JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

القناة C. ايليجانس مطرح نموذج خلية واحدة فريدة من نوعها لتحليل البصرية في فيفو نشوء حيثياته استقطاب غشاء حيوي. ويصف هذا البروتوكول مزيجاً من القياسي الوراثية/[رني] والتصوير النهج، قابلة للتكيف لتحديد وتوصيف جزيئات توجيه أحادي الخلية توبولوجينيسيس، ونشوء حيوي الغشاء والتجويف قمي.

Abstract

هي القنوات مطرح C. ايليجانس أربعة أنابيب ضيقة تمتد من خلال طول الحيوان من خلية واحدة، بالتساوي تقريبا الآن الموسعة اندوتوبيس داخل الخلايا بناء واستقرار التجويف بالغشاء وسوبميمبرانيوس سيتوسكيليتون حرف قمي. يوسع الخلية مطرح طوله حوالي ألفي لتوليد هذه القنوات، مما يجعل هذا النموذج الفريد للتقييم في فيفو لنشوء حيثياته استقطاب غشاء حيوي، morphogenesis التجويف داخل الخلايا وأحادي الخلية توبولوجينيسيس. البروتوكول المعروضة هنا يوضح كيفية الجمع بين معيار العلامات، الربح والخسارة-من-وظيفة الوراثية أو الحمض النووي الريبي التدخل ([رني])-، والنهج المجهري لاستخدام هذا النموذج لتشريح بصريا ووظيفيا تحليل هذه العمليات على مستوى جزيئي. كمثال على نهج وضع العلامات، يحدد البروتوكول توليد الحيوانات المحورة وراثيا مع البروتينات الفلورية الانصهار لتحليل العيش من توبولوجينيسيس. كمثال على نهج الوراثية، يسلط الضوء على النقاط الرئيسية من الشاشة المرئية التفاعل القائم على [رني] تهدف إلى تعديل النمط الظاهري قناة الكيسي مكسب للدالة. أساليب محددة ووصف كيفية: التسمية ووضع تصور للقنوات بالتعبير عن البروتينات الفلورية؛ بناء مكتبة [رني] مستهدفة، ووضع استراتيجية [رني] فحص للتحليل الجزيئي للقناة morphogenesis؛ تقييم بصريا التعديلات لتعمل القناة؛ نقاط لهم بتشريح مجهرية الأسفار؛ وصف مكونات القناة سوبسيلولار دقة أعلى بالفحص المجهري [كنفوكل]؛ والتحديد الكمي للمعلمات البصرية. النهج مفيد للمحقق الذي يرغب في الاستفادة من القناة C. ايليجانس مطرح لتحديد ووصف الجينات المتورطين في عمليات فيلوجينيتيكالي مصانة في التجويف داخل الخلايا وأحادي الخلية أنبوب morphogenesis.

Introduction

جميع الأجهزة الداخلية تتكون من أنابيب، حاسمة بالنسبة للعديد من وظائفها المختلفة، مثل النقل وتبادل الغازات والسوائل والمواد المغذية وإفراز النفايات الأيضية. طابعها الاستقطاب، مع الأغشية قمي ولومينال متميزة، هو تكييف هذه المهام المحددة، والعيوب في نشوء حيوي نظمها إندو-وغشاء البلازما سبب كثرة الأمراض البشرية1،2. معظم الأنابيب المفرج والأجهزة الداخلية متعددة الخلايا وتشكل من تجويف إينتيرسيلولارلي؛ بيد أن يمكن، على سبيل المثال، تمثل أنابيب أحادي الخلية، التي تشكل التجويف إينتراسيلولارلي، بقدر ما 30 – 50% من البشرية الشعرية الأسرة2. أغشية الاستقطاب المتعدد الأطراف وأنابيب أحادي الخلية متشابهة في تكوينها، على الرغم من أن هذه ميكرودوماينس قد تختلف استناداً إلى أنبوب وظيفة معينة (مثلاً، كاناليكولي قناة مطرح مقابل زغيبات الأمعاء في كاينورهابديتيس ايليجانس؛ انظر المصاحبة للورقة على توبولوجينيسيس المعوية C. ايليجانس )3. يتم المحافظة عليها مبادئ نشوء الاستقطاب غشاء حيوي وتوبولوجينيسيس بين ميتازوانس، ويوجه إليه جزيئية مماثلة لهم1،،من24.

C. ايليجانس مطرح تتألف من خمس خلايا: خلية مطرح (الجماعة الأوروبية)، خلية لاصق (DC)، المسام خلية (PC) واثنين من خلايا الغدة. الاجتثاث من المفوضية الأوروبية، DC أو الكمبيوتر يسبب تراكم السائل في تجويف الجسم ويموت الحيوانات مرحلة يرقات مبكر5. الفضول، إنشاء هذه الأنابيب أحادي الخلية ثلاثة بهم لومن بثلاث طرق مختلفة: بخلية تفريغ (EC)؛ الخلية التفاف مقترنة بتشكيل تقاطع أوتوسيلولار (PC)؛ وقبل التفاف الخلية مقرونا أوتوفوسيون (DC)؛ آليات مختلفة من morphogenesis التجويف التي حفظت فيلوجينيتيكالي6،كل7. المفوضية الأوروبية، يقع في الجهة الجانبية اليسرى من لمبة البلعوم الخلفي، يرسل امتدادات جانبية اثنين من التي تتفرع القنوات الأربع تمتد إلى الأسفل والخلف (في كل من الجانب الأيمن والأيسر) غيض من الآنف دودة والذيل ، على التوالي (الشكل 1)5،،من68. المفوضية الأوروبية يمتد من حوالي 1 ميكرون إلى 2 x 1,000 ميكرومتر، مما يجعلها أكبر الخلية في الحيوان. على مستوى سوبسيلولار، القناة مطرح أنبوب بسيط، المتولدة من غشاء القاعدي توجه بسيودوكولوم، ونفق بغشاء لومينال (اندوتوبي). غشاء لومينال قناة تتصل بغشاء لاصق لومينال على مفترق طرق بين الخلايا فقط؛ وإلا القنوات جونكتيونلس على طول أطوال (الشكل 1). غشاء لومينال قناة مطرح وما سيتوسكيليتون سوبميمبرانيوس قمي، حددها التركيب الجزيئي يشبه تكوين غشاء قمي وسيتوسكيليتون سوبميمبرانيوس من أنابيب متعددة الخلايا، مثل الأمعاء، ومن ابيثيليا الأخرى (مثلاً، شقة). هيولى العضيات، بما في ذلك اندوسومال حويصلية وأخرى (مثلاً، غولجي) توزع اندوميمبرانيس على طول القناة. وبالإضافة إلى ذلك، تكون مترابطة متعددة الحويصلات كاناليكولار-أما متصلة بغشاء لومينال، و/أو مترابطة، أو معزولة-من خلال قناة السيتوبلازم7،،من89،10 . هذا الصدد البلازما-غشاء/كاناليكولار الحيوية كذلك توسع نظام غشاء القناة ويساهم كلا التجويف morphogenesis وأوسموريجوليشن10. وهكذا يتكون القناة مطرح كلياً تقريبا من إندو-والأغشية البلازمية، تقديم نموذج ممتاز لتحليل نشوء حيوي غشاء الاستقطاب وتنظيم إندو-إلى واجهة غشاء البلازما. توسعا هائلا من غشاء قمي خلال القناة morphogenesis-في هذا النظام خلية واحدة تزامنت مع ملحق التجويف – يسمح أيضا لتحليل المشاكل المعمارية الناشئة بالحاجة إلى تحقيق الاستقرار ومركز غشاء لومينال داخل الخلايا . ويركز هذا البروتوكول على تحليل morphogenesis الهيكلية القناة الأنبوب وفي التجويف وديناميات غشاء داخل الخلايا المطلوبة لهذه العملية بدلاً من الإشارات التي توجه حركة الخلية التي تولد موقف المفوضية الأوروبية في نظام مطرح وتشييد صلاتها المعقدة إلى العناصر الخلوية الأخرى (استعرض في6).

وثمة ميزة أخرى للنظام قناة وحيدة الخلية C. ايليجانس للتحليل الغشاء الاستقطاب ونشوء حيوي التجويف داخل الخلايا هو قدرته على فصل، عبر الزمن التنموية، جيل مكونات مختلفة في الأغشية والوصلات. المفوضية الأوروبية هو ولد في وقت الإغلاق البطني ويستقر فينترو أفقياً من البلعوم خلال منتصف embryogenesis5،،من68، تحدث خلالها تمديد الوقت القناة الجانبية والتفريع. هذا هو متبوعة تمديد قناة الأمامي الخلفي خلال أواخر embryogenesis، عملية التي ما زالت في مرحلة اليرقات L1 (الشكل 1). يرقة فقست حديثا، الحافة الخلفية قناة تصل إلى حوالي منتصف الدودة، تماما توسيع للذيل في نهاية المرحلة L1، بعد الوقت الذي القناة الغضروفي جنبا إلى جنب مع دودة8. قناة نشطة في النمو بسرعة تفوق نمو الحيوان وهكذا ينتهي في مرحلة اليرقات الأولى، إلا أن زيادة النمو يحدث بالتوازي مع نمو الحيوان كله خلال مراحل اليرقات إضافية (L2 – 4). يوفر هذا الإعداد الفرصة لتحليل الخطوات المختلفة لنشوء حيثياته استقطاب غشاء حيوي مستقلة عن انقسام الخلية الاستقطاب أو الهجرة. وعلاوة على ذلك، فهو يسمح الفصل بين هذه العملية من الجمعية للوصلات (التي تحدث في الجنين قبل الشروع في التجويف)؛ شرط الضبط في استقطاب الغشاء لا تزال مسألة مفتوحة في مجال الأقطاب. وأخيراً، فإنه فريد يفصل قمي من توسع الغشاء القاعدي، العملية الأخيرة السابقة السابقة في القنوات مطرح10. نموذج القناة مطرح C. ايليجانس هو ذلك تكملة مفيدة خاصة لنموذج المعوية التي أسهم عدد من هذه المزايا لتحليل نشوء الاستقطاب غشاء حيوي ولكن تنفيذ ذلك في بيئة متعددة الخلايا (انظر الورقة المرفقة على توبولوجينيسيس المعوية3).

على الرغم من أن القنوات البرية من نوع سامسونج الأنابيب في هذا دودة صغيرة، لومن بهم يمكن أن يكون السادسسواليزيد مباشرة من بصريات نومارسكي في هذا الحيوان شفافة. وفي الواقع، يمكن أن توصف مورفولوجيس قناة الكيسي المسخ في الحيوانات غير مسمى باستخدام التكبير المنخفض تشريح مجهرية، التي استخدمت لتأثير كبير في شاشات الجينية إلى الأمام لتحديد الجينات المشتركة في توبولوجينيسيس11. التصور تحسين مورفولوجية الترع والتمييز على الأغشية الاستقطاب ومكونات سيتوسكيليتال، العضيات داخل الخلايا المختلفة والهياكل الأخرى سوبسيلولار، ومع ذلك، يتطلب وضع العلامات وأعلى السلطة فلوري مجهر تشريح و [كنفوكل]. على الرغم من أن هيكل غرامة على القنوات يطرح عددا من الصعوبات لوضع العلامات والفحص المجهري، يمكن التمييز بين الأغشية ومكونات سوبسيلولار عن طريق جزيئات معينة فريدة من نوعها لكل حجرة، ويمكن تركيبة الحيوانات بأمان للفحص المجهري إذا وتتخذ احتياطات معينة لتجنب إدخال الفنية (انظر البروتوكول و المناقشة). وضع العلامات يمكن القيام به إيمونوهيستوتشيميستري في عينات ثابتة أو بتوليد الديدان المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات الفلورية الانصهار تحت سيطرة الخاصة بهم أو مطرح المروجين قناة خاصة للتصوير في فيفو . يصف هذا الأسلوب وصفها الأخير من هذا البروتوكول (انظر الورقة المرفقة على توبولوجينيسيس المعوية لجسم تلطيخ3).

مستوى القدرة على الجمع بين الدراسات في فيفو الخسارة أو الربح-من-وظيفة في فيفو التصوير التحليل في خلية واحدة فقط في جميع أنحاء يجعل التنمية القناة مطرح C. ايليجانس نموذج قوي بصفة خاصة الجزيئية و تحليل الخلوية توبولوجينيسيس أحادي الخلية. يمكن أن يؤديها إلى الأمام أو عكس شاشات الجينية بدءاً الحيوانات المحورة وراثيا البرية من نوع أو المسمى لتحديد قناة morphogenesis تعمل (على سبيل المثال، الخراجات) وبها عيوب الجينات الكامنة. بدلاً من ذلك، هذه الشاشات يمكن أن تبدأ النمط الظاهري المسخ (مثلاً، قناة الكيسي) وتحديد المكثفات أو محسنات من هذا النمط الظاهري لتحديد الجينات وظيفيا تتفاعل مع الجينات تسبب النمط الظاهري متحولة. العيب الوراثي مما تسبب في النمط الظاهري المسخ يمكن أن يستحث مكسب أو خسارة (مثلاً، عن طريق حذف الجينات) (مثلاً، عن طريق الطفرات تفعيل أو عن طريق الأخذ بنسخ الجينات الزائدة) وظيفة التحقيق. إلى الأمام الطفرات أو منهجي [رني] شاشات دون أفكار مسبقة حول وظيفة الجينات وتسمح بتحديد الجينات المتورطين في وظيفة الفائدة غير متحيزة. نظراً لتوفر تغذية المكتبات [رني] على نطاق الجينوم، تقريبا كل الجينات يمكن أن تكون بسهولة ترسيتها قبل [رني] في C. ايليجانس، مثل أن أي مورثة واحدة من الاهتمام أو أي مجموعة من الجينات (مثلاً، في الشاشات المستهدفة) يمكن أيضا أن تكون سرعة سبر لأثرها في نهج علم الوراثة عكسي. وللتدليل على مزيج ممكن من النهج، نحن هنا وصف شاشة تفاعل [رني] مستهدفة، بدءاً متحولة قناة مطرح الكيسي مكسب للدالة، المسمى بروتين فلوري هيولى قناة الأخضر (التجارة والنقل). النمط الظاهري المسخ تم إنشاؤها بواسطة overexpression من إدارة مخاطر المؤسسات-1، الغاية مصانة C. ايليجانس أورثولوج الأسرة رابط غشاء-أكتين Ezrin-راديكسين-موسين (ERM)، الذي كان متورطا في التجويف morphogenesis والغشاء المنظمة في العديد من الأنواع12. C. ايليجانس ERM-1 يموضع للأغشية لومينال أجهزة الداخلية، مثل قناة مطرح والأمعاء، وهو مطلوب لتشكيل التجويف في كلا13. إدارة مخاطر المؤسسات-1 overexpression المجندين أكتين الزائدة وحويصلات للغشاء لومينال القناة، زيادة الجريان في التجويف وتوليد قناة الكيسي قصيرة وغشاء لومينال مجعد مع الأكتين سميكة الفروة9. البروتوكول توضح كيفية توليد سلالات معدلة وراثيا مع مطرح أعرب عن قناة المسمى الانصهار البروتينات (أو غيرها من البروتينات)؛ كيفية أداء شاشات [رني] مستهدفة بدءاً من هذه الضغوط، لتحديد المعدلات النمط الظاهري القناة؛ وكيفية تحليل نتائج هذه الشاشات بصريا بالفحص المجهري تشريح و [كنفوكل] الأسفار، بما في ذلك طرق بسيطة لقياس تعمل توبولوجينيسيس غنية بالمعلومات. يمكن الاطلاع على البديل العلامات تقنيات والتفاصيل [رني], تعديل الجينات توبولوجينيسيس قاتلة في كثير من الأحيان، في الورقة المرفقة بشأن توبولوجينيسيس المعوية3. يمكن استخدام كافة الأساليب في توليفات مختلفة لتحقيق مسائل أخرى على قناة توبولوجينيسيس.

Protocol

1-تسمية القناة Excretory C. ايليجانس "الفلورسنت الانصهار البروتينات" 14

ملاحظة: انظر الورقة المرفقة على توبولوجينيسيس المعوية 3 لوضع العلامات التي في الموقع الضد تلطيخ إجراءات قابلة للتكيف للقناة مطرح. انظر الجدول 1 للاطلاع على أمثلة للجزيئات التي أثبتت أنها مفيدة لتصور C. ايليجانس قناة مطرح إندو-وأغشية البلازما، الجدول 2 للحصول على أمثلة من المروجين يقود التعبير إلى قناة الإخراج، و الجدول 3 للموارد لمجموعة أكثر شمولاً من علامات والمروجين، بما في ذلك المراجع مناقشة اختيار مختلف فلوروفوريس.

  1. بناء الأنسجة والبلازميدات علامة نيون محددة بإنزيم التقييد على أساس استنساخ 15
    ملاحظة: انظر المناقشة لتقنيات بديلة لتشييد البروتينات الفلورية الانصهار.
    1. تحديد التسلسل من المروج (للانشطار النسخي) أو الجين كامل اهتمامها وورمباسي 44 مع المروج لها (للانشطار متعدية).
      ملاحظة: للمروجين، حوالي 1 – 3 كيلوبس (kb) غير كافية لمعظم C. ايليجانس الجينات. كما يمكن تصميم البروتينات الانصهار متعدية بوضع مورثة الفائدة في ظل عاملاً مطرح قناة معينة (انظر الجدول 2).
    2. تصميم الإشعال إلى الأمام وعكس للتضخيم المروج (للانشطار النسخي) و/أو جين كامل مع المروج (للانشطار متعدية). إضافة إنزيم التقييد linkers 5 ’ و 3 ’ الغايات كبسولة تفجير.
      ملاحظة: اختر إنزيمات التقييد التي تكون موجودة في ناقلات بلازميد (مثلاً، pPD95.79) 16. للانشطار متعدية الجنسيات، 3 ’ رابط يجب أن يكون تصميم بحيث بعد الهضم إنزيم التقييد وربط مع الناقل، سيكون الإطار كودون إدراج المستمر مع codons فلوروفوري، مثلاً، التجارة والنقل. واحد قد تحتاج إلى إضافة 1 أو 2 من قواعد أكثر نموذجية التقييد الإنزيم linkers 14؛ الحرص على عدم خلق كودون وقف.
    3. بوليميريز إجراء سلسلة من ردود الفعل (PCR) لتضخيم المروج أو كامل طول الجينات باستخدام الديدان الحية أو البرية من نوع الحمض النووي أو كدنا كقالب 15-
      ملاحظة: عند استخدام الديدان كقالب، أولاً الديدان في تحلل المخزن المؤقت (PCR المخزن المؤقت بالإضافة إلى ك البروتيناز) 17. يمكن استخدام الديدان المرحلة المختلطة كقالب. يمكن استخدام الديدان المتعطشة لتفادي التلوث مع الحمض النووي البكتيري.
    4. (1 ٪) [اغروس] إجراء هلام التفريد على منتجات PCR لتحديد الحجم الصحيح للمنتج تضخيم.
      ملاحظة: إذا كان حجم الفرقة الصحيحة، تابع مع الخطوة التالية. إذا كان يتم إنشاء نطاقات متعددة، تحسين ظروف التضخيم لإنتاج موسيقى واحد. إذا لم ينجح هذا، قطع الفرقة الصحيحة من الجل وتنقية الحمض النووي بالأساليب القياسية 15 وثم المتابعة مع الخطوة التالية-
    5. إجراء تقييد موجز عن المنتج بكر وبلازميد المتجهات التي تحتوي على فلوروفوري (مثلاً، pPD95.79) في أنابيب منفصلة بالأساليب القياسية 15-
    6. فصل السلطات الوطنية المعينة هضمها بالتفريد جل والوت المنتج بكر وناقلات شرائط الحمض النووي في أنابيب منفصلة.
    7. نق السلطات الوطنية المعينة من جل الشرائح بالأساليب القياسية 15. قياس تركيز الحمض النووي بواسطة جهاز المطياف الضوئي.
    8. اضطر المنتج بكر وناقلات الحمض النووي بالطرق القياسية وتحويل الخلايا المختصة المعينة المؤتلف بالأساليب القياسية 15-
    9. انتشار 10 ميكروليتر، 50 ميكروليتر و 100 ميكروليتر من الخلايا المحولة على ثلاث لوحات مرق لوريا (رطل) الفردية وتستكمل مع 50 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين.
      ملاحظة: انتشار كميات مختلفة من الخلايا على لوحات مختلفة لمجموعة كفاءات التحول. على سبيل المثال، تصفيح كثيفة جداً قد لا يسمح عزل المستعمرات إذا كان التحول كفاءة.
    10. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. صباح اليوم التالي، تأخذ بها اللوحات من الحاضنة.
      ملاحظة: إذا كانت المستعمرات صغيرة جداً، احتضانها لعدة ساعات أكثر.
    11. بلازميد تحضير السلطات الوطنية المعينة من المستعمرات واحد من الأساليب القياسية 15. مزيج قالب الحمض النووي والإشعال وترسل للتسلسل (يقوم عادة في مركز خدمات أساسية)-
    12. قراءة التسلسل والتحقق من سلامة بناء الانصهار.
      ملاحظة: الحرجة: تأكيد الإطار كودون الصحيح بين المدرج الجينات والجينات علامة مضيئة لاندماج الترجمة. ومن الناحية المثالية، تسلسل الجين كله للتأكد من أن لا طفرة قدم خلال إجراءات الاسترداد وربط-
    13. توليد مزيد بلازميد الحمض النووي (باستخدام الخطوة 1.1.11) لحقن للخطوة 1.2.
  2. جيل حيوانات المحورة وراثيا ب microinjection للحمض النووي لتحويل الخط 18
    ملاحظة: انظر مناقشة لتقنيات بديلة لإدخال المتسلسلات. الإجراءات المحددة التي يمكن استخدامها لتوليد الحيوانات المحورة وراثيا التي تحمل بروتين انصهار الأسفار أو أي البروتين الأخرى ذات الاهتمام. على سبيل المثال، يمكن أن تكون البروتينات خارجية أدخلت حديثا (مثلاً، أورثولوج مغايرة) أو يمكن يعيد (مثلاً إلى المسخ germline المقابلة للإنقاذ) بروتين ذاتية أو أوفيريكسبريسيد لتوليد النمط الظاهري (مثل حقن إدارة مخاطر المؤسسات- 1 استخدمت لإنشاء النمط الظاهري القناة الكيسي overexpression بمثابة هدف لتعديل الشاشة التفاعل [رني] هو موضح أدناه).
    1. ميكس بنية الحمض النووي (1 – 50 نانوغرام/ميكروليتر) مع علامة بلازميد الحمض النووي (عادة 100 نانوغرام/ميكروليتر)، على سبيل المثال العلامة الغالبة رول-6 (su1006) (انظر 1.2.3 لخيارات العلامة)-
      ملاحظة: الحرجة: تركيز حقن الحمض النووي يجب أن تحدد تجريبيا لتجنب إدخال تعمل أرتيفاكتوال (الخراجات، وعيوب الإرشاد، والفتك) عند التعبير عن الجينات في القنوات مطرح التي خاصة حساسة للتعبير عن المتسلسلات. يمكن للمرء، على سبيل المثال، أن عدة مخاليط والبلازميدات بتركيزات من 1 نانوغرام/ميكروليتر، 10 نانوغرام/ميكروليتر، 50 نانوغرام/ميكروليتر، و 100 نانوغرام/ميكروليتر مع 100 نانوغرام/ميكروليتر rol-6(su1006) لاختبار مجموعة من تركيزات للجيل من سلالة صالحة مع التعبير المطلوب أو النمط الظاهري (تركيزات مرتفعة من المحتمل أن تكون سامة غير خصيصا لقناة morphogenesis وقد تكون مميتة).
    2. تصفية الخليط الحمض النووي من خلال مرشح أنبوب الطرد مركزي تدور-x حجم 0.22-ميكرومتر (ميكرومتر) مسام.
      ملاحظة: لا تترك غطاء الأنبوبة المفتوحة لتفادي الغبار التي يمكن أن تمنع الإبر microinjection.
    3. ميكروينجيكت والبلازميدات المؤتلف في الغدد التناسلية الديدان البرية من نوع أو متحولة بالأساليب القياسية لتحويل الخط (انظر المرجع 18 للحصول على تفاصيل الإجراء).
      ملاحظة: علامة قياسية والبلازميدات، على سبيل المثال: rol-6(su1006)، دبي-20، unc-119، فا-1. تدخل المتسلسلات المهيمنة مثل rol-6(su1006) في الديدان نوع البرية، بينما هي أدخلت المتسلسلات إنقاذ بهم طفرات كل منهما. والبلازميدات العلامة حقن المشترك لصيانة سهلة لخطوط المعدلة وراثيا منذ المتسلسلات اكستراتشروموسومال تضيع عشوائياً أثناء انقسام الخلية (انظر 1.2.8). عند حقن الجينات ترميز للانشطار فلوروفوري، أحد يمكن أيضا استخدام fluorophore، التجارة والنقل، نفسها كعلامة. 6 رول يستحث الديدان لفة حول نفسها التي غالباً ما تكون مفيدة لتقييم تعمل morphogenesis.
    4. نقل حقن الديدان على الإشريكيّة القولونية المصنف لوحات متوسطة النمو ديدان أسطوانية (NGM) (مثلاً، الديدان/لوحة 5) (انظر المرجع 19 لمعيار C. ايليجانس إجراءات الثقافة وصيانتها و جدول المواد)-
    5. احتضان اللوحات وترك ذرية وضع في 20 درجة مئوية لحوالي 3 د
    6. دراسة ذرية F1 تحت مجهر تشريح للديدان (المتداول) رول (أو أي أخرى حقن محددة ماركر، مثلاً، التجارة والنقل) واختيار t بكراتلوحات فردية س.
    7. حدد لوحات مع المتداول الحيوانات F2 وتأكيد وجود الأسفار تحت مجهر fluorescence تشريح (عادة ما تكون جميع الرول الحيوانات بروتينات فلورية خضراء إيجابية).
      ملاحظة: يشير كرات F2 الجيل الناجح من خط محوره وراثيا. خطوط فردية قد تكون مختلفة، مثلاً، فيما يتعلق بمعدل انتقال التحوير. فمن المفيد لصيانة وتخزين عدة أسطر.
    8. الحفاظ على خطوط المحورة وراثيا بإثراء اللوحات الجديدة للحيوانات علامة إيجابية.
      ملاحظة: حقن الحمض النووي هو إدماج الفعل كمصفوفة اكستراتشروموسومال. معدلات انتقال للمصفوفات اكستراتشروموسومال متغير لكن عموما حوالي ~ 50%. لا تفقد السلالة، ولذلك من الأهمية بمكان لإثراء الأسطر يدوياً مع علامات المهيمنة (مثلاً، خطوط غير مضمونة بالانتقاء السلبي).
    9. تجميد خطوط معدلة وراثيا باستخدام تقنيات التجميد القياسية للتخزين على المدى الطويل في-80 درجة مئوية 19-
      ملاحظة: المتسلسلات على صفائف اكستراتشروموسومال يمكن أيضا إدماج الفعل باشعاع الأشعة فوق البنفسجية في خطوة إضافية تسفر عن خطوط متجانسة 18. على سبيل المثال، كان دمج إدارة مخاطر المؤسسات-1 الفعل باشعاع الأشعة فوق البنفسجية للحصول على سلالة ERM-1 [++] fgIs2[erm-1p::erm-1;rol-6p::rol-6(su1006) [ حيث يحمل كل الحيوانات التحوير، شرطا لاستخدامها في القائم [رني] شاشة التفاعل الموصوفة أدناه. هذه السلالة كان بالإضافة إلى ذلك المسمى بقناة مطرح هيولى التجارة والنقل عبر معبر في سلالة تحتوي على ف فى-1:: التحوير التجارة والنقل (ولدت بنفس الإجراءات المبينة أعلاه؛ انظر مرجع 20 الجينية الأساسية إجراءات مثل الصلبان) ويشار إلى إدارة مخاطر المؤسسات-1 [++]؛ ف vha-1:: إجهاد بروتينات فلورية خضراء أدناه.

2. بناء استهدفت مكتبة [رني] وتصميم على شاشة التفاعل [رني] لتعديل "النمط الظاهري قناة"

ملاحظة: شاشة تفاعل وراثية مستهدفة على أساس [رني] هو وصف يستخدم أوفيريكسبريسيون قناة الكيسي النمط الظاهري ل البحث عن المورثات morphogenesis قناة مطرح المتفاعلة. إدارة مخاطر المؤسسات-1 [++] السلالة (راجع الخطوة 1.2.9) بمثابة مثال 9. هذا النهج ويعرض فقط واحدة من العديد من النهج الممكنة للتحليل الوراثي للقناة مطرح التجويف morphogenesis (انظر عرض و مناقشة للنهج الوراثية الأخرى). انظر الورقة المرفقة على توبولوجينيسيس المعوية 3 ومراجع 17 ، 21 ، 22 لخلفية على [رني]، تفاصيل [رني] الإجراءات، وتعديل قوام [رني] (يعدل للجينات القاتلة غالباً ما توبولوجينيسيس) ومناقشة المشاكل التقنية متصلة [رني]. راجع مرجع 19 للثقافة دودة القياسية والصيانة و جدول المواد-

  • البحث عن إدارة مخاطر المؤسسات-1 (أو الجينات الأخرى ذات الأهمية) الجزيئات المتفاعلة في قواعد البيانات والمقالات المنشورة
      .
      ملاحظة: إمكانية إدارة مخاطر المؤسسات-1 التمثيلات ستشمل جميع الجزيئات التي عرضت تجريبيا وظيفيا أو وراثيا، أو جسديا التفاعل مع البروتينات إدارة مخاطر المؤسسات في أي الأنواع و/أو تم التنبؤ للقيام بذلك بأي في السيليكون، إنتاجية عالية أو بيولوجيا الأنظمة النهج (انظر الجدول 3 أمثلة لقواعد البيانات والموارد)-
    1. بإنشاء قائمة لجميع الجينات وتجد homologs C. ايليجانس حيثما يقتضي الأمر-
      ملاحظة: النظر في توسيع نطاق قائمة الجينات التي تم تحديدها لفئات الجينات، الذي يأخذ في الاعتبار وظيفة الجينات للفائدة وتتسع الشبكة لتحديد التمثيلات (مثلاً، بالنسبة لرابط غشاء-أكتين ERM-1، حدد جميع أكتينس و الجزيئات المتصلة أكتين)-
    2. تحديد المقابلة [رني] تغذية الحيوانات المستنسخة في المتاحة تجارياً على نطاق الجينوم البكتيري مكتبات [رني] لجميع الجينات البكتيرية (مثلاً، أهرينجير الجينوم C. ايليجانس [رني] تغذية مكتبة 21؛ جدول المواد)
    3. بإنشاء جدول بيانات لجميع الجينات والمقابلة [رني] لوحة وعدد جيدا.
    4. بيك ومتتالية ~ 50 [رني] استنساخ على ألواح رطل/الأمبيسلّين/التتراسيكلين (اختيار المضادات الحيوية يتحدد بناء المكتبة) يوميا ويستمر استهداف يتم إنشاء مكتبة [رني].
      ملاحظة: اعتماداً على حجم المكتبة وسير العمل المتوقعة، تجاهل إنشاء مكتبة كاملة والانتقال مباشرة إلى تحليل دفعي. ويمكن تخزين لوحات عند 4 درجة مئوية، لمدة لا تزيد على أسبوعين تقريبا (إذا لزم الأمر، إعادة متتالية على لوحات جديدة بعد ذلك). على العكس من ذلك، واحد يمكن أن تولد أكبر المكتبات المجمدة في تنسيقات 96-بئر أو آبار 384 نسخ متماثل للتخزين على المدى الطويل في-80 درجة مئوية.
    5. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. صباح اليوم التالي، إزالة لوحات من الحاضنة ومخزن في 4 ° C.
    6. البكتيريا [رني] انتقاء من صفيحة من مسواك عقيمة، مزج البكتيريا مع ميكروليتر 600 رطل/الأمبيسلّين مرق (50 نانوغرام/ميكروليتر) في microtube 1.5 مل، واحتضان هذه الأنابيب عند 37 درجة مئوية، ويهز ل 6 h.
      ملاحظة: تلقيح البكتيريا [رني] في المرق بفرك بيك (نصيحة مسواك أو ميكروبيبيتي) على طول الجانب microtube-
      7. ميكروليتر
    7. 70 البذور المستزرعة البكتيريا في كل بئر من لوحات [رني] 6-جيدا في مجموعات مكررة أو ثلاث. احتضان اللوحات [رني] عند 22 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: لوحات [رني] الناتجة عن إجراءات موحدة (الجدول للمواد والمراجع 3 ، ، من 17 21) وتستخدم هنا في نسيج 6-جيدا تنسيق لوحة الثقافة لاتباع نهج إنتاجية العليا التي ما زالت تسمح لتقييم مجهرية morphogenesis القناة في الحيوانات الحية على اللوحات-
    8. التالي صباح اليوم، اختيار 3 L4 مرحلة إدارة مخاطر المؤسسات-1 [++]؛ ف vha-1:: بروتينات فلورية خضراء الديدان على كل بئر من الألواح [رني].
      1. لتجنب التلوث بالبكتيريا OP50 (انظر المرجع 19) التي تتداخل مع [رني] أولاً البذور الديدان على صفيحة NGM دون البكتيريا واسمحوا الحيوانات الزحف لحوالي 10 دقيقة. فقط استخدام الحيوانات صحية غير المتعطشة.
    9. احتضان لوحات عند 22 درجة مئوية ل 3 (د) السماح للحيوانات لإنتاج ذرية.
    10. دراسة القناة تعمل في ذرية F1 تحت المجهر fluorescence تشريح.

    3. في فيفو التصوير قناة Excretory C. ايليجانس Fluorescence تشريح مجهرية و "سجل تعمل توبولوجينيسيس"

    1. تحضير ورقة التهديف النمط الظاهري (على سبيل المثال الموضح في الجدول 4 و الرقم 5 ).
    2. وضع لوحة أجار مع الديدان مباشرة تحت ديسيكتين الأسفاراستخدام مجهر ز، فتح غطاء لوحة للتقييم، انخفاض نسبة التكبير للتركيز.
      ملاحظة: هذا البروتوكول وصف استخدام نطاق مع 1.5 X و 10 × أهداف ونطاق تكبير من 3.5 إلى 45 (جدول المواد)-
    3. تقييم الحيوانات التي تركز على كل منهما أيضا على حدة، بدءاً من 1 جيدا، والعمل باستمرار اللوحة-
      ملاحظة: تبدأ دائماً مع تقييم الضوابط. على سبيل المثال، وهمية (متجه فارغة) السلبية تحكم ([رني] HT115 البكتيريا (انظر مراجع 17 ، 21) مع إدراج جينات لا علاقة لها أو بدون) والاقتضاء إيجابية تسيطر على، مثلاً، في هذه الشاشة التفاعل، إدارة مخاطر المؤسسات-1 [رني] (يمنع النمط الظاهري إدارة مخاطر المؤسسات-1 [++]) و sma-1/سبيكترين [رني] (يعزز النمط الظاهري القناة ERM-1 [++])-
      4. أولاً، دراسة
    4. العامة تعمل مرئية تحت الضوء الساطع (على سبيل المثال: السماح/قاتلة، Clr/واضحة، والتطريز/الجنينية الفتاكة، الظريف/العقيمة، Unc/غير منسقة، ودبي/دين وقصير، إلخ)، كمياً النمط الظاهري بحساب إجمالي عدد الحيوانات وعدد للحيوانات، ومع النمط الظاهري تسجيل الأرقام (انظر الجدول 4).
      ملاحظة: كنوكدوونس جينات تسبب العيوب التي قد تؤثر على تقييم تعمل قناة (مثلاً، التطريز، الظريف)، النظر في تكرار التجربة مع الشرطي، وظيفة الجنينية [رني] (انظر المصاحبة للورقة لإجراءات 3 ).
    5. الثانية، بحث تعمل قناة مطرح تحت ضوء الفلورسنت ونقاط تعمل القابلة للقياس الكمي (مثلاً، طول القناة، عرض التجويف، الخراجات) وتسجيل الأرقام وتصف تعمل على ورقة التهديف (انظر الجدول 4، < فئة قوية = "إكسفيج" > الرقم 5)-
      ملاحظة: مطلوب أعلى التكبير بتكبير نطاق تقييم أكثر دهاء قناة تعمل. الانتقال ذهابا وإيابا بين التكبير المنخفضة والعالية بعناية تقييم القناة ’ s الطول والعرض وأي النمط الظاهري morphogenesis القناة. للتحديد الكمي أو شبه الكمي لتعمل بسيطة، عد الحيوانات 100 (مثلاً، L4s في هذه الشاشة [رني] المستهدفة؛ وتعمل: قناة طولها 1/4، 1/2، 3/4 وكامل تمديد القنوات الخلفية وقطر التجويف القنوات الخلفية، صغيرة الخراجات (< 1/3 عرض الحيوان)، الخراجات الكبيرة (> 1/3 عرض الحيوانات)؛ انظر الجدول 4).
    6. الحصول على الصور من تعمل الغالبة من الحيوانات المختلفة على الأقل 3 مجهر شنت الكاميرا الرقمية جهاز اقتران (CCD) وبرامج التصوير المقابلة (انظر الجدول للمواد)
      1. للحصول على الصور، أولاً قم بتشغيل الكاميرا وقم بتشغيل الكمبيوتر المرفق، انقر نقراً مزدوجاً فوق رمز برنامج التقاط الصورة، تركز منطقة لوحة دودة يدوياً تحت تكبير منخفضة وفتح مصراع الكاميرا.
      2. انقر فوق “ المعاينة المباشرة ” أيقونة لبرنامج التقاط الصور على شاشة الكمبيوتر لتصور الديدان على شاشة الكمبيوتر، ضبط التركيز يدوياً وضوح تصور الديدان على الشاشة، ثم انقر فوق “ المفاجئة ” رمز، ثم انقر “ حفظ ” رمز-
        ملاحظة: سيتم نقل الحيوانات أسرع تحت ضوء الفلورسنت، ولذلك تبقى يدا واحدة على فأرة الكمبيوتر جاهزة حين نقل اللوحة إلى مجال الاهتمام باليد الأخرى. ثم انقر على الفور “ المفاجئة ” رمز للحصول على الصورة. من الممكن عادة للحصول على صورة جيدة مع عدة محاولات.
      3. حفظ الصور المكتسبة مع اسم ملف الصحيح (تتضمن اسم السلالة والاسم استنساخ [رني] وتاريخ)-
        ملاحظة: الديدان البرية من نوع تتحرك أسرع مع قنوات رقيقة وطويلة أكثر صعوبة الصورة من طفرات. طفرات مع القنوات الكيسي و/أو أخرى تعمل من المحتمل أن تتحرك ببطء، مما يسهل التصوير. والبلازميدات علامة كرول يمكن أن تكون مفيدة لتصوير عن طريق الحفاظ على الحيوانات “ على الفور ” بدلاً من أن تتحرك إلى الأمام، وقد تقدم أيضا طريقة عرض محسنة على النمط الظاهري الحيوان المتداول حول نفسها-

    4. التصوير لقناة اكسكريتوري C. ايليجانس بدقة عالية بالليزر الفحص المجهري [كنفوكل]

    1. تصاعد الحيوانات الحية
      1. ضع كمية صغيرة من الشحوم أو هلام البترول في غيض من مسحه القطن، أو على الطرف مؤشر الإصبع، وانتشار الشحوم توليد دائرة سامسونج التي يبلغ قطرها ~ 6 – 8 ملم في منتصف شريحة زجاجية نظيفة.
      2. 6 مكان ميكروليتر 5% ليدوكائين الحل (مخدر) في الدائرة من ميكروبيبيتي.
        ملاحظة: يمكن إجراء حل أسهم ليدوكائين بتذويب مسحوق ليدوكائين في المياه. تخفف إلى 5% مع M9 المخزن المؤقت 19 (جدول المواد). من الأهمية بمكان لتحليل القناة مطرح لتجنب الحلول التثبيت الشائعة (مثل أزيد الصوديوم) التي تسبب الخراجات تمزق والحث على أن تعمل قناة.
      3. اختيار العديد من الحيوانات من صفيحة [رني]، ووضعها في الحل ليدوكائين إيميرجينج بيك دودة 19 إلى الحل.
        ملاحظة: يفضل أن يكون انتقاء الحيوانات الخاصة بالمرحلة التي ستسهل متصاعدة حتى بسماكة موحدة. يمكن أن يكون مقدما تحديد الحيوانات في المجهر fluorescence تشريح.
        4. ضع ساترة 22 مم × 22 مم على شريحة الزجاج
      4. ؛ والسماح لها بلطف تسوية على دائرة الشحوم.
        ملاحظة: لا تطبق أي ضغوط جسدية على ساترة التي قد تضر مورفولوجيا القناة، لا سيما في طفرات أو الديدان [رني] تعامل مع القناة، وربما غيرها تعمل. من المهم لذلك لتجنب دائرة سميكة من الشحوم؛ من الناحية المثالية هي تقع الحيوانات بلطف بين الشرائح الزجاجية وكشف الغطاء-
      5. كتابة اسم العينة على الجانب متجمد من الشريحة الزجاجية. تتخذ على الفور الشريحة بالمجهر [كنفوكل] للتحليل من النمط الظاهري القناة والحصول على صور-
        ملاحظة: قد ينتج عنه تلف الخراجات قناة التأخير أو تغيير في قناة التجويف مورفولوجيا.
    2. الصور [كنفوكل] اكتساب
      1. مكان الشريحة على المسرح عينة من المجهر [كنفوكل]، وتركز الديدان في تضخم منخفضة (10 X)-
      2. عرض وحدد الحيوانات تحت 60 س و/أو أهداف X 100، دراسة القناة مطرح ’ الخلوية s وتعمل سوبسيلولار، مثلاً، شكل التجويف والقطر، وحجم وشكل الخراجات؛ أو مكونات سوبسيلولار المسمى للتحليل، مثل، اندوسومال مقابل الحويصلات كاناليكولار، السيتوبلازم، العضيات الأخرى (انظر المناقشة و الشكل 2 و الشكل 4)، غشاء قمي/لومينال، الغشاء القاعدي.
        3. الحصول على الصور من النمط الظاهري محددة تهم
      3. .
        ملاحظة: يصف هذا البروتوكول استعمال ليزر المسح مجهر [كنفوكل] (جدول المواد). لحل سوبسيلولار المكونات في رقيقة C. ايليجانس مطرح القنوات، أعلى تكبير الأهداف (60 X 100 X) مطلوبة. مجهر [كنفوكل] الغزل-القرص يمكن استخدامها للحصول على صور انقضاء الوقت ولكن يوفر أقل كونفوكاليتي (انظر المناقشة).
        1. للحصول على صور [كنفوكل]، قم بتشغيل جهاز الكمبيوتر وانقر نقراً مزدوجاً فوق البرامج مجهر [كنفوكل] وحدد الليزر بالنقر فوق رمز ليزر محددة.
        2. انقر فوق “ مسح ” رمز لتصور الدودة مركزة على شاشة الكمبيوتر، ضبط كثافة الليزر من خلال البرمجيات، وانقر مرة أخرى على “ مسح ” رمز لإيقاف المسح الضوئي، ثم انقر فوق “ التقاط ” رمز لالتقاط صورة، ثم انقر فوق “ حفظ ” رمز-
        3. حفظ الصور مع اسم الملف الصحيح وتشمل الاسم استنساخ [رني] واسم السلالة والتاريخ.
          ملاحظة: يمكن اكتساب الصور كواحد ومقاطع متعددة (مثلاً، 10 – 15 المقاطع على طول محور ع). ويسمح التصور 3D تمزيقها. الحصول على صور الإسقاط وحفظها بشكل منفصل إذا لزم الأمر (اعتماداً على المجهر). للقرار الأمثل باستخدام إعدادات الليزر مع الكسب المنخفض ولا فتح الثقب كثيرا، وإضافة عدة في المتوسط كل صورة (انظر مراجع 23 ، 24 للمناقشة العامة التصوير [كنفوكل]). الحرص على الحصول على الصور في سطوع أدنى مستوى التشبع للسماح للتعديل ببرامج التصوير إذا لزم الأمر (يفضل استخدام غير معدلة الصور)-
        4. الحصول على الصور من مزدوج أو ضرب القنوات المسماة (مثلاً، والأحمر والأخضر والأزرق) بنفس الطريقة، بواسطة النقر فوق رموز الليزر متعددة، ولكن استخدام المسح الضوئي متسلسلة لتجنب التسييل خلال بين القنوات (الحرجة لدراسات الترجمة المشارك).
          ملاحظة: قد تحتاج أحد تأخذ في الاعتبار الوقت اللازم لمسح متسلسل (الذي أيضا زيادة النتائج في المقابلة في صور تبيض) وتعديل إعدادات الماسح الضوئي. عدم فحص الحيوانات من شريحة واحدة لأكثر من 30 دقيقة كحد أقصى لتفادي الآثار غير محدد في مورفولوجيا القناة. جبل شريحة جديدة إذا كان المسح الضوئي وقتاً أطول مطلوب.
        5. اكتساب المقابلة التدخل التفاضلية البصريات (DIC)/الصور نومارسكي، ولا سيما إذا كان التحديد الكمي لقناة قطر طول والتجويف فيما يتعلق بالدودة ’ طول الجسم s والقطر. تراكب الأسفار والصور نومارسكي عن طريق النقر على “ تراكب ” الرمز لإظهار معالم ( الشكل 1 و الشكل 4A – د)-
      4. للقياس الكمي، قياس كثافة fluorescence المكون المسمى لمصلحة ImageJ البرنامج 25 ( الشكل 5).

    • النتائج

    هذا البروتوكول يصف كيفية استخدام القنوات مطرح C. ايليجانس بصريا وجزيئيا تحليل أحادي الخلية توبولوجينيسيس و morphogenesis التجويف داخل الخلايا في خلية واحدة. أثناء تمديد الفترة من منتصف امبريوجينيسيس إلى مرحلة البلوغ، أربع قنوات مطرح الاستمرار في توسيع باسولاتيرال والأغشية قمي/لومينال جنبا إلى جنب مع نظامها اندوميمبراني كاناليكولار واندوسومال، تقدم نموذجا فريداً التحليل في فيفو حيثياته استقطاب الغشاء نشوء حيوي (الشكل 1). يمكن تصور مكونات سوبسيلولار مثل الأغشية قمي، والسيتوبلازم، واندوسومال مقابل الحويصلات كاناليكولار بالإعراب عن البروتينات الانصهار الفلورسنت محددة (الوارد وصفها في المادة 1 من البروتوكول)، والتي يمكن تمييزها عن بعضها البعض من خلال ضعفين أو ثلاثة إضعاف وضع العلامات في الحيوانات المحورة وراثيا واحد (الشكل 2). يتم استخدام النمط الظاهري قناة مطرح فريدة من نوعها (الشكل 3 ألف– ب) إنشاؤها بواسطة overexpressing جزيء غشاء قمي المرتبطة (إدارة مخاطر المؤسسات-1)، لشرح كيفية أداء شاشة [رني] هادفة تحديد الجينات تعمل في غشاء قمي و نشوء حيوي التجويف؛ وهذا يخدم كمثال للتحليل الجزيئي والبصرية لنشوء الاستقطاب غشاء حيوي في هذا النموذج (المذكورة في القسم 2 من البروتوكول). يتم استخدام هذا النمط الظاهري القناة ERM-1 [++] لإظهار كيفية تقييم بصريا وقمع نقاط (الشكل 3-د) وتعزيز (الرقم 3E-F) بتشريح مجهرية الفلورية (الوارد وصفها في المادة 3 من البروتوكول) . تعمل قناة الناجمة عن تعديل مستويات إدارة مخاطر المؤسسات-1 تعمل على إظهار كيفية حل العيوب على المستوى المجهري [كنفوكل] (الشكل 4) سوبسيلولار (الوارد وصفها في المادة 4 من البروتوكول)، وكيفية قياس تعمل قناة بسيطة (طول القناة وكيسه الحجم) وغشاء قمي نشوء حيوي العيوب (الشكل 5).

    figure-results-1943
    الشكل 1 : Morphogenesis C. ايليجانس Excretory القناة و "هياكل القنوات سوبسيلولار"
    (أ) التمثيل التخطيطي لتمديد القناة مطرح (خطوط زرقاء) أثناء تطور الجنين واليرقه. الخلية مطرح يصل إلى موقعة النهائي في الجانب الأيسر من فينترو الجانبية لمبة البلعوم الخلفي في المرحلة الفاصلة للجنين (غير معروضة). كما الغضروفي الجنين، فهي أولاً تمتد اثنين من الأسلحة أفقياً نحو الجانبين الأيمن والأيسر؛ ثم إلى كل ذراع إلى غصن الأمامي والخلفي. تقديم المزيد من هذه الفروع الأمامي والخلفي في جميع أنحاء استطالة الحيوان خلال أربع مراحل اليرقات، أولاً اللحاق بنمو الحيوان في مرحلة L2، ثم المصاحبة لها تحقيق المزيد من النمو، حتى سن البلوغ. دي نوفو استقطاب الغشاء نشوء حيوي يدعم هذا التمديد حتى مرحلة البلوغ. (ب) في الحيوان الكبار، وفروع الأمامي قناة تصل إلى طرف الآنف وفروع الخلفي، الذيل (خطوط زرقاء). ويرد الجسم خلية مطرح قرب لمبة البلعوم الخلفي (أزرق). تتم المحافظة على مجالات استقطاب الغشاء أثناء مرحلة البلوغ. (ج) توسيع وجهات النظر لمقطع ذراع القناة. اليسار: عرض ثلاثي الأبعاد لتظهر القناة: الغشاء القاعدي (أسود)، السيتوبلازم (الأزرق)، الغشاء لومينال (الأخضر) والتجويف (أبيض). حق: داخل عرض القناة وفي الأغشية: الغشاء القاعدي (أسود)، السيتوبلازم (الأزرق)، اندوسوميس (الأشكال البيضاوية الصفراء)، الحويصلات كاناليكولار (المجالات البيضاء، حويصلات واحد متصل إلى كل أخرى متصلة التجويف أو معزولة)، وغشاء قمي (أخضر) والتجويف (أبيض). (د) كونفوكال/DIC تراكب ميكروجرافس مطرح الخلية في جنين والقنوات مطرح في يرقة، المسمى لومينال مقابل هيولى بروتينات فلورية خضراء، على التوالي. الصورة اليسرى: خلية مطرح (السهم الأخضر) في جنينا 1.5-fold، مع قناة التجويف تصور بالإعراب عن 1::GFP ERM قمي تحت المروج 1 إدارة مخاطر المؤسسات . الصورة الصحيحة: أربعة مطرح قناة الفروع (السهم الأخضر) في اليرقات L3، تصور من هيولى ف vha-1:: التجارة والنقل. تغيير حجم أشرطة = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    figure-results-4117
    الشكل 2 : تصور مكونات سوبسيلولار في الأسلحة البرية من نوع القناة مطرح بوسم مزدوجة مع البروتينات الفلورية الانصهار
    (أ) التمييز بين السيتوبلازم غشاء قمي. التعبير للتجارة والنقل بموجب المروج 5 سولب يتصور السيتوبلازم القناة (الأخضر، أعلى)؛ التعبير عن إدارة مخاطر المؤسسات-1::mCherry تحت الخاصة به المروج يتصور غشاء قمي (الأحمر، الأوسط)؛ دمج هذه الصور (أسفل) يميز بين السيتوبلازم والغشاء قمي الذي لولا ذلك لا يمكن تمييزها بوصفها واحدة حتى في التكبير عالية. شريط المقياس = 5μm. (ب) تحديد العلاقة المكانية من الحويصلات اندوسومال التجويف. التصور التجويف قمي المرتبطة بغشاء بروتينات فلورية خضراء انصهار بروتين (الزائفة الملونة إلى اللون الأحمر، الأعلى)؛ تصور حويصلات اندوسومال بالإعراب عن mCherry::RAB-7 (الزائفة ملونة بالأزرق، والأوسط)؛ ويبين المواضع النسبية المكانية للحويصلات اندوسومال إلى التجويف دمج هذه الصور (أسفل). شريط المقياس = 5μm. (ج ود) حل الأشكال أنبوب القناة مقابل مكونات قناة سوبسيلولار في تكبير مختلفة. يسمى السيتوبلازم يرقات L1 بالإعراب عن التجارة والنقل تحت المروج سولب-5 وحويصلات كاناليكولار هيولى بالإعراب عن قناة المياه أقب-8::mCherry تحت المروج أقب-8 . (ج) حل نمط "الخرز في سلسلة" المقابلة الخاصة بمرحلة فاريكوسيتيس (فاريكوسيتيس هي خزانات المياه الوفيرة في الحويصلات كاناليكولار وغيرها من العناصر اللازمة لنمو القناة) الصور المكتسبة في التكبير أقل، ولكن لا حل هيولى عقب-8 بونكتا. (د) حل الصور التي حصلت على أعلى التكبير عقب-8 بونكتا في السيتوبلازم القناة، المقابلة للحويصلات كاناليكولار. أشرطة الحجم: 20 ميكرومتر في ج و 5 ميكرومترات في دال. إظهار جميع اللوحات الإسقاطات [كنفوكل] من أقسام كل 10 – 15. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    figure-results-6085
    الشكل 3 : سجل معززات والقامعs النمط الظاهري القناة الكيسي (ERM-1[++]) بتشريح مجهرية
    (أ) إدارة مخاطر المؤسسات-1 [++]؛ هي تصور القنوات مطرح rol-6(su1006) بالإعراب عن التجارة والنقل تحت مروج vha-1 . توسيع القنوات الخلفية حتى الفرج أو منتصف جسم الحيوان (الأسهم؛ تعتبر ملحق 1/2) في التكبير أقل (1.5 × الهدف وتكبير منخفضة). (ب) في أعلى التكبير، إدارة مخاطر المؤسسات-1 [++] التوقيع مجعد القناة الصغيرة الكيسي يمكن أن تحل، مع تلميح القنوات الخلفية (ذراع واحدة أشارت إلى جانب سهم صغير) تمديد يصل إلى الفرج أو يتجاوز قليلاً (قناة الفرج المبين بالسهم كبيرة؛ يمكن اعتبار التجويف في لوحة د كنوع البرية للمقارنة). (ج) قمع، تضخم منخفض: قنوات ممدود ورقيقة في [رني] معاملة الحيوانات ERM-1 [++]. (د) في أعلى التكبير، القنوات الخلفية يمكن أن تمتد تقريبا تماما بذيل (أسهم صغيرة مقارنة بالحيوانات الأصل، ويظهر في لوحة ب)؛ ويشير السهم كبيرة موضع الفرج. (ﻫ) تعزيز: زيادة تقصير القنوات مع الخراجات الكبيرة في [رني] معاملة الحيوانات ERM-1 [++]؛ التكبير المنخفض، لا التكبير. (و) في أعلى التكبير، تمديد القناة الخلفية يمكن تحديدها كأقل من 1/2 (السهم الصغير) أو لم تمدد حتى الفرج (مشار إليها بالسهم الكبير) وحجم كيسه تتجاوز 1/3 عرض الحيوان (أوسع من أن الحيوان الأصل سيظهر في الفقرة ب). تغيير حجم أشرطة = 400 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    figure-results-7734
    الشكل 4 : تحليل البصرية مورفولوجيا قناة مطرح ومكونات قناة سوبسيلولار في الحيوانات المسخ/[رني] من [كنفوكل] مجهرية
    (أ-د) التمييز بين رغوي النمط الظاهري قناة الكيسي (تراكب [كنفوكل]/DIC ترد ميكروجرافس). (أ) هو تصور السيتوبلازم من قناة البرية من نوع بالإعراب عن التجارة والنقل تحت المروج سولب-5 (الزائفة الملونة إلى اللون الأزرق في تمييز من غشاء قمي وسم، الأخضر هو موضح في لوحة ب). (ب) هو تصور غشاء قمي قناة البرية من نوع بالإعراب عن إدارة مخاطر المؤسسات-1::GFP؛ ملاحظة أن التجويف غير مرئية في هذا التكبير، وأن تسمية واحدة لا يميز هيولى من الغشاء وسم. (ج) قناة مطرح النمط الظاهري الناجم عن [رني]: وسم هيولى لا يميز vacuoles هيولى من الخراجات إينترالومينال. (د) النمط الظاهري القناة مطرح الناجم عن [رني]: وسم 1::GFP ERM قمي بالكشف عن تراكم السوائل داخل التجويف، تحديد الخراجات (لومينال) بدلاً من (هيولى) فاكوليس (قارن 4I الشكل ل vacuoles هيولى). شريط المقياس = ميكرومترات 40 ألف-دال، المبينة في (أ) (ه-ي) تحليل الخسارة والربح-من-وظيفة آثار على مكونات القناة سوبسيلولار (تظهر الصور [كنفوكل] الأسلحة قناة واحدة). (ه-ز) تأثير إدارة مخاطر المؤسسات-1 [رني] بشأن إضفاء الطابع المحلي على سوبسيلولار كاناليكولي. (ﻫ) البرية من نوع القناة السيتوبلازم؛ ملاحظة التجويف تشير إلى استبعاد التجارة والنقل. (و) البرية من نوع هيولى عقب-8::GFP بونكتا، المقابلة للحويصلات كاناليكولار. (ز) سيتوبلاسميك وتشريد القاعدية بونكتا عقب 8::GFP في الحيوان erm-1(RNAi) . (ح) التجويف متقطع والتفصيل الباثولوجي نصيحة التجويف (الشباك وفقدان لتوسيط التجويف) في الحيوان erm-1(mildRNAi) (انظر3 لتحوير قوام [رني])؛ لاحظ أن السيتوبلازم قناة يمتد إلى أبعد من غيض التجويف، هنا يتبين من الخراجات الصغيرة. Vacuoles (ط) هيولى في هيئة القناة مطرح دون أي تمديد القناة في المتأثرة بشدة erm-1(RNAi) الحيوانية3؛ علما بأن ليس من قانون 5::GFP المعينين التجويف (باستثناء عدة بقع صغيرة حول بعض vacuoles). (ي) تعيين الزائدة قانون-5::GFP وأقب-8::mCherry إلى التجويف في الحيوانات المحورة وراثيا ثلاثية overexpressing ERM-1 (الحزام ملاحظة سميكة من قانون 5::GFP وتداخل كتل أقب-8::mCherry حول التجويف الكيسي). شريط المقياس = 5 ميكرومترات ه – ي، سيظهر في هاء الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    figure-results-10383
    الشكل 5 : أمثلة للقياس الكمي عيوب القناة بالفحص المجهري تشريح و [كنفوكل]
    (أ) التمثيل التخطيطي من نوع البرية (اللوحة العلوية) والطور الكيسي (أفرقة أقل) القنوات مطرح للتحديد الكمي لحجم الطول وكيسه القناة. طول القناة الخلفية هو كمياً ك 0، 1/4، 1/2، 3/4، و 1. طول القناة '0' إلى أي تمديد و '1' تشير إلى تمديد طول كامل. حجم الكيس هو كمياً ك < 1/3 (صغير) و > 1/3 (كبير) من قطر الجسم. (ب) التحديد الكمي مورفولوجية القناة الإجمالي في مراقبة وإدارة مخاطر المؤسسات-1 [++]([رني]) الحيوانات بتشريح مجهر فلوري. طول القناة الخلفية بصورية ERM([رني]) -1 [++] الحيوانات، حوالي 1/2 الموسعة في الحيوانات 95% (صورة مرجعية، الشكل 3 ألف– باء). في القامع ERM-1 [++]([رني]) الحيوانات، تم تمديد طول القناة الخلفية الكامل تقريبا في الحيوانات 80 – 90% (صورة مرجعية، الشكل 3-د). في الحيوانات ERM-1 [++]([رني]) محسن، يكون حوالي 60-70% قنوات الخراجات الكبيرة وطول أقصر (< 1/2) (الصورة المرجعية، الرقم 3E-F). البيانات المعروضة كما يعني ± SD (n > 3). (ج) التحديد الكمي لكثافة fluorescence cytoskeleton قمي/لومينال القناة التي إيماجيج من الصور [كنفوكل]. غشاء قمي للقناة هو المسمى بقانون 5::GFP، يظهر الذراع البرية من نوع القناة إلى الذراع الأيسر، إدارة مخاطر المؤسسات-1 [++] قناة، إلى اليمين. غادر لوحات: كثافة في القانون-5::GFP في البرية نوع غشاء الأكمام هي حوالي 50 (رمادي القيمة/الغشاء؛ وهو مبين بالسهم الأسود والأحمر)، الأرض المعروضة أسفل الصورة. الحق الألواح: كثافة في القانون-5::GFP في إدارة مخاطر المؤسسات-1 [++] فوق 100 (قيمة الرمادي من الغشاء الظهرية هو حوالي 110 (السهم الأسود)، ومن الغشاء البطني هو حوالي 140 (السهم الأحمر)) والمؤامرة التي تظهر أسفل الصورة. تغيير حجم أشرطة = 5 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    الجدول 1: أمثلة على علامات C. ايليجانس نظام غشاء القناة مطرح
    اسم البروتينSub
    تعريب الهاتف الخلوي الدالة أمثلة من السلالات المتوفرة مراجع 1-إدارة مخاطر المؤسسات المجال قمي رابط الغشاء – سيتوسكيليتون VJ402 (fgEx13 [إدارة مخاطر المؤسسات-1p::erm-1::gfp، rol-6p::rol-6(su1006)]) المرجع (13) 5-قانون المجال قمي أكتين من المترجمة VJ268 (fgEx12[(act-5p::act-5::gfp)؛ وقيادة الأمم المتحدة--119 (+)؛ وقيادة الأمم المتحدة--119 (ed3) ثالثا]) المرجع (13) أبتس-2 باسولاتيرال نقل شاردة/بيكربونات أبتس-2::GFP المرجع (42) سولب-8 باسولاتيرال سولفاتيبيرميسي سولب-8::GFP المرجع (42) VHA-1 حويصلات كاناليكولار الخامس-ATPase VJ535 (fgEx35 (فى-1p::vha-1::gfp؛ ورول-6p:: rol-6(su1006))) المرجع (9) فى-5 حويصلات كاناليكولار الخامس-ATPase ML846 (vha-5(mc38) الرابع؛ mcEx337 [فى-5 (+):: بروتينات فلورية خضراء + rol-6(su1006)]) المرجع (10) 8-عقب حويصلات كاناليكولار أكوابورين، قناة مائية VJ533 (fgEx33 (عقب-8p::aqp-8::gfp)) المرجع (9) RAB-5 حويصلات اندوسومال الاتجار بالأشخاص BK209 (qpIs99 (exc9p::mCherry::rab-5)) المرجع (36) RAB-7 حويصلات اندوسومال الاتجار بالأشخاص BK210 (qpIs100 [بيكسك-9::mCherry::rab-7]) المرجع (36) RAB-11 حويصلات اندوسومال الاتجار بالأشخاص BK205 (qpIs97 (exc9p::mCherry::rab-11)) المرجع (36) 1 ويتم اختيار أمثلة من الموارد المدرجة في الجدول 3.

    الجدول 2: أمثلة على C. ايليجانس المروجين Excretory قناة محددة
    مروجينمرحلة التعبير
    1-إدارة مخاطر المؤسساتالجنين مرحلة فاصلة
    سولب-5الجنين 3-fold
    vha-1إضعاف الجنين
    فها-5إضعاف الجنين
    أقب-8إضعاف الجنين
    glt-3الجنين أواخر
    1 ويتم اختيار أمثلة من الموارد المدرجة في الجدول 3.

    الجدول 3: الموارد
    الموارد لتحديد الجزيئات الخاصة بقناة مطرح C. ايليجانس، وسم الكواشف/سلالات والأجسام المضادة
    1-مركز علم الوراثة كاينورهابديتيس (كجك)43 الكواشف المتوفرة وسلالات
    2-وورمباسي44 للحصول على معلومات حول الإخراج الخاصة بقناة الجزيئات وسلالات والأجسام المضادة
    3-معلومات عن مطرح الجزيئات الخاصة بالقناة: راجع المرجع6
    4-ترانسجينيومي الموقع45 متعدية بنيات الانصهار بروتينات فلورية خضراء
    5-C.elegans التعبير نمط46 النسخي ثوابت الانصهار بروتينات فلورية خضراء
    6-الوطني بيوريسورسي المشروع (NBRP)::C.elegans47 للمعلومات عن طفرات C. ايليجانس والمروجين
    7-فلوروفوريس: انظر مرجع48،49
    الموارد المستندة إلى ويب لتجميع جزيئات لمكتبة [رني] المستهدفة
    1-جينيمانيا50
    2-أسيفييو51
    3-iHOP52
    4-وورمباسي44
    5-قاعدة بيانات الجينوم saccharomyces53
    6-فليباسي54
    7-الماوس الجينوم قاعدة بيانات55
    8-قاعدة بيانات الجينوم البشري56
    9-انفجار57

    الجدول 4: مثال على النمط الظاهري بسيطة سجل ورقة
    مكتبة [رني]إجهادالنمط الظاهري العامة (% إجمالي)قناة النمط الظاهري
    قناة طولها < 1/2 (% L4)قناة طولها > 1/2 (% L4)النمط الظاهري قناة أخرىالعدد الكلي للحيوانات عدها
    رقم اللوحةعدد جيدا
    I-1A1إدارة مخاطر المؤسسات-1 [++]؛ ف vha-1:: بروتينات فلورية خضراءClr (30)8020100
    X-5B12نفسلا شيء3070100
    ثالثا-10C5نفسUnc (54)7030الخراجات الكبيرة100

    Discussion

    C. ايليجانس التنوع الوراثي، والشفافية وخطة الهيئة بسيطة ونسب ثابتة من خلية جعله نموذجا رائعا لتحليل morphogenesis. هذا البروتوكول ويصف كيفية الجمع بين التلاعبات الجينية القياسية وتصوير دراسات للاستفادة من ميكرون 2 رقيقة C. ايليجانس القنوات مطرح دراسة الغشاء الاستقطاب ونشوء حيوي التجويف داخل الخلايا في أنبوب خلية مفردة.

    وضع العلامات
    يمكن أن يكون المسمى القنوات مطرح C. ايليجانس بالتعبير عن البروتينات الفلورية الانصهار، تسمح بتحليل العيش (الموصوفة هنا)، أو بجسم أو تلطيخ الكيميائية (انظر المصاحبة للورقة على توبولوجينيسيس المعوية لتلطيخ جسم 3)-التعبير عن اثنين أو أكثر من فلوروفوريس مختلفة، أو المزيج من هذه مختلفة وسم التقنيات، يسمح لتشريح بصرية دقة عالية من هذه الأنابيب رقيقة (الشكل 2). البروتينات الفلورية الانصهار إخراج مروج قناة محددة للقنوات هي الخيار الأول للقناة مطرح وسم لعدة أسباب، من بينها: (1) مستويات منخفضة من التعبير العديد من قناة البروتينات، وهيكل غرامة (2) القناة التي يتم بسهولة غارقة في تلطيخ خارج القنوات فيها أيضا يمكن التعبير عن البروتين للفائدة. من ناحية أخرى، قنوات حساسة للبروتينات الخارجية وسهولة تطوير تعمل غير محدد (مثلالعيوب التمديد والخراجات أو حتى الفتك) عند هذه البروتينات يتم التعبير عنها بقوة. وهذا ينبغي أن تزن في القرار عند اختيار بين طرق مختلفة لتوليد الحيوانات المحورة وراثيا. من حيث المبدأ، المتسلسلات يمكن إدخالها كصفائف اكستراتشروموسومال (مثلاً، عن طريق الحقن المباشر من بلازميد الحمض النووي في الغدد التناسلية الفعل التحول، كما هو موضح هنا)، الذي عادة ما يولد صفائف عالية-نسخة رقم (غالباً مع ارتفاع التعبير)، أو مدمجة في الجينوم، عادة في عدد نسخ منخفضة أو واحد (مثلاً، بقصف26 أو عن طريق نسخ واحدة Mos1 بوساطة الإدراج [موستشي]27). صفائف اكستراتشرومسومال أيضا يمكن أن تكون متكاملة في مجال المجين في خطوة ثانية (لا يزال، مع ذلك، في عدد نسخ عالية)18. من ناحية أخرى، عندما يحقن الفعل في التركيز المنخفض (مثلاً، 1-2 نانوغرام/ميليلتر الحمض النووي، جنبا إلى جنب مع وجود تركيز أعلى من علامة الحمض النووي)، يمكن أن تكون نسخة (حتى واحد) انخفاض عدد صفائف ولدت سهولة28. هذا السيناريو له ميزة أنه يمكن أن تختلف تركيزات الحمض النووي، مما قد يساعد في إيجاد أفضل تعبير مستوى لوسم القناة، لا منخفضة جداً أو مرتفعة جداً (السامة). العلاقة بين مستوى التركيز والتعبير حقن الحمض النووي يعتمد على عوامل متعددة (مثلاً، المروج)، وهكذا يجب تجريبيا تحديد. بدلاً من ذلك، يمكن أن توصف بمباشرة الجينات للفائدة مع فلوروفوري في الفعل "متفاوت المسافات" بشكل منتظم ويتخلل قصيرة المتناوب يكرر (كريسبر) على أساس إجراءات التوسيم29،30. على الرغم من أن يضع هذا النهج في فلوروفوري في سياقها الجينوم الفيزيولوجية الأكثر، هذا ليس دائماً ضروريا أو حتى مرغوب فيه (على سبيل المثال، عندما يتم التعبير عن البروتين عند مستويات منخفضة جداً). ومع ذلك، قد، يكون الخيار الأفضل، على سبيل المثال إذا كانت الجينات لفائدة كبيرة جداً.

    يمكن إنجاز التصور القناة بتوجيه ثوابت النسخي في القناة سوف تسلط الضوء على السيتوبلازم القناة التي فلوروفوري. على النقيض من ذلك، وصف مكونات القناة سوبسيلولار يتطلب مزيجاً متعدية الجنسيات حيث متصل الجينات كاملة الطول في الإطار إلى fluorophore ترميز الجينات. عند استخدام أحد المروجين قناة محددة للتعبير (بدلاً من المروج الجينات الخاصة)، خيارها ينبغي أن يقوم على القوة في المروج، والتحليل التنموي، والوقت للتعبير عن. لا تعبر عن القناة مطرح العديد من جينات محددة قبل مرحلة اليرقات عند الدالة ناضح بقناة تصبح حرجة؛ متأخراً جداً لتحليل مرحلة التمديد النشطة (erm-1 و 1-الإيجابيات هي الجينات أعرب المبكر)10،13. وترد أمثلة لعلامات القناة مطرح إندو-والأغشية البلازمية والمروجين القناة المحددة في الجدولين 1 و 2، على التوالي، وموارد من أجل العثور على جزيئات خاصة بقناة إضافية في الجدول 3. يمكن أيضا استخدام هذه الموارد للعثور بروتين انصهار فلورسنت مناسب بالفعل، التي قد تكون متاحة من خلال مركز علم الوراثة كاينورهابديتيس (كجك؛ انظر أيضا الجدول 1). لتشييد والبلازميدات المؤتلف للتعبير عن هذا الأنشطار البروتين، يمكن للمرء استخدام مختلف أساليب الاستنساخ, مع محدد إيجابيات وسلبيات كل (التي نوقشت في أماكن أخرى14). وتشمل هذه إنزيم التقييد التقليدية القائمة على استنساخ النهج، الموصوفة هنا، واستنساخ وحدات استخدام تنشيط نظام العبارة31، "الجمعية جيبسون"32أو مراسل الجينات البناء بطريقة "PCR خياطة"14 ،33. هذه النهوج المختلفة يمكن تكييفها وفقا للأسلوب المحدد لإدخالها إلى الفعل و/أو احتياجات محددة أخرى (على سبيل المثال، العبارة تنوعاً نظام يسهل خلط المروجين وكدناس على نطاق أوسع وسم نهج) . العناية بالاحتياجات التي يتعين اتخاذها لاختيار موقع الإدراج الصحيح فلوروفوري (ربطه في ن-مقابل المحطة ج من البروتين) مع الأخذ بالاعتبار وظيفة البروتين للفائدة.

    التدخل مع وظيفة الجينات
    ويصف هذا البروتوكول كواحدة من العديد من الطرق الممكنة للتشويش وظيفة الجينات في C. ايليجانس، شاشة تفاعل [رني] هادفة ترمي إلى تعديل النمط الظاهري تجويف الكيسي قناة، الناجمة عن أوفيريكسبريسينج أحد مكونات غشاء لومينال. في هذه الحالة المحددة، أوفيريكسبريسينج غشاء قمي/لومينال المرتبطة علامة مثل إدارة مخاطر المؤسسات-1 تتمتع بميزة توجيه التحقيق مباشرة إلى الهدف المنشود: تحليل نشوء حيوي غشاء قمي/لومينال داخل الخلايا. النمط الظاهري مكسب للدالة التي تم إنشاؤها بواسطة أوفيريكسبريسيون كما يوفر مزايا معينة عندما جنبا إلى جنب مع شاشة تفاعل ([رني]) خسارة لدالة كما هو موضح هنا (انظر34 لمناقشة تحليل الخسارة والربح-من-وظيفة تصميم الشاشات الوراثية). وعلاوة على ذلك، هو 1 إدارة مخاطر المؤسسات نفسها التحقيق جيدا "morphogenesis التجويف" وغشاء قمي الهوية جزيء12. ولذلك، في هذه الحالة، شاشة المستهدفة (بدلاً من غير متحيزة) يحتمل أن تكون غنية بالمعلومات مباشرة التجويف morphogenesis بينما في الوقت ذاته مواصلة تميز إدارة مخاطر المؤسسات 1 وظيفة محددة في هذه العملية. ومع ذلك، يمكن أن تجري على شاشة غير متحيزة غير المستهدفة بطريقة مماثلة، تبدأ أما مع الحيوانات البرية نوع، الحيوانات المحورة وراثيا مع ولوريسسينتلي المسمى القنوات مطرح، أو مع أي قناة المسخ. العامة مزايا ومساوئ [رني] (مثلاً، مقابل الطفرات) لتوليد تعمل خسارة للدالة، والتوصيل، ومناقشة أنواع مختلفة من الشاشات الوراثية في C. ايليجانس تناقش في أماكن أخرى 34-[رني] تنتج طائفة تعمل، بما في ذلك تعمل أكثر اعتدالا، بميزة محددة لتحليل الجينات القاتلة في كثير من الأحيان توبولوجينيسيس. هذا هو وصف ونوقشت في الورقة المرفقة في الأمعاء توبولوجينيسيس3. نهج مختلفة لتوليد الربح وإجراءات الوراثية الكلاسيكية مثل الصلبان، وطفرات فقدان لوظيفة تفصيلية وناقش في الأدب أساليب الوراثة العامة20.

    الفحص المجهري والتقييم تعمل توبولوجينيسيس
    تقييم بصريا وسجل تعديل النمط الظاهري قناة المعالم تحت فلوري تشريح مجهر باستخدام معلمات التسجيل بسيطة (مثل قناة طولها والتجويف قطر)، كما هو موضح هنا، يمكن تحقيقه في فترة قصيرة من الزمن حتى عند تجهيز إعداد كبيرة من الحيوانات في المستهدفة أو منهجي الوراثية أو الشاشة [رني]. في المقابل، أن البحث الشاشة مماثلة لرواية قناة morphogenesis تعمل في سلالة البرية من نوع (باستثناء وصفها قناة التحوير)، أكثر استهلاكاً للوقت، ولكن يمكن، من حيث المبدأ، يقوم بنفس الطريقة (قمنا بمثل هذه الشاشة على نطاق الجينوم في عدة شهور). هذه الشاشات سيحدد تعمل قناة مختلفة متعددة (لا يظهر هنا) و ولذلك يجب وضع المقابل معلمات التهديف مختلفة، مثلاً، تصنيف نوعي مخطط (انظر،،من 911 35،36،،من3738 لطرق مختلفة لنقاط تعمل القناة بتشريح مجهرية). عند تفسير أي قناة النمط الظاهري، من الأهمية بمكان أن نضع في اعتبارنا أن يمكن تشكيل كيسه تأثيراً غير محدد للعديد من الإهانات المختلفة لهذا الهيكل أنبوبي رقيقة، وهي غالباً النمط الظاهري محطة إعلامية أقل. كيسه الحجم والموقع، ومن ناحية أخرى، قد تكون مفيدة، مثلكيسه قريبة من الخلية القناة (مع بداية تمديد القناة)، والخراجات على طول القناة أو الخراجات نصائح القناة، في تقديم أدلة إلى الآلية الأساسية للعيوب. ينبغي تمييز الخراجات القناة (يعرف هنا داخل لومينال الماغنيسيوم مملوءة بسائل محاط غشاء قمي/لومينال) من حويصلات (الصغيرة هيولى زمنياً غشاء السائل الماغنيسيوم) أو فاكوليس (تضخم هيولى غشاء محدد الماغنيسيوم مليئة السائل)، لا يحيط بها غشاء لومينال، أن يمكن جميع نظرة سطحية مماثلة (الشكل 4 أ-د). Vacuoles هيولى يمكن كذلك تنشأ ثانوي، مثلاً، عن طريق الآثار السمية لتركيب حلول (أزيد الصوديوم). الخراجات الكبيرة و vacuoles هيولى على حد سواء، يمكن أن يستغرق تقريبا حجم الحيوان، والحاجة إلى زيادة التمييز بين الكلاسيكية "واضحة (Clr)" قناة النمط الظاهري بسبب تراكم السوائل في تجويف الجسم. وأخيراً، طول القناة مهددة دائماً تقريبا ثانوي في قنوات الكيسي، ولذلك عيب تمديد قناة حقيقية بحاجة إلى إثبات في أجواء حرة كيسه.

    على الرغم من أقطار صغيرة، مكونات سوبسيلولار مطرح قنوات، مثل قمي مقابل الأغشية القاعدية، داخل الخلايا اندوسومال مقابل الحويصلات كاناليكولار، العضيات داخل الخلية ومكوناتها سيتوسكيليتال، يمكن تصور بأعلى التكبير، مثلاً، [كنفوكل] مجهرية (الشكل 2، الرقم 4). بتصوير [كنفوكل]، بروتينات فلورية خضراء السيتوبلازم قناة إيجابية وحدها كافية للتمييز بين التجويف من السيتوبلازم قناة عبر خط غير الفلورية (الشكل 2A، 4E الشكل). هوية علامات يسهم في حل كاناليكولار من الحويصلات اندوسومال (أيضا لافت للنظر مختلفة في الحجم)، على الرغم من أن سيتطلب تخصيص نهائي إيممونوليكترونميكروسكوبي39. يمكنك تحديد تسمية مزدوجة وثلاثية التعريب سوبسيلولار جزيء فائدة والعلاقة بين مكونات سوبسيلولار إلى بعضها البعض (الشكل 2). أغشية القناة لومينال مسماة واحدة تنتج نفس الخط المزدوج السيتوبلازم أو الغشاء القاعدي، ولكن يمكن تمييزها عن طريق مزدوج أو ثلاثة إضعاف وضع العلامات. لتحليل [كنفوكل]، التركيب السليم المهم، نظراً لهشاشة هيكل القناة وحساسيته للتغيرات ناضح والضعف في النمط الظاهري الكيسي الأكثر شيوعاً. الخراجات انفجر بسهولة مع التغييرات ناضح أو ضغوط جسدية وهي حساسة للسموم الغشاء مثل أزيد الصوديوم وحساسة أيضا لبعض المسكنات المستخدمة لتجميد (التي قد تنتج أيضا هيولى vacuoles). في أيدينا، يعمل ليدوكائين 5% في المخزن المؤقت M9 أفضل لفحوصات القناة مطرح آخر. ينبغي أن تكون إجراءات التصوير والتعامل مع جميع لطيف، كما هو موضح. لتجنب النتائج الملموسة التي تحاكي تعمل (مثلاً، والخراجات و vacuoles)، فمن الأفضل الفور الحصول على الصور بعد التركيب. إذا لم يكن ذلك ممكناً، ينبغي أن يكتسب صور كيسه أولاً، قبل التصوير الأخرى تعمل. ويناقش هذا البروتوكول الفحص المجهري [كنفوكل] المسح القياسية التي توفر كونفوكاليتي متفوقة، بالمقارنة بالقرص المجهري [كنفوكل] الذي، على النقيض من ذلك، يقلل من الضيائية والفحص المجهري للاختيار لتحليل التغيرات الدينامية للغزل سوبسيلولار المكونات مع مرور الوقت. يمكن أيضا معالجة مثل هذه الأسئلة على ديناميات سوبسيلولار باستخدام تقنيات فوتوبليتشينج أو وسم البروتينات الانصهار مع فلوروفوريس صور--التحويل أن تغير لون40. وأخيراً، يمكن زيادة نطاق القرار كذلك بإضافة مجهر إلكتروني (TEM، تقديم أعلى دقة الهيكلية ولكن لا الجزيئية)، القرار فائقة مجهرية (تقديم القرار الجزيئية في نطاق نانومتر)؛ أو39،إيممونوليكترونميكروسكوبي (توفير)41. يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع مقاطع المسلسل تيم 3D التصوير المقطعي ومفيد بشكل خاص لتحليل واجهة غشاء البلازما كاناليكولار القنوات مطرح9،10. مواصلة تطوير تقنيات محسنة لهذه الأنواع المختلفة من الفحص المجهري ومزيج من هذه الطرق التصوير المختلفة.

    Disclosures

    الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

    Acknowledgements

    ونحن نشكر م. Buechner (جامعة كانساس، كانساس، الولايات المتحدة الأمريكية)، ك. نيهركي (المركز الطبي في جامعة روتشستر، روتشستر، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية)، ومركز علم الوراثة كاينورهابديتيس ، تموله "المعاهد الوطنية للصحة"، البنية التحتية مكتب للبحوث البرامج (P40 OD010440). أيد منح GM078653 المعاهد الوطنية للصحة، 224570 هو MGH و 223809 سا واظب هذا العمل

    Materials

    NameCompanyCatalog NumberComments
    Cloning
    Plasmid pPD95.75AddgeneCat. No. 37464
    PCR KitQiagenCat. No. 27106
    Ligation kitNew England BiolabsCat. No. E2611L
    DNA markerThermo ScientificCat. No. SM1331
    Agarose DNA gradeFisher ScientificCat. No. BP164-100
    Competent cellsNew England BiolabsCat. No. C2987H
    TrisFisher ScientificCat. No. BP154-1
    EDTASigmaCat. No. ED-1KG
    Acetic acidFisher ScientificCat. No. A38S-500
    Ethidium bromideFisher ScientificCat. No. BP1302-10
    Equipments
    PCR machine MJ ResearchCat. No. PTG-200 
    CentrifugeEppendorf Cat. No. 5415C
    Water BathPrecision Scientific Cat. No. 666A3 
    Gel running instrumentFisher ScientificCat. No. 09-528-165
    Gel running power supplyFisher ScientificCat. No. 45-000-465
    Molecular Imager Gel Doc XR SystemBio-RadCat. No. 1708195EDU
    Nanodrop SpectrophotometerThermo ScientificCat. No. ND1000
    C. elegans related11see reference19 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
    LB Medium and plates22see reference19 for protocols.
    Tryptone Acros OrganicsCat. no. 611845000
    Yeast ExtractBD BiosciencesCat. no. 212750
    NaClSigmaCat. no. S7653
    Bacto Agar BD BiosciencesCat. no. 214040
    AmpicillinSigmaCat. no. A0116
    TetracyclineFisher ScientificCat. no. BP912
    M9 Medium22see reference19 for protocols.
    NaClSigmaCat. no. S7653
    KH2PO4SigmaCat. no. P0662
    Na2HPO4SigmaCat. no. S7907
    MgSO4SigmaCat. no. M2773
    NGM plates 22see reference19 for protocols.
    NaClSigmaCat. no. S7653
    Peptone BD BiosciencesCat. no. 211677
    Tryptone Acros OrganicsCat. no. 611845000
    Bacto Agar BD BiosciencesCat. no. 214040
    MgSO4SigmaCat. no. M2773
    CaCl2SigmaCat. no. C3881
    Cholesterol SigmaCat. no. C8667
    K2HPO4 SigmaCat. no. P3786
    KH2PO4SigmaCat. no. P0662
    RNAi plates33see reference21 for protocols.
    NaClSigmaCat. no. S7653
    Peptone BD BiosciencesCat. no. 211677
    Tryptone Acros OrganicsCat. no. 611845000
    Bacto Agar BD BiosciencesCat. no. 214040
    MgSO4SigmaCat. no. M2773
    CaCl2SigmaCat. no. C3881
    Cholesterol SigmaCat. no. C8667
    K2HPO4 SigmaCat. no. P3786
    KH2PO4SigmaCat. no. P0662
    IPTG US BiologicalCat. no. I8500
    CarbenicillinFisher ScientificCat. no. BP2648
    NaOHFisher ScientificCat. no. SS266-1
    Sodium hypochloriteFisher ScientificCat. no. 50371500
    Bacteria
    OP50 bacteriaCGC
    HT115 bacteriaCGC
    Genome-wide RNAi libraries
    Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref21,58,59)Source BioScience
    C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref60)Source BioScience
    Imaging related
    LidocaineMP Biomedicals,LLGCat. no. 193917
    Materials
    Vacuum Grease SiliconeBeckmanCat. no. 335148
    Microscope slides Fisher ScientificCat. no. 4448
    Tissue culture plate, 6 well Corning Inc.Cat. no. 08-772-33
    Equipment
    SMZ-U dissecting microscope (Nikon)
    SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions).
    TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem)
    C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon)

    References

    1. Lubarsky, B., Krasnow, M. A. Tube morphogenesis: making and shaping biological tubes. Cell. 112 (1), (2003).
    2. Sundaram, M. V., Cohen, J. D. Time to make the doughnuts: Building and shaping seamless tubes. Semin. Cell Dev. Biol. S1084-9521, 30130-30136 (2016).
    3. Zhang, N. The C. elegans intestine as a model for intercellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis at the single-cell level. JoVE. , (2017).
    4. Andrew, D. J., Ewald, A. J. Morphogenesis of epithelial tubes: Insights into tube formation, elongation, and elongation. Dev. Biol. 341 (1), 34-55 (2010).
    5. Nelson, F. K., Albert, P. S., Riddle, D. L. Fine structure of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system. J. Ultrastruct. Res. 82 (2), 156-171 (1983).
    6. Sundaram, M. V., Buechner, M. The Caenorhabditis elegans Excretory System: A Model for Tubulogenesis, Cell Fate Specification, and Plasticity. Genetics. 203 (1), 35(2016).
    7. Altun, Z. F., Hall, D. H. Excretory system. WormAtlas. , (2009).
    8. Buechner, M. Tubes and the single C. elegans excretory cell. Trends Cell Biol. 12 (10), 479-484 (2002).
    9. Khan, L. A. Intracellular lumen extension requires ERM-1-dependent apical membrane expansion and AQP-8-mediated flux. Nat. Cell Biol. 15 (2), 143-156 (2013).
    10. Kolotuev, I., Hyenne, V., Schwab, Y., Rodriguez, D., Labouesse, M. A pathway for unicellular tube extension depending on the lymphatic vessel determinant Prox1 and on osmoregulation. Nat. Cell Biol. 15 (2), 157-168 (2013).
    11. Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Dev. Biol. 214 (1), 227-241 (1999).
    12. Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11 (4), 276-287 (2010).
    13. Gobel, V., Barrett, P. L., Hall, D. H., Fleming, J. T. Lumen morphogenesis in C. elegans requires the membrane-cytoskeleton linker erm-1. Dev. Cell. 6 (6), 865-873 (2004).
    14. Boulin, T., et al. Reporter gene fusions, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. , April 5, 2006 http://www. wormbook.org (2006).
    15. Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. Sambrook, J., DW, R. ussell , Cold Spring Harbor Laboratory Press . (2006).
    16. Fire, A., Harrison, S. W., Dixon, D. A modular set of lacZ fusion vectors for studying gene expression in Caenorhabditis elegans. Gene. 93 (2), 189-198 (1990).
    17. Ahringer, J. Reverse genetics, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. 6, April 6, 2006 http://www. wormbook.org (2006).
    18. Transformation and microinjection, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. Evans, T. C. , April 6, 2006 http://www.wormbook.org (2006).
    19. Maintenance of C. elegans, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. Stiernagle, T. , February 11, 2006 http://www.wormbook.org (2006).
    20. Genetic mapping and manipulation: Chapter 7-Making compound mutants, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. Fay, D. , February 17, 2006 http://www.wormbook.org (2006).
    21. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
    22. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
    23. Pawley, J. B. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , Springer. (2006).
    24. Hibbs, A. R. Confocal Microscopy for Biologists. , Springer. US. (2004).
    25. Bankhead, P. Analyzing fluorescence microscopy images with ImageJ. , (2014).
    26. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157 (3), 1217-1226 (2001).
    27. Frøkjaer-Jensen, C. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nat. Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).
    28. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).
    29. Barrangou, R. Cas9 Targeting and the CRISPR Revolution. Science. 344 (6185), 707-708 (2014).
    30. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).
    31. Esposito, D., Garvey, L. A., Chakiath, C. S. Gateway cloning for protein expression. Methods Mol. Biol. 498, 31-54 (2009).
    32. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
    33. Hobert, O. PCR fusion-based approach to create reporter gene constructs for expression analysis in transgenic C. elegans. Biotechniques. 32 (4), 728-730 (2002).
    34. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat. Rev. Genet. 3 (5), 356-369 (2002).
    35. Berry, K. L., Bulow, H. E., Hall, D. H., Hobert, O. A. C. elegans CLIC-like protein required for intracellular tube formation and maintenance. Science. 302 (5653), 2134-2137 (2003).
    36. Mattingly, B. C., Buechner, M. The FGD homologue EXC-5 regulates apical trafficking in C. elegans tubules. Dev. Biol. 359 (1), 59-72 (2011).
    37. Shaye, D. D., Greenwald, I. The disease-associated formin INF2/EXC-6 organizes lumen and cell outgrowth during tubulogenesis by regulating F-actin and microtubule cytoskeletons. Dev. Cell. 32 (6), 743-755 (2015).
    38. Lant, B. CCM-3/STRIPAK promotes seamless tube extension through endocytic recycling. Nat. Commun. 6 (6), 6449(2015).
    39. Paupard, M. C., Miller, A., Grant, B., Hirsh, D., Hall, D. H. Immuno-EM localization of GFP-tagged yolk proteins in C. elegans using microwave fixation. J. Histochem. Cytochem. 49 (8), 949-956 (2001).
    40. Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 885-891 (2005).
    41. Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
    42. Sherman, T. The abts and sulp families of anion transporters from Caenorhabditis elegans. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 289 (2), C341-C351 (2005).
    43. Caenorhabditis Genetics Center (CGC). , http://cbs.umn.edu/cgc/home (2017).
    44. Wormbase. , http://www.wormbase.org/ (2017).
    45. Transgeneome website. , https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html (2017).
    46. C. elegans expression pattern. , http://gfpworm.org/ (2017).
    47. National BioResource Project (NBRP)::C. elegans. , https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/ (2017).
    48. Heppert, J. K. Comparative assessment of fluorescent proteins for in vivo imaging in an animal model system. Mol. Biol. Cell. 27 (22), 3385-3394 (2016).
    49. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
    50. GeneMANIA. , http://genemania.org/ (2017).
    51. AceView. , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ieb/research/acembly/ (2017).
    52. iHOP. , http://www.ihop-net.org/UniPub/iHOP / (2017).
    53. Saccharomyces Genome Database. , http://www.yeastgenome.org (2017).
    54. Flybase. , http://www.flybase.org (2017).
    55. Mouse Genome Database. , http://www.informatics.jax.org (2017).
    56. Human Genome Database. , http://www.gdb.org (2017).
    57. BLAST. , https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (2017).
    58. Kamath, R. S., Martinezcampos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002(2001).
    59. Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
    60. Rual, J. F. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome research. 14 (10B), 2162-2168 (2004).

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Explore More Articles

    128 morphogenesis fluorescence

    This article has been published

    Video Coming Soon

    JoVE Logo

    Privacy

    Terms of Use

    Policies

    Contact Us

    Recommend to library

    JoVE NEWSLETTERS

    Research

    Education

    Authors

    Librarians

    ABOUT JoVE

    Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved