşımlardan germline onların giriş için seçilen yöntem ve/veya (örneğin, Organizatör ve cDNAs daha büyük ölçekli yaklaşımlar etiketleme için karıştırma sistemi kolaylaştırır çok yönlü Gateway) diğer ihtiyaçlarınıza adapte edilebilir . İlgi proteinin işlevi göz önünde bulundurarak (N-C-terminus protein karşı bağlama) fluorophore, doğru ekleme sitesini seçmek için alınması gereken umurumda.

Gen işlevi ile girişim
C. elegansişlevinde gen huzursuz için birçok olası yollarından biri, lumenal membran bileşen overexpressing tarafından indüklenen bir Kistik kanal Lümen fenotip değiştirmek için tasarlanmış bir hedeflenen RNAi etkileşimi ekran bu protokolünü açıklar. ERM-1 doğrudan soruşturma için istenen hedef yol gösterici avantajı vardır gibi bu özel durumda, apikal/lumenal bir membran overexpressing işaretçisi ilişkili: hücre içi apikal/lumenal membran dipnotlar analiz. Overexpression tarafından oluşturulan bir işlev kazanç fenotip burada açıklandığı gibi bir işlev kaybı (RNAi) etkileşimi ekran ile birlikte bazı avantajlar da sağlar (³⁴ kaybı ve kazanç-in-fonksiyonlu analizleri tartışılması için görmek ve Tasarım genetik ekranlar). Ayrıca, ERM-1 kendisi iyi incelenen olduğunu "lumen morfogenez" ve apikal membran kimlik molekül¹². Bu nedenle, bu durumda, hedeflenen (yerine tarafsız) ekran doğrudan Lümen morfogenez kullanılazlar bu süreçte daha fazla karakteristik ERM-1'in belirli işlev sırasında için bilgilendirici olma olasılığı yüksektir. Ancak, tarafsız bir sigara hedefli ekran herhangi bir vahşi türü hayvanla, f transgenik bir hayvanla birlikte başlamadan benzer bir şekilde yürütülenboşaltım kanallar, etiketli luorescently veya herhangi bir kanal mutant ile. Genel avantajları ve dezavantajları (örneğin, mutagenesis karşı) RNAi işlev kaybı fenotipleri ve iletim nesil ve tartışma C. elegans genetik ekranları farklı türde için başka bir yerde ele alınmıştır ³⁴. RNAi üreten bir yelpazede fenotipleri daha hafif fenotipleri, dahil olmak üzere, öldürücü tubulogenesis gen analizi için belirli bir avantaj. Bu açıklanan ve beraberindeki gazetede bağırsak tubulogenesis³üzerinde tartışıldı. Kazanç ve fonksiyon kaybı mutantlar ve haçlar gibi klasik genetik yordamları oluşturmak için farklı yaklaşımlar detaylı ve genel genetik yöntemler edebiyat²⁰' tartışıldı.

Mikroskobu ve tubulogenesis fenotipleri değerlendirilmesi
Görsel olarak değerlendirilmesi ve iyi tanımlanmış kanal fenotip altında bir floresan mikroskop (örneğin kanal çapı) uzunluğu ve lümen, basit puanlama parametreleri kullanarak burada açıklandığı gibi anatomi modifikasyonu puanlama kısa bir süre içinde elde edilebilir Hatta hayvanlar bir hedefli veya sistematik genetik veya RNAi ekranın daha büyük sayıda işleme sırasında. Buna ek olarak, arama roman kanal morfogenez fenotipleri içinde büyük bir yük için benzer ekran bu vahşi-tipi (onun kanal etiketleme transgene dışında), daha fazla zaman, ancak, prensip olarak, alıcı aynı şekilde yapılabilir mi (böyle taşıdı bir ekran genom-wide olarak birkaç ay içinde). Bu tür ekranları (burada gösterilmeyen) birden çok farklı kanal fenotipleri tanımlar ve bu nedenle buna bağlı olarak geliştirmek gerekir farklı puanlama parametreleri, örneğin, nitel bir sınıflandırma (bkz. ^{9,11, düzeni 35,36,37,38} kanal fenotipleri mikroskobu dissekan tarafından puanı farklı yollar). Herhangi bir kanal fenotip yorumlarken, kist oluşumu bu ince borulu yapı için pek çok farklı hakaret belirsiz bir etkisi olabilir ve genellikle daha az bilgilendirici bir terminal fenotip olduğunu akılda tutmak önemlidir. Kist boyutu ve konumu, öte yandan, bilgilendirici, olabilir örneğin, kanal hücre (kanal uzantısı başında) yakın bir kist, kistler canal'ın uzunluğu boyunca veya kistler kanal ucunda sağlamak kusurların altta yatan mekanizma için ipuçları. (Burada lumenal içi sıvı dolu pulcuklarının apikal/lumenal bir membran ile çevrili olarak tanımlanan) kanal kistler veziküller ayırt (küçük sitoplazmik membran bağlı sıvı dolu pulcuklarının) veya boşluklar (büyütülmüş sitoplazmik membran bağlı sıvı dolgulu pulcuklarının), değil tüm bakmak yüzeysel olarak aynı (şekil 4A-D) olabilir bir lumenal membran tarafından çevrili. Sitoplazmik boşluklar aynı şekilde ikincil olarak, örneğin, çözümleri (sodyum azid) Montaj toksik etkileri ile ortaya çıkabilir. Hem, büyük kistler ve sitoplazmik çarpıtmalardan neredeyse hayvan boyutu kadar al ve daha fazla klasik "Temizle (Clr)" ayırt edilebilir gerek vücut boşluğunda sıvı birikimi nedeniyle oluşur fenotip kanal. Son olarak, kanal uzunluğu hemen hemen her zaman ikincil olarak Kistik Kanallar güvenilir değil, bu nedenle doğru kanal uzantısı kusur bir kist özgür ortamda göstermiş gerekir.

Onların küçük çaplarda rağmen boşaltım hücre altı bileşenleri kanallar, gibi Bazal membran, hücre içi karşı apikal endosomal karşı canalicular veziküller, hücre içi organellerin ve hücre iskeleti bileşenleri, görselleştirildiği tarafından daha yüksek Büyütme, örneğin, confocal mikroskobu (2 şekil, şekil 4). Confocal görüntüleme tarafından yalnız bir GFP olumlu kanal sitoplazma bir floresan satırı (şekil 2A, şekil 4E) üzerinden kanal sitoplazma Lümen ayırmak yeterlidir. İşaretleyicileri kimliğinin kesin ayırma immunoelectronmicroscopy³⁹gerektirir rağmen endosomal veziküller (boyut olarak da çarpıcı farklı), canalicular çözme için katkıda bulunur. Çift ve Üç Kişilik etiketleme bir molekül ilgi ve birbirlerine (Şekil 2) hücre altı bileşenleri arasındaki bağıntı hücre altı lokalizasyonu belirleyebilirsiniz. Tek etiketli lumenal kanal membranlar ama çift ile ayırt edilebilir veya etiketleme üçlü aynı çift çizgi sitoplazma veya Bazal membran olarak üretmek. Confocal analiz için uygun montaj önemli, kanal yapısı, ozmotik değişikliklere duyarlı ve en sık görülen, Kistik fenotip güvenlik açığı kırılganlık verilir. Kistler kolayca ozmotik değişiklikleri veya fiziksel baskı ile patlama, membran toksinler gibi sodyum azid duyarlıdır ve ayrıca (Bu da sitoplazmik boşluklara neden olabilir) immobilizasyon için kullanılan bazı anestezikler duyarlıdır. Bizim ellerde %5 lidokain M9 arabelleğindeki en boşaltım kanalı deneyleri için en iyi. Görüntüleme yordamlar ve tüm işleme açıklandığı gibi nazik olmalıdır. Fenotipleri (örneğin, kistler ve çarpıtmalar) taklit eserler önlemek için hemen sonra montaj görüntüleri elde etmek en iyisidir. Bu mümkün değilse, kist görüntüleri, diğer fenotipleri Imaging önce Öncelikle, elde edilebilir. Bu iletişim kuralı olan, buna karşılık, fototoksisite azaltır ve mikroskopi dinamik değişiklikleri analiz için tercih olduğunu disk confocal mikroskobu iplik ile karşılaştırıldığında üstün confocality sağlar Standart tarama confocal mikroskobu anlatılmaktadır zaman içinde hücre altı bileşenleri. Hücre altı dynamics böyle sorular da photobleaching teknikleri kullanarak ya da füzyon protein renk⁴⁰değiştirmek fotoğraf değiştirilebilir fluorophores ile etiketleme tarafından ele alınması. Son olarak, çözünürlük aralığı daha fazla transmisyon elektron mikroskobu (TEM, en yüksek yapısal ama değil moleküler çözünürlükte sağlayan), ekleyerek artırılabilir süper çözünürlük mikroskobu (nanometre aralıktaki moleküler çözünürlük sağlamak); ya da immunoelectronmicroscopy (her ikisi de sağlayan)^39,41. 3D tomografi TEM seri bölümlerle birleştirilebilir ve boşaltım Kanallar^9,10canalicular-plazma zarı arabiriminin analiz için özellikle kullanışlıdır. Mikroskopi bu farklı türleri ve bu farklı görüntüleme yaklaşımlardan kombinasyonları için geliştirilmiş teknikleri geliştirilmeye devam.

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

M. Buechner (University of Kansas, Kansas, ABD), K. Nehrke (Rochester Üniversitesi Tıp Merkezi, Rochester, New York, ABD) ve Caenorhabditis genetik Merkezi, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından Office araştırma altyapı finanse teşekkür ediyoruz Programlar (P40 OD010440). Bu eser NIH GM078653, MGH olduğunu 224570 ve SAA 223809 V.G. için hibe tarafından desteklenmiştir