Vitro Simüle mikrogravite altında fare Preantral follikül gelişimi

Matrisi kullanarak simüle mikrogravite koşuldaki kültür hücrelere olmadan doku oluşturmak için son derece gelecek vaat eden bir teknik oluşturur. Döner kültür sistemiyle, yumurtalık folikülü büyüme ve oosit olgunlaşma folikül hayatta kalma, morfolojisi, büyüme ve oosit işlevini simüle mikrogravite koşul altında açısından incelenmiştir.

14 günlük eski fare yumurtalık dokusu ve preantral follikül aynı yaşlı fareler izole bir simüle mikrogravite kültür sistemi içinde inkübe. Kantitatif folikül hayatta kalma, ölçülen folikül ve oosit çapları değerlendirildi ve sistemden üretilen yumurtalar ultrastructure muayene etti. Biz azalma folikül hayatta kalma gözlenen, downregülasyon Proliferasyona ifadelerin hücre nükleer antijen ve büyüme farklılaşma faktörü 9, granulosa hücreleri ve yumurtalar, kalkınma göstergeleri olarak sırasıyla ve yumurta ultrastructural anormallikler simüle mikrogravite koşul altında. Simüle mikrogravite deneysel Kur'un oosit/folikül vitro geliştirilmesinde rol mekanizmaları incelenmesi için bir model sağlamak için optimize edilmiş olması gerekir.

Vitro yumurtalık folikül gelişimi ve oosit olgunlaşma petri yemekler ve aljinat ve hidrojel^{1 gibi üç boyutlu (3D) matris yüzeyi gibi 2-boyutlu kültür, geleneksel yöntemler kullanarak elde ,2,3}. 3D kültür sistemi etkili bir şekilde follikül doku benzeri yapıda saklanır ve benzer gen ifade profilleri vivo içinde⁴ köklerinin olarak devam etti ve meiotically yetkili yumurta^5,6üretilen. 3D kültür sistemleri de matris-Alerjik bir durumda kurulabilir, örneğin, asılı damla süspansiyon ve haddeleme gemiler. Ulusal Havacılık ve Uzay Dairesi (NASA) tarafından geliştirilen dönen duvar gemi (RWV) içinde gemi⁷kültürlü hücreler için benzetimli mikrogravite (s-µg) oluşturur. Bu simüle mikrogravite şartları sağlayan benzersiz kültür sistemi hücre çoğalması ve farklılaşma sedimantasyon konveksiyon için eksikliği nedeniyle. O simüle mikrogravite endotel damar oluşumu endotel hücreleri^8,9, tiroid hücreleri¹⁰ve chondrogenesis yağ kaynaklı gelen montaj tiroid dokusu terfi gösterilmiştir Mezenkimal Kök hücre RWV cihazlar¹¹. Ancak, diğer çalışmalar simüle mikrogravite Gastrik hücrelerde apoptoz indüklenen ve etkileri öne B lymphoblasts^12,13,14, Mikroyerçekimi hücresel yaralanma üzerinde simüle göstermiştir hücre türü bağımlı olabilir. Simüle Mikroyerçekimi da ultrastructural düzeyinde değişiklikler rahatsız iğ kuruluşta bildirildiği gibi neden olabilir ve yumurta¹⁵sitoplazmik blebbing indüklenen. En iyi duruma getirilmiş simüle mikrogravite koşulları ve doku Mühendisliği veya hücresel yaralanmalarının altında sistem teşvik mekanizmaları daha fazla araştırma gereken. Yumurtalık köklerinin/yumurta RWV cihazlar kullanarak büyüyen vitro deneyler yumurta gen ifadeleri ve ultrastructures oosit organelleri, değerli bilgiler sağlayabilir. Bu çalışmada, yumurtalık dokusu preantral follikül ve izole preantral follikül içeren simüle mikrogravite etkilerini araştırmak için kullanılanfolikül gelişimi ve oosit olgunlaşma üzerinde.

Bu çalışmada, yumurtalık dokusu preantral follikül ve izole preantral follikül içeren folikül gelişimi ve oosit olgunlaşma üzerinde simüle mikrogravite etkilerini araştırmak için kullanılmıştır. Bizim çalışmada, RWV bir simüle mikrogravite aygıt, spin bir % 5 CO₂ kuluçka makinesi içinde yatay eksen çevresinde bir simüle mikrogravite koşulu ile verimli oksijenlenme ve çok düşük kesme stres sağlanması. Gen ifadeleri (GDF-9) Proliferasyona hücre nükleer antijen (PCNA) ve büyüme farklılaşma faktörü 9 granulosa hücreleri ve yumurtalar, kalkınma göstergeleri olarak anılan sıraya göre analiz ettik. PCNA ve GDF-9 ifadeleri granulosa hücreleri ve yumurtalar, sırasıyla, RWV cihazda kültürlü zaman bastırılır ve biz s-μ altında kültürlü köklerinin oosit microvilli zona pelusida üzerinden çekilmesi gösterdi gösterdi g GDF 9 eksikliği fare köklerinin¹⁶' benzer durumu.

Etik onay bu çalışma için hayvan araştırma Etik Komitesi, Wen Zhou tıbbi kolejden elde edildi.

1. Kültür medya ve aljinat hidrojel hazırlanması

1. Yumurtalık dokusu ve folikül işleme orta L-15 Orta % 10 fetal sığır serum, 100 IU/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin kullanarak hazırlayın. İki hafta boyunca 4 ° C'de depolayın.
2. Yumurtalık dokusu ve folikül kültür % 5 fetal sığır serum ile [FBS], takıma Alfa-çok az temel orta [α-MEM] oluşan orta hazırlamak % 1 insülin-selenyum-transferrin, 10 mIU/ml rFSH, 100 IU/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin. İki hafta boyunca 4 ° C'de depolayın.
3. % 0.8 (w/v) sodyum aljinat çözüm steril PBS kullanarak aljinat hidrojel hazırlamak, sonra bu çözümün 10 µL aljinat boncuk oluşturmak için kapsülleme çözüm içine (140 mM NaCl /50 mM CaCl₂) bırakın.
   Not: Aljinat Boncuk boyutu yaklaşık 3 mm çapında yapıldı.

2. fare folikül yalıtım ve kapsülleme

1. 14 bayat ICR dişi fareler tarafından servikal yerinden çıkması, aseptik makas ve forseps kullanarak Kaldır yumurtalık itlaf ve yumurtalık orta işleme 2 mL koymak.
2. Yumurtalık neşter kullanarak yarıya. Yarım boy yumurtalık doku kültürü kültür orta için yaklaşık 1 mm kalınlığında oldu.
3. El ile köklerinin 26 1/2-kalibre iğneler altında 2-4 X stereomicroscope kullanarak yumurtalıklar üzerinden ayırma ve Kültür Kültür orta için seçili köklerinin toplamak.
   Not: Folikül seçim ölçütü: 1) köklerinin yuvarlak ile yumurtalar ve yumurta, 2 çevreleyen granulosa hücreleri 2-3 kat) köklerinin vardı bazı granulosa hücreler ile bağlı olduğu gibi bir Bazal membran ve 3) folikül boyutu 90-100 µm çapı
4. Adım 1.3 başına aljinat boncuk oluşturun. Köklerinin aljinat çözüm ile yıkama ve her boncuk bir stereomicroscope altında tek bir folikül içeren emin olmak her aljinat boncuk ortasına tek bir folikül pipette. Kültür ortamı, kültür aljinat 150 µL 35 × kültür ortamının boncuklar durulama sonra 10 mm çanak veya RWV aygıt kültür.

3. yumurtalık dokusu veya folikül kültür simüle mikrogravite altında

1. RWV aygıt simüle mikrogravite oluşturmak için kullanın. Damar ışık parafin yağı (~ 10 mL) ile doldurmak, 150 µL kültür ortamının bir damlacık yağın içine yerleştirin, sonra Yumurtalık dokusunun tek parça veya üç aljinat boncuk kapsüllenmiş köklerinin ile orta damlacık aktarın. Gemi liman kapağı kapatın ve cihazın dönen Bankası üzerine gemi tamir.
2. Denetim grupları, köklerinin içeren aljinat boncuk yerleştirin veya hafif parafin yağı 35 × 10 mm kültür yemekleri yumurtalık dokusu içine bir damlacık kültür ortamının 150 µL kaplı.
3. Kültür yemekleri ve oksijen kuluçka 37 ° C'de RWV cihazla havada %5 CO₂ kuluçkaya.
4. RWV aygıt ortamda kültür değiştirmek için: yağ ve orta gemisinden bir 150 × 20 mm kültür tabak içine dökün, yumurtalık dokusu veya aljinat boncuk kültür orta ile bir kültür yemek için transfer. Gemi kültür sistemi adım 3.1 başına yeniden kurun.

4. kapsülden çıkarma ve folikül alma

1. Kültür 4 gün sonra petrol ve orta gemisinden bir 150 × 20 mm kültür tabak içine dökün. 10 U/mL aljinat liyaz 37 ° C'de 30 dk ile takıma orta işleme kuluçka aljinat boncuk ve decapsulate köklerinin üzerinden aljinat boncuk almak
2. Köklerinin toplamak ve daha sonra orta bir stereomicroscope altında işleme içinde yıkayın.

5. yumurtalık dokusu ve folikül değerlendirme

1. Hücre canlılığı tahlil
   1. D-PBS içinde üç kez decapsulated köklerinin yıkama ve sonra onları birleştirilmiş hücre canlılığı tahlil reaktifler 150 µL içinde kuluçkaya (2 µM calcein AM ve 4 µM EthD-1) için 45 dakika oda sıcaklığında.
   2. Köklerinin temiz mikroskop slayt 10 ile transfer µL D-PBS, kapak ile bir coverslip ve açık tırnak boyasıyla mühür.
   3. Count yeşil ve kırmızı hücreleri (400 X) confocal floresan mikroskop altında slaytlar.
      Not: Bu canlılığı assay olarak, yeşil hücreler canlı hücrelerdir ve ölü hücreleri kırmızı hücreleri vardır. Köklerinin az %10 kırmızı hücreleri (ölü) ile hayatta köklerinin kabul edilir.
2. Hematoksilen ve Eozin (H & E) yumurtalık dokusu ve folikül boyama
   1. Taze 14 günlük eski fare yumurtalıklar ve preantral follikül Bouin'ın çözüm 14 bayat farelerde gün 0 örnekleri olarak gelen izole düzeltmek. Kültürlü yumurtalık dokusu sonra 2 gün ya da 4 günlük kültür ve aljinat boncuk içinde bireysel köklerinin deneysel örnek olarak 4 günlük kültür sonra düzeltmek.
   2. Parafin, Bölüm 5 µm kalınlık, seri olarak, tüm örneklerini göm ve H ile leke & E üretici yönergelerine göre.
3. Folikül sayma ve çap ölçümü
   1. H ile lekeli yumurtalık dokusu bölümlerde & E, tüm köklerinin ve sağlıklı preantral follikül doku kesit alanı (400 X büyütme) mikroskopla içinde say. Folikül yoğunluğu köklerinin toplam sayısına göre preantral follikül sayısı bölerek hesaplayın.
      Not: sağlıklı preantral follikül granulosa hücreleri en az iki kat ile bunlar.
   2. Ölçü çapı gün 0 köklerinin ve gün kültürlü 4 köklerinin kökü ve yumurta.
4. İmmünhistokimya
   1. Yumurtalık dokusu içinde %4 paraformaldehyde düzeltmek, parafin, 5-µm-kalınlığı, kısmında katıştırmak ve doku bölümleri slaytlar üzerine monte. Kesitler, dewax suyla temasa ve onları sitrat arabelleği 15 dk. blok için %3 hidrojen peroksit endojen peroksidaz kuluçkaya, antijen %5 keçi Serumda meydana çıkarmak ve 3 h için oda sıcaklığında birincil antikorlar ile kuluçkaya.
      1. 3 dakikadır PBS içinde yıkayın, sonra sulandırılmış 1:500 horseradish peroksidaz (HRP) ile slaytlar kuluçkaya-keçi Anti-tavşan IgG (H + L) oda sıcaklığında 1 h için Birleşik.
         Not: çalışmada kullanılan birincil antikorlar tavşan anti-GDF-9 antikor (1:500 seyreltme) ve tavşan anti-PCNA antikor (1: 200 seyreltme) idi.
   2. Cam slaytlara sulu montaj orta ile yumurtalık bölümü slaytları 3, 3'-Diaminobenzidine [peroksidaz aktivitesi ve mount algılamak için DAB] kuluçkaya.
   3. Yumurtalık bölümü slaytları 400 X büyütme, mikroskop altında gözlemlemek.
5. Transmisyon elektron mikroskobu [TEM]
   1. Köklerinin % 2.5 oxazolidin oda sıcaklığında 3 h için fix, sonra sonrası % 1 Osmiyum tetroxide 37 ° C'de 1 h için fix

6. istatistiksel analiz

1. Tüm veriler ortalama ± SEM biçimde sunmak. Gruplarına göre tek yönlü Varyans analizi (ANOVA) arasındaki farklar Tukey tarafından birden fazla karşılaştırma testi takip belirlemek. Test sonucu önemi için α eşik p ayarla < 0,05.

Şekil 1A gemi içinde yağ ile bir RWV gösterir. Bir damlacık Yumurtalık dokusunun tek parça veya üç aljinat boncuk kapsüllenmiş köklerinin ile içeren 150 µL orta yağ konulmuştur. Orta damlacık bir devlet içinde bir simüle mikrogravite (s-µg) koşul oluşturulan dakikada 25 rotasyonlar hızda dönen yağ damlacıkları üzerinde sıvı drag nedeniyle terminal hız tutuldu. Bir denetim deneyde, yumurtalık dokusu veya capsulated köklerinin 150 µL orta mineral yağ 35 × 10 mm ile kaplı bir damlacık içinde kültürlü yemekleri (şekil 1B), 1 - oluşturulang durumu.

Biz 14 günlük eski fare yumurtalık dokusu altında 1 - kültürlü preantral follikül geliştirme vitrosimüle mikrogravite etkilerini incelemek içing (Denetim deney) ya da s-µg koşulları. H sağlıklı köklerinin sayısı saydık & E iki koşul bölümlerde kültür (Şekil 2) 0, 2 ve 4 gün sonra lekeli. Yumurtalık dokusu s-µg durumda tedavi folikül hayatta önemli ölçüde altında 1 - daha düşük buldukg koşul 2 gün ve gün 4 kültür (p < 0,05, ANOVA). Ayrıca, hiçbir PCNA sinyalleri s-µg koşul (şekil 3) altında yumurtalık dokusu içinde tespit edildi olumlu bulduk. Kültür izole preantral follikül aljinat boncuklar kapsüllü, biz önemli ölçüde daha fazla folikül küçük 1 - hayatta kaldığını ortayag koşulu (%76.8 ± % 5.3, n 227 =) s-µg durumu daha (%54,4 ± % 6.7, n 249) kültür, günde 4 . Ayrıca, oosit boyutu yok önemli artış kültür, 4 gün sonra yine de folikül vardı boyutu artar önemli ölçüde koşulların her ikisi de yerçekimi altında (şekil 4). Ancak, köklerinin az %10 ölü granulosa hücrelerle (şekil 5) altında 1 - anlamlı düşüktüg koşulu (81.5 ± % 5, n = 10) daha s-µg koşul altında (90 ± % 8, n = 10) (p < 0,05).

Oosit işlevini simüle mikrogravite etkilerini araştırmak için oosit özgü marker GDF-9 ifade inceledi. GDF-9 ifade s-µg koşul (şekil 6) altında yumurtalık dokusu içinde son derece aşağı-düzenlenir gösterdi. Buna ek olarak, günde 4 s-µg koşul (Şekil 7) altında kültürünün kapsüllenmiş köklerinin oosit organelleri sık ultrastructural anormallikleri gösterdi.

Resim 1 : S - Kurulumuµg ve 1-g kültür koşullar. (A)s-µg duvar gemi döndürme ve kültür konuları hareketli yağ içinde sürekli serbest düşme bir durumda tutmak tarafından yaratıldı. (B) A 1 -g koşulu yumurtalık dokusu veya mineral yağ ile kaplı bir petri yüzeyinde köklerinin kültür tarafından oluşturuldu. Ok bir damlacık orta gösterir. Ölçek çubuğu 1 cm =. Bu şekil Zhang ve ark. değiştirildi ¹⁷ Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 : S-µg etkileri yumurtalık doku kültürü üzerinde. (A)bölümleri Yumurtalık dokusunun altında 1 - kültürlüg ya da s-µg koşulları için 0, 2 ve 4 gün. Ölçek çubuğu = 50 µm. (B) folikül yoğunluğu yumurtalık dokusu bölümlerde. Hata temsil 1 SEM, bar *: p < 0,05. Bu şekil Zhang ve ark. değiştirildi ¹⁷ Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3 : PCNA immünhistokimya. PCNA protein ifade muayene yumurtalık dokusu granulosa hücrelerinde kültürlü altında 1 -g ya da s-µg koşulları için 0, 2 ve 4 gün. Ölçek çubuğu 50 µm =. Bu şekil Zhang ve ark. değiştirildi ¹⁷ Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4 : S-µg etkileri aljinat boncuk kapsüllenmiş preantral follikül kültür. Preantral follikül(a)Morfoloji kültürlü altında 1 -g ya da s-µg koşulları 0 gün ve 4 gün için. Ölçek çubuğu = 50 yumurta çapı µm. (B) ve (C) folikül çapı karşılaştırıldığında 1 g ve s-µg koşullar arasında. Hata temsil 1 SEM, bar *: p < 0,05. Bu şekil Zhang ve ark. değiştirildi ¹⁷ Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5 : Hücre canlılığı tahlil. Temsilcisi görüntüleri 400 X büyütme, mikroskop altında alındı. Tahlil anlamları canlı hücreleri görselleştirmek için Calcein AM yeşille lekeli ve ölü hücreleri çekirdekleri görselleştirmek için EthD-1 kırmızı lekeli. (A): ~ %100 canlı granulosa hücreleri (yeşil) ile bir folikül. (B): bir folikül canlı granulosa hücreleri (yeşil), hem de 10'dan fazla % ölü hücreleri (kırmızı). Ölçek çubuğu 50 µm =.Bu şekil Zhang ve ark. değiştirildi ¹⁷ Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 6 : İmmünhistokimya GDF-9. GDF-9 protein ifade muayene yumurta yumurtalık dokusu içinde altında 1 - kültürlüg ya da s-µg koşulları için 0, 2 ve 4 gün. Ölçek çubuğu 50 µm =. Bu şekil Zhang ve ark. değiştirildi ¹⁷ Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 7 : Ultrastructural analizi izole preantral follikül kültürlenir küçük 1 - g veya s-µ g koşulları günde 4 kültür. (A) bir yumurta zona pelusida uzanan microvilli (oklar) ile (1 -g durumu). (B-F) Büyük boşluklar (*), multilamellar organları ile yumurta (#), lipid damlacıkları (oklar), cristae (ok) eksik ve Golgi aygıtı (ok), sırasıyla dağıtırken vacuolated mitokondri (s-µg durumu). O: oosit; ZP: zona pelusida. Bu şekil Zhang ve ark. değiştirildi ¹⁷ Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Başarılı preantral köklerinin kültür için kritik adımlar şunlardır: 1) doğru tarif edildi seçim kriterlerine göre preantral follikül Protokolü metin 2.1 seçerek); 2) preforming şüpheci koşuldaki tüm yordamları ve steril bir kültür Bakımı; ve 3) doğru RWV kültür sistemi ayarlama.

Deneysel gözlemler Çoğalt deneylerde tutarlılığını koruma benzer veya aynı malzeme kullanmaktır. Fare preantral follikül seçim ölçütlerini köklerinin 1 olduğunu ortaya) tarafından ince bir zona pelusida; çevrili germinal vezikül arıza (GVBD) aşamasında sağlıklı yumurta 2) 2-3 katmanları granulosa hücrelerinin Bazal membran tarafından alınmış; ve 3) thecal bazı hücreler Bazal membran için bağlı. Böylece, sadece tüm seçili köklerinin vardı oosit büyüme, aynı zamanda bir benzer morfolojik tanımlaması çapında 90-100 µm desteklemek için bir yumurtalık folikülü üç işlevsel bölmeleri.

Bu şekilde altında simüle mikrogravite kültür 3D fare preantral follikül büyümeye ilk girişimi olduğunu. Birkaç kültür sistemleri fare preantral follikül için geliştirilmiştir. Petri yemekler, sözde 2D kültür, düz bir yüzeye kültürlü folikül elde edilen yumurta döllenmiş ve canlı yavru üretti. Ayrıca, aljinat boncuklar, köklerinin kültürler gibi 3D kültürler ne vücut yüksek oranda meiotically yetkili yumurta üretir benzer bir doku yapısını korumak. Ancak, sıfır yerçekimi alanı yumurtalık köklerinin/yumurta gelişim süreci bilinmiyor. RWV, a aygıt hangi doku mühendisliğinde önemli dikkat çeken bir simüle mikrogravite ortamı oluşturmak ve simüle mikrogravite yumurtalık folikül/yumurta büyüme üzerindeki etkilerini araştıran için ideal bir ortam sağlamak vitro.

RWV cihazları, hücre kültürü için düzgün kurmak önemlidir. Gemi hava kabarcıkları kaldırılması gerekir. Hava kabarcıkları, kaldırmak için yöntem damar içinde oluşturulan gibidir: 0.5 mL yağı ile iki şırınga her iki şırınga bağlantı noktaları olarak yerleştirin. Şırınga noktalarını denetleme vanaları açın. Hava kabarcıkları şırınga bağlantı noktası altında manevra. Baloncuklar yaklaşık aynı birimin diğer şırınga bağlantı noktası üzerinden medya enjekte ederken şırınga çek. Tüm kabarcıklar kaldırıldıktan sonra vanaları kapatın, şırıngaları kaldırmak ve şırınga bağlantı noktası kapaklar takın. Sürekli rotasyon yerleşme hücrelerin engeller doğru dönme hızı bulmak için önemlidir. Dönüş hızı optimizasyonu hücreleri, sıvı yoğunluğu ve viskozite özgül ağırlığı tarafından belirlenir.

PCNA ve GDF-9, GDF 9 eksikliği fare köklerinin¹⁶ile benzer, ifade profilleri bu simüle mikrogravite granulosa hücreleri ve yumurta gelişimi üzerinde zararlı etkileri vardı saptandı. Taşıyıcıyı RWV cihazın bükülmüş arasında bir membran arkada olması olası çok düşük kesme stres ve verimli oksijenasyonu sağlamak için oksijen ve karbon dioksit nüfuz izin bir % 5 CO₂ İnkübatör içinde yatay eksen çevresinde folikül/oosit yaralanma nedenidir. Deneysel Kur ve daha fazla analiz optimizasyonu mekanizması zararlı etkileri ve araştırmak için gereklidir.

Daha fazla çalışmaları RWV kültür sisteminden türetilen vitro yumurta gelişim potansiyelini araştırmak için ihtiyaç vardır. Yumurtalar MII sahne için olgunlaşma vitro halen yürütülmektedir. Bu kültür sisteminin son doğrulama alınan yumurta döllenme kapasitesine tarafından incelenecektir.

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Yazarlar Yilong Wang ve Yanlin Zhao hayvanları korumak onların yardım için Chan Zhang yardımını histolojik örnekleri hazırlanmasında ve Dr Songtao He eleştirel okuma bu el yazması için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser doğal Bilim Vakfı, Zhejiang eyaleti tarafından desteklenmiştir (sayı vermek: LY13C120002).