Method Article
Der C. Elegans Ausscheidungsorgane Kanal ist ein einzigartiges einzellige Modell für die optische in-Vivo -Analyse der de Novo polarisiert Membran Biogenese. Dieses Protokoll beschreibt eine Kombination aus standard genetische/RNAi und imaging-Ansätze, zur Identifizierung und Charakterisierung von Molekülen Regie einzelligen Tubulogenesis und apikale Membran und Lumen Biogenese anpassungsfähig.
Die vier C. Elegans Ausscheidungsorgane Kanäle sind engen Röhren, die durch die Länge des Tieres aus einer einzigen Zelle mit fast ebenso weit ausgedehnten intrazelluläre Endotubes, die aufbauen und stabilisieren das Lumen mit einer Membran und Submembraneous erweitert Zytoskelett der apikalen Charakter. Die Ausscheidungsorgane Zelle erweitert seine Länge ca. 2.000 Mal, um diese Kanäle, so dass dieses Modell für die in-Vivo -Beurteilung der de Novo polarisiert Membran Biogenese, intrazelluläre Lumen Morphogenese eindeutig zu generieren und einzelligen Tubulogenesis. Die hier vorgestellten Protokoll zeigt, wie Sie Standard Beschriftung, Gewinn - und Verlust-der-Funktion genetische oder RNA-Interferenz (RNAi) kombinieren-, und mikroskopische Ansätze, dieses Modell optisch zu sezieren und funktionell analysiert diese Prozesse auf molekularer Ebene zu verwenden. Als ein Beispiel für eine Kennzeichnung Ansatz beschreibt das Protokoll die Generation von transgenen Tieren mit fluoreszierenden Fusionsproteine für live-Analyse des Tubulogenesis. Als ein Beispiel für eine genetische Ansatz unterstreicht es Eckpunkte eines visuellen RNAi-basierten Interaktion Bildschirm entwickelt, um eine zystische Kanal Gain-of-Function-Phänotyp ändern. Die spezifischen Methoden beschrieben sind wie: beschriften und visualisieren die Kanäle zum Ausdruck bringen, fluoreszierende Proteine; eine gezielte RNAi-Bibliothek zu konstruieren und strategisch RNAi screening für die molekulare Analyse der Kanal Morphogenese; Änderungen der Kanal Phänotypen visuell zu beurteilen; Punkten sie durch sezieren Fluoreszenz-Mikroskopie; subzelluläre Kanal Komponenten mit höherer Auflösung durch konfokale Mikroskopie zu charakterisieren; und Quantifizierung der visuelle Parametern. Der Ansatz eignet sich für den Prüfer, der unter Ausnutzung des C. Elegans Ausscheidungsorgane Kanals für die Identifizierung und Charakterisierung von Genen beteiligt die phylogenetisch konserviert Prozesse der intrazellulären Lumen und einzelligen interessiert ist Rohr-Morphogenese.
Alle inneren Organe bestehen aus Rohren, entscheidend für ihre viele verschiedenen Funktionen, wie z. B. den Transport und Austausch von Gasen, Flüssigkeiten und Nährstoffen und die Ausscheidung von Stoffwechselschlacken. Ihre polarisierten Charakter, mit deutlichen lumenal und apikalen Membranen, ist auf diese spezifische Funktionen angepasst, und Mängel in der Biogenese ihrer Endo und Plasmamembran-Systeme sind eine häufige Ursache von Krankheiten1,2. Die Mehrheit der Rohre des Gefäßsystems und der inneren Organe sind mehrzelligen und bilden ein Lumen intercellularly; jedoch können, einzellige Röhren, die das Lumen intrazellulär bilden, z. B. so viel wie 30 – 50 % der menschlichen Kapillare Betten2darstellen. Die polarisierten Membranen der Multi- und einzelligen Röhren ähneln sich in Zusammensetzung, obwohl ihre Microdomains basierend auf das Rohr bestimmte Funktion (z.B., Ausscheidungsorgane Kanal Canaliculi gegen Darm Mikrovilli in Caenorhabditis unterscheiden können Elegans; siehe Papier auf C. Elegans Darm Tubulogenesis begleiten)3. Die Grundsätze der polarisierten Membran Biogenese und Tubulogenesis sind bei Metazoen konserviert, und eine ähnliche molekulare Maschinerie leitet sie1,2,4.
Die Ausscheidungsorgane C. Elegans besteht aus fünf Zellen: die Ausscheidungsorgane Zelle (EC), Kanal Zellen (DC), pore Zelle (PC) und zwei Drüsenzellen. Ablation der EG, DC oder PC verursacht Flüssigkeitsansammlung in der Körperhöhle und die Tiere sterben an einer frühen Larvenstadium5. Faszinierend, diese drei einzelligen Rohre erstellen ihr Lumen auf drei verschiedene Arten: von Zelle Aushöhlung (EG); Zelle Verpackung gekoppelt mit Autocellular Kreuzung Bildung (PC); und durch die Zelle Umhüllung in Verbindung mit Autofusion (DC); verschiedene Mechanismen der Lumen Morphogenese, die alle phylogenetisch konserviert6,7. Die EG, befindet sich auf der linken lateralen Seite der hinteren Rachenraum Lampe, sendet zwei seitliche Erweiterungen aus, die die vier Kanäle verzweigen sich vorangegangene erweitern und nach hinten (auf der rechten und linken Seite) bis zur Spitze des der Wurm Nose und tail , bzw. (Abbildung 1)5,6,8. Die EG erstreckt sich von etwa 1 µm bis 2 x 1.000 µm, so dass es die größte Zelle im Tier. Auf subzellulärer Ebene ist der Ausscheidungsorgane Kanal ein einfaches Rohr, generiert aus einer Basalmembran auf das Pseudocoelom gerichtet, und durch eine lumenal Membran (Endotube) getunnelt. Die Kanal lumenal Membran verbindet der Kanal lumenal Membran an der nur interzellulären Kreuzung; Ansonsten sind die Kanäle junctionless entlang ihrer Länge (Abbildung 1). Die Ausscheidungsorgane Kanal lumenal Membran und seine Submembraneous Zytoskelett sind apikale, definiert durch ihre molekulare Zusammensetzung, die die Zusammensetzung der apikalen Membran und Submembraneous Zytoskelett mehrzelligen Röhren, wie der Darm ähnelt, und von anderen Epithelien (z.B.Wohnung). Zytoplasmatischen Organellen, einschließlich Endosomal vesikuläre und andere (z.B.Golgi) Endomembranes entlang der Länge des Kanals verteilt sind. Darüber hinaus sind mehrere canalicular Vesikel - verbunden mit der lumenal Membran und/oder miteinander verbunden oder isoliert - durch den Kanal Zytoplasma7,8,9,10 Gewinde . Diese dynamische Plasma-Membran/canalicular Verbindung weiter erweitert den Kanal-Membran-System und trägt zur sowohl Lumen Morphogenese und Muskeltätigkeit10. Die Ausscheidungsorgane Kanal besteht somit fast ausschließlich aus Endo und Plasmamembranen, die ein hervorragendes Modell für die Analyse der polarisierten Membran Biogenese und die Regulierung der Endo-Plasmamembran Schnittstelle. Die drastische Ausweitung der apikalen Membran während Kanal Morphogenese - in diesem einzellige System deckungsgleich mit Lumen Erweiterung – ermöglicht auch die architektonische Probleme, die durch die Notwendigkeit, zu stabilisieren und in der Mitte einer intrazellulären lumenal Membran zu analysieren . Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Analyse der Kanal Rohr und Lumen der strukturellen Morphogenese und der intrazellulären Membran Dynamik für diesen Prozess nicht auf die Signale, die die Zelle Bewegungen lenken, die in der Standpunkt der EG zu erzeugen die Ausscheidungsorgane und seiner komplizierten Verbindungen mit anderen zellulären Elementen (rezensiert in6) zu konstruieren.
Ein weiterer Vorteil von C. Elegans einzellige Kanalsystem für die Analyse von polarisierten Membran und intrazellulären Lumen Biogenese ist seine Fähigkeit, durch Entwicklungszeit, die Generation der verschiedenen Komponenten der Membranen zu trennen und Kreuzungen. Die EG entsteht zum Zeitpunkt der ventralen Schließung und siedelt sich Ventro-seitlich des Rachens während Mitte Embryogenese5,6,8, während die Verlängerung der Seitenkanal und Verzweigungen auftreten. Das anterior-posterioren Kanal Erweiterung in der späten Embryogenese, einen Prozess folgt, die weiterhin in der L1-Larvenstadium (Abbildung 1). In einer frisch geschlüpften Larve die hinteren Kanal Spitze erreicht ungefähr in die Mitte des Wurms, voll Verlängerung am Schwanz am Ende der Phase L1, nach welcher Zeit des Kanals zusammen mit dem Wurm8verlängert. Aktiven Kanal Wachstum mit einer Geschwindigkeit über das Wachstum des Tieres so endet im ersten Larvenstadium, allerdings weiter Wachstum tritt gleichzeitig mit dem Wachstum des gesamten Tieres während die weiteren Larvenstadien (L2-4). Diese Einstellung bietet die Möglichkeit, die verschiedene Stufen der de Novo polarisiert Membran Biogenese unabhängig von polarisierten Zellteilung oder Migration zu analysieren. Außerdem ermöglicht es die Trennung dieses Prozesses von der Versammlung der Knotenpunkte (die im Embryo vor Lumen Einleitung auftreten); Ihre genauen Anforderungen in Membran Polarisierung ist immer noch eine offene Frage im Feld Polarität. Schließlich trennt es eindeutig apikalen von Basalmembran Expansion, das letztere Verfahren vor der ehemaligen in der Ausscheidungsorgane Kanäle10. Das C. Elegans Ausscheidungsorgane Kanal Modell ist daher eine besonders informative Ergänzung mit dem Darm Modell, das eine Reihe von diesen Vorteilen für die Analyse von polarisierten Membran Biogenese teilt aber führt ihn in einer mehrzelligen Einstellung (siehe die begleitenden Paper über den Darm Tubulogenesis3).
Obwohl Wildtyp Kanäle ultradünnen Tubuli in diesem winzigen Wurm sind, können ihre Lumen vi sein.Sualized direkt von Nomarski Optik in diesem transparenten Tier. In der Tat können mutierten zystische Kanal Morphologien charakterisiert werden, in unbeschrifteten Tiere mit geringer Vergrößerung sezieren Mikroskopie, die mit großer Wirkung in vorwärts genetischer Bildschirme verwendet wurde, um an Tubulogenesis11beteiligten Gene zu identifizieren. Verbesserte Visualisierung von der Morphologie der Kanäle und Unterscheidung von ihren polarisierten Membranen, Zellskelett Komponenten, verschiedene intrazelluläre Organellen und andere subzellulären Strukturen, jedoch erfordert, Kennzeichnung und höher macht Leuchtstofflampen sezierenden und konfokalen Mikroskopie. Obwohl die Kanäle Feinstruktur eine Reihe von Schwierigkeiten für die Kennzeichnung und Mikroskopie stellt, Membranen und subzelluläre Komponenten unterschieden werden, über die bestimmte Moleküle, die einzigartig für jedes Fach und Tiere können sicher für die Mikroskopie montiert werden, wenn bestimmte Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, zu vermeiden Einführung Artefakten (siehe Protokoll und Diskussion). Kennzeichnung kann erfolgen durch Immunhistochemie in festen Proben oder durch die Erzeugung transgener Würmer mit dem Ausdruck fluoreszierende Fusionsproteine unter die Kontrolle über ihre eigenen oder Ausscheidungsorgane Kanal-spezifische Promotoren für in-Vivo Bildgebung. Dieses Protokoll beschreibt die Kennzeichnung Verfahren (siehe begleitende Papier auf intestinale Tubulogenesis für Antikörper Färbung3).
Die Fähigkeit, in Vivo Verlust oder Gewinn-of-Function-Studien mit in-Vivo imaging-Analyse auf die einzelne Zelle level in der gesamten Entwicklung macht den C. Elegans Ausscheidungsorgane Kanal ein besonders starkes Modell für die molekulare und zelluläre Analyse der einzelligen Tubulogenesis. Vorwärts oder rückwärts genetische Bildschirme können durchgeführt werden, beginnend mit einem Wildtyp oder beschrifteten transgenen Tieres Kanal Morphogenese Phänotypen (z.B. Zysten) zu identifizieren und ihre zugrunde liegenden Gendefekten. Alternativ können solche Bildschirme beginnen mit einem mutierten Phänotyp (z.B. eine zystische Kanal) und Unterdrücker oder Enhancer von diesen Phänotyp zur Identifizierung von Genen, die funktionell interagieren mit dem Gen verursacht des mutierten Phänotyps zu identifizieren. Der Gendefekt verursacht des mutierten Phänotyps kann induzieren einen Verlust (z.B. über gen löschen) oder ein Gewinn (z.B. über eine aktivierende Mutation oder über die Einführung des überschüssigen gen Kopien) der untersuchten Funktion. Vorwärts Mutagenese oder systematische RNAi-Screens sind ohne Vorurteile auf Genfunktion und die unvoreingenommene Identifizierung von Genen, die in der Funktion des Interesses ermöglichen. Angesichts der Verfügbarkeit der genomweiten RNAi Fütterung Bibliotheken kann fast jedes gen leicht durch RNAi in C. Elegans, abgerissen werden, dass jedes einzelne gen des Interesses oder eine Gruppe von Genen (z. B.in gezielte Bildschirme) auch schnell sondiert werden kann für ihre Wirkung in einem reverse Genetik-Ansatz. Um eine mögliche Kombination von Ansätzen zu demonstrieren, beschreiben wir hier einen gezielte RNAi Interaktion Bildschirm, beginnend mit eine zystische Ausscheidungsorgane Kanal Gain-of-Function-Mutante mit zytoplasmatischen Kanal grün fluoreszierenden Proteins (GFP) gekennzeichnet. Die mutierte Phänotyp wurde durch Überexpression des Erm-1, einer hoch konservierten C. Elegans generiert Ortholog der Membran-Aktin Linker Familie Ezrin-Radixin-Moesin (ERM), die in Lumen Morphogenese und Membran verwickelt Organisation in vielen Arten12. C. Elegans ERM-1 lumenal Membranen der inneren Organe, wie z. B. die Ausscheidungsorgane Kanal und des Darms, lokalisiert und ist erforderlich für Lumen Bildung in beiden13. ERM-1 Überexpression Rekruten überschüssige Aktin und Vesikeln der Kanal lumenal Membran, Erhöhung der Fluss in das Lumen und generieren einen kurzen zystische Kanal und einem gekräuselten lumenal Membran mit verdickten Aktin Unterwolle9. Das Protokoll beschreibt, wie Sie transgene Linien mit Ausscheidungsorgane Kanal ausgedrückt erzeugen mit der Bezeichnung Fusion Proteine (oder andere Proteine); Gewusst wie: ausführen eine gezielte RNAi-Screens ausgehend von dieser Stämme, Modifikatoren des Phänotyps Kanal zu identifizieren; und wie Sie visuell analysieren die Ergebnisse solcher Bildschirme von sezierenden und konfokale Fluoreszenzmikroskopie, einschließlich einfache Möglichkeiten, um informative Tubulogenesis Phänotypen zu quantifizieren. Alternative Techniken und die Details der RNAi, abgestimmt auf die oft tödliche Tubulogenesis Gene, Kennzeichnung finden Sie in der begleitenden Zeitung am Darm Tubulogenesis3. Alle Methoden können in verschiedenen Kombinationen für die Untersuchung weiterer Fragen auf Kanal Tubulogenesis verwendet werden.
1. Kennzeichnung der C. Elegans Excretory Kanal durch fluoreszierende Fusionsproteine 14
Hinweis: finden Sie im begleitende Paper am Darm Tubulogenesis 3 für die Kennzeichnung von in Situ Antikörper Färbung Verfahren anpassbar an die Ausscheidungsorgane Kanal. Siehe Tabelle 1 Beispiele für Moleküle bewährt zur Visualisierung von C. Elegans Ausscheidungsorgane Kanal Endo- und Plasmamembranen, Tabelle 2 Beispiele für Promotoren, die Ausdruck der Ausscheidungsorgane Kanal fahren und Tabelle 3 Mittel für umfassende Sammlungen von Markern und Promotoren, einschließlich der Verweise, die Diskussion über die Auswahl der verschiedenen Fluorophore.
2. Bau eines gezielten RNAi Bibliothek und Design eines RNAi-Interaktion-Bildschirms auf einen Kanal Phänotyp ändern
Hinweis: ein gezielte RNAi-basierten genetischen Interaktion Bildschirm wird beschrieben, die eine Überexpression zystische Kanal Phänotyp, verwendet Suche nach interagierenden Ausscheidungsorgane Kanal Morphogenese Genen. Die ERM-1 [++]-Stamm dient (siehe Schritt 1.2.9) als Beispiel 9. Dieser Ansatz stellt nur eine von vielen möglichen Ansätzen für die genetische Analyse der Ausscheidungsorgane Kanal Lumen Morphogenese (siehe Einführung und Diskussion für andere gentechnische Ansätze). Finden Sie im begleitende Paper am Darm Tubulogenesis 3 und Referenzen 17 , 21 , 22 Hintergrundinformationen über RNAi, Details der RNAi Verfahren, Modulation der RNAi-Stärke (eingestellt auf die oft tödliche Tubulogenesis Gene) und Diskussion von technischen Problemen verbunden RNAi. Siehe Referenz 19 für standard Wurm Kultur und Wartung und Tabelle Materialien.
3. In Vivo Imaging von C. Elegans Excretory Canal durch Fluoreszenzmikroskopie sezieren und Scoring der Tubulogenesis Phänotypen
4. Imaging von C. Elegans Excretory Kanal mit hoher Auflösung durch Scannen konfokale Lasermikroskopie
Dieses Protokoll beschreibt, wie das C. Elegans Ausscheidungsorgane Kanäle verwenden, um visuell und molekular einzelligen Tubulogenesis und intrazellulären Lumen Morphogenese in einer einzelnen Zelle zu analysieren. Während ihre Erweiterung aus der Zeit der Mitte Embryogenese bis zum Erwachsenenalter weiterhin die vier Ausscheidungsorgane Kanäle ihre basolateralen und apikalen/lumenal Membranen zusammen mit ihren canalicular und Endosomal Endomembrane System und bietet ein einzigartiges Modell für erweitern die in Vivo -Analyse der de Novo polarisiert Membran Biogenese (Abbildung 1). Subzelluläre Komponenten wie apikalen Membranen, Zytoplasma und Endosomal versus canalicular Vesikel visualisiert werden, zum Ausdruck bringen, bestimmte fluoreszierende Fusionsproteine (im Protokoll Abschnitt 1 beschrieben), und sie können voneinander unterschieden werden doppelte oder dreifache Beschriftung in einem einzelnen transgenen Tieres (Abbildung 2). Ein einzigartige Ausscheidungsorgane Kanal Phänotyp (Abb. 3A, B) erzeugte überexprimierenden eine apikale Membran verbunden-Molekül (ERM-1), wird verwendet, um einen gezielten RNAi-Bildschirm, um Gene funktionieren in der apikalen Membran zu identifizieren Ausführung zu veranschaulichen und Lumen Biogenese; Dies dient als ein Beispiel für eine molekulare und visuelle Analyse der polarisierten Membran Biogenese in diesem Modell (im Protokoll Abschnitt 2 beschrieben). Diese ERM-1 [++] Kanal Phänotyp wird verwendet, um wie visuell bewertet und Partitur Unterdrückung (Abbildung 3-D) und Verbesserung (Abbildung 3E-F) zeigen durch sezieren Fluoreszenz-Mikroskopie (im Protokoll Abschnitt 3 beschrieben) . Kanal-Phänotypen, die durch die Modulation der ERM-1-Spiegel zu dienen, zu zeigen, wie Defekte auf der subzellulären Ebene durch konfokale Mikroskopie (Abbildung 4) (beschrieben in Abschnitt 4 Protokoll) zu lösen und wie einfache Kanal-Phänotypen (Kanallänge und Zyste zu quantifizieren Größe) und apikale Membran Biogenese Mängel (Abbildung 5).
Abbildung 1 : Morphogenese von C. Elegans Excretory Canal und subzellulären Strukturen der Kanal
(A) schematische Darstellung der Ausscheidungsorgane Kanal Erweiterung (blaue Linien) während der Entwicklung des Embryos und Larve. Die Ausscheidungsorgane Zelle erreicht seine endgültigen Speicherort auf der linken Seite der Ventro-Lateral der hinteren Rachenraum Lampe Komma Stadium des Embryos (nicht dargestellt). Wie der Embryo verlängert, reicht es zunächst zwei Arme seitlich nach links und rechts; dann gabelt jeden Arm in einen vorderen und hinteren Zweig. Diese vorderen und hinteren Zweige reichen weiter im gesamten Dehnung des Tieres während vier Larvenstadien, zuerst holt das Tier Wachstum in der L2-Stadium, dann ihr weitere Wachstum bis ins Erwachsenenalter begleitet. De Novo polarisiert Membran Biogenese unterstützt diese Erweiterung bis ins Erwachsenenalter. (B) In das Erwachsene Tier erreichen die vorderen Kanal Zweigen die Nasenspitze und die hinteren Zweige, die Rute (blaue Linien). Die Ausscheidungsorgane Zellkörper ist in der Nähe der hinteren Rachenraum Lampe (blau) dargestellt. Polarisierte Membrandomänen werden im Erwachsenenalter beibehalten. (C) vergrößerte Ansichten von einem Kanalabschnitt Arm. Links: 3D Ansicht der Kanal zeigt: Basalmembran (schwarz), Zytoplasma (blau), lumenal Membran (grün) und das Lumen (weiß). Rechts: Innenansicht des Kanals und der Membranen: Basalmembran (schwarz), Zytoplasma (blau), Endosomen (gelbe ovale), canalicular Vesikeln (weiße Kugeln, verbunden mit jeweils anderen, verbunden mit dem Lumen oder isoliert einzelne Vesikel), apikale Membran (grün) und das Lumen (weiß). (D) Confocal/DIC Overlay Mikrographen der Ausscheidungsorgane Zelle in einem Embryo und die Ausscheidungsorgane Kanäle in eine Larve, gekennzeichnet durch lumenal gegen cytoplasmatische GFP bzw.. Linkes Bild: Ausscheidungsorgane Zelle (grün, Pfeil) in ein 1,5-facher Embryo mit Kanal Lumen visualisiert apikalen ERM-1::GFP unter der Erm-1 -Promoter zum Ausdruck zu bringen. Rechtes Bild: vier Ausscheidungsorgane Kanal Niederlassungen (grün, Pfeil) in L3-Larven, visualisiert durch den zytoplasmatischen Vha - 1P:: GFP. Skalieren von Balken = 20 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Visualisierung subzelluläre Komponenten in Wildtyp Ausscheidungsorgane Canal Armen durch doppelte Kennzeichnung mit fluoreszierenden Fusionsproteine
(A) das Zytoplasma von der apikalen Membran unterscheiden. Ausdruck der GFP unter der Sulp-5 Promoter visualisiert das Kanal Zytoplasma (grün, oben); Ausdruck der ERM-1::mCherry unter seinen eigenen Promotor visualisiert die apikale Membran (rot, Mitte); Zusammenführen von diesen Bildern (unten) unterscheidet zwischen Zytoplasma und die apikale Membran, die sonst nicht zu unterscheiden wäre durch einheitliche Kennzeichnung auch bei hoher Vergrößerung. Maßstabsleiste = 5μm. (B) bestimmen die räumliche Beziehung der Endosomal Vesikel, das Lumen. Visualisierung des Gefäßlumens durch eine apikale membranassoziierten GFP Fusionsprotein (Pseudo-gefärbt rot, oben); Visualisierung von Endosomal Vesikeln zum Ausdruck bringen, mCherry::RAB-7 (Pseudo-gefärbt, blau, Mitte); Verschmelzung dieser Bilder (unten) zeigt die relative räumliche Positionen der Endosomal Vesikel, das Lumen. Maßstabsleiste = 5μm. (C und D) Auflösen von Kanal Rohrformen versus subzelluläre Kanal Komponenten bei verschiedenen Vergrößerungen. Das Zytoplasma der L1-Larven ist beschriftet, GFP unter Sulp-5 Förderer und zytoplasmatischen canalicular Vesikel zum Ausdruck bringen den Wasserkanal AQP-8::mCherry unter der Aqp-8 Veranstalter zum Ausdruck zu bringen. (C) Bilder erworben bei niedriger Vergrößerung beheben eine "Perlen on a String"-Muster, Bühne-spezifische Krampfadern (Krampfadern sind Stauseen reichlich in canalicular Vesikeln und anderen Komponenten für Kanal Wachstum) entspricht, aber tun nicht lösen Sie zytoplasmatischen AQP-8 Puncta. (D) Bilder erworben bei höherer Vergrößerung lösen AQP-8 Puncta im Zytoplasma Kanal entspricht canalicular Vesikel. Maßstabsleisten: C 20 μm und 5 μm in D. Alle Tafeln zeigen konfokale Projektionen von jeweils 10 – 15 Abschnitte. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Scoring-Enhancer und Suppressors eine zystische Canal Phänotyp (ERM-1[++]) durch sezieren Mikroskopie
(A) ERM-1 [++]; Rol-6(su1006) exkretorischen Kanäle werden visualisiert, GFP unter Vha-1 Förderer zum Ausdruck zu bringen. Hinteren Kanäle zu erweitern, bis die Vulva oder Mitte Körper des Tieres (Pfeile; als Verlängerung 1/2) bei geringer Vergrößerung (1,5 X objektiven und niedrigen Zoom). (B) bei höherer Vergrößerung der Signatur ERM-1 [++] kleine zystische gekräuselte Kanal gelöst werden kann, mit der Spitze der hinteren Kanäle (ein Arm wird durch kleine Pfeil) Verlängerung bis nach der Vulva oder etwas weiter (Kanal Vulva wird durch große Pfeil; Lumen im Bedienfeld "D" kann als Wildtyp zum Vergleich betrachtet werden). (C) Unterdrückung, geringer Vergrößerung: länglich und dünne Kanäle in RNAi ERM-1 [++] Tiere behandelt. (D) bei höherer Vergrößerung, hinteren Kanäle sehen Sie fast vollständig ausgefahren, das Heck (kleine Pfeile im Vergleich zu derjenigen der Elterntiere, gezeigt im Bedienfeld "B"); großer Pfeil zeigt die Position der Vulva. (E) Verstärkung: weitere gekürzte Kanäle mit größeren Zysten in RNAi behandelt ERM-1 [++] Tiere; geringer Vergrößerung, kein Zoom. (F) bei höherer Vergrößerung, hinteren Kanal Erweiterung kann bestimmt als weniger als 1/2 (kleiner Pfeil) oder nicht erweitert werden bis hin zur Vulva (durch große Pfeil gekennzeichnet) und Zyste Größe wie von mehr als 1/3 des Tieres Breite (breiter als die des übergeordneten Tieres gezeigt (b). Skalieren von Balken = 400 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Visuelle Analyse der Ausscheidungsorgane Canal Morphologie und subzelluläre Kanal Komponenten in Mutant/RNAi Tiere durch konfokale Mikroskopie
(A – D) Ein vacuolar von eine zystische Kanal Phänotyp (konfokale/DIC überlagert, die Aufnahmen gezeigt werden) zu unterscheiden. (A) , die das Zytoplasma der Wildtyp Kanal visualisiert wird, zum Ausdruck bringen GFP unter der Sulp-5 Promoter (Pseudo-farbig Blau in der Unterscheidung von apikalen Membran etikettieren, gezeigt im Grün im Bedienfeld "B"). (B) die apikale Membran eines Wildtyp Kanals wird visualisiert, ERM-1::GFP zum Ausdruck zu bringen; Beachten Sie, dass Lumen nicht bei dieser Vergrößerung sichtbar, dass einzelne Kennzeichnung kann nicht von der Membran Etikettierung zytoplasmatischen unterscheiden. (C) Ausscheidungsorgane Kanal Phänotyp induziert durch RNAi: zytoplasmatischen Kennzeichnung nicht zytoplasmatischen Vakuolen von Intralumenal Zysten unterscheiden. (D) Ausscheidungsorgane Kanal Phänotyp induziert durch RNAi: apikale ERM-1::GFP Kennzeichnung erkennt Flüssigkeitsansammlung in das Lumen (lumenal) Zysten statt (zytoplasmatischen) Vakuolen (vergleiche Abbildung 4I für zytoplasmatischen Vakuolen) zu identifizieren. Maßstabsleiste = 40 μm für A – D, gezeigt in A. (E-J) analysieren Verlust und Gewinn-of-Function Auswirkungen auf subzellulärer Kanal Komponenten (konfokale Bilder der einzelnen Kanal Arme werden angezeigt). (E-G) Wirkung der Erm-1 RNAi auf der subzellulären Lokalisierung von Canaliculi. (E) Wildtyp Kanal Zytoplasma; Beachten Sie die GFP Ausgrenzung anzeigt Lumen. (F) Wildtyp cytoplasmatische AQP-8::GFP Puncta, entsprechend canalicular Vesikel. (G) Cytoplasmic und basalen Verschiebung der AQP-8::GFP Puncta erm-1(RNAi) Tier. (H) diskontinuierlich Lumen und Detail der Lumen Spitze Pathologie (Curling und Verlust des Zentrierens Lumen) in erm-1(mildRNAi) Tier siehe (3 für modulierende RNAi Stärke); Beachten Sie, dass die Spitze des Lumens, hier angedeutet durch kleine Zysten, dass Kanal Zytoplasma hinausragt. (I) zytoplasmatischen Vakuolen absondernde Kanal Körper ohne Kanal Erweiterung in stark betroffenen erm-1(RNAi) Tier3; Beachten Sie, dass ACT-5::GFP, das Lumen (mit Ausnahme von einigen kleinen Flecken rund um einige Vakuolen) nicht eingestellt ist. (J) Rekrutierung von überschüssigen ACT-5::GFP und AQP-8::mCherry, das Lumen in dreifach transgenen Tieres überexprimierenden ERM-1 (Hinweis dicken Gürtel von ACT-5::GFP und überlappenden AQP-8::mCherry Klumpen um die zystische Lumen). Maßstabsleiste = 5 μm für E-J, gezeigt in E. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Beispiele für Quantifizierung der Kanal Mängel sezierenden und konfokalen Mikroskopie
(A) schematische Darstellung der Wildtyp (obere Abdeckung) und Mutant zystische (untere Platten) Ausscheidungsorgane Kanäle für die Quantifizierung der Kanal Länge und Zyste Größe. Posterior Kanallänge wird als 0, 1/4, 1/2, 3/4 und 1 quantifiziert. Kanallänge '0' zeigt keine Verlängerung und '1' in voller Länge Verlängerung. Größe der Zyste wird quantifiziert, als < 1/3 (klein) und > 1/3 (groß) der Körperdurchmesser. (B) Quantifizierung der Brutto-Kanal Morphologie in Kontrolle und ERM-1 [++](RNAi) Tiere durch fluoreszierende sezieren Mikroskopie. Bei mock(RNAi) ERM-1 [++] Tieren ist der hintere Kanallänge ca. 1/2 in 95 % Tiere (Referenz-Bild, Bild 3A– B) erweitert. In Suppressor ERM-1 [++](RNAi) Tiere wird der hintere Kanallänge fast vollständig in 80 – 90 % Tiere (Referenz-Bild, Abbildung 3– D) erweitert. In Enhancer ERM-1 [++](RNAi) Tiere, ca. 60-70 % Kanäle haben große Zysten und kürzere Länge (< 1/2) (Referenz-Bild, Abbildung 3E-F). Datendarstellung als ± SD bedeuten (n > 3). (C) Quantifizierung der Fluoreszenzintensität des apikalen/lumenal Kanal Zytoskeletts von ImageJ aus konfokale Bilder. Der Kanal apikale Membran ist gekennzeichnet von ACT-5::GFP, Wildtyp Kanal Arm wird an der linken, ERM-1 [++] Kanal Arm, auf der rechten Seite angezeigt. Links Platten: Intensität der ACT-5::GFP in Wildtyp-Membran-Hülse ist etwa 50 (Wert/Membran grau, mit schwarzen und roten Pfeil angezeigt), Grundstück unter Bild gezeigt. Rechten Platten: Intensität des ACT-5::GFP in ERM-1 [++] ist über 100 (Grauwert des dorsalen Membran beträgt ca. 110 (schwarzer Pfeil) und ventralen Membran beträgt ca. 140 (roter Pfeil)), Grundstück unter Bild gezeigt. Skalieren von Balken = 5 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Tabelle 1: Beispiele von Markern für die C. Elegans Ausscheidungsorgane Kanalsystem Membran | ||||
Proteinnamen | Sub |
Tabelle 2: Beispiele für C. Elegans Excretory Kanal-spezifische Promotoren | ||
Promotoren | Ausdruck-Bühne | |
Erm-1 | Komma-Bühne-embryo | |
SULP-5 | 3-Fold embryo | |
VHA-1 | 2-Fold embryo | |
VHA-5 | 2-Fold embryo | |
AQP-8 | 2-Fold embryo | |
GLT-3 | späte embryo | |
1 Beispiele sind in Tabelle 3 aufgeführten Ressourcen entnommen. |
Tabelle 3: Ressourcen | |||||
Ressourcen zur Identifizierung von C. Elegans Ausscheidungsorgane Kanal-spezifische Moleküle, Kennzeichnung Reagenzien/Stämme und Antikörper | |||||
(1) Caenorhabditis Genetik Center (CGC)43 verfügbar Reagenzien und Stämme | |||||
2. Wormbase44 für Informationen über die Ausscheidungsorgane Kanal-spezifische Moleküle, Zerrungen und Antikörper | |||||
3. Informationen über Ausscheidungsorgane Kanal-spezifische Moleküle: siehe Referenz6 | |||||
(4) Transgeneome Webseite45 für Translationale GFP Fusion Konstrukte | |||||
5. C.elegans Ausdruck Muster46 für transkriptionelle GFP Fusion Konstrukte | |||||
6. nationale BioResource Projekt (NBRP)::C.elegans47 für Informationen über C. Elegans Mutanten und Promotoren | |||||
(7) Fluorophore: siehe Referenz48,49 | |||||
Web-basierte Ressourcen für die Montage der Moleküle für eine gezielte RNAi-Bibliothek | |||||
(1) GeneMANIA50 | |||||
(2) AceView51 | |||||
(3) iHOP52 | |||||
4. Wormbase44 | |||||
(5) Saccharomyces Genom Datenbank53 | |||||
6. Flybase54 | |||||
7. Maus Genom Datenbank-55 | |||||
8. menschliche Genom Datenbank56 | |||||
9. BLAST57 |
Tabelle 4: Beispiel für einfache Phänotyp Scoring-Blatt | |||||||
RNAi-Bibliothek | Stamm | Allgemeine Phänotyp (% insgesamt) | Kanal-Phänotyp | ||||
Kanal Länge < 1/2 (% L4) | Kanal Länge > 1/2 (% L4) | Anderen Kanal-Phänotyp | Gesamtzahl der Tiere gezählt | ||||
Platte Nr. | Auch Nummer | ||||||
I-1 | A1 | ERM-1 [++]; VHA - 1P:: GFP | CLR (30) | 80 | 20 | 100 | |
X-5 | B12 | gleichen | keine | 30 | 70 | 100 | |
III-10 | C5 | gleichen | UNC (54) | 70 | 30 | große Zysten | 100 |
C. Elegans genetische Flexibilität, Transparenz, einfache Körper Plan und invariante Zelle Abstammung machen es ein hervorragendes Modell für die Analyse der Morphogenese. Dieses Protokoll beschreibt, wie Sie kombinieren standard genetische Manipulationen und Bildgebung Studien nutzen die 2 Mikrometer dünn C. Elegans Ausscheidungsorgane Kanäle um polarisierte Membran und intrazellulären Lumen Biogenese in einer Einzelzelle Röhre zu studieren.
Kennzeichnung
Die C. Elegans Ausscheidungsorgane Kanäle können durch die Expression von fluoreszierenden Fusionsproteine, ermöglicht live-Analyse (hier beschrieben), oder durch Antikörper oder chemische Färbung (siehe begleitende Papier auf intestinale Tubulogenesis für Antikörper Färbung beschriftet werden 3). der Ausdruck von zwei oder mehr verschiedenen Fluorophore oder die Kombination dieser verschiedenen Techniken, Kennzeichnung ermöglicht eine hochauflösende visuelle Zerlegung von diesen dünnen Röhrchen (Abbildung 2). Fluoreszierende Fusionsproteine angewiesen, die Kanäle von einem bestimmten Kanal-Förderer sind die erste Wahl für die Ausscheidungsorgane Kanal Beschriftung aus verschiedenen Gründen, darunter: (1) die geringe Expression Ebenen viele Kanal-Proteine, und (2) den Kanal Feinstruktur, die leicht überwältigt von der Färbung außerhalb der Kanäle, wo das Protein des Interesses auch ausgedrückt werden kann. Auf der anderen Seite Kanäle reagieren empfindlich auf exogene Proteine und unspezifische Phänotypen (z. B.Erweiterung Mängel und Zysten oder sogar Letalität) leicht zu entwickeln als solche Proteine stark zum Ausdruck. Dies sollte in die Entscheidung wiegen, bei der Wahl zwischen verschiedenen Möglichkeiten zur Erzeugung transgener Tiere. Im Prinzip kann transgene als extrachromosomale Arrays (z.B.durch direkte Injektion von Plasmid DNA in die Gonade Keimbahn Transformation, wie hier beschrieben), eingebracht werden erzeugt in der Regel High-Kopie Nummer Arrays (oft mit hohen (Ausdruck), oder integriert in das Genom, in der Regel zu niedrig oder einzelne Kopienzahl (z. B.durch Bombardierung26 oder über einzelne Kopie Mos1-vermittelte Aufnahme [MosSCI]27). Extrachromsomal Arrays können auch integriert das Genom in einem zweiten Schritt (noch, jedoch bei einer hohen Kopienzahl)18. Auf der anderen Seite in die Keimbahn bei niedrigen Konzentration (z. B.1 – 2 ng/µL DNA, kombiniert mit einer höheren Konzentration der Marker-DNA) injiziert, sein niedrig (noch) Exemplar Nummer Arrays einfach generierten28. Dieses Szenario hat den Vorteil, dass DNA-Konzentrationen variiert werden können, die dazu beitragen können, den besten Ausdruck Ebene zum Kanal zu beschriften, weder zu niedrig noch zu hoch (giftig) zu finden. Das Verhältnis zwischen injizierten DNA-Konzentration und Ausdruck Ebene ist abhängig von mehreren Faktoren (z.B. der Projektträger) und muss somit empirisch ermittelt werden. Alternativ kann das gen des Interesses direkt mit einem Fluorophor in der Keimbahn von gruppierten regelmäßig eingestreut kurze palindromische wiederholt (CRISPR) basierte Kennzeichnung Verfahren29,30beschriftet werden. Obwohl dieser Ansatz der Fluorophor in den meisten physiologischen genomische Zusammenhang stellt, ist dies nicht immer notwendig oder sogar wünschenswert (z. B. wenn das Protein auf sehr niedrigem Niveau zum Ausdruck kommt). Kann es jedoch sein, die beste Option, zum Beispiel wenn das gen des Interesses sehr groß ist.
Kanal-Visualisierung kann erreicht werden, durch die Leitung transkriptionelle Konstrukte in den Kanal, der das Kanal Zytoplasma von einer Fluorophor hervorheben. Im Gegensatz dazu erfordert die Kennzeichnung subzelluläre Kanal Komponenten eine translationale Fusion, wo das Full-length-gen im Rahmen der Fluorophor Kodierung gen verbunden ist. Wenn einen Kanal spezifischen Promotor zum Ausdruck (anstatt der Promoter des Gens) verwenden, sollte seiner Wahl des Projektträgers Kraft und für die entwicklungspolitische Analyse, die Zeit ihres Ausdrucks beruhen. Viele Ausscheidungsorgane Kanal spezifischer Gene drücken nicht vor das Larvenstadium wird der Kanal osmotische Funktion kritisch; zu spät für die Analyse von seiner aktiven Ausbauphase (Erm-1 und Profis-1 sind frühe exprimierten Genen)10,13. Für Markierungen der Ausscheidungsorgane Kanal Endo- und Plasmamembranen und Kanal spezifische Promotoren Beispiele in Tabelle 1 und 2, bzw., und Ressourcen für die Suche nach zusätzlichen Kanal-spezifische Moleküle in Tabelle 3. Diese Ressourcen können auch verwendet werden, für die Suche nach einem bereits gemacht geeignet fluoreszierende Fusionsprotein, das möglicherweise durch das Caenorhabditis Genetik Zentrum vorhanden (CGC; siehe auch Tabelle 1). Um rekombinante Plasmide für den Ausdruck von solchen Protein Fusionen zu konstruieren, kann man verschiedenen Klonen Methoden, jeweils mit spezifischen vor- und Nachteile verwenden (an anderer Stelle erläutert14). Dazu gehören konventionelle Restriktionsenzym basierte Ansätze, die hier beschriebenen Klonen, modulare Klonen mit der multisite Gateway System31, Gibson Versammlung32oder Reporter-gen Bau von der "Nähte PCR"-Methode14 ,33. Diese unterschiedlichen Ansätze lässt sich anpassen an die Methode ausgewählt für ihre Einführung in die Keimbahn und/oder an andere Bedürfnisse (z. B. das vielseitige Gateway System erleichtert die Promotoren und cDNAs für größeren Maßstab Kennzeichnung Ansätze mischen) . Darauf zu achten, dass die korrekte Einstichstelle für das Fluorophor (Verknüpfung auf die N-im Vergleich zu C-Terminus des Proteins), unter Berücksichtigung der Funktion des Proteins des Interesses zu wählen.
Interferenzen mit Genfunktion
Als eine von vielen Möglichkeiten, die Genfunktion in C. Eleganszu belästigen beschreibt dieses Protokoll einen gezielte RNAi Interaktion Bildschirm entwickelt, um eine zystische Kanal Lumen Phänotyp, induziert durch überexprimierenden eine lumenal Membran-Komponente zu ändern. In diesem speziellen Fall eine apikale/lumenal Membran überexprimierenden verbundenen Marker wie ERM-1 hat den Vorteil die Untersuchung direkt an das gewünschte Ziel zu lenken: die Analyse der intrazellulären apikalen/lumenal Membran Biogenese. Ein Gain-of-Function-Phänotyp durch Überexpression erzeugt auch bietet gewisse Vorteile, wenn Sie mit einem Verlust der Funktion (RNAi) Interaktion Bildschirm kombiniert, wie hier beschrieben (siehe34 für die Erörterung von Verlust und Gewinn-of-Function-Analysen und die Design der genetischen Bildschirme). ERM-1 selbst ist übrigens ein gut untersuchten "Lumen Morphogenese" und apikale Membran Identität Molekül12. Daher dürfte in diesem Fall ein gezielte (anstatt unvoreingenommener) Bildschirm direkt informativ für Lumen Morphogenese und damit auch weitere kennzeichnende ERM-1 spezifische Funktion in diesem Prozess sein. Allerdings könnte ein unvoreingenommener ungezielte Bildschirm in ähnlicher Weise, entweder mit einem Wildtyp Tier, eines transgenen Tieres mit f ab durchgeführt werdenLuorescently exkretorischen Kanäle, beschriftet oder mit jedem Kanal Mutant. Die allgemeinen vor- und Nachteile von RNAi (z.B.im Vergleich zu Mutagenese) für die Generierung von Verlustfunktion Phänotypen und die Wärmeleitung und Diskussion der verschiedenen Arten von genetischen Bildschirme in C. Elegans werden an anderer Stelle diskutiert 34. RNAi produziert ein Spektrum von Phänotypen, mildere Phänotypen, einschließlich einen besonderen Vorteil für die Analyse der Gene oft tödliche Tubulogenesis. Dies wird beschrieben und diskutiert in den begleitenden Papier auf intestinale Tubulogenesis3. Verschiedene Ansätze, um Gewinn und Verlust der Funktion Mutanten und klassische genetische Verfahren wie Kreuze, generieren sind detailliert und in der Allgemeinen Genetik Methoden Literatur20diskutiert.
Mikroskopie und Auswertung von Tubulogenesis Phänotypen
Visuell auswerten und die Änderung des Phänotyps wohldefinierte Kanal unter einem Mikroskop mit einfachen scoring Parametern (z. B. Kanal und Lumen Durchmesser), sezieren, wie hier beschrieben Leuchtstofflampenlicht scoring können in kurzer Zeit erreicht werden auch bei der Verarbeitung von größeren Anzahl von Tieren gezielt oder systematische genetische oder RNAi-Bildschirm. Im Gegensatz dazu einen ähnlichen Bildschirm auf der Suche nach neuartigen Kanal Morphogenese Phänotypen in einem Stamm, der Wildtyp ist (außer für die Kanal-Kennzeichnung Transgen), wird mehr Zeit in Anspruch, sondern kann im Prinzip auf die gleiche Weise durchgeführt werden (wir haben durchgeführt, so ein Bildschirm auf einer genomweiten Basis in einigen Monaten). Solche Bildschirme werden mehrere verschiedene Kanal-Phänotypen (hier nicht dargestellt) zu identifizieren und deshalb entwickeln müssen entsprechend verschiedene scoring Parameter, z. B., eine qualitative Klassifizierung Schema (siehe 9,11, 35,36,37,38 für verschiedene Möglichkeiten, um Kanal Phänotypen zu erzielen, indem sezieren Mikroskopie). Jeder Kanal Phänotyp zu interpretieren, ist es wichtig zu beachten, dass Zystenbildung kann eine unspezifische Wirkung von vielen verschiedenen Beleidigungen auf diese dünnen röhrenförmigen Struktur, und es oft eine weniger informativ terminal Phänotyp ist. Zyste Größe und Lage, auf der anderen Seite, informativ, möglicherweise z. B., eine Zyste in der Nähe der Kanal-Zelle (zu Beginn des Kanal-Erweiterung), Zysten entlang des Kanals oder Zysten am Kanal Tipps liefern Hinweise auf die zugrunde liegenden Mechanismus der Mängel. Kanal-Zysten (hier definiert als Intra-lumenal Flüssigkeit gefüllten Sphäroide, umgeben von einer apikalen/lumenal Membran) sollte von Vesikeln unterschieden werden (kleine cytoplasmatische Membrane-springen Flüssigkeit gefüllt Sphäroide) oder Vakuolen (erweiterten cytoplasmatische Membrane-springen Flüssigkeit gefüllten Sphäroide), nicht von einer lumenal Membran, die alle Blick oberflächlich identisch (Abb. 4A-D) umgeben. Zytoplasmatischen Vakuolen können auch sekundär, z. B.über toxische Wirkungen von Befestigungslösungen (Natriumazid) entstehen. Sowohl große Zysten und zytoplasmatischen Vakuolen können Sie fast die Größe des Tieres, und müssen weiter vom klassischen unterschieden werden "löschen (Clr)" Kanal Phänotyp, die durch Ansammlung von Flüssigkeit in die Körperhöhle verursacht wird. Zu guter Letzt muss Kanallänge fast immer sekundär in zystische Kanäle beeinträchtigt wird, daher ein wahre Kanal Erweiterung defekt frei inmitten der Zyste nachgewiesen werden.
Trotz ihrer winzigen Durchmessern subzelluläre Komponenten der Ausscheidungsorgane Kanäle, wie z. B. apikalen versus basalen Membranen, intrazelluläre Endosomal versus canalicular Vesikel, intrazellulären Organellen und Zytoskeletts Komponenten visualisiert werden durch höhere Vergrößerung, z.B.konfokalen Mikroskopie (Abbildung 2, Abbildung 4). Durch konfokale Bildgebung ist eine GFP-positiven Kanal Zytoplasma allein ausreicht, um das Lumen von Kanal Zytoplasma über eine nicht-fluoreszierende (Abb. 2A, Abbildung 4E) zu unterscheiden. Die Identität der Markierungen trägt zur Lösung canalicular aus Endosomal Vesikel (auch auffallend unterschiedlicher Größe), obwohl die endgültige Aufteilung Immunoelectronmicroscopy39benötigen. Doppelte und dreifache Beschriftung bestimmen die subzelluläre Lokalisation ein Molekül des Interesses und das Verhältnis von subzelluläre Komponenten zueinander (Abbildung 2). Single beschrifteten lumenal Kanal Membranen produzieren die gleichen Doppellinie als Zytoplasma oder der Basalmembran, aber unterschieden werden über doppelt oder dreifach-Kennzeichnung. Für die konfokale Analyse ordnungsgemäße Montage ist wichtig, angesichts der Fragilität des Kanal-Struktur, seine Sensibilität für osmotische Veränderungen und die Verletzlichkeit seiner häufigsten zystische Phänotyp. Zysten platzen leicht osmotische Veränderungen oder körperlichen Druck, reagieren empfindlich auf Membran Giftstoffe wie Natriumazid und sind auch empfindlich auf einige Anästhetika zur Immobilisierung (das auch zytoplasmatischen Vakuolen produzieren kann). In unseren Händen funktioniert 5 % Lidocain in M9 Puffer am besten für die Ausscheidungsorgane Kanal Assays. Bildgebende Verfahren und alle Handhabung sollte sanft, werden wie beschrieben. Um Artefakte zu vermeiden, die Phänotypen (z.B., Zysten und Vakuolen) zu imitieren, empfiehlt es sich, Bilder sofort nach der Montage zu erwerben. Wenn das nicht möglich ist, sollte zunächst Zyste Bilder erworben werden, vor anderen Phänotypen imaging. Dieses Protokoll beschreibt standard Scan konfokalen Mikroskopie, die bietet überlegene Confocality, verglichen mit spinning Disk konfokalen Mikroskopie, die im Gegensatz dazu reduziert Phototoxizität und die Mikroskopie der Wahl für die Analyse der dynamischen Veränderungen von subzelluläre Komponenten im Laufe der Zeit. Solche Fragen auf subzellulärer Dynamik können auch durch Immunofluoreszenz Techniken oder Kennzeichnung Fusionsproteine mit Foto-schaltbare Fluorophore, die Farbe40ändern behoben werden. Zu guter Letzt das Spektrum der Auflösung kann weiter erhöht werden durch Hinzufügen von Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM, Bereitstellung der höchsten strukturellen aber nicht molekularen Auflösung), super-Auflösung Mikroskopie (Bereitstellung von molekularer Auflösung im Nanometerbereich); oder Immunoelectronmicroscopy (vorausgesetzt beide)39,41. 3D Computertomographie mit TEM Schnittserien kombinierbar und eignet sich besonders für die Analyse der Schnittstelle canalicular Plasmamembran Ausscheidungsorgane Kanäle9,10. Verbesserte Techniken für diese verschiedenen Arten der Mikroskopie und Kombinationen dieser verschiedenen bildgebenden Ansätze weiter entwickelt werden.
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Wir danken M. Buechner (University of Kansas, Kansas, USA), K. Nehrke (Medical Center der Universität von Rochester, Rochester, New York, USA) und dem Caenorhabditis Genetik Center, gefördert durch die National Institutes of Health, Office of Research Infrastructure Programme (P40 OD010440). Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse des NIH GM078653, MGH ist 224570 und SAA-223809, V.G.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cloning | |||
Plasmid pPD95.75 | Addgene | Cat. No. 37464 | |
PCR Kit | Qiagen | Cat. No. 27106 | |
Ligation kit | New England Biolabs | Cat. No. E2611L | |
DNA marker | Thermo Scientific | Cat. No. SM1331 | |
Agarose DNA grade | Fisher Scientific | Cat. No. BP164-100 | |
Competent cells | New England Biolabs | Cat. No. C2987H | |
Tris | Fisher Scientific | Cat. No. BP154-1 | |
EDTA | Sigma | Cat. No. ED-1KG | |
Acetic acid | Fisher Scientific | Cat. No. A38S-500 | |
Ethidium bromide | Fisher Scientific | Cat. No. BP1302-10 | |
Equipments | |||
PCR machine | MJ Research | Cat. No. PTG-200 | |
Centrifuge | Eppendorf | Cat. No. 5415C | |
Water Bath | Precision Scientific | Cat. No. 666A3 | |
Gel running instrument | Fisher Scientific | Cat. No. 09-528-165 | |
Gel running power supply | Fisher Scientific | Cat. No. 45-000-465 | |
Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | Cat. No. 1708195EDU | |
Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | Cat. No. ND1000 | |
C. elegans related1 | 1see reference19 for standard C. elegans culture and maintenance procedures. | ||
LB Medium and plates2 | 2see reference19 for protocols. | ||
Tryptone | Acros Organics | Cat. no. 611845000 | |
Yeast Extract | BD Biosciences | Cat. no. 212750 | |
NaCl | Sigma | Cat. no. S7653 | |
Bacto Agar | BD Biosciences | Cat. no. 214040 | |
Ampicillin | Sigma | Cat. no. A0116 | |
Tetracycline | Fisher Scientific | Cat. no. BP912 | |
M9 Medium2 | 2see reference19 for protocols. | ||
NaCl | Sigma | Cat. no. S7653 | |
KH2PO4 | Sigma | Cat. no. P0662 | |
Na2HPO4 | Sigma | Cat. no. S7907 | |
MgSO4 | Sigma | Cat. no. M2773 | |
NGM plates 2 | 2see reference19 for protocols. | ||
NaCl | Sigma | Cat. no. S7653 | |
Peptone | BD Biosciences | Cat. no. 211677 | |
Tryptone | Acros Organics | Cat. no. 611845000 | |
Bacto Agar | BD Biosciences | Cat. no. 214040 | |
MgSO4 | Sigma | Cat. no. M2773 | |
CaCl2 | Sigma | Cat. no. C3881 | |
Cholesterol | Sigma | Cat. no. C8667 | |
K2HPO4 | Sigma | Cat. no. P3786 | |
KH2PO4 | Sigma | Cat. no. P0662 | |
RNAi plates3 | 3see reference21 for protocols. | ||
NaCl | Sigma | Cat. no. S7653 | |
Peptone | BD Biosciences | Cat. no. 211677 | |
Tryptone | Acros Organics | Cat. no. 611845000 | |
Bacto Agar | BD Biosciences | Cat. no. 214040 | |
MgSO4 | Sigma | Cat. no. M2773 | |
CaCl2 | Sigma | Cat. no. C3881 | |
Cholesterol | Sigma | Cat. no. C8667 | |
K2HPO4 | Sigma | Cat. no. P3786 | |
KH2PO4 | Sigma | Cat. no. P0662 | |
IPTG | US Biological | Cat. no. I8500 | |
Carbenicillin | Fisher Scientific | Cat. no. BP2648 | |
NaOH | Fisher Scientific | Cat. no. SS266-1 | |
Sodium hypochlorite | Fisher Scientific | Cat. no. 50371500 | |
Bacteria | |||
OP50 bacteria | CGC | ||
HT115 bacteria | CGC | ||
Genome-wide RNAi libraries | |||
Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref21,58,59) | Source BioScience | ||
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref60) | Source BioScience | ||
Imaging related | |||
Lidocaine | MP Biomedicals,LLG | Cat. no. 193917 | |
Materials | |||
Vacuum Grease Silicone | Beckman | Cat. no. 335148 | |
Microscope slides | Fisher Scientific | Cat. no. 4448 | |
Tissue culture plate, 6 well | Corning Inc. | Cat. no. 08-772-33 | |
Equipment | |||
SMZ-U dissecting microscope (Nikon) | |||
SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions). | |||
TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem) | |||
C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon) |
Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden
Genehmigung beantragenThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten