Method Article
C. elegans boşaltım kanalı görsel vivo içinde analiz polarize de novo membran dipnotlar için benzersiz bir tek hücreli modelidir. Bu iletişim kuralı standart genetik/RNAi ve yaklaşımlar, uyarlanabilir kimlik ve tek hücreli tubulogenesis ve apikal membran ve Lümen Biyogenez yönetmenlik molekülleri karakterizasyonu için Imaging birleşimidir açıklar.
Dört C. elegans boşaltım Kanallar kurmak ve Lümen bir membran ve submembraneous ile stabilize etmek hemen hemen eşit kadar genişletilmiş hücre içi endotubes ile tek bir hücreden hayvan uzunluğu ile genişletilmiş dar tüpler vardır sitoiskeleti apikal karakter. Boşaltım hücre uzunluğu yaklaşık 2.000 kez bu model de novo polarize membran dipnotlar, hücre içi Lümen morfogenez vivo içinde değerlendirilmesi için benzersiz yaparak bu kanalları oluşturmak için genişler ve tek hücreli tubulogenesis. Burada sunulan iletişim kuralı standart etiketleme, kazanç ve kayıp-in-fonksiyonlu genetik ya da RNA müdahale (RNAi) birleştirmek gösterilmiştir-ve görsel olarak incelemek ve işlevsel olarak bu işlemlerin moleküler düzeyde çözümlemek için bu modeli kullanmak için mikroskobik yaklaşımlar. Etiketleme bir yaklaşım örneği protokol Transjenik hayvanlar ile floresan füzyon protein üretimi canlı tubulogenesis çözümlenmesi için özetliyor. Genetik bir yaklaşım örneği, bu işlev kazanç Kistik kanal fenotip değiştirmek için tasarlanmış bir görsel RNAi tabanlı etkileşim ekran kilit noktaları vurgular. Belirli yöntemleri açıklanan nasıl yapılır: etiket ve floresan proteinler; ifade ederek Kanallar görselleştirmek hedeflenen RNAi kütüphane oluşturmak ve kanal morfogenez moleküler analiz için eleme RNAi strateji; Kanal fenotipleri değişiklikler görsel olarak değerlendirmek; Onları Floresans mikroskobu dissekan tarafından Puan edinildi; hücre altı kanal bileşenleri daha yüksek çözünürlükte confocal mikroskobu tarafından karakterize; ve görsel parametrelerini ölçmek. Belirlenmesi ve genler hücre içi Lümen filogenetik korunmuş süreçlerinde yer alan ve tek hücreli karakterize C. elegans boşaltım kanalı yararlanarak ilgilenen araştırmacı için yararlı bir yaklaşımdır morfogenez tüp.
Tüm iç organları tüpler, taşıma ve gazlar, sıvılar ve besin alışverişini ve metabolik atık atılımı gibi birçok farklı fonksiyonları için çok önemli oluşur. Onların polarize karakterle ayrı apikal ve lumenal membran, bu belirli işlevler için uyarlanmış ve dipnotlar endo - ve plazma membran sistemlerinin hatalarını insan hastalık1,2sık bir nedenidir. Tüpler damarlara ve iç organlara çoğunluğu çok hücreli ve bir Lümen intercellularly oluşturur; Ancak, Lümen intracellularly oluşturan, tek hücreli tüpler, örneğin, insan kapiller yatak%230-50'si kadar temsil edebilir. Onların microdomains göre tüp'ın belirli işlevi (örneğin, boşaltım kanalı kanalcık Caenorhabditis bağırsak microvilli karşı farklı olabilir polarize membranları ile multi - tek hücreli tüpler kompozisyon, benzer olmakla birlikte elegans; bkz. kağıt üzerinde C. elegans bağırsak tubulogenesis eşlik eden)3. Polarize membran dipnotlar ve tubulogenesis ilkelerine metazoans arasında korunmuş ve benzer bir moleküler makineler onları1,2,4yönlendirir.
C. elegans boşaltım sistemi beş hücreleri oluşur: boşaltım hücre (EC), kanal hücre (DC), gözenek (PC) ve iki bezi hücreyi. Ablasyon EC, DC veya PC vücut boşluğu ve hayvanlar die erken bir larva sahne5sıvı birikimine neden olur. Bu üç tek hücreli tüpler intriguingly, onların Lümen üç farklı yöntemleri kullanarak oluşturmalısınız: hücre (EC) oymaya; Hücre kaydırma birleştiğinde autocellular junction oluşumu (PC); ve hücre kaydırma tarafından (DC); autofusion ile birleştiğinde Tüm filogenetik korunmuş6,7olan farklı mekanizmaları Lümen morfogenez. Posterior faringeal ampul yanal sol kısmında bulunan EC, iki yanal uzantıları dışarı hangi dört Kanallar anteriorly genişletmek için dışarı şube ve özafagusu (tarafında her iki sağ ve sol) solucan'ın burun ve kuyruk ucuna gönderir , sırasıyla (şekil 1)5,6,8. EC 2 x 1000 µm için yapım o büyük hücre içinde hayvan yaklaşık 1 µm kadar uzanır. Bir hücre altı düzeyde boşaltım kanalı bir Bazal membran doğru pseudocoelom yönettiği ve lumenal membran (endotube) tarafından tünel oluşturulmuş basit bir tüp var. Kanal lumenal membran kanal lumenal membran sadece hücreler arası kavşağında bağlanır; Kanallar aksi takdirde onların uzunlukları (şekil 1) junctionless. Boşaltım kanalı lumenal membran ve onun submembraneous sitoiskeleti apikal membran bileşimi ve submembraneous sitoiskeleti bağırsak gibi çok hücreli tüpler benzer moleküler onların kompozisyon tarafından tanımlanan apikal,, ve diğer (örneğin, düz) epiteli. Sitoplazmik organelleri, endomembranes kanal uzunluğu boyunca dağıtılır endosomal veziküler ve diğer (örneğin, Golgi) dahil olmak üzere. Ayrıca, birden çok canalicular veziküller - lumenal membran için bağlı ve/veya bağlı ya da izole - kanal sitoplazma7,8,9' dan,10 dişli . Bu dinamik plazma-membran/canalicular bağlantı daha fazla kanal'ın membran sistem genişletir ve her iki Lümen morfogenez ve ozmoregülasyon10için katkıda bulunur. Boşaltım kanalı böylece neredeyse tamamen endo - ve plazma membran, mükemmel bir model polarize membran dipnotlar çözümleme ve düzenleme, endo-plazma zarı arayüzü sağlayan oluşur. Apikal membran dramatik genişleme kanal morfogenez - bu tek hücreli sistemde Lümen uzantısıyla – çakışık sırasında da stabilize ve hücre içi lumenal membran Merkezi gerek tarafından kaynaklanan mimari sorunlarını analiz etmek için sağlar. . Bu iletişim kuralı kanal tüp ve Lümen'ın yapısal morfogenez ve bu işlemi için gereken hücre içi zar dinamiği analizi yerine AK 's konumda oluşturmak hücre hareketlerini doğrudan sinyalleri odaklanır boşaltım sistemi ve diğer hücresel öğelere (6' gözden), karmaşık bağlantıları oluşturun.
Bir daha fazla polarize membran ve hücre içi Lümen Biyogenez analizi için C. elegans tek hücreli kanal sistemi ayırmak, gelişimsel zaman içinde farklı bileşenleri, membran üretimi için onun yetenek avantajdır ve kavşak. EC ventral kapanış saatinde tarihi ve ventro-yanal sırasında zaman yanal kanal uzantısı ve dallanma ortaya orta embriyo5,6,8sırasında yutak yerleşir. Bu geç embriyogenez, L1-larva sahne (şekil 1) devam ediyor bir işlem sırasında ön-arka kanal uzantısı tarafından takip ediyor. Yeni taranmış bir larva, arka kanal ucunu solucan yaklaşık yarısı ulaşır, kuyruk L1 aşamasının sonunda hangi süre sonra kanal tam genişletme ile birlikte solucan8uzatıyor. İlk larva aşamasında etkin kanal büyüme bu hayvanın büyüme böylece aşan bir hızda biter, ancak, daha fazla büyüme paralelinde bütün hayvan büyüme ek larva aşamaları (L2-4) sırasında oluşur. Bu ayar farklı adımları polarize de novo membran dipnotlar polarize hücre bölünmesi veya geçiş bağımsız analiz etmek için fırsat sağlar. Ayrıca, bu bu işlem ayrılması (hangi Lümen başlatma önce embriyo içinde meydana) kavşaklar derlemesinden izin verir; onların tam membran polarizasyon içinde hala bir açık soru polarite alanındaki gereksinimdir. Son olarak, benzersiz olarak apikal Bazal membran genişleme, eski boşaltım Kanallar10' önceki ikinci işlem üzerinden ayırır. C. elegans boşaltım kanalı modeli bu nedenle bu avantajları polarize membran Biyogenez analizi için bir dizi hisse ama çok hücreli bir ortamda (bkz: yürütür bağırsak modeli özellikle bilgilendirici bir tamamlayıcıdır eşlik eden kağıt üzerinde bağırsak tubulogenesis3).
Vahşi-türü kanallar bu küçük solucan ultrathin tübüllerin olmakla birlikte, onların Lümen VI olabilirNomarski optik bu şeffaf hayvan tarafından doğrudan sualized. Aslında, mutant Kistik kanal türleri Morfoloji düşük büyütme ileri genetik ekranlarda büyük etkisi genlerin tubulogenesis11' de yer alan tanımlamak için kullanılmıştır mikroskobu dissekan kullanarak etiketsiz hayvanlarda karakterize edilebilir. Geliştirilmiş görsel Kanallar morfolojisi ve onların polarize membranlar, hücre iskeleti bileşenleri, farklı hücre içi organellerin ve diğer hücre altı yapıları, bir ayrım olarak ancak, etiketleme gerektirir ve daha yüksek güç floresan diseksiyon ve confocal mikroskobu. Etiketleme ve mikroskopi için zorluklar çok sayıda Kanallar fine yapısı pozlar rağmen belirli molekülleri her bölmesi için benzersiz üzerinden ayrılır membranlar ve hücre altı bileşenleri ve hayvanların güvenli bir şekilde mikroskopi için Eğer monte edilebilir (bkz: protokolü ve tartışma) eserler tanıtımı önlemek için bazı önlemler alındı. Etiketleme-ebilmek kılınmak sabit örnekler immünhistokimya veya transgenik solucanlar floresan füzyon protein kendi kontrolü altında ifade oluşturarak veya boşaltım kanalı özel Organizatör vivo içinde görüntüleme için. Bu iletişim kuralı ikinci etiketleme tekniği açıklar (eşlik eden kağıt3boyama antikor için bağırsak tubulogenesis bakınız).
Vivo kaybı veya kazanç-in-fonksiyonlu çalışmalar tek hücre analiz görüntüleme vivo içinde birleştirmek için yetenek düzey geliştirme yapar C. elegans boşaltım kanalı için moleküler özellikle güçlü bir model ve tek hücreli tubulogenesis hücresel analizi. İleriye veya geriye doğru genetik ekranlar gerçekleştirilen kanal morfogenez fenotipleri (örneğin, kistleri) tanımlamak için bir vahşi-türü veya etiketli transgenik hayvan ile başlayan ve onların temel gen kusurları. Alternatif olarak, bu tür ekranları mutant fenotip (örneğin, Kistik bir kanal) başlatmak ve bastırıcılarının veya bu fenotip arttırıcılar işlevsel olarak etkileşim genleri mutasyona uğramış fenotip neden gen ile tanımlamak için tanımlar. Mutant fenotip neden olan genetik bozukluk bir kaybı (örneğin, gen silme üzerinden ) ya da bir kazanç neden olabilir (örneğin, üzerinden aktive bir mutasyon ya da aşırı Gen kopya getirilmesi yolu ile) incelenen işlev. İleriye doğru mutagenesis ya da sistematik RNAi ekranlar önyargılarını gen işlevi olmadan ve genler faiz işlevinde yer tarafsız tanımlanmasına izin. Böyle ilgi herhangi bir gen veya gen (örneğin, hedeflenen ekranlar) herhangi bir grup da hızla probed genom çapında RNAi kitaplıkları besleme durumu göz önüne alındığında, hemen hemen her gen kolayca C. elegans, RNAi tarafından nakavt bir ters genetik yaklaşım kendi etki için. Yaklaşımlar olası birleşimini göstermek için biz burada bir hedeflenen RNAi etkileşimi ekran, bir işlev kazanç Kistik boşaltım kanalı mutant ile başlayan tarif sitoplazmik kanal yeşil flüoresan protein (GFP) ile Etiketlenmiş. Mutant fenotip erm-1, son derece korunmuş C. elegans overexpression tarafından oluşturulan ortholog membran-aktin bağlayıcı ailesinin Ezrin-Radixin-Moesin (ERM), lumen morfogenez ve membran karıştığı birçok tür12kuruluşta. C. elegans ERM-1 boşaltım kanalı ve bağırsak, gibi iç organların lumenal membranlar yerelleştirir ve her iki13Lümen oluşumu için gereklidir. ERM-1 overexpression fazla aktin ve akı Lümen artan ve kısa bir Kistik kanal ve bükük lumenal membran kalınlaşmış aktin astar boya9ile üreten kanal lumenal zar, veziküller acemi. Protokol transgenik suşları ile boşaltım kanalı ifade oluşturmak füzyon protein (veya diğer proteinler); etiketli açıklar nasıl bir kanal fenotip değiştiriciler tanımlamak için böyle suşları ile başlayan hedeflenen RNAi ekranlar gerçekleştirmek için; ve görsel olarak bilgilendirici tubulogenesis fenotipleri ölçmek için basit yollar dahil olmak üzere Floresans diseksiyon ve confocal mikroskobu tarafından bu tür ekranları sonuçlarını analiz etme. Etiketleme teknikleri ve öldürücü tubulogenesis genler için ayarlanmış RNAi ayrıntılarını alternatif bağırsak tubulogenesis3eşlik eden kağıda bulunabilir. Tüm yöntemleri çeşitli kombinasyonlarda kanal tubulogenesis diğer sorulara incelenmesi için kullanılabilir.
1. C. elegans Excretory Canal floresan füzyon protein 14 tarafından etiketleme
Not: eşlik eden kağıt üzerinde bağırsak tubulogenesis bkz: 3 in situ antikor yordamlar boşaltım kanalı uyarlanabilir boyama tarafından etiketleme için. Tablo 1 C. elegans boşaltım kanalı endo - ve plazma membran, Tablo 2 ifade boşaltım kanalı için sürüş rehberleri örnekleri için görüntülenmesi için yararlı kanıtlanmış molekülleri örnekleri için bkz: ve Tablo 3 işaretleri ve Organizatör daha kapsamlı koleksiyonları için kaynaklar için farklı fluorophores yelpazesi tartışırken başvurular da dahil olmak.
2. Bir hedef RNAi Kütüphane ve bir kanal fenotip değiştirmek için tasarım bir RNAi etkileşim ekranın inşaat
Not: hedeflenen RNAi tabanlı genetik etkileşimi ekran kullanan bir overexpression Kistik kanal fenotip anlatılan etkileşen boşaltım kanalı morfogenez genler için arama. ERM-1 [++] zorlanma (bkz. Adım 1.2.9 yükleme) örnek 9 olarak hizmet vermektedir. Bu yaklaşım sadece bir boşaltım kanalı Lümen morfogenez genetik analizi için birçok olası yaklaşımlar sunuyor (genetik diğer yaklaşımlar için bkz: giriş ve tartışma). Bağırsak tubulogenesis 3 ve başvurular 17 , 21 , 22 için geçmiş RNAi, RNAi ayrıntılarını üzerinde eşlik eden kağıt görmek yordamlar, modülasyonu'nu (öldürücü tubulogenesis genler için ayarlanabilir) RNAi güç ve teknik sorunların tartışılması RNAi için bağlı. Başvuru 19 standart solucan kültür ve bakım ve malzemelerin tablo için bkz:.
3. Vivo Floresans mikroskobu anatomi ve puanlama, Tubulogenesis fenotipleri C. elegans Excretory kanalının Imaging
4. C. elegans Excretory kanal tarafından lazer tarama Confocal mikroskobu yüksek çözünürlükte görüntüleme
Bu iletişim kuralı, görsel ve tatlı tek hücreli tubulogenesis ve tek bir hücrede hücre içi Lümen morfogenez çözümlemek için C. elegans boşaltım Kanallar kullanmayı açıklamaktadır. Onların uzantısı sırasında orta embriyogenez zaman yetişkinlik, dört boşaltım Kanallar onların demiri ve apikal/lumenal membranlar için benzersiz bir model sağlar onların canalicular ve endosomal endomembrane sistemi ile birlikte genişlemeye devam de novo vivo içinde analizini membran dipnotlar (şekil 1) polarize. Apikal membranlar gibi hücre altı bileşenleri, sitoplazma ve endosomal karşı canalicular veziküller belirli floresan füzyon protein (Bölüm 1 iletişim kuralında tanımlanan) ifade ederek görüntülenmeyecektir ve onlar birbirinden tarafından ayırt edici olabilir Çift veya tek bir transgenik hayvan (Şekil 2) içinde etiketleme üçlü. Bir apikal membran ilişkili molekül (ERM-1), overexpressing tarafından oluşturulan bir benzersiz boşaltım kanalı fenotip (şekil 3A-B) apikal membran işleyen genlerin tanımlamak için hedeflenen RNAi ekranı nasıl göstermek için kullanılır ve Lümen Biyogenez; Bu bir moleküler ve görsel analiz (Bölüm 2 iletişim kuralında tanımlanan) bu modelde polarize membran dipnotlar örneği olarak hizmet vermektedir. Bu ERM-1 [++] kanal fenotip Floresans mikroskobu (Bölüm 3 iletişim kuralında tanımlanan) anatomi görsel olarak değerlendirmek nasıl ve skor bastırma (şekil 3 c-D) ve geliştirme (şekil 3E-F) göstermek için kullanılır . Confocal mikroskobu (şekil 4) tarafından hücre altı düzeyde (Bölüm 4 iletişim kuralında tanımlanan) kusurları gidermek ve basit kanal fenotipleri (kanal uzunluğu ve kist ölçmek nasıl göstermek için kanal fenotipleri ERM-1 düzeyleri modülasyon tarafından indüklenen hizmet boyutu) ve apikal membran Biyogenez kusurları (şekil 5).
Resim 1 : Morfogenez C. elegans Excretory Canal ve hücre altı kanal yapıları
(A) şematik gösterimi boşaltım Kanalı uzantısı (mavi çizgiler) embriyo ve larva geliştirilmesi sırasında. Boşaltım hücre son ventro-lateral sol konumunda posterior faringeal ampul (gösterilmez) embriyo virgülle aşamada ulaşır. Embriyo uzatıyor gibi ilk iki kolu yanal sol ve sağ tarafında doğru genişletir; o zaman her kol bir anterior ve posteiror dalına bifurcates. Bu anterior ve posteiror dallardan daha da genişletmek hayvan dört larva aşamalarında uzama ilk hayvanın büyüme L2 aşamada yakalama, o zaman daha da büyümesini yetişkinliğe kadar eşlik eden. De novo polarize membran Biyogenez bu uzantı yetişkinliğe kadar destekler. (B) yetişkin hayvan anterior kanal dalları burun ucu ve posterior dalları, kuyruk (mavi çizgiler) ulaşmak. Boşaltım hücre Vücut posterior faringeal ampul (mavi) gösterilir. Polarize membran etki alanları yetişkinlik sırasında korunur. (C) sayısı bir kanal kol bölümünün büyütülmüş. Sol: 3D görüş-in kanal gösterir: Bazal membran (siyah), sitoplazma (mavi), lumenal membran (yeşil) ve Lümen (beyaz). Sağ: içinde kanal ve onun membranlar görünümünü: Bazal membran (siyah), sitoplazma (mavi), endosomes (sarı oval), canalicular veziküller (beyaz küreler, her diğer, lumen bağlı veya izole bağlı tek veziküller), apikal membran (yeşil) ve Lümen (beyaz). (D) Confocal/DIC bindirme filmler bir embriyo boşaltım hücreye ve tarafından etiketli bir larva, boşaltım kanalları sitoplazmik GFP karşı lumenal anılan sıraya göre. Sol görüntü: boşaltım hücreye (Yeşil ok) erm-1 organizatörü altında apikal ERM-1::GFP ifade ederek görselleştirildiği kanal Lümen ile 1.5-fold bir embriyo. Doğru görüntü: dört boşaltım kanalı L3 larva, sitoplazmik vha-1 ptarafından görüntülenmiştir (Yeşil ok) dallarında:: GFP. Ölçek çubukları 20 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Çift floresan Fusion proteinler ile etiketleme tarafından vahşi tipi boşaltım kanalı kollarında hücre altı bileşenleri görselleştirme
(A) apikal membran sitoplazma ayırt. GFP ifade sulp-5 organizatörü altında görüntüler kanal sitoplazma (yeşil, üst); ERM-1::mCherry ifadesi altında kendi organizatörü apikal membran (kırmızı, orta); görüntüler Bu görüntüler (alt) birleştirme sitoplazma ve aksi durumda tek bile yüksek büyütme oranında etiketleme tarafından ayırt edilemez olacak apikal membran ayırt eder. Ölçek çubuğu 5μm =. (B) endosomal veziküller Lümen için mekansal ilişki belirleme. Görselleştirme Lümen tarafından bir apikal membran ilişkili GFP füzyon proteini (sözde) kırmızı, en iyi renkli; mCherry::RAB-7 (sözde) mavi, orta renkli; ifade tarafından endosomal veziküller görselleştirme Bu görüntüler (alt) birleştirme endosomal veziküller Lümen için göreli uzamsal konumları gösterir. Ölçek çubuğu 5μm =. (C ve D) Kanal tüp şekillerin hücre altı kanal bileşenleri farklı büyüklüklerde, karşı çözümleniyor. L1 larva sitoplazma GFP sulp-5 organizatörü ve sitoplazmik canalicular veziküller altında su kanal AQP-8::mCherry aqp-8 organizatörü altında ifade ederek ifade ederek etiketlenir. (C) alt büyütme oranında alınan görüntüleri sahne-özel varicosities (varicosities canalicular veziküller ve kanal büyüme için gerekli diğer bileşenleri bol miktarda su depoları vardır) karşılık gelen bir "boncuk-a-dize üzerinde" deseni gidermek, ama yapmak sitoplazmik AQP-8 puncta çözemediğinizde kullanın. (D) daha yüksek büyütme oranında alınan görüntüleri için canalicular veziküller karşılık gelen kanal sitoplazmada AQP-8 puncta çözmek. Ölçek çubukları: 20 mikron c ve d 5 mikron Tüm panelleri 10-15 bölüm her confocal projeksiyonlar göster. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Arttırıcılar ve bastırıcı puanlamaKistik kanal fenotip (ERM-1[++]) mikroskobu dissekan tarafından s
(A) ERM-1 [++]; rol-6(su1006) boşaltım Kanallar GFP vha-1 organizatörü altında ifade ederek görüntülenir. Posterior Kanallar genişletmek kadar vulva veya hayvan bedeni orta (oklar; 1/2 uzantısı olarak kabul) daha düşük büyütmede (1.5 X amaç ve düşük zum). (B) daha yüksek büyütme oranında imza ERM-1 [++] küçük Kistik bükük kanal, posterior kanallar (bir kol küçük okla gösterilen) ucu ile çözülebilir vulva veya biraz ötesine kadar uzanan (vulva büyük okla; gösterilen kanal Lümen panelinde D karşılaştırma için vahşi türü olarak kabul edilebilir). (C) bastırma, düşük büyütme: RNAi daha uzun ve ince Kanallar tedavi ERM-1 [++] hayvanlar. Neredeyse tamamen kuyruk (küçük oklar; karşılaştırmak-e doğru bu panel B gösterilen üst hayvanların); genişletmek için posterior Kanallar yüksek büyütme oranında görülebilir (D) büyük bir ok vulva konumunu gösterir. (E) geliştirme: daha fazla kısaltılmış kanallar daha büyük kistler RNAi ile tedavi ERM-1 [++] hayvanlar; düşük büyütme, zoom. (F) daha yüksek büyütme oranında arka kanal uzantısı olabilir daha az 1/2 (küçük ok) belirlenen veya (büyük okla gösterilen) vulva ve 1/3 (daha geniş gösterilen üst hayvan bundan hayvanın genişliğinin aşan olarak kist boyutu kadar genişletilmiş değil B). Ölçek çubukları 400 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Görsel analiz boşaltım kanalı morfoloji ve Mutant/RNAi hayvanlar tarafından Confocal mikroskobu bileşenlerinde hücre altı kanal
(A-D) Bir katmaninin bir Kistik kanal fenotip (confocal/DIC bindirme Filmler gösterilir) ayırt. (A) sulp-5 organizatörü (ayrım apikal zar etiketleme, B panelinde gösterilen yeşil mavi olarak sözde bkz. colour) altında GFP ifade ederek sitoplazma bir vahşi tipi kanal görüntülenir. (B) bir vahşi tipi kanal apikal membran ERM-1::GFP ifade ederek görüntülenir; Not Lümen bu büyütme oranında görünür değil ve bu tek etiketleme sitoplazmik membran etiketleme dan ayırt edemez. (C) boşaltım kanalı fenotip indüklenen tarafından RNAi: sitoplazmik etiketleme intralumenal kistleri sitoplazmik çarpıtmalardan ayırt edemez. (D) boşaltım kanalı fenotip indüklenen tarafından RNAi: apikal ERM-1::GFP etiketleme (sitoplazmik) boşluklar (karşılaştırmak sitoplazmik boşluklar için şekil 4I) yerine (lumenal) kistleri tanımlayan Lümen içinde sıvı birikimi algılar. Ölçek çubuğu için A-D, A. (E-J) çözümleme kaybı ve kazanç-in-fonksiyonlu etkileri (tek kanal silah confocal görüntüleri gösterilir) hücre altı kanal bileşenleri üzerinde gösterilen 40 mikron =. (E-G) Erm-1 RNAi kanalcık hücre altı lokalizasyonu üzerinde etkisi. (E) vahşi tipi kanal sitoplazma; GFP dışlama gösteren Lümen unutmayın. (F) için canalicular veziküller karşılık gelen vahşi tipi sitoplazmik AQP-8::GFP puncta. (G) Cytoplasmic ve Bazal deplasman AQP-8::GFP puncta erm-1(RNAi) hayvan. (H) kesintili Lümen ve Lümen ipucu patoloji (kıvırma ve Lümen merkezleme kaybı) erm-1(mildRNAi) hayvan detayını (RNAi gücü oransal için3 bakınız); Not Bu kanal sitoplazma burada küçük kistler tarafından belirtilen lümen, ucu ötesine uzanır. (I) sitoplazmik çarpıtmalardan boşaltım kanalı vücudunda herhangi bir kanal uzantısı olmadan güçlü erm-1(RNAi) hayvan3etkilenen; ACT-5::GFP Lümen (dışında bazı boşluklar çevresinde birkaç küçük lekeleri) için işe değil unutmayın. (J) alımı aşırı ACT-5::GFP ve AQP-8::mCherry Lümen ERM-1 (Not kalın kemer ACT-5::GFP ve Kistik Lümen çevresinde örtüşen AQP-8::mCherry kümeleri) overexpressing Üç Kişilik transgenik hayvan için. Ölçek çubuğu E-J, E. içinde gösterildiği için 5 mikron = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Miktar tarafından parçalanmış ve Confocal mikroskobu kanal kusurların örnekleri
Vahşi türü (üst paneli) ve mutant Kistik (alt panelleri) (A) şematik gösterimi için miktar kanal uzunluğu ve kist boyutu boşaltım kanallar. Arka kanal uzunluğu 0, 1/4, 1/2, 3/4 ve 1 sayılabilir. Kanal uzunluğu '0' uzantısı gösterir ve '1' tam uzunlukta uzantısı belirtir. Kist boyutu olarak sayısal < 1/3 (küçük) ve > 1/3 (büyük) gövde çapı. Brüt kanal Morfoloji kontrolü ve floresan mikroskopi dissekan hayvanlara ERM-1 [++](RNAi) , (B) miktar. Sahte(RNAi) ERM-1 [++] hayvanlarda yaklaşık %1/2 95 hayvanlarda (başvuru yansıması, şekil 3A-B) genişletilmiş arka kanal uzunluğudur. Bastırıcı ERM-1 [++](RNAi) hayvanlarda arka kanal'ın uzunluğu % 80 – 90 hayvanlarda (başvuru yansıması, şekil 3 c-D) neredeyse tamamen genişletilir. Artırıcı ERM-1 [++](RNAi) hayvanlarda büyük kistler ve kısa uzunluğu yaklaşık % 60-70 Kanallar hakkına sahiptir (< 1/2) (başvuru yansıması, şekil 3E-F). ± SD demek olarak sunulan veri (n > 3). ImageJ tarafından apikal/lumenal kanal sitoiskeleti confocal görüntülerden floresan yoğunluğu (C) miktar. Kanal'ın apikal membran ACT-5::GFP tarafından etiketlenir, vahşi tipi kanal kol sağ sol, ERM-1 [++] kanal kolu gösterilir. Panelleri yaptı: ACT-5::GFP vahşi türü membran kol yoğunluğu olan yaklaşık 50 (gri değeri/membran; siyah ve kırmızı okla gösterilen), görüntü altında gösterilen arsa. Sağ kapı aynası: ACT-5::GFP ERM-1 [++] yoğunluğunu 100 olduğunu (dorsal membran gri değeri yaklaşık 110 (siyah ok) ise ventral membran yaklaşık 140 (kırmızı ok)), görüntü altında gösterilen arsa. Ölçek çubukları 5 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tablo 1: işaretçileri için örnekleri C. elegans Boşaltım kanalı membran sistemi | ||||
Protein adı | Alt |
Tablo 2: örnekleri C. elegans Excretory Canal özel rehberleri | ||
Organizatör | İfade sahne | |
Erm-1 | virgül sahne embriyo | |
sulp-5 | 3 kat embriyo | |
vha-1 | logosuna 2 kat embriyo | |
vha-5 | logosuna 2 kat embriyo | |
aqp-8 | logosuna 2 kat embriyo | |
GLT-3 | geç embriyo | |
1 Örnek tablo 3'te listelenen kaynaklardan seçilir. |
Tablo 3: kaynaklar | |||||
C. elegans boşaltım kanalı özgü molekülleri, reaktifler/suşları ve antikorlar etiketleme tanımlamak için kaynak | |||||
1. Caenorhabditis genetik Merkezi (CGC)43 kullanılabilir reaktifler ve suşları için | |||||
2. Wormbase44 boşaltım kanalı özgü molekülleri, soy ve antikorlar hakkında bilgi için | |||||
3. boşaltım kanalı özgü molekülleri hakkında bilgi: bkz: başvuru6 | |||||
4. Transgeneome Web sitesi45 translasyonel GFP füzyon yapıları için | |||||
5. C.elegans ifade deseni46 transkripsiyon GFP füzyon yapıları | |||||
6. ulusal BioResource Projesi (NBRP)::C.elegans47 bilgi C. elegans mutantlar ve rehberleri | |||||
7. Fluorophores: başvuru48,49 görmek | |||||
Web tabanlı kaynaklara molekülleri hedefli RNAi kitaplığı için hazırlamak için | |||||
1. GeneMANIA50 | |||||
2. AceView51 | |||||
3. IHOP52 | |||||
4. Wormbase44 | |||||
5. saccharomyces genom veritabanı53 | |||||
6. Flybase54 | |||||
7. fare genom veritabanı55 | |||||
8. insan genomu veritabanı56 | |||||
9. patlama57 |
Tablo 4: Örnek basit fenotip Sheet puanlama | |||||||
RNAi Kütüphane | Zorlanma | Genel fenotip (% Toplam) | Kanal fenotip | ||||
Kanal uzunluğu < 1/2 (% L4) | Kanal uzunluğu > 1/2 (% L4) | Diğer kanal fenotip | Sayılan hayvanlar toplam sayısı | ||||
Plaka No | İyi numara | ||||||
I-1 | A1 | ERM-1 [++]; vha-1 p:: GFP | CLR (30) | 80 | 20 | 100 | |
X-5 | B12 | aynı | hiçbiri | 30 | 70 | 100 | |
III-10 | C5 | aynı | UNC (54) | 70 | 30 | büyük kistler | 100 |
C. elegans genetik çok yönlülük, şeffaflık, basit vücut planı ve sabit hücre soyu morfogenez analizi için mükemmel bir model olun. Bu iletişim kuralı standart genetik manipülasyon ve görüntüleme birleştirmek açıklar 2 mikron yararlanmak için çalışmalar ince polarize membran ve hücre içi Lümen Biyogenez bir tek hücre tüp çalışmaya C. elegans boşaltım kanallar.
Etiketleme
C. elegans boşaltım kanalları canlı analiz (burada açıklanan) izin floresan füzyon proteinlerin ifade veya antikor veya kimyasal (bkz: kağıt üzerinde antikor boyama için bağırsak tubulogenesis eşlik eden boyama etiketli 3). iki veya daha fazla farklı fluorophores veya bunların birleşimini ifade teknikleri, etiketleme yüksek çözünürlüklü bir görsel diseksiyon bu ince tübüllerin (Şekil 2) için farklı sağlar. Kanallar için bir kanal belirli düzenleyici tarafından yönetmen floresan füzyon proteinlerdir aralarında çeşitli nedenlerden dolayı boşaltım kanalı etiketleme için ilk tercihi: (1) en düşük ifade düzey birçok kanal protein ve (2) kanal'ın güzel kolayca yapı nerede faiz protein de ifade edilebilir Kanallar dışında boyama tarafından boğulmuş. Öte yandan, kanallar eksojen proteinler için hassas ve kolayca belirsiz fenotipleri (örneğin, uzantısı hataları ve kistler veya hatta ölümcül) geliştirmek ne zaman böyle proteinler güçlü dile getirdi. Bu karar içine Transjenik hayvanlar oluşturmanın farklı yolları arasında seçim yaparken tartmak gerekir. Prensip olarak, transgenes extrachromosomal diziler (örneğin, plazmid DNA erbezi germline dönüşüm, burada açıklandığı şekilde içine direkt enjeksiyon tarafından), genellikle yüksek kopyalama sayı dizileri (kez ile yüksek üreten tanıttı olabilir ifade), ya da genellikle düşük veya tek kopya numarası (örneğin, bombardıman26 ya da tek kopya Mos1-aracılı ekleme [MosSCI]27yoluyla), genom içine entegre. Extrachromsomal diziler Ayrıca entegre olabilir içine ikinci bir adım (hala, ancak, yüksek kopya numaradan) genom18. Öte yandan, germline düşük konsantrasyon (örneğin, 1-2 ng/µL DNA, işaretleyici DNA daha yüksek bir konsantrasyon ile birlikte), içine enjekte edildiğinde düşük (hatta tek) kopya sayı dizileri kolayca oluşturulan28olabilir. Bu senaryo için kanal etiketleme, en iyi ifade düzeyi çok düşük ne de çok yüksek (toksik) bulmak yardımcı olabilir DNA konsantrasyonları değiştirilebilir avantajı vardır. Enjekte DNA konsantrasyon ve ifade düzeyi arasındaki ilişki birden fazla faktöre (örneğin, düzenleyici) bağlıdır ve böylece ampirik olarak belirlenmelidir. Alternatif olarak, faiz gen doğrudan germline bir fluorophore ile kümelenmiş düzenli olarak serpiştirilmiş kısa palindromik yineler (alan CRISPR) etiketleme yordamlar29,30' etiketli. Her ne kadar bu yaklaşım fluorophore en fizyolojik genomik bağlamı yerleştirir, bu her zaman gerekli ya da arzu (protein çok düşük seviyelerde ifade edilir zamanÖrneğin, ) değildir. Ancak, en iyi seçenek, örneğin olabilir gen ilgi çok büyükse.
Kanal görselleştirme kanal sitoplazma bir fluorophore tarafından vurgular kanal içine transkripsiyon yapıları yönlendirerek gerçekleştirilebilir. Buna ek olarak, hücre altı kanal bileşenleri etiketleme translasyonel bir füzyon tam uzunlukta gen gen kodlama fluorophore kareye bağlandığı gerektirir. Bir kanal belirli organizatörü (yerine ifade için gene kendi organizatörü) kullanırken, kendi seçtiği Düzenleyici'nın yoğun ve gelişimsel analizi için ifadesini zaman dayanmalıdır. Kanal'ın ozmotik işlevi kritik olacağı birçok boşaltım kanalı belirli genler larva sahne önce ifade değil; çok geç ve etkin uzantısı aşamasında analizi için (erm-1 ve profesyoneller-1 olan erken ifade genler)10,13. Boşaltım kanalı endo - ve plazma zarı işaretleyicileri ve kanal belirli rehberleri örnek verilen Tablo 1 ve 2, sırasıyla ve ek kanal özgü molekülleri Tablo 3' te bulmak için kaynaklar. Bu kaynaklar Caenorhabditis genetik merkezi üzerinden kullanılabilir olan bir zaten yapılmış uygun floresan füzyon protein bulmak için de kullanılabilir (CGC; Ayrıca bkz. Tablo 1). Rekombinant plazmid böyle protein füzyon ifade oluşturmak için bir çeşitli klonlama yöntemleri, her biri belirli artılarını ve eksilerini kullanabilirsiniz (başka bir yerde tartışıldı14). Bunlar geleneksel restriksiyon enzimi dayalı dahil burada açıklanan yaklaşımlar, klonlama, modüler klonlama birden fazla site ağ geçidi sistem31, Gibson derleme32veya muhabir gen inşaat "PCR dikiş" yöntemiyle14 kullanarak ,33. Bu farklı yaklaşımlardan germline onların giriş için seçilen yöntem ve/veya (örneğin, Organizatör ve cDNAs daha büyük ölçekli yaklaşımlar etiketleme için karıştırma sistemi kolaylaştırır çok yönlü Gateway) diğer ihtiyaçlarınıza adapte edilebilir . İlgi proteinin işlevi göz önünde bulundurarak (N-C-terminus protein karşı bağlama) fluorophore, doğru ekleme sitesini seçmek için alınması gereken umurumda.
Gen işlevi ile girişim
C. elegansişlevinde gen huzursuz için birçok olası yollarından biri, lumenal membran bileşen overexpressing tarafından indüklenen bir Kistik kanal Lümen fenotip değiştirmek için tasarlanmış bir hedeflenen RNAi etkileşimi ekran bu protokolünü açıklar. ERM-1 doğrudan soruşturma için istenen hedef yol gösterici avantajı vardır gibi bu özel durumda, apikal/lumenal bir membran overexpressing işaretçisi ilişkili: hücre içi apikal/lumenal membran dipnotlar analiz. Overexpression tarafından oluşturulan bir işlev kazanç fenotip burada açıklandığı gibi bir işlev kaybı (RNAi) etkileşimi ekran ile birlikte bazı avantajlar da sağlar (34 kaybı ve kazanç-in-fonksiyonlu analizleri tartışılması için görmek ve Tasarım genetik ekranlar). Ayrıca, ERM-1 kendisi iyi incelenen olduğunu "lumen morfogenez" ve apikal membran kimlik molekül12. Bu nedenle, bu durumda, hedeflenen (yerine tarafsız) ekran doğrudan Lümen morfogenez kullanılazlar bu süreçte daha fazla karakteristik ERM-1'in belirli işlev sırasında için bilgilendirici olma olasılığı yüksektir. Ancak, tarafsız bir sigara hedefli ekran herhangi bir vahşi türü hayvanla, f transgenik bir hayvanla birlikte başlamadan benzer bir şekilde yürütülenboşaltım kanallar, etiketli luorescently veya herhangi bir kanal mutant ile. Genel avantajları ve dezavantajları (örneğin, mutagenesis karşı) RNAi işlev kaybı fenotipleri ve iletim nesil ve tartışma C. elegans genetik ekranları farklı türde için başka bir yerde ele alınmıştır 34. RNAi üreten bir yelpazede fenotipleri daha hafif fenotipleri, dahil olmak üzere, öldürücü tubulogenesis gen analizi için belirli bir avantaj. Bu açıklanan ve beraberindeki gazetede bağırsak tubulogenesis3üzerinde tartışıldı. Kazanç ve fonksiyon kaybı mutantlar ve haçlar gibi klasik genetik yordamları oluşturmak için farklı yaklaşımlar detaylı ve genel genetik yöntemler edebiyat20' tartışıldı.
Mikroskobu ve tubulogenesis fenotipleri değerlendirilmesi
Görsel olarak değerlendirilmesi ve iyi tanımlanmış kanal fenotip altında bir floresan mikroskop (örneğin kanal çapı) uzunluğu ve lümen, basit puanlama parametreleri kullanarak burada açıklandığı gibi anatomi modifikasyonu puanlama kısa bir süre içinde elde edilebilir Hatta hayvanlar bir hedefli veya sistematik genetik veya RNAi ekranın daha büyük sayıda işleme sırasında. Buna ek olarak, arama roman kanal morfogenez fenotipleri içinde büyük bir yük için benzer ekran bu vahşi-tipi (onun kanal etiketleme transgene dışında), daha fazla zaman, ancak, prensip olarak, alıcı aynı şekilde yapılabilir mi (böyle taşıdı bir ekran genom-wide olarak birkaç ay içinde). Bu tür ekranları (burada gösterilmeyen) birden çok farklı kanal fenotipleri tanımlar ve bu nedenle buna bağlı olarak geliştirmek gerekir farklı puanlama parametreleri, örneğin, nitel bir sınıflandırma (bkz. 9,11, düzeni 35,36,37,38 kanal fenotipleri mikroskobu dissekan tarafından puanı farklı yollar). Herhangi bir kanal fenotip yorumlarken, kist oluşumu bu ince borulu yapı için pek çok farklı hakaret belirsiz bir etkisi olabilir ve genellikle daha az bilgilendirici bir terminal fenotip olduğunu akılda tutmak önemlidir. Kist boyutu ve konumu, öte yandan, bilgilendirici, olabilir örneğin, kanal hücre (kanal uzantısı başında) yakın bir kist, kistler canal'ın uzunluğu boyunca veya kistler kanal ucunda sağlamak kusurların altta yatan mekanizma için ipuçları. (Burada lumenal içi sıvı dolu pulcuklarının apikal/lumenal bir membran ile çevrili olarak tanımlanan) kanal kistler veziküller ayırt (küçük sitoplazmik membran bağlı sıvı dolu pulcuklarının) veya boşluklar (büyütülmüş sitoplazmik membran bağlı sıvı dolgulu pulcuklarının), değil tüm bakmak yüzeysel olarak aynı (şekil 4A-D) olabilir bir lumenal membran tarafından çevrili. Sitoplazmik boşluklar aynı şekilde ikincil olarak, örneğin, çözümleri (sodyum azid) Montaj toksik etkileri ile ortaya çıkabilir. Hem, büyük kistler ve sitoplazmik çarpıtmalardan neredeyse hayvan boyutu kadar al ve daha fazla klasik "Temizle (Clr)" ayırt edilebilir gerek vücut boşluğunda sıvı birikimi nedeniyle oluşur fenotip kanal. Son olarak, kanal uzunluğu hemen hemen her zaman ikincil olarak Kistik Kanallar güvenilir değil, bu nedenle doğru kanal uzantısı kusur bir kist özgür ortamda göstermiş gerekir.
Onların küçük çaplarda rağmen boşaltım hücre altı bileşenleri kanallar, gibi Bazal membran, hücre içi karşı apikal endosomal karşı canalicular veziküller, hücre içi organellerin ve hücre iskeleti bileşenleri, görselleştirildiği tarafından daha yüksek Büyütme, örneğin, confocal mikroskobu (2 şekil, şekil 4). Confocal görüntüleme tarafından yalnız bir GFP olumlu kanal sitoplazma bir floresan satırı (şekil 2A, şekil 4E) üzerinden kanal sitoplazma Lümen ayırmak yeterlidir. İşaretleyicileri kimliğinin kesin ayırma immunoelectronmicroscopy39gerektirir rağmen endosomal veziküller (boyut olarak da çarpıcı farklı), canalicular çözme için katkıda bulunur. Çift ve Üç Kişilik etiketleme bir molekül ilgi ve birbirlerine (Şekil 2) hücre altı bileşenleri arasındaki bağıntı hücre altı lokalizasyonu belirleyebilirsiniz. Tek etiketli lumenal kanal membranlar ama çift ile ayırt edilebilir veya etiketleme üçlü aynı çift çizgi sitoplazma veya Bazal membran olarak üretmek. Confocal analiz için uygun montaj önemli, kanal yapısı, ozmotik değişikliklere duyarlı ve en sık görülen, Kistik fenotip güvenlik açığı kırılganlık verilir. Kistler kolayca ozmotik değişiklikleri veya fiziksel baskı ile patlama, membran toksinler gibi sodyum azid duyarlıdır ve ayrıca (Bu da sitoplazmik boşluklara neden olabilir) immobilizasyon için kullanılan bazı anestezikler duyarlıdır. Bizim ellerde %5 lidokain M9 arabelleğindeki en boşaltım kanalı deneyleri için en iyi. Görüntüleme yordamlar ve tüm işleme açıklandığı gibi nazik olmalıdır. Fenotipleri (örneğin, kistler ve çarpıtmalar) taklit eserler önlemek için hemen sonra montaj görüntüleri elde etmek en iyisidir. Bu mümkün değilse, kist görüntüleri, diğer fenotipleri Imaging önce Öncelikle, elde edilebilir. Bu iletişim kuralı olan, buna karşılık, fototoksisite azaltır ve mikroskopi dinamik değişiklikleri analiz için tercih olduğunu disk confocal mikroskobu iplik ile karşılaştırıldığında üstün confocality sağlar Standart tarama confocal mikroskobu anlatılmaktadır zaman içinde hücre altı bileşenleri. Hücre altı dynamics böyle sorular da photobleaching teknikleri kullanarak ya da füzyon protein renk40değiştirmek fotoğraf değiştirilebilir fluorophores ile etiketleme tarafından ele alınması. Son olarak, çözünürlük aralığı daha fazla transmisyon elektron mikroskobu (TEM, en yüksek yapısal ama değil moleküler çözünürlükte sağlayan), ekleyerek artırılabilir süper çözünürlük mikroskobu (nanometre aralıktaki moleküler çözünürlük sağlamak); ya da immunoelectronmicroscopy (her ikisi de sağlayan)39,41. 3D tomografi TEM seri bölümlerle birleştirilebilir ve boşaltım Kanallar9,10canalicular-plazma zarı arabiriminin analiz için özellikle kullanışlıdır. Mikroskopi bu farklı türleri ve bu farklı görüntüleme yaklaşımlardan kombinasyonları için geliştirilmiş teknikleri geliştirilmeye devam.
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
M. Buechner (University of Kansas, Kansas, ABD), K. Nehrke (Rochester Üniversitesi Tıp Merkezi, Rochester, New York, ABD) ve Caenorhabditis genetik Merkezi, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından Office araştırma altyapı finanse teşekkür ediyoruz Programlar (P40 OD010440). Bu eser NIH GM078653, MGH olduğunu 224570 ve SAA 223809 V.G. için hibe tarafından desteklenmiştir
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cloning | |||
Plasmid pPD95.75 | Addgene | Cat. No. 37464 | |
PCR Kit | Qiagen | Cat. No. 27106 | |
Ligation kit | New England Biolabs | Cat. No. E2611L | |
DNA marker | Thermo Scientific | Cat. No. SM1331 | |
Agarose DNA grade | Fisher Scientific | Cat. No. BP164-100 | |
Competent cells | New England Biolabs | Cat. No. C2987H | |
Tris | Fisher Scientific | Cat. No. BP154-1 | |
EDTA | Sigma | Cat. No. ED-1KG | |
Acetic acid | Fisher Scientific | Cat. No. A38S-500 | |
Ethidium bromide | Fisher Scientific | Cat. No. BP1302-10 | |
Equipments | |||
PCR machine | MJ Research | Cat. No. PTG-200 | |
Centrifuge | Eppendorf | Cat. No. 5415C | |
Water Bath | Precision Scientific | Cat. No. 666A3 | |
Gel running instrument | Fisher Scientific | Cat. No. 09-528-165 | |
Gel running power supply | Fisher Scientific | Cat. No. 45-000-465 | |
Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | Cat. No. 1708195EDU | |
Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | Cat. No. ND1000 | |
C. elegans related1 | 1see reference19 for standard C. elegans culture and maintenance procedures. | ||
LB Medium and plates2 | 2see reference19 for protocols. | ||
Tryptone | Acros Organics | Cat. no. 611845000 | |
Yeast Extract | BD Biosciences | Cat. no. 212750 | |
NaCl | Sigma | Cat. no. S7653 | |
Bacto Agar | BD Biosciences | Cat. no. 214040 | |
Ampicillin | Sigma | Cat. no. A0116 | |
Tetracycline | Fisher Scientific | Cat. no. BP912 | |
M9 Medium2 | 2see reference19 for protocols. | ||
NaCl | Sigma | Cat. no. S7653 | |
KH2PO4 | Sigma | Cat. no. P0662 | |
Na2HPO4 | Sigma | Cat. no. S7907 | |
MgSO4 | Sigma | Cat. no. M2773 | |
NGM plates 2 | 2see reference19 for protocols. | ||
NaCl | Sigma | Cat. no. S7653 | |
Peptone | BD Biosciences | Cat. no. 211677 | |
Tryptone | Acros Organics | Cat. no. 611845000 | |
Bacto Agar | BD Biosciences | Cat. no. 214040 | |
MgSO4 | Sigma | Cat. no. M2773 | |
CaCl2 | Sigma | Cat. no. C3881 | |
Cholesterol | Sigma | Cat. no. C8667 | |
K2HPO4 | Sigma | Cat. no. P3786 | |
KH2PO4 | Sigma | Cat. no. P0662 | |
RNAi plates3 | 3see reference21 for protocols. | ||
NaCl | Sigma | Cat. no. S7653 | |
Peptone | BD Biosciences | Cat. no. 211677 | |
Tryptone | Acros Organics | Cat. no. 611845000 | |
Bacto Agar | BD Biosciences | Cat. no. 214040 | |
MgSO4 | Sigma | Cat. no. M2773 | |
CaCl2 | Sigma | Cat. no. C3881 | |
Cholesterol | Sigma | Cat. no. C8667 | |
K2HPO4 | Sigma | Cat. no. P3786 | |
KH2PO4 | Sigma | Cat. no. P0662 | |
IPTG | US Biological | Cat. no. I8500 | |
Carbenicillin | Fisher Scientific | Cat. no. BP2648 | |
NaOH | Fisher Scientific | Cat. no. SS266-1 | |
Sodium hypochlorite | Fisher Scientific | Cat. no. 50371500 | |
Bacteria | |||
OP50 bacteria | CGC | ||
HT115 bacteria | CGC | ||
Genome-wide RNAi libraries | |||
Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref21,58,59) | Source BioScience | ||
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref60) | Source BioScience | ||
Imaging related | |||
Lidocaine | MP Biomedicals,LLG | Cat. no. 193917 | |
Materials | |||
Vacuum Grease Silicone | Beckman | Cat. no. 335148 | |
Microscope slides | Fisher Scientific | Cat. no. 4448 | |
Tissue culture plate, 6 well | Corning Inc. | Cat. no. 08-772-33 | |
Equipment | |||
SMZ-U dissecting microscope (Nikon) | |||
SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions). | |||
TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem) | |||
C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon) |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır