В пробирке Рост Preantral фолликулов мыши под искусственной микрогравитации

Весьма перспективным технику для создания ткани конструкции без использования матрицы в культуре клеток в состоянии искусственной микрогравитации. С помощью системы ротационные культуры, мы рассмотрели, яичников фолликул и яйцеклетка созревания фолликула выживания, морфология, роста и яйцеклетки функции в условиях имитируемой микрогравитации.

14 день старая мышь тканей яичника и preantral фолликулов, изолированные от мышей же возрасте инкубировали в системе культуры имитируемой микрогравитации. Мы количественно оценили фолликула выживания, измеренной фолликула и диаметр ооцитов и изучены Ультраструктура яйцеклеток, производится из системы. Мы наблюдали снижение фолликула выживания, Даунрегуляция выражений пролиферирующих клеток ядерного антигена и рост дифференциации фактор 9, как показатели для развития клеток гранулезы и яйцеклетки, соответственно и яйцеклетка ультраструктурные аномалии в условиях имитируемой микрогравитации. Экспериментальной установки искусственной микрогравитации должна быть оптимизированы, чтобы служить моделью для изучения механизмов, участвующих в развитии яйцеклетки/фолликула в пробирке .

В vitro развития фолликула яичника и созревания ооцитов были достигнуты с использованием традиционных методов для 2-мерных культуры, такие как на поверхности чашки Петри и три трехмерные (3D) матрицы, например альгината и Гидрогель в^{1 ,2,3}. Система 3D культуры эффективно поддерживали фолликулов в структуре ткани как держал Похожие профили выражение гена как в естественных условиях⁴ фолликулов и производится meiotically компетентные ооцита^5,6. 3D культуры системы также могут быть установлены в бесплатно Матрица состояния, например, вися падение подвески и подвижного судов. Вращающийся стены судна (RWV), разработанный Национальным управлением по аэронавтике и пространства (НАСА) создает искусственной микрогравитации (gs-µ) для клетки культивировали внутри судна⁷. Этот имитируемой микрогравитации условие обеспечивает уникальную культуру системы для пролиферации и дифференциации ввиду отсутствия седиментации для конвекции. Было показано, что имитируемой микрогравитации поощрять формирование эндотелия сосудов из эндотелиальных клеток^8,9, ткань щитовидной железы, сборка из щитовидной железы клетки¹⁰и chondrogenesis от жировых, полученных мезенхимальные стволовые клетки в RWV устройства¹¹. Однако другие исследования показали, что имитируемой микрогравитации индуцированного апоптоза клеток желудка и B лимфобластов^12,13,14, предлагая эффекты имитируемых микрогравитации на клеточных повреждений может зависеть от ячейки типа. Имитируемой микрогравитации также может вызвать изменения на уровне ультраструктурных, как сообщалось в Организации обеспокоены шпинделя и индуцированных цитоплазматических блеббинг в¹⁵яйцеклеток. Оптимизированный имитируемой микрогравитации условия и механизмы, которые индуцируют инженерных или сотовой повреждения тканей под системы требуют дальнейшего расследования. В vitro эксперименты растущей яичников фолликул/яйцеклеток с использованием RWV устройств может обеспечить ценную информацию о выражения гена ооцитов и данное ооцитов органеллы. В этом исследовании, тканей яичника, содержащие preantral фолликулов и изолированных preantral фолликулы был использован для изучения воздействия искусственной микрогравитациина развитие и яйцеклетка созревания фолликула.

В этом исследовании тканей яичника, содержащие preantral фолликулов и изолированных preantral фолликулы были использованы для изучения воздействия искусственной микрогравитации на развитие и яйцеклетка созревания фолликула. В нашем исследовании, RWV, устройство имитируемой микрогравитации, спинов вокруг горизонтальной оси внутри 5% CO₂ инкубатора, обеспечивая имитируемой микрогравитации состояние с эффективным оксигенации и очень низкого напряжения сдвига. Мы проанализировали выражения гена пролиферирующих клеток ядерного антигена (PCNA) и рост дифференциации фактор 9 (GDF-9) как показатели для развития клеток гранулезы и яйцеклетки, соответственно. Мы продемонстрировали, что выражения PCNA и GDF-9 были подавлены в клетки гранулезы и ооциты, соответственно, когда культивировали в RWV устройство, и мы показали вывода ооцитов микроворсинки от zona pellucida в фолликулах, культивированный под s-µ g состояние, который был похож на что в GDF-9-недостаточным мыши фолликулов¹⁶.

Этические утверждения для этого исследования была получена из животных исследовательской этики Комитет из Вэнь Чжоу медицинский колледж.

1. Подготовка культуры средств массовой информации и альгинат Гидрогель

1. Подготовка тканей яичника и фолликул обработки среднего с использованием среднего L-15 с 10% плода бычьим сывороточным, 100 МЕ/мл пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл. Хранить при 4 ° C в течение двух недель.
2. Подготовка тканей яичника и фолликул питательной среды, состоящей из альфа минимальный основных средних [α-MEM] ДОПОЛНЕНО плода бычьим сывороточным 5% [FBS], 1% инсулина Селена трансферрин, 10 mIU/мл rFSH, пенициллин 100 МЕ/мл и 100 мкг/мл стрептомицина. Хранить при 4 ° C в течение двух недель.
3. Подготовить альгината гидрогеля с помощью 0,8% (w/v) раствора альгината натрия в стерильных PBS, затем падение 10 мкл этого решения в решение инкапсуляции (140 мм NaCl /50 мм CaCl₂) для создания альгината бусины.
   Примечание: Размер бисера альгината было около 3 мм в диаметре.

2. мышь фолликула изоляции и инкапсуляции

1. Отбирать 14 день старый ICR самок мышей, шейки матки вывих, удаление яичников асептически используя ножницы, щипцы и положить яичников в 2 мл обработки среднего.
2. Пополам яичников с помощью скальпеля. Половина размера тканей яичника был толщиной около 1 мм для культуры в среде культуры.
3. Вручную изолировать фолликулов от яичников, используя 26 1/2-guage иглы под стереомикроскопом X 2-4 и собирать выбранные фолликулов для культуры в среде культуры.
   Примечание: Критерии отбора фолликул: 1) фолликулы были круглыми с яйцеклеток в середине и 2-3 слоя клеток гранулезы, окружающих ооцитов, 2) фолликулов нетронутыми базальной мембраны, с некоторых клеток теки прилагается, и размер 3) фолликул был 90-100 мкм в диаметре
4. Создайте альгината бусины в шаге 1.3. Вымойте фолликулов с раствора альгината и затем Пипетка одного фолликула в середину каждого альгината шарик, чтобы убедиться, что каждый шарик содержит один фолликул под стереомикроскопом. После промывки в среде культуры, культуры альгината бусины в 150 мкл питательной среды в 35 × 10 мм культуры блюдо или RWV устройства.

3. яичников ткани или фолликул культуры под искусственной микрогравитации

1. Используйте устройство RWV для создания искусственной микрогравитации. Заполните емкость с легкими парафинового масла (~ 10 мл), место 150 мкл питательной среды в капельки нефти, а затем перевести один кусок ткани яичников или три альгината бусины с инкапсулированным фолликулов в средних капли. Закройте крышку порта судно и исправить судна на базе вращающегося устройства.
2. В элементе управления группы, место бусины альгинат, содержащие фолликулов или тканей яичника в 150 мкл питательной среды в капли, покрытые света парафинового масла в 35 × 10 мм культуры блюд.
3. Инкубируйте культуры блюда и RWV устройства в увлажненные инкубатора при 37 ° C с 5% CO₂ в воздухе.
4. Чтобы изменить питательной среды в RWV устройства: налить масло и среднего от судна в 150 × 20 мм культуры блюдо, передачи яичников бисером ткани или альгината культуры блюдо с питательной среды. Восстановление системы культуры судна за шаг 3.1.

4. деинкапсуляции и Извлечение фолликулов

1. После 4 дней культивирования наливайте масло и среднего от судна в 150 × 20 мм культуры блюдо. Подбирать альгината бисер и decapsulate фолликулов из бисера альгинат, инкубации в обработке среднего дополнена 10 ед/мл альгината лиазы 30 мин при температуре 37 ° C.
2. Собирать фолликулов и затем промойте их в обработке среднего под стереомикроскопом.

5. яичников ткани и фолликул оценки

1. Assay жизнеспособности клетки
   1. Мыть очищенные фолликулов три раза в D-PBS и инкубировать их в 150 мкл комбинированных Assay жизнеспособности клетки реагентов (2 мкм Флуорексон утра и 4 мкм EthD-1) при комнатной температуре 45 мин.
   2. Трансфер фолликулов в чистой микроскопа с 10 мкл D-PBS, крышка с coverslip, а затем уплотнение с четкой ноготь польский.
   3. Количество зеленых и красных клеток в слайды под микроскопом конфокальный флуоресцирования (400 X).
      Примечание: В этот assay жизнеспособности, зеленые клетки живых клеток, и красные клетки мертвые клетки. Фолликулы с менее чем 10% эритроцитов (мертвых), рассматриваются как выжили фолликулов.
2. Гематоксилином и эозином (H & E) окрашивания тканей яичника и фолликул
   1. Исправьте свежие 14-дневных мыши яичников и preantral фолликулов, изолированные от 14-дневного мышей в Буэна в решении как день 0 образцы. Исправить культурной ткани яичников после либо 2- или 4-день культуры и отдельные фолликулы внутри альгината бусы после 4-день культуры как экспериментальные образцы.
   2. Внедрить все образцы в парафин, раздел серийно на 5 микрон толщины и затем пятно с H & E согласно инструкциям производителя.
3. Фолликул подсчета и измерения диаметра
   1. В разделах ткани яичников, окрашенных с H & E, граф все фолликулы и здоровой preantral фолликулов в пределах области раздела ткани под микроскопом (увеличение 400 X). Вычислить плотность фолликула путем деления числа preantral фолликулов на общее количество фолликулов.
      Примечание: здоровый preantral фолликулов являются те, с по крайней мере два слоя клеток гранулезы.
   2. Мера фолликула и яйцеклетки диаметра фолликулов день 0 и 4 день культивированный фолликулов.
4. Иммуногистохимии
   1. Исправить тканей яичника в параформальдегида 4%, внедрить в парафин, раздел 5-мкм-толщиной и монтирования разделов ткани на слайдах. DEWAX разделы, увлажняет и инкубировать их в буфере цитрат для 15 мин блок эндогенной пероксидазы в 3% перекиси водорода, разоблачать антигена в 5% козьего сыворотки и затем инкубации с первичных антител при комнатной температуре в течение 3 ч.
      1. Стирать в PBS на 3 мин, затем инкубировать слайды с разбавленным 1: 500 пероксидазы (ПХ)-конъюгированных коза анти кролик IgG (H + L) за 1 ч при комнатной температуре.
         Примечание: Первичного антитела, используемые в исследовании были антитела анти GDF-9 кролик (разбавления 1: 500) и антитела анти PCNA кролик (разбавления 1: 200).
   2. Инкубируйте слайды яичников секции с 3, 3'-диаминобензидин [DAB] обнаруживать активность пероксидазы и смонтировать на стекле слайды с водной монтажа средних.
   3. Наблюдать за яичников разделе Слайды под микроскопом при 400-кратном.
5. Микроскопия электрона передачи [ТЕА]
   1. Исправить фолликулов в низкотемпературном растворе глютаральдегида 2,5% за 3 ч при комнатной температуре, затем после исправления в 1% осмия тетраоксид за 1 ч при 37 ° C.

6. Статистический анализ

1. Представить все данные в формате среднее ± SEM. Определите, что различия между группами, односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) следуют Тьюки множественные сравнения теста. Α порог значение результата теста был установлен на p < 0,05.

Рисунок 1A показывает RWV с маслом внутри судна. Капля 150 мкл среду, содержащую один кусок ткани яичников или три альгината бусины с инкапсулированным фолликулов была введена в масло. Средний капелька хранилась в состояние терминала скорости из-за жидкости сопротивления на капельки внутри вращающегося нефти в размере 25 вращений в минуту, которая создается условие имитируемой микрогравитации (gs мкг). В эксперименте управления, тканей яичника или капсулированной фолликулы были культивировали в капли 150 мкл среды, покрытые минерального масла в 35 × 10 мм блюда (рис. 1B), которые вызвали 1 -g условие.

Для изучения воздействия искусственной микрогравитации на preantral фолликула развития в пробирке, мы культивировали тканей яичника 14 день старая мышь под 1 -g (управления эксперимент) или s мкг условий. Мы подсчитали количество здоровых фолликулов в H & E, окрашенных секций в двух условий после 0, 2 и 4 дней культуры (рис. 2). Мы обнаружили, что выживание фолликула в тканей яичника лечение в состоянииg s мкг был значительно ниже, чем при 1 -g состояние на 2 день и день 4 культивирования (p < 0,05, ANOVA). Кроме того мы обнаружили, что не PCNA позитивные сигналы были обнаружены в тканей яичника в условияхg s-µ (рис. 3). В культуре изолированных preantral фолликулов, инкапсулированные в альгинатные бусы, мы показали, что значительно больше фолликулов выжили до 1 -g состояние (76,8% ± 5,3%, n = 227) чем условиеg s-µ (54,4% ± 6,7%, n = 249) на 4 день культивирования . Кроме того, размер ооцитов имел никакого существенного увеличения после 4 дней культивирования, хотя фолликула размер значительно возросли в обоих условиях гравитации (рис. 4). Однако, фолликулы с менее чем 10% мертвых гранулезы клеток (рис. 5) были значительно ниже, под 1 -g условие (81,5 ± 5%, n = 10) чем при условииg s-µ (90 ± 8%, n = 10) (p < 0,05).

Для изучения воздействия искусственной микрогравитации на функциональность ооцитов, мы изучили выражение яйцеклетки специфических маркеров GDF-9. Мы продемонстрировали, что выражение GDF-9 был удивительно вниз регулируется в ткани яичников при условииg s-µ (рис. 6). Кроме того мы продемонстрировали частые ультраструктурных аномалии ооцитов органелл в инкапсулированном фолликулов на 4 день культуры в условияхg s-µ (рис. 7).

Рисунок 1 : Установка s-µg и 1-g культура условий. (A) s-µг был создан вращающихся стене судна и хранение предметов культуры в состоянии постоянного падения в пределах перемещения нефти. (B) был создан 1 -g условия культивирования тканей яичника или фолликулов на поверхности чашку Петри, покрыты с минеральным маслом. Стрелка указывает капли среднего. Шкалы бар = 1 см. Этот показатель был изменен с Чжан и др. ¹⁷ пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Эффекты s мкг на яичников культуры ткани. (A) разделы тканей яичника культивировали под 1 -g или s-µg условия для 0, 2 и 4 дней. Шкалы бар = 50 µm. (B) фолликул плотность в разделах тканей яичника. Ошибка бар представляет 1 SEM, *: p < 0,05. Этот показатель был изменен с Чжан и др. ¹⁷ пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : Иммуногистохимия PCNA. Выражение протеина PCNA был рассмотрен в клетках гранулезы в тканей яичника культивировали под 1 -g или s-µg условия для 0, 2 и 4 дней. Шкалы бар = 50 мкм. Этот показатель был изменен с Чжан и др. ¹⁷ пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4 : Эффекты s-µg на культуру инкапсулированное preantral фолликулов в альгинатные бусины. (A) морфология preantral фолликулов культивировали под 1 -g или s-µg условия для 0 дней и 4 дня. Шкалы бар = 50 µm. (B) ооцитов и (C) фолликул диаметром были сопоставлены между 1 g и s-µg условий. Ошибка бар представляет 1 SEM, *: p < 0,05. Этот показатель был изменен с Чжан и др. ¹⁷ пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5 : Assay жизнеспособности клетки. Представитель изображения были взяты под микроскопом при 400-кратном. Пробирного использует Флуорексон AM для визуализации живых клеток окрашенных в зеленых и EthD-1 для визуализации ядер мертвых клеток окрашенных в красный цвет. (A): фолликул с ~ 100% живой гранулезы ячейки (зеленый). (B): фолликул с живой гранулезы ячейки (зеленый), а также более чем 10% мертвых клеток (красный). Шкалы бар = 50 мкм.Этот показатель был изменен с Чжан и др. ¹⁷ пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6 : Иммуногистохимия GDF-9. Выражение протеина GDF-9 был рассмотрен в яйцеклеток в тканей яичника культивировали под 1 -g или s-µg условия для 0, 2 и 4 дней. Шкалы бар = 50 мкм. Этот показатель был изменен с Чжан и др. ¹⁷ пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 7 : Культивированный ультраструктурных анализ изолированных preantral фолликулов под 1 - g или s-µ g условия на 4 день культуры. (A) яйцеклетки с микроворсинки (стрелки) в zona pellucida (1 -g условие). (B-F) Ооциты с большими вакуолей (*), multilamellar органов (#), липидного капель (стрелки), vacuolated митохондрий хватает макул (стрелка) и диспергирования Гольджи (стрелка), соответственно (s-µg состояние). O: ооцитов; ZP: zona pellucida. Этот показатель был изменен с Чжан и др. ¹⁷ пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Важнейшие шаги для успешного культивирования preantral фолликулов являются: 1) правильно выбрав preantral фолликулов в соответствии с критериями отбора, которые были описаны в протокол текста 2.1); 2) брикетирования все процедуры в условие скептически и поддержании стерильных культуры; и 3) правильно Настройка системы культуры RWV.

Обеспечение согласованности экспериментальных наблюдений в реплицировать экспериментов заключается в использовании аналогичных или идентичных материалов. Критерии отбора мыши preantral фолликулов показали, что фолликулы 1) здоровых яйцеклеток на стадии распада (GVBD) Жерминаль везикул, окружен тонкой вителлинового; 2) 2-3 слоя клеток гранулезы, окруженная базальной мембраны; и 3) некоторые гнойный клетки придают базальной мембраны. Таким образом, фолликулы выбран был не только все три функциональные отсеки яичников фолликула для поддержки роста яйцеклеток, но и аналогичные морфологической идентификации с диаметром 90-100 мкм.

Это первая попытка расти мыши preantral фолликулов в манере 3D, культивирование под искусственной микрогравитации. Некоторые культуры системы были разработаны для мыши preantral фолликулов. Ооциты, полученные из фолликула, культивируемых на плоской поверхности чашки Петри, так называемые 2D культуры, может быть оплодотворена и производимых живой потомство. Кроме того 3D культур, таких как культур фолликулов в альгинатные бусы, поддерживают структуру ткани похож на то, что тело производит в высокий процент meiotically компетентные ооцита. Однако процесс развития яичников фолликул/яйцеклеток в поле нулевой гравитации неизвестно. RWV, устройство, которое привлекает к себе значительное внимание в тканевой инженерии, можно создавать среде имитируемой микрогравитации и обеспечивают идеальные условия для изучения воздействия искусственной микрогравитации на рост яичников фолликула/ооцитов в пробирке.

Важно настроить RWV аппарат правильно для клеточной культуры. Пузырьков воздуха в сосуде должно быть удалено. Метод для удаления пузырьков воздуха, если в сосуде, является следующим: место два шприцы с 0,5 мл масла в каждый из двух шприц портов. Откройте клапаны управления портов шприца. Маневр пузырьков воздуха под порт шприца. Тянут пузырьков в шприц при парентеральном примерно такой же объем средств массовой информации через другой порт шприца. После того, как будут удалены все пузыри, закройте клапаны, удалите шприцы и заменить шприц порт шапки. Важно также, чтобы узнать правильный вращения, которая предотвращает клеток от урегулирования через постоянное вращение. Оптимизация скорости вращения определяется удельный вес клетки, жидкость плотности и вязкости.

Выражение профили PCNA и GDF-9, которые были аналогичны GDF-9-недостаточным мыши фолликулов¹⁶, показали, что имитируемой микрогравитации пагубное воздействие на развитие клеток гранулезы и яйцеклеток. Судно RWV устройства вращаться вокруг горизонтальной оси внутри 5% CO₂ инкубатора, позволяя для проникновения кислорода и углекислого газа через мембрану в спину, обеспечивая эффективную оксигенацию и очень низкое напряжение сдвига, который вряд ли может быть причиной травмы фолликула/ооцитов. Оптимизация работы экспериментальной установки и дальнейшего анализа необходимо исследовать механизм пагубные последствия.

Необходимы дальнейшие исследования, чтобы исследовать потенциал развития яйцеклеток в пробирке , полученных от системы культуры RWV. В настоящее время осуществляется в vitro созревания яйцеклеток MII сцену. Окончательной проверки этой культуры системы будут рассмотрены возможности оплодотворения проверено яйцеклеток.

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Авторы хотели бы поблагодарить Илу Wang и Чжао Yanlin за их помощь в поддержании животных, Чжан Чан за ее помощь в подготовке гистологические образцы и доктор Международный он критически чтения этой рукописи. Эта работа была поддержана естественных наук фонд провинции Чжэцзян (номер гранта: LY13C120002).