В C. elegans Excretory канал как модель для внутриклеточного люмен морфогенеза и In Vivo поляризованной мембраны биогенеза в одной ячейке: маркировка GFP-расплавы, RNAi взаимодействие экрана и изображений

В C. elegans выделительной канал является уникальный одноячеечной модели для анализа визуальных в vivo биогенеза de novo поляризованной мембраны. Этот протокол описывает сочетание стандартных генетических/RNAi и изображений подходы, пригодных для идентификации и определения характеристик молекул, направляя одноклеточные tubulogenesis и апикальном мембрана и Люмене биогенеза.

Четыре C. elegans выделительной каналы являются узкие трубки продлен через длину животного из одной клетки, с почти одинаково далеко расширенной внутриклеточных endotubes, что строить и стабилизировать люмен с мембраной и submembraneous Цитоскелет апикальной характера. Выделительной ячейки расширяет его длина около 2 000 раз для создания этих каналов, делая эта модель уникальной в естественных условиях оценки de novo поляризованной мембраны биогенеза, внутриклеточный люмен морфогенеза и одноклеточные tubulogenesis. Протокола, представленные здесь показано, как объединить стандарта маркировки, выгоды и потери из функцию - генетических или РНК-интерференции (RNAi)-и микроскопический подходы использовать эту модель для визуально анализировать и функционально анализа этих процессов на молекулярном уровне. Как пример маркировки подхода Протоколе излагаются поколения трансгенных животных с флуоресцентные синтез белков для живой анализа tubulogenesis. Как пример генетического подхода в нем освещаются ключевые моменты визуальный РНК-интерференции на основе взаимодействия экран предназначен для изменения фенотипа кистозных канал усиления функции. Конкретные методы, описанные в как: ярлык и визуализировать каналов, выражая флуоресцентных белков; построить библиотеку целевых RNAi и выработать стратегию RNAi скрининг для молекулярного анализа канал морфогенеза; визуально оценить изменения канала фенотипов; Оценка их путем рассечения микроскопии флуоресцирования; характеризуют канал субцеллюлярные компоненты с более высоким разрешением, confocal микроскопии; и количественно визуальных параметров. Этот подход полезен для следователя, кто заинтересован в использовании преимуществ в C. elegans выделительной канал для выявления и классификации генов, участвующих в филогенетически сохранены процессах внутриклеточного просвета и одноклеточные трубка морфогенеза.

Все внутренние органы состоят из трубок, решающее значение для их много разных функций, таких как транспорта и обмен газов, жидкостей и питательных веществ и выведение метаболических отходов. Их поляризованный характер, с собственный апикальной и lumenal мембраны, приспособлен для этих конкретных функций, и дефекты в биогенеза их систем эндо - и плазматической мембраны являются частой причиной человеческих болезней^1,2. Большинство трубок сосудистую и внутренних органов многоклеточных и формируют просвет intercellularly; Однако одноклеточными трубок, которые формируют просвета внутриклеточно, можно например, представляют столько, сколько 30 – 50% человеческого капиллярные кровати². Поляризованной мембраны multi - и одноклеточные трубы похожи в составе, хотя их microdomains могут различаться в зависимости от трубки определенной функции (например, выделительной канал канальцев против кишечных микроворсинки в Caenorhabditis Элеганс; сопроводительный документ на кишечные нематоды Caenorhabditis elegans tubulogenesis см)³. Среди размером сохраняются принципы биогенеза поляризованной мембраны и tubulogenesis, и подобные молекулярные машины направляет их^1,2,4.

C. elegans выделительной системы состоит из пяти ячеек: выделительной клеток (EC), проток клетки (DC), поры клеток (PC) и две железы клетки. Аблация EC, DC или PC приводит к накоплению жидкости в полости тела и животные умирают в начале личиночной стадии⁵. Интригующе, эти три одноклеточными трубки создать их люмен тремя различными способами: клеткой раздалбывают (EC); ячейки обертывания в сочетании с autocellular стыке формирования (PC); и путем обмотки клеток в сочетании с autofusion (DC); различные механизмы люмен морфогенеза, которые являются все филогенетически сохраняется^6,7. EC, расположенный на левой боковой стороне задней глотки колбы, отправляет два боковых расширений из которых четыре каналов разветвляются продлить кпереди и кзади (на правой и левой стороне) в кончик носа червя и хвост , соответственно (рис. 1)^5,6,8. ЕК простирается от примерно 1 мкм 2 x 1000 мкм, что делает его крупнейшим ячейки в животное. На субклеточном уровне выделительной канал представляет собой простой трубку, созданный из базальной мембраны направлена на pseudocoelom и туннель lumenal мембраны (endotube). Канал lumenal мембраны подключается воздуховод lumenal мембраны на его только межклеточные соединения; в противном случае каналы junctionless вдоль их длины (рис. 1). Lumenal мембрана выделительной канала и его submembraneous цитоскелета верхушечный, определяется их молекулярного состава, напоминающее состав апикальной мембраны и submembraneous цитоскелета многоклеточных трубок, как кишечник, и другие (например, плоские) эпителия. Цитоплазматических органелл, включая от англ везикулярный и другие (например, Гольджи) endomembranes распределяются по длине канала. Кроме того несколько канальцев везикулы - либо подключен к lumenal мембраны, взаимосвязаны или изолированные - являются многопоточными через канал цитоплазме^7,8,9,10 . Это динамическое подключение плазмы мембраны/канальцев далее расширяет канал мембранной системы и способствует как люмен морфогенеза и осморегуляция¹⁰. Выделительной канал таким образом почти полностью состоит из эндо - и плазменных мембран, обеспечивая отличную модель для анализа биогенеза поляризованной мембраны и регулирование Эндо-интерфейсу плазматической мембраны. Резкое расширение апикальной мембраны в ходе морфогенеза канал - в этой системе одноклеточных совпадающих с расширением люмен – также позволяет анализировать архитектурных проблем необходимость стабилизации и центра внутриклеточного lumenal мембрана . Этот протокол сосредоточена на анализе канала трубки и Люмене в структурной морфогенеза и внутриклеточные мембраны динамика, необходимые для этого процесса, а не на сигналы, которые направляют ячейки движения, которые генерируют позиции ЕС в выделительной системы и построить его сложные соединения другие клеточные элементы (обзор в⁶).

Еще одним преимуществом C. elegans одноклеточных канал системы для анализа поляризованной мембраны и внутриклеточных люмен биогенеза является его способность отделить, путем развития время поколения различных компонентов своих мембран и развязок. ЕК рождается во время закрытия брюшной и оседает Вентро боков глотки в середине эмбриогенеза^5,6,8, во время которого времени боковой канал расширение и ветвление возникают. Это сопровождается расширением передний задний канал во время позднего эмбриогенеза, процесс, который продолжается в L1-личиночной стадии (рис. 1). В только что вылупившихся личинок кончик заднего канала достигает примерно в середине червь, полностью расширения к хвосту в конце этапа L1, после чего канал удлиняется наряду с червь⁸. Рост активного канала со скоростью, превышающей животного роста таким образом заканчивается на первом личиночной стадии, однако, дальнейшего роста происходит параллельно с ростом всего животного в течение дополнительных личиночной стадии (L2-4). Этот параметр обеспечивает возможность анализировать различные шаги de novo поляризованной мембраны биогенеза независимо от поляризации деление клеток или миграции. Кроме того он допускает разделение этого процесса от Ассамблеи узлов (которые встречаются в эмбриона до инициации люмен); их точное требованием в поляризацию мембраны по-прежнему является открытым вопросом в области полярности. Наконец он однозначно отделяет апикальной от базальной мембраны экспансии, последний процесс, предшествующий бывший в выделительной каналов¹⁰. В C. elegans выделительной канал модель является поэтому особенно информативным дополнением к кишечной модель, которая разделяет ряд этих преимуществ для анализа биогенеза поляризованной мембраны, но выполняет его в многоклеточных обстановке (см. сопроводительный документ на кишечную tubulogenesis³).

Хотя одичал тип каналов ультратонких трубочки в этой крошечной червя, их люмен может быть visualized непосредственно на Номарски оптики в этой прозрачной животного. В самом деле морфологии мутант кистозных канал может быть охарактеризована в непомеченном животных, с использованием малое увеличение рассекает микроскопии, который был использован для большой эффект в вперед генетических экраны для идентификации генов, участвующих в tubulogenesis¹¹. Улучшенная визуализация морфология каналов и различия их поляризованной мембраны, цитоскелетных компонентов, различных внутриклеточных органелл и других внутриклеточных структур, однако, требует маркировки и выше мощность люминесцентных рассечения и конфокальная микроскопия. Хотя по каналам тонкой структуры создает ряд трудностей для маркировки и микроскопии, мембраны и субцеллюлярные компоненты можно выделить через конкретных молекул, уникальные для каждого отсека, и животные могут безопасно установлены для микроскопии, если меры предосторожности во избежание введения артефакты (см. протокол и обсуждение). Маркировка может быть сделано по иммуногистохимия в фиксированных образцов, или путем создания трансгенных червей, выражая флуоресцентные синтез белков под их собственным контролем или выделительной промоутеров канал специфичные для изображений в естественных условиях . Этот протокол описывает последний метод маркировки (см. сопроводительный документ на кишечную tubulogenesis для антитело пятная³).

Способность сочетать в vivo исследований или получить из функция потерь с в vivo imaging анализ на одну ячейку уровень на протяжении всего развития делает в C. elegans выделительной канал особенно строгую модель для молекулярных и Сотовый анализ одноклеточные tubulogenesis. Прямого или обратного генетического экраны могут быть выполнены начиная с одичал тип или помечены трансгенных животных, чтобы определить канал морфогенеза фенотипов (например, кисты) и их основные дефекты гена. Кроме того такие экраны можно начать с мутант фенотип (например, кистозный канал) и идентифицировать Подавители или усилители этот фенотип для идентификации генов, которые функционально взаимодействуют с геном, вызывая фенотипом мутанта. Может вызвать генетический дефект, вызывая фенотипом мутанта прибыли или убытка (например, через удаление ген) (например, через активирующих мутаций или через введение избыточного гена копий) исследуемой функции. Вперед, мутагенеза или систематического RNAi экраны без предубеждений на функции гена и объективной идентификации генов, вовлеченных в функции интерес. Учитывая наличие генома общесистемной RNAi кормления библиотек почти каждый ген может быть легко сбит RNAi в C. elegans, таким образом, что любой одного гена интереса или любой группы генов (например, в целевых экраны) могут также быть быстро исследован для их эффекта обратной генетики подход. Чтобы продемонстрировать возможно сочетание подходов, мы здесь описать целевой экран взаимодействия РНК-интерференции, начиная с кистозным выделительной канал усиления функции мутант, помечены цитоплазматических канал зеленого флуоресцентного белка (ГПУП). Мутант фенотип порожденных гиперэкспрессия erm-1, высоко сохранены C. elegans ortholog мембраны актина компоновщика семьи Эзрин-Radixin-Moesin (ERM), который был вовлечен в просвете морфогенеза и мембраны Организация в многих видов¹². C. elegans ERM-1 локализуется в lumenal мембраны внутренних органов, например выделительной канал и кишечника и необходим для формирования Люмене в обоих¹³. ERM-1 гиперэкспрессия новобранцев избыток актина и везикулы канал lumenal мембраны, увеличение потока в просвет и генерации короткий кистозных канал и гофрированные lumenal мембраны с утолщенными актина подшерсток⁹. Протокол описывает способы создания трансгенных штаммы с выделительной выразил канал помечены синтез белков (или другие белки); как выполнить целевые RNAi экраны, начиная с таких штаммов, определить модификаторы канал фенотип; и как визуально анализировать результаты таких экранов путем рассечения и конфокальной микроскопии флуоресцирования, включая простые способы для количественного определения информативный tubulogenesis фенотипов. Альтернативные методы и детали интерференции, часто смертельным tubulogenesis генов, с учетом можно найти в сопроводительный документ на кишечную tubulogenesis³. Все методы могут использоваться в различных сочетаниях для расследования других вопросов на канал tubulogenesis.

1. Маркировка на канал Excretory C. elegans флуоресцентные белки Fusion ¹⁴

Примечание: увидеть сопроводительный документ на кишечную tubulogenesis ³ для маркировки в situ антитело пятная процедуры адаптации в выделительной канал. Таблица 1 примеры молекул, доказано полезным для визуализации C. elegans выделительной канал эндо - и плазменных мембран, Таблица 2 примеры промоутеров вождения выражение в выделительной канал, смотреть и Таблица 3 ресурсов для более всеобъемлющей коллекции маркеров и промоутеров, включая ссылки, обсуждают выбор различных флуорофоров.

1. Строительство плазмид конкретных флуоресцентные маркер ткани, энзима ограничения на основе клонирования ¹⁵
   Примечание: Смотрите обсуждение альтернативных методов строительства Флуоресцентный синтеза белков.
   1. Определить последовательность промоутер (для transcriptional сплавливания) или весь ген интереса с его промоутер (для трансляционного сплавливания) в WormBase ⁴⁴.
      Примечание: для промоутеров, около 1 – 3 kilobase (КБ) является достаточным для большинства C. elegans генов. Переводческая фьюжн белки также могут быть построены, поместив ген интереса по конкретной промоутера выделительной канала (см. таблицу 2).
   2. Дизайн-вперед и назад грунтовки для амплификации промоутер (для transcriptional сплавливания) и/или полный геном с промоутером (для трансляционного слияния). Добавить линкеры энзима ограничения на 5 ’ и 3 ’ концах праймеров.
      Примечание: Выберите энзимов ограничения, которые присутствуют в вектор плазмиды (например, pPD95.79) ¹⁶. Для трансляционного сплавливания, 3 ’ компоновщика должны разрабатываться таким образом, чтобы после Пищеварение энзима ограничения и перевязки с вектором, вставка кодон кадр будет непрерывно кодонов Флюорофор, например, GFP. Может понадобиться добавить 1 или 2 больше баз в типичном энзима ограничения линкеры ¹⁴; заботиться, чтобы не создавать стоп-кодон.
   3. Выполнять полимеразной цепной реакции (ПЦР) для того чтобы усилить промоутер или полноразмерные гена, используя живые черви или одичал тип геномной ДНК или cDNA как шаблон ¹⁵.
      Примечание: При использовании червей как шаблон, сначала лизируют червей в лизис буфера (буфер ПЦР плюс протеиназы K) ¹⁷. Черви смешанные стадии может использоваться как шаблон. Голодная червей может использоваться для предотвращения загрязнения с бактериальной ДНК.
   Электрофорез на продукты PCR для определения правильного размера усиливается продукта геля
   4. выполнять агарозы (1%).
      Примечание: Если установлен правильный размер группы, приступайте к следующему шагу. Если создаются несколько полос, улучшить условия усилители для производства одной полосы. Если это не работает, вырезать правильную группу из геля и очистить ДНК, стандартные методы ¹⁵ и затем приступить к следующему шагу.
   5. Выполнять ограничение дайджест на продукт PCR и вектор плазмиды, содержащий Флюорофор (например, pPD95.79) в отдельных труб, стандартные методы ¹⁵.
   6. Отдельные переваривается ННО электрофорезом геля и элюировать продукт PCR и векторные ДНК полос в отдельных труб.
   7. Очистить ННУ из ломтиков геля на стандартные методы ¹⁵. Измерять концентрации ДНК, спектрофотометр.
   8. Перевязать продукт PCR и векторные ДНК стандартными методами и превратить сведущие клетки рекомбинантных ДНК, стандартные методы ¹⁵.
   9. Распространение 10 мкл, 50 мкл и 100 мкл трансформированных клеток на три отдельных пластины бульоне Лурия (LB), дополнены 50 мкг/мл ампициллин.
      Примечание: Распространение различное количество клеток на различных пластин для спектра эффективность преобразования. Например, покрытие слишком плотно не может разрешать изоляции колоний если преобразование является эффективным,.
   10. Инкубировать пластины при 37 ° C на ночь. Следующее утро, вывезти пластин из инкубатора.
       Примечание: Если колонии очень малы, Проинкубируйте несколько больше часов.
   11. Подготовка плазмида ДНК из одного колоний на стандартные методы ¹⁵. Mix ДНК шаблонов и капсюли и отправить для последовательности (обычно выполняется в центр обслуживания ключевых).
   12. Чтения последовательности и проверить целостность конструкции фьюжн.
       Примечание: критическая: подтвердить правильные кодон кадр между вставленной гена и флуоресцентных маркеров генов для перевода сплавливания. В идеале последовательности весь ген для подтверждения, что не мутация была введена во время процедуры ПЦР и перевязка.
   13. Генерировать больше плазмида ДНК (с помощью шаг 1.1.11) для инъекций для шага 1.2.
2. Поколения трансгенных животных путем микроинъекции ДНК для преобразования микрофлорой ¹⁸
   Примечание: смотрите обсуждение альтернативных методов для введения трансгенов. Изложил процедуры могут использоваться для создания трансгенных животных, которые осуществляют синтез белка флюоресценции или любые другие протеина интереса. К примеру экзогенных белка могут быть вновь введены (например, гетерологичных ortholog) или эндогенного белка может быть вновь (например, в своих соответствующих микрофлорой мутант для спасения) или оверэкспрессировали для генерации фенотип (например, инъекции erm - 1 был используется для создания гиперэкспрессия кистозных канал фенотип, который служит в качестве целевого для модификации на экране взаимодействия РНК-интерференции, описанных ниже).
   1. Микс конструкции ДНК (1 – 50 нг/мкл) с маркером плазмидной ДНК (обычно 100 нг/мкл), например доминирующим маркер rol-6 (su1006) (см. 1.2.3 для параметры маркера).
      Примечание: критическая: концентрации ДНК вводят должна определяться эмпирически, чтобы избежать введения артефакта фенотипов (кисты, расширение дефекты, летальность) когда выражая генов в выделительной каналы, которые являются особенно чувствителен к экспрессии трансгенов. Можно например, сделать несколько смесей плазмид в концентрации 1 нг/мкл и 10 нг/мкл, 50 нг/мкл, 100 нг/мкл с 100 нг/мкл rol-6(su1006) для тестирования диапазон концентраций для создания жизнеспособных штамма с желаемый выражение или фенотип (высокие концентрации могут быть специально не токсичен для канала морфогенеза и может быть смертельным).
   2. Фильтр ДНК смесь через фильтр трубки центрифуги спин x 0,22 μm (микрометр) поры размер.
      Примечание: Не закрывайте крышку трубки избежать пыли, которая может блокировать иглы микроинъекции.
   3. Microinject рекомбинантных плазмид в Гонада одичал тип или мутант червей стандартными методами для преобразования микрофлорой (см. ¹⁸ ссылку подробности процедуры).
      Примечание: Стандартный маркер плазмид являются, например: rol-6(su1006), dpy-20, unc-119, pha-1. Доминирующей трансгенов как rol-6(su1006) вводятся в дикого типа червей, тогда как спасение трансгенов вводятся в их соответствующих мутантов. Плазмиды маркера совместно вводят для легкого обслуживания трансгенных линий, поскольку нехромосомной трансгенов случайно потеряны во время деления клеток (см. 1.2.8). При внутривенном введении гены, кодирующие Флюорофор расплавы, также можно использовать Флюорофор, GFP, себя как маркер. ROL-6 индуцирует червей катиться вокруг себя, которые часто является выгодным для оценки морфогенеза фенотипов.
   4. Передачи вводят червей на Escherichia coli посеян нематода среднего роста (НГМ) плиты (например, 5 червей/пластина) (см. ссылку ¹⁹ для стандартных C. elegans культуры и технического обслуживания и Таблица материалов).
   5. Инкубировать пластины и пусть потомства развивать при 20 ° C около 3 д
   6. Изучения потомства F1 под микроскопом рассечения рол (прокатки) червей (или любые другие конкретные инъекции маркер, например, GFP) и выбрать ролики to отдельных пластин.
   7. Выберите пластины с прокатки животных F2 и подтвердить наличие флуоресценции под микроскопом рассечения флуоресцирования (обычно все животные, роликовые, GFP положительных).
      Примечание: F2 ролики указывают успешный поколения трансгенные линии. Отдельные линии могут быть различными, например, что касается трансген скорость передачи. Поэтому полезно сохранять и хранить несколько линий.
   8. Поддерживать трансгенных линий, обогащая новые пластины для маркера инфицированных животных.
      Примечание: Вводят ДНК является частью микрофлорой как нехромосомной массив. Скорость передачи данных для нехромосомной массивы являются переменными, но обычно около ~ 50%. Чтобы не потерять деформации, поэтому важно вручную обогатить линии с доминирующим маркеров (например, строки, не обеспеченных негативный выбор).
   9. Заморозить трансгенных линий стандартных методов замораживания, для длительного хранения-80 ° C ¹⁹.
      Примечание: Трансгенов на нехромосомной массивы также могут быть интегрированы в микрофлорой, УФ-облучения в дополнительный шаг для получения однородной линии ¹⁸. К примеру, erm-1 была интегрирована в микрофлорой, УФ-облучения для получения штамма ERM-1 [++] fgIs2[erm-1p::erm-1;rol-6p::rol-6(su1006)] где каждое животное несет в себе трансген, требование для его использования в РНК-интерференции на основе взаимодействие экрана, описанные ниже. Этот штамм был дополнительно обозначены цитоплазматических выделительной канал GFP через пересечение в штамм, содержащие vha-1 p:: GFP трансген (порожденных теми же процедурами, как указано выше; см. ссылку ²⁰ для основных генетических процедуры, такие как кресты) и называется ERM-1 [++]; VHA-1 p:: GFP штамм ниже.

2. Строительство целевой библиотеки RNAi и дизайн экрана взаимодействия РНК-интерференции для изменения канала фенотип

Примечание: экран целевой основе RNAi генетических взаимодействие описан, использующий гиперэкспрессия фенотип кистозных канал для Поиск для взаимодействия генов морфогенеза выделительной канал. ERM-1 [++] штамм (см. шаг 1.2.9) служит пример ⁹. Этот подход представляет только один из многих возможных подходов для генетического анализа выделительной канал люмен морфогенез (см. представление и обсуждение других генетических подходов). Увидеть сопроводительный документ на кишечную tubulogenesis ³ и ссылки ^{17 , 21 , 22} для фона на РНК-интерференции, детали RNAi процедуры, модуляция RNAi прочности (с учетом часто смертоносного tubulogenesis генов) и обсуждения технических проблем, подключенных к RNAi. Смотреть ¹⁹ ссылки для стандартных червь культуры и технического обслуживания и таблица материалов.

1. Поиск ERM-1 (или другой ген интереса) взаимодействующих молекул в базах данных и опубликованных статей.
   Примечание: Потенциальные посредники ERM-1 будет включать все молекулы, которые были экспериментально показано функционально, генетически или физически взаимодействовать с ERM белков в любых видов и/или были предсказаны сделать это на любых в silico, высокая пропускная способность или Системная биология подхода (см. Таблица 3 Примеры баз данных и ресурсов).
2. Создать список всех генов и найти C. elegans гомолог где требуется.
   Примечание: Рассмотреть вопрос о расширении списка идентифицированных генов гена классам, которые принимает во внимание функции гена интереса и расширяет сеть для выявления посредники (например, для компоновщика мембраны актина ERM-1, выберите всех совладельцев и Актин связанные молекулы).
3. Определения соответствующего RNAi бактериальные кормления клоны в коммерчески доступных генома общесистемной бактериальной интерференции библиотек для всех генов (например, Ahringer генома C. elegans RNAi кормления библиотеки ²¹; Таблица материалов)
4. Создать электронную таблицу для всех генов и их соответствующие пластины RNAi и хорошо номер.
5. Подобрать и полоска ~ 50 RNAi клонов на тарелках LB/ампициллин/тетрациклина (выбор антибиотика определяется библиотека строительство) в день и продолжаться до тех пор, пока целевой создается библиотека RNAi.
   Примечание: В зависимости от размера библиотеки и прогнозируемые рабочего процесса, пропустить формирование полной библиотеки и перейти непосредственно с пакета анализа. Плиты могут храниться на 4 ° C, не более, чем приблизительно 2 недели (если необходимо, повторно полоска на новые пластины после этого). И наоборот, одно может генерировать больше замороженных библиотек в реплицировать 96-луночных или 384-ну форматов для долгосрочного хранения на -80 ° C.
6. Инкубировать пластины при 37 ° C на ночь. Следующее утро, удалить пластины из инкубатора и магазин на 4 ° C.
7. Выбрать RNAi бактерий от плиты, стерильные зубочисткой, смесь бактерий с 600 мкл LB/ампициллин (50 нг/мкл) бульон в 1,5 мл микропробирок, инкубировать трубы при 37 ° C, сотрясать 6 h.
   Примечание: Инокуляции RNAi бактерий в бульон, потерев забрать (кончик зубочистки или микропипеткой) вдоль стороны Микропробирка.
8. Семян 70 мкл культивированный бактерий в каждой скважине 6-ну RNAi плит в двойные или тройные наборы. Инкубировать RNAi пластин при 22 ° C ночь.
   Примечание: RNAi пластины создаются стандартные процедуры (Таблица материалов и ссылок на ^{3 , 17 , 21}) и здесь используется в 6-ну ткани формат пластин культура выше пропускная способность подхода, который по-прежнему позволяет для микроскопических оценки канал морфогенеза в живых животных на тарелках.
9. Следующий утром, забрать 3 L4 стадии ERM-1 [++]; VHA-1 p:: GFP червей на каждой скважине RNAi плит.
   1. , Чтобы избежать загрязнения с ОР50 бактерий (см. ссылку ¹⁹), которые мешают RNAi сначала семян червей на NGM пластину без бактерий и пусть животных обхода для около 10 мин. Использовать только здоровых животных, не голодали.
10. Инкубировать пластин при 22 ° C для 3 d, чтобы позволить животных для производства потомства.
11. Проверить канал фенотипов потомства F1 под рассечения флуоресцентным микроскопом.

3. В естественных условиях Imaging канала Excretory C. elegans микроскопии флуоресцирования рассечения и забил Tubulogenesis фенотипов

1. подготовить фенотип скоринга лист (пример, показанный в таблице 4 и Рисунок 5 ).
2. Место пластину агар с глистами непосредственно под dissectin флуоресцированияg микроскопа, откройте крышку пластины для оценки, используйте ниже увеличение сосредоточиться.
   Примечание: Этот протокол описывает использование область с 1,5 X и 10 X цели и масштаб диапазоне от 3,5 до 45 (Таблица материалов).
3. Оценить животных путем сосредоточения внимания на каждой хорошо отдельно, начиная с хорошо 1 и работать вниз пластину.
   Примечание: Всегда начинается с оценки механизмов контроля. Например, макет (пустой вектор) отрицательного контроля (HT115 RNAi бактерии-(см. ссылки в ^{17 , 21}) без или с вставкой несвязанных Джин) и соответствующие позитивные элементы управления, например, в Этот экран взаимодействия, erm-1 интерференции (подавляет ERM-1 [++] фенотип) и sma-1 / Спектрин интерференции (повышает ERM-1 [++] канал фенотип).
4. Во-первых, изучить общие фенотипов видимые под ярким светом (например: пусть/смертоносное, Clr/очистить, наб/эмбриональных смертоносное, Ste/стерильные, КООН/несогласованных, Dpy/унылый и т.д.), количественно фенотипа путем подсчета общее количество животных и животных с фенотипом, запись чисел (см. таблицу 4).
   Примечание: Для нокдаунов генов, вызывающих дефекты, которые могут повлиять на оценки канал фенотипов (например, наб, Ste), повторив эксперимент с условным, пост эмбриональных интерференции (см. сопровождающие бумаги для процедуры ³ ).
5. Во-вторых, изучить фенотипов выделительной канал под люминесцентные лампы дневного света, оценка количественных фенотипов (например, длина канала, ширина просвета, кисты), записи чисел и описания фенотипов на листе скоринга (см. таблицы 4, < сильный класс = «xfig» > рисунок 5).
   Примечание: Увеличение с диапазон масштабирования требуется оценить более тонкие канал фенотипов. Двигаться взад и вперед между низким и высоким увеличением тщательно оценить канал ’ s длины и ширины и любой другой канал морфогенеза фенотип. Для количественной оценки или полу количественного определения простых фенотипов, отсчет 100 животных (например, L4s в этой целевой экран RNAi; фенотипов: канал длиной 1/4, 1/2, 3/4 и полное расширение заднего каналов и диаметр просвета задняя каналов, малый кисты (< 1/3 ширины животных), крупные кисты (> 1/3 ширины животных); см таблицу 4).
6. Получить изображения преобладающим фенотипов от по крайней мере 3 различных животных от Микроскоп установлены камеры Цифровые зарядовой (связью ПЗС) и соответствующее программное обеспечение (см. Таблицу материалы)
   1. для получения изображений, Сначала включите камеру, включите прилагаемый компьютер, дважды щелкните значок программного обеспечения захвата изображения, приоритетная область червь пластины вручную под низким увеличением и открытия затвора камеры.
   2. Нажмите на “ живой предварительный просмотр ” значок программного обеспечения захвата изображения на экране компьютера для визуализации червей на экране компьютера, Отрегулируйте фокус вручную, чтобы четко визуализировать червей на экране, а затем нажмите “ оснастки ” значок, затем Нажмите кнопку “ сохранить ” значок.
      Примечание: Животных будет двигаться быстрее под люминесцентные лампы дневного света, поэтому держать одной рукой на компьютерной мыши готовы при перемещении пластину в область интереса, с другой стороны. Затем быстро нажмите “ оснастки ” значок, чтобы получить изображение. Это обычно позволяет получить хорошее изображение с нескольких попыток.
   3. Сохранить полученные изображения с именем нужного файла (включая имя штамм, RNAi клонов имя и дата).
      Примечание: Быстрее двигаться одичал тип червей с тонкие и длинные каналы являются более трудными для изображения чем мутантов. Мутанты с кистозным каналов и/или другие фенотипы, вероятно, двигаться медленно, способствуя тем самым изображений. Плазмиды маркер например Rol может быть полезным для изображений, сохраняя животных “ на месте ” вместо того, чтобы двигаться вперед и также может предоставить улучшенный вид на фенотип животного, прокатки вокруг себя.

4. C. elegans Excretory канала с высоким разрешением, лазерное сканирование Confocal микроскопии изображений

1. монтаж живых животных
   1. место небольшое количество жира или вазелина на кончике ватным тампоном или на кончике индекс палец и распространение смазка для создания ультратонких круг с диаметром ~ 6 – 8 мм в середине слайда чистого стекла.
   2. Место 6 мкл 5% раствор лидокаина (обезболивающий) в круг по микропипеткой.
      Примечание: Лидокаин раствор могут быть сделаны растворения порошка лидокаина в воде. Разбавляют до 5% с M9 буфера ¹⁹ (Таблица материалов). Это важно для анализа выделительной канала, чтобы избежать общих решений иммобилизации (например, азид натрия) которые вызывают кисты на разрыв и что заставить канал фенотипов.
   3. Выбрать несколько животных от интерференции пластины и поместить их в раствор лидокаина, immerging забрать червя ¹⁹ в раствор.
      Примечание: Желательно выберите этап конкретных животных, которые будет способствовать даже монтажа равномерной толщины. Животных можно предварительно на рассечения флуоресцентным микроскопом.
   4. Место 22 x 22 мм coverslip на стекло слайд; пусть она аккуратно оседают на круг смазка.
      Примечание: Не применять любое физическое давление на coverslip, которые могут повредить канал морфологии, особенно в мутантов или червей RNAi относились с канала и, возможно, другие фенотипы. Важно поэтому, чтобы избежать густой смазки круг; идеально животных нежно прослоены между стеклянное скольжение и крышка выскальзования.
   5. Написать имя образца на стороне матового стекла слайда. Немедленно принять Конфокальный микроскоп для анализа канал фенотипа и приобрести изображений слайд.
      Примечание: Задержки могут привести к повреждению канал кисты или изменить в морфологии просвета канала.
2. Приобретение конфокальный изображения
   1. место слайда на сцене образца конфокального микроскопа, фокус червей на малое увеличение (10 X).
   2. Пункт Просмотреть и выбрать животных под 60 X и 100 X целей, изучения выделительной канал ’ s сотовых и внутриклеточных фенотипов, например, люмен форму и диаметр, размер и форму кисты; или субцеллюлярные компоненты помечены для анализа, например, верхушечный/lumenal мембраны, базальной мембраны, цитоплазма, от англ против канальцев везикулы, другие органеллы (см. обсуждение, рис. 2 и рис. 4).
   3. Изображения приобретать конкретные фенотипа интерес.
      Примечание: Этот протокол описывает использование лазерный Сканирующий конфокальный микроскоп (Таблица материалов). Для устранения субцеллюлярные компоненты в тонких C. elegans выделительной каналов, выше цели увеличения (60 X-100 X) не требуется. Конфокальный микроскоп спиннинг диск может использоваться для получения изображений промежуток времени, но предоставляет меньше confocality (см. обсуждение).
      1. Приобрести конфокальный изображений, включите компьютер, дважды щелкните на Конфокальный микроскоп программного обеспечения и выберите лазер, нажав на значок в виде конкретных лазерного.
      2. Нажмите “ сканирования ” значок, чтобы визуализировать целенаправленного червя на экране компьютера, регулировать интенсивность лазера через программное обеспечение и снова нажмите на “ сканирования ” значок Остановить сканирование, а затем нажмите на “ захватить ” значок, чтобы захватить изображение, а затем нажмите на “ сохранить ” значок.
      3. Сохранение изображений с именем файла и включают в себя имя RNAi клон, штамм имя и дата.
         Примечание: Изображения могут быть приобретены как сингл и несколько разделов (например, 10 – 15 секций по оси z). Секционирование позволяет 3D визуализации. Приобрести проекции изображения и сохранять отдельно, если требуется (в зависимости от Микроскоп). Для оптимального разрешения, используйте параметры лазера с малым коэффициентом усиления, не открыть отверстие слишком много и добавить несколько среднем в изображения (см. ссылки ^{24 23 ,} для общего обсуждения конфокальная томография). Позаботьтесь, чтобы получить изображения на яркости ниже уровня насыщенности позволяет для изменения изображения программное обеспечение, если это необходимо (желательно использовать неизмененные изображения).
      4. Получить изображения двойных- или умножить помечены каналов (например зеленый, красный и синий) таким же образом, нажав на несколько лазерных иконы, но использовать последовательное сканирование, чтобы избежать кровотечения через между каналами (критических исследований совместно локализации).
         Примечание: Один может потребоваться принимать во внимание время, необходимое для последовательного сканирования (который также результаты в соответствующем увеличении фото отбеливание) и изменить настройки сканера. Не проверять животных из одного слайда для более чем 30 мин Максимальная избежать неспецифических эффектов на канал морфологии. Смонтировать новый слайд, если требуется больше сканирование.
      5. Приобрести соответствующий дифференциальной помехи оптика (DIC) / Номарски изображения, особенно если количественного определения канала Диаметр Длина и люмен по отношению к червь ’ s тела длины и диаметра. Наложение флуоресценции и Номарски изображения, нажав на “ накладку ” значок, чтобы продемонстрировать достопримечательности ( Рисунок 1 d и Рисунок 4A – D).
   4. Для количественной оценки, измеряют интенсивность флуоресценции метками компонент интерес ImageJ программного обеспечения ²⁵ ( рис. 5 c).

Этот протокол описывает, как использовать C. elegans выделительной каналов для визуально и молекулярно анализа одноклеточные tubulogenesis и внутриклеточных люмен морфогенеза в одну ячейку. Во время их расширение с момента середине эмбриогенеза к взрослой жизни четыре выделительной каналов продолжать расширять их базолатеральной и апикального/lumenal мембраны вместе с их канальцев и от англ endomembrane системы, обеспечивая уникальную модель для в естественных условиях анализ de novo поляризованной мембраны биогенеза (рис. 1). Субцеллюлярные компоненты, такие как верхушечный мембраны, цитоплазмы и от англ против канальцев пузырьки могут быть визуализированы выражением конкретных флуоресцентные фьюжн белков (описано в протоколе раздел 1), и их можно отличить друг от друга двойной или тройной маркировки в одном трансгенных животных (рис. 2). Уникальный канал выделительной фенотип (рис. 3A– B), порожденных экспрессирующих апикальном мембрана связанные молекулы (ERM-1), используется для демонстрации способов выполнения целевой экран РНК-интерференции для идентификации генов, функционирующих в апикальном мембрана и люмен биогенеза; Это служит примером молекулярной и визуального анализа биогенеза поляризованной мембраны в этой модели (описано в протоколе Секция 2). Этот фенотип ERM-1 [++] канал используется для демонстрации как визуально оценить и оценка подавления (рис. 3 c– D) и расширения (Рисунок 3E– F) путем рассечения микроскопии флуоресцирования (описано в протоколе раздела 3) . Канал фенотипов индуцированных модуляции ERM-1 уровня служат для показать как для устранения дефектов на субклеточном уровне confocal микроскопии (рис. 4) (описано в протоколе раздел 4) и как количественно фенотипов простой канал (канал длиной и киста Размер) и апикальном мембрана биогенеза дефектов (Рисунок 5).

Рисунок 1 : Морфогенеза C. elegans Excretory канал и внутриклеточных структур, канал
(A) схематическое представление выделительной канал расширение (синие линии) во время развития эмбриона и личинки. Выделительной ячейки достигает его окончательному расположению на левой стороне Вентро боковое задней глотки колбы в запятая стадии эмбриона (не показан). Как зародыш удлиняется, он сначала расширяет две руки боков к левой и правой сторон; Затем каждая рука может разветвлять каждой присваивать в передней и задней ветви. Эти ветви передней и задней продлить всей удлинение животного во время четырех личиночных стадий, сначала догнать рост животного на стадии L2, а затем сопровождающих его дальнейшего роста, до совершеннолетия. De novo поляризованной мембраны биогенеза поддерживает это расширение до совершеннолетия. (B) в взрослого животного, ветви передней канал до кончика носа и задней ветви, хвост (синие линии). Выделительной клетки тела отображается возле задней глотки лампочку (синий). Поляризованной мембраны домены поддерживаются во взрослом возрасте. (C) расширенного представления раздела руку канал. Слева: 3D вид шоу канала: базальной мембраны (черный), цитоплазмы (синий), lumenal мембрана (зеленый) и люмен (белый). Справа: вид на канал и его оболочек изнутри: базальной мембраны (черный), цитоплазмы (синий), endosomes (желтый овалов), канальцев везикулы (белые шары, подключенных друг другие, подключенным к Люмене или изолированные одного везикулы), верхушечный мембраны (зеленый) и люмен (белый). (D) Confocal/DIC оверлея микроскопии выделительной клеток эмбриона и выделительной каналов в личинки, обозначены lumenal против цитоплазмы GFP, соответственно. Левое изображение: выделительной клеток (зеленая, стрелка) в 1,5 раза эмбриона, с канала люмен визуализированное выражая апикальной ERM-1::GFP под erm-1 промоутер. Правое изображение: четыре выделительной канал ветви (зеленая, стрелка) в L3 личинки, визуализированное цитоплазматических vha-1 p:: GFP. Масштаб баров = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Визуализации субцеллюлярные компоненты в выделительной канал одичал тип оружия с двойной маркировки с флуоресцентные синтез белков
(A) отличительные цитоплазме от апикального мембраны. Выражение гена GFP под sulp-5 промоутер визуализирует канал цитоплазмы (зеленый, сверху); выражение ERM-1::mCherry под свой собственный промоутер визуализирует апикальной мембраны (красный, среднего); слияние этих изображений (внизу) различает цитоплазмой и апикального мембраны, которая в противном случае ничем бы по одной маркировки даже при большом увеличении. Шкалы бар = 5μm. (B) определение пространственных отношений от англ везикулы в просвет. Визуализация просвета в апикальной связанный мембранами GFP синтез белка (псевдо, окрашенные в красный, топ); Визуализация везикулы от англ, выразив mCherry::RAB-7 (псевдо, окрашенные в синий, среднего); слияние этих изображений (внизу) показывает относительную пространственных положениях от англ везикулы в просвет. Шкалы бар = 5μm. (C и D) Разрешения канала трубки формы против внутриклеточных канал компоненты при различных увеличениях. Цитоплазма L1 личинки обозначена выражением GFP под sulp-5 промоутер и цитоплазматических везикул канальцев, выразив канал воды AQP-8::mCherry под промоутер aqp-8 . (C) изображения, полученные на нижней увеличение разрешения «бусы на строку» шаблон, соответствующий конкретной стадии Варикоз (варикоз, водохранилищ, обильные в канальцев везикулы и других компонентов, необходимых для роста канал), но делать не разрешить цитоплазматических AQP-8 puncta. (D) изображения, полученные на увеличение разрешения puncta AQP-8 в цитоплазме канал, соответствующий канальцев везикулы. Масштаб бары: 20 мкм в C и 5 мкм в D. Все панели показывают конфокальный прогнозы 10 – 15 секций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : Озвучивание усилители и подавительs кистозных канал фенотип (ERM-1[++]) путем рассечения микроскопия
(A) ERM-1 [++]; ROL-6(su1006) выделительной каналов визуализируются выразить GFP под промоутера vha-1 . Задняя каналы доходят до вульвы или середине тела животного (стрелки; рассматривается как расширение 1/2) на нижней масштаб (1.5 X объективной и низкого масштаба). (B) на увеличение, подпись ERM-1 [++] малых кистозные гофрированные канал могут быть решены, с кончика задняя каналов (одна рука обозначаются небольшой стрелкой) расширение до вульвы или слегка за пределами (вульвы отмечен большой стрелкой; канал просвет в группе D может рассматриваться как дикого типа для сравнения). (C) подавления, низкий масштаб: удлиненные и тонких каналов в RNAi лечить животных ERM-1 [++]. (D) на увеличение, задняя каналов можно увидеть в почти полностью выразить хвост (маленькие стрелки по сравнению с родительского животных, отображаемые в панели B); большая стрелка указывает позицию вульвы. (E) укрепление: далее сокращен каналов с больших кист в RNAi лечить животных ERM-1 [++]; малое увеличение, без масштабирования. (F) на увеличение, расширение заднего канала может быть определено как менее 1/2 (маленькая стрелка) или не продлен до вульвы (обозначается большая стрелка) и размер кисты как более 1/3 ширины животного (шире, чем у родительского животных показано в B). Масштаб баров = 400 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4 : Визуальный анализ выделительной канал морфологии и внутриклеточных канал компонентов в мутанта/RNAi животных конфокальная микроскопия
(A-D) Отличительные вакуолярной от кистозного канал фенотип (конфокальный/DIC оверлея, который показывает микроскопии). (A) , которую в цитоплазму одичал тип канала визуализируется выразить GFP под промоутер sulp-5 (псевдо-цвет на синий в отличие от апикального мембраны, маркировки, показано на зеленой панели B). (B) апикальном мембрана одичал тип канала визуализируется выразить ERM-1::GFP; Обратите внимание, что просвет не видны в этом масштабе и что единого маркировки не может отличить цитоплазматической мембраны пометки. (C) выделительной канал фенотип индуцированных интерференции: цитоплазматический маркировки нельзя отличить от intralumenal кисты цитоплазменные вакуоли. (D) выделительной канал фенотип индуцированных интерференции: верхушечный ERM-1::GFP маркировки обнаруживает накопление жидкости внутри просвета, выявления (lumenal) киста, вместо того, чтобы (цитоплазмы) вакуоли (сравните рисунок 4I для цитоплазменные вакуоли). Шкалы бар = 40 мкм для A – D, показано в A. (E – J) анализ - и получить из функция потерь воздействие на субклеточном канал компоненты (конфокальный изображения одного канала оружия показаны). (E-G) Влияние RNAi erm-1 на субклеточном локализации канальцев. (E) одичал тип канала цитоплазмы; Обратите внимание, GFP исключения указанием люмен. (F) одичал тип цитоплазматических AQP-8::GFP puncta, соответствующий канальцев везикулы. (G) Эндоплазматический и базальной перемещение puncta AQP-8::GFP в erm-1(RNAi) животных. (H) разрывными люмен и подробно люмен кончик патологии (керлинг и потери центрирующих люмен) в erm-1(mildRNAi) животных (см.³ для плавного RNAi прочности); Обратите внимание, что канал цитоплазме выходит за пределы кончика люмен, здесь обозначается малые цисты. (I) цитоплазменные вакуоли в выделительной канал теле без каких-либо расширения канала в сильно пострадавших erm-1(RNAi) животных³; Обратите внимание, что закон 5::GFP не набирается до люмен (за исключением нескольких небольших пятна вокруг некоторых вакуолей). (J) набор избыточного акт 5::GFP и AQP-8::mCherry в Люмене в тройной трансгенных животных, экспрессирующих ERM-1 (Примечание толстые пояс акт 5::GFP и перекрывающихся AQP-8::mCherry сгустков вокруг кистозных люмен). Шкалы бар = 5 мкм для E-J, показано в э. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5 : Примеры количественной оценки дефектов канала путем рассечения и конфокальная микроскопия
(A) схематическое представление дикого типа (Верхняя панель) и мутанта кистозный (нижняя панели) выделительной каналы для количественного определения размера длины и киста канал. Длина заднего канала количественно как 0, 1/4, 1/2, 3/4 и 1. Длина канала '0' означает расширение не и '1' означает полнометражного расширение. Размер кисты количественно как < 1/3 (малый) и > (большой) для 1/3 диаметра тела. (B) количественной морфологии валового канала управления и ERM-1 [++](RNAi) животных, люминесцентные, рассекает микроскопии. В макет(RNAi) ERM-1 [++] животных длина заднего канала составляет около 1/2 в 95% животных (ссылка изображение, Рисунок 3A– B). В подавитель ERM-1 [++](RNAi) животных задний канал длиной почти полностью распространяется в 80 – 90% животных (Эталонное изображение, Рисунок 3 c– D). В усилитель ERM-1 [++](RNAi) животных, примерно 60-70% каналы имеют крупные кисты и короче длины (< 1/2) (эталонный образ, 3E рисунок– F). Данные, представленные как означает ± SD (n > 3). (C) количественная оценка интенсивности флуоресценции апикальной/lumenal канал цитоскелета, ImageJ конфокальный изображений. Канала в апикальном мембрана обозначены акт 5::GFP, руку одичал тип канала отображается в левой, ERM-1 [++] канал руку, справа. Левой панели: интенсивность акт 5::GFP в дикого типа мембранных рукав составляет около 50 (серый значение/мембраны, черной и красной стрелкой), участок, показано под изображением. Правой панели: интенсивность акт 5::GFP в ERM-1 [++]-выше 100 (серый значение спинной мембраны около 110 (черная стрелка), и брюшины мембраны составляет около 140 (красная стрелка)), участок, показано ниже изображения. Масштаб баров = 5 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

C. elegans генетических универсальность, прозрачности, план простой тела и инвариантные клеток линии делают отличную модель для анализа морфогенеза. Этот протокол описывает как сочетать стандартные генетических манипуляций и томографии исследования воспользоваться 2 микрон тонкие C. elegans выделительной каналов для изучения поляризованной мембраны и внутриклеточных люмен биогенеза в одну ячейку трубку.

Маркировка
C. elegans выделительной каналов могут быть помечены с выражением флуоресцентные синтез белков, разрешительные оперативный анализ (описано здесь), или антитела или химическое окрашивание (см. сопроводительный документ на кишечную tubulogenesis для пятнать антитела ³). выражение два или более различных флуорофоров, или сочетание этих различных маркировки методов, позволяет высоким разрешением визуальных рассечение эти тонкие трубочки (рис. 2). Флуоресцентный синтез белков, направленные каналы по конкретной промоутера канал являются первым выбором для выделительной канал маркировки по нескольким причинам, среди них: (1) уровень низкий выражение многих белков канал, и (2 канал тонкой структуры, которая легко перегружены пятнать вне каналов, где также может быть выражена протеина интереса. С другой стороны, каналы чувствительны к экзогенным белков и легко развивать неспецифических фенотипов (например, расширение дефектов и кисты или даже летальность) когда сильно выражаются такие белки. Это должен весить на принятие решения при выборе между различными способами получения трансгенных животных. В принципе трансгенов могут быть введены как нехромосомной массивы (например, путем прямого впрыска плазмидной ДНК в Гонада микрофлорой трансформации, как описано здесь), который обычно создает высокий копия число массивов (часто с высоким выражение), или интегрированы в геноме, обычно на низкой или одной копии номер (например, путем бомбардировки²⁶ или через Mos1-опосредованной одной копии вставки [MosSCI]²⁷). Extrachromsomal массивы также могут быть интегрированы в геном на втором этапе (до сих пор, однако, в ряд высоких копирования)¹⁸. С другой стороны когда вводят в микрофлорой при низкой концентрации (например, 1-2 нг/мкл ДНК, в сочетании с высокой концентрацией маркеров ДНК), низким (даже одна) копия число массивов может быть легко сгенерированный²⁸. Этот сценарий имеет то преимущество, что концентрации ДНК может быть изменено, который может помочь найти лучший уровне выражения для канала маркировки, ни слишком низким, ни слишком высокой (токсичные). Связь между вводят ДНК концентрации и выражение уровня зависит от нескольких факторов (например, промоутер) и таким образом должны определяться эмпирически. Кроме того гена интереса могут быть непосредственно помечены Флюорофор в микрофлорой кластерного регулярно чередовались короткие палиндром повторяет (ТРИФОСФАТЫ) на основе маркировки процедур^29,30. Хотя этот подход ставит Флюорофор в его наиболее физиологической геномной контекст, это не всегда необходимо и даже желательно (например, когда белок выражается на очень низком уровне). Это однако, возможно, лучшим вариантом, например если ген интереса является очень большой.

Визуализация канал может быть достигнуто, направляя транскрипционный анализ конструкций в канал, который будет выделить в цитоплазму канал, Флюорофор. В отличие от маркировки канал субцеллюлярные компоненты требует трансляционная фьюжн, где полнометражного ген связан в кадре для кодирования гена Флюорофор. При использовании конкретной промоутера канала для выражения (вместо собственных гена промоутер), его выбор должен основываться на промоутер прочность и, для развития анализа, время его выражения. Многие конкретные гены выделительной канал не выражают перед личиночной стадии когда канал осмотического функция становится критической; слишком поздно для анализа его активного расширения фазы (erm-1 и профи-1 являются ранние выраженной генов)^10,13. В таблицах 1 и 2, соответственно, приводятся примеры для маркеров выделительной канал эндо - и плазменных мембран и канал конкретных промоутеров и ресурсами для поиска дополнительных канала конкретных молекул в таблице 3. Эти ресурсы может также использоваться для поиска уже сделал подходящей флуоресцентные синтез белка, которые могут быть доступны через центр генетики Caenorhabditis (CGC; см. также таблицу 1). Для создания рекомбинантных плазмид для выражения такого протеин сплавливания, можно использовать различные методы клонирования, каждый с конкретные плюсы и минусы (обсуждается в другом месте¹⁴). К ним относятся обычные энзима ограничения на основе клонирования подходы, описанные здесь, Модульная клонирования с помощью Мультисайтовая система Gateway³¹, Гибсон Ассамблеи³²или Репортер ген строительство методом «ПЦР строчки»^{14 ,33}. Эти различные подходы могут быть адаптированы, чтобы метод, выбранный для их внедрения в микрофлорой и/или других конкретных потребностей (например, универсальный шлюз системы способствует перетасовки промоутеров и cDNAs для больших масштабах маркировки подходы) . Уход необходимо принять выбрать правильные вставки сайт для Флюорофор (ссылок на N-по сравнению с C-конечная белка), принимая во внимание функции протеина интереса.

Вмешательство с функции гена
Как один из многих возможных способов повлиять функции генов у нематоды Caenorhabditis elegansэтот протокол описывает целевых RNAi взаимодействия экран предназначен для изменения кистозных канал люмен фенотип, вызванных экспрессирующих lumenal мембраны компонент. В данном конкретном случае, экспрессирующих апикальной/lumenal мембраны связанные маркер, такие как ERM-1 имеет преимущество непосредственно руководящие запрос к желаемой цели: анализ биогенеза внутриклеточные мембраны апикальной/lumenal. Получить из функция фенотип, порожденных гиперэкспрессия также обеспечивает определенные преимущества, в сочетании с экрана взаимодействия (RNAi) функция потерь, как описано здесь (см³⁴ для обсуждения потери - и получить из функции анализа и Дизайн генетических экранов). Кроме того, ERM-1 сам является хорошо исследованы «люмен морфогенеза» и апикальном мембрана личность молекулы¹². Таким образом в этом случае целевой (вместо объективной) экран может быть непосредственно информативным для люмен морфогенеза хотя сопутствующе обстоятельств дальнейшего характеризующих ERM-1 конкретные функции в этом процессе. Однако беспристрастной-целевой экран может быть проведена в Аналогичным образом, начиная с дикого животного, трансгенных животных с fluorescently, помечены выделительной каналы, или с любой канал мутант. Общие преимущества и недостатки интерференции (например, по сравнению с мутагенез) для генерации фенотипы функция потерь, и проводимости и обсуждения различных типов генетических экранов в C. elegans , обсуждаются в другом месте ³⁴. RNAi производит спектр фенотипов, включая мягкий фенотипы, конкретные преимущества для анализа часто смертоносного tubulogenesis генов. Это описывается и обсуждается в сопроводительном документе на кишечную tubulogenesis³. Различные подходы к генерировать прибыль и потери функции мутантов и классические генетические процедур, таких как кресты, подробно и обсуждаются в литературе методы общей генетики²⁰.

Микроскопия и оценки tubulogenesis фенотипов
Визуально оценки и забил модификации фенотип четко канал под люминесцентные, рассекает микроскопом с помощью простых скоринга параметров (например, канал длиной и Люмене диаметр), как описано здесь, может быть достигнуто в течение короткого времени даже при обработке большего числа животных в целенаправленной или систематического генетических или RNAi экрана. В отличие от, что подобный поиск экрана Роман канал морфогенеза фенотипы в штамм одичал тип (за исключением его канал маркировки трансген), это больше времени, но может, в принципе, осуществляться таким же образом (мы осуществили такие экран на основе общесистемной генома в несколько месяцев). Такие экраны будут определены несколько различных канала фенотипов (здесь не показаны) и поэтому необходимо разработать соответственно скоринга различные параметры, например, качественной классификации схемы (см.^{, 9,11 35,36,,3738} для различных способов забить канал фенотипов путем рассечения микроскопия). При толковании любого канала фенотип, важно иметь в виду, что формирование кисты могут быть неспецифическим эффект многих различных оскорбления на этой тонкой трубчатые структуры, и это часто менее информативным терминала фенотип. Киста размер и местоположение, с другой стороны, может быть информативным, например, киста близко к клетке канала (в начале расширение канала), кисты по длине канала или кисты на канал советы, обеспечивают ключи для базового механизма дефектов. Канал кисты (здесь определяется как интра lumenal заполненные жидкостью сфероидов окружении апикальной/lumenal мембрана) следует отличать от везикулы (небольшие цитоплазматической мембраны прыгните жидкости заполнены сфероидов) или вакуолей (расширенного цитоплазматической мембраны граница жидкости заполнены сфероидов), не окружен lumenal мембраны, которые могут все выглядят внешне идентичны (рис. 4A– D). Цитоплазменные вакуоли могут также возникают вторично, например, через токсические эффекты крепления (азид натрия). Так, больших кист и цитоплазменные вакуоли может занять до почти размер животного и нужно также отличать от классической «очистить (Clr)» канал фенотип, вызванных накоплением жидкости в полости тела. Наконец канал длиной почти всегда вторично скомпрометированы в кистозные каналов, поэтому истинный канал расширение дефекта необходимо продемонстрировать в свободной обстановке кисты.

Несмотря на свои крошечные диаметров, субцеллюлярные компоненты выделительной каналы, такие как верхушечный против базальной мембраны, внутриклеточный от англ против канальцев везикулы, внутриклеточных органелл и цитоскелетных компонентов, могут быть визуализированы на выше увеличение, например, confocal микроскопии (рис. 2, рис. 4). По конфокальная томография, GFP позитивного канала цитоплазме только достаточно, чтобы отличить просвета от цитоплазмы канал через не люминесцентные линии (рисунок 2A, 4E рисунок). Личность маркеров способствует решению канальцев (также разительным образом отличается в размер), везикулы от англ, хотя окончательное распределение потребует immunoelectronmicroscopy³⁹. Двойные и тройные маркировки можно определить субцеллюлярные локализации молекулы интереса и отношение внутриклеточных компонентов друг с другом (рис. 2). Один канал помечены lumenal мембраны производят же двойной линии в цитоплазме или базальной мембраны, но можно выделить через двойной или тройной маркировки. Конфокальный анализа правильного монтажа имеет важное значение, учитывая хрупкость структуре канала, его чувствительность к осмотическим изменениям и уязвимость ее наиболее частых кистозных фенотип. Кисты легко лопнуть с осмотическим изменения или физического давления, чувствительны к мембране токсинов, таких как азид натрия и также чувствительны к некоторым анестетики используемые для иммобилизации (который может также производить цитоплазменные вакуоли). В наших руках 5% лидокаина в буфере M9 лучше всего подходит для наиболее выделительной канал анализов. Визуализация процедуры и все обработки должны быть нежным, как описано. Чтобы избежать артефактов, которые имитируют фенотипов (например, кисты и вакуоли), то лучше сразу приобрести изображения после монтажа. Если это не представляется возможным, киста изображения должны быть приобретены во-первых, до визуализации другие фенотипы. Этот протокол описывает стандартные сканирования confocal микроскопии, которая обеспечивает улучшенный confocality, по сравнению с спиннинг диска confocal микроскопии, который, напротив, снижает Фототоксичность и микроскопии выбор для анализа динамических изменений субцеллюлярные компоненты со временем. Такие вопросы на субклеточном динамика также могут решаться с помощью методов Фотообесцвечивание или маркировки протеины сплавливания с фото переключаемый флуорофоров, изменить цвет⁴⁰. Наконец, спектр резолюции могут быть увеличены путем добавления просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА, обеспечивая высокое разрешение структурных но не молекулярной), супер-резолюции микроскопии (предоставление молекулярной резолюции в нанометровом диапазоне); или immunoelectronmicroscopy (предоставление оба)^39,41. Томография 3D могут быть объединены с ТЕА последовательных секций и особенно полезна для анализа канальцев плазматической мембраны интерфейса выделительной каналы^9,10. Усовершенствованные методы для этих различных типов микроскопии и комбинации этих различных изображений подходов продолжают разрабатываться.

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Мы благодарим M. Бюхнер (Университет штата Канзас, Канзас, США), K. Nehrke (медицинский центр университета Рочестера, Рочестер, Нью-Йорк, США) и центр генетики Caenorhabditis , финансируемых за счет национальных институтов здравоохранения, управление исследовательской инфраструктуры Программы (P40 OD010440). Эта работа была поддержана грантов низ GM078653, MGH является 224570 и 223809 SAA в в.г.