Method Article
بنيات تقنية واعدة جداً لتوليد الأنسجة دون استخدام مصفوفة لخلايا الثقافة في حالة محاكاة الجاذبية الصغرية. باستخدام نظام ثقافة روتاري، قمنا بدراسة نمو جريب المبيض ونضوج البويضات من حيث بقاء المسام ومورفولوجيا، والنمو، والدالة البويضيه تحت ظروف محاكاة الجاذبية الصغرية.
كانت المحتضنة أنسجة المبيض الماوس عمره يوما والمسام بريانترال المعزولة من الفئران نفس سن 14 في نظام ثقافة محاكاة الجاذبية الصغرية. الكمية قيمنا بقاء المسام والمسام المقاسة وأقطار البويضيه، ودرست أولتراستروكتوري بويضات أنتجت من هذا النظام. لاحظنا بقاء جريب انخفض، downregulation التعبير عن تكاثر الخلية مستضد النووية وعامل التمايز النمو 9، كمؤشرات لتنمية الخلايا granulosa وبويضات، على التوالي، والبويضات ultrastructural شذوذ تحت ظروف محاكاة الجاذبية الصغرية. يحتاج الإعداد التجريبي محاكاة الجاذبية الصغرية يكون الأمثل لتقديم نموذج لتحقيق الآليات المعنية بالبويضات/جريب التطوير في المختبر .
في المختبر التنمية جريب المبيض ونضوج البويضات قد تحققت باستخدام الأساليب التقليدية للثقافة ثنائي الأبعاد، كما هو الحال على سطح أطباق بيتري، ومصفوفة (ثلاثي الأبعاد) الأبعاد الثلاثة، مثل الجينات والمائية1 ،،من23. نظام 3D ثقافة الحفاظ على المسام في بنية الأنسجة مثل فعالية وأبقى ملامح التعبير الجيني مماثلة كما في فيفوالمسام4 ، وإنتاج بويضات المختصة ميوتيكالي5،6. يمكن أيضا إنشاء أنظمة الثقافة 3D في حالة خالية من المصفوفة، على سبيل المثال، انخفاض معلقة تعليق والسفن المتداول. السفينة الجدار الدورية (روف) وضعتها "الإدارة الوطنية للملاحة الجوية" والفضاء (ناسا) يولد محاكاة الجاذبية الصغرية (s-μg) للخلايا المزروعة داخل السفينة7. هذا محاكاة الجاذبية الصغرية شرط توفر نظام ثقافة فريدة من نوعها لتكاثر الخلايا والتمايز بسبب عدم الترسيب للحمل الحراري. وقد ثبت أن محاكاة الجاذبية الصغرية تشجيع تشكيل السفينة غشائي من خلايا بطانية8،9, تجميع من خلايا الغدة الدرقية10، وتشوندروجينيسيس تستمد الدهنية أنسجة الغدة الدرقية الخلايا الجذعية الوسيطة في روف الأجهزة11. ومع ذلك، أظهرت دراسات أخرى أن محاكاة الجاذبية الصغرية التي يسببها المبرمج في خلايا المعدة وب ليمفوبلاستس12،،من1314، مما يوحي بالآثار محاكاة الجاذبية الصغرية على الضرر الخلوي قد تكون الخلايا المعتمدة على النوع. يمكن أيضا أن يسبب تغييرات على مستوى ultrastructural، كما ورد في المنظمة المغزل الانزعاج محاكاة الجاذبية الصغرية والتي يسببها بلبينغ هيولى في بويضات15. الشروط الأمثل محاكاة الجاذبية الصغرية والآليات التي تسبب إصابات الأنسجة الهندسة أو الخلوية تحت النظام تتطلب مزيدا من التحقيق. تجارب في المختبر لزراعة بصيلات/بويضات المبيض باستخدام أجهزة روف يمكن أن توفر معلومات قيمة في التعبير الجيني البويضات وأولتراستروكتوريس من العضيات البويضات. في هذه الدراسة، تم استخدام أنسجة المبيض التي تحتوي على بريانترال المسام وبصيلات بريانترال معزولة للتحقيق في آثار محاكاة الجاذبية الصغريةعلى نضوج البويضات والتنمية جريب.
في هذه الدراسة، استخدمت أنسجة المبيض التي تحتوي على بريانترال المسام وبصيلات بريانترال معزولة للتحقيق في آثار محاكاة الجاذبية الصغرية على نضج جريب التنمية والبويضات. في دراستنا، روف، توفير جهاز محاكاة الجاذبية الصغرية، ويدور حول محور أفقي داخل حاضنة2 CO 5% شرط محاكاة الجاذبية الصغرية بكفاءة الأوكسجين وإجهاد القص منخفضة جداً. قمنا بتحليل الجينات تعابير تكاثر الخلايا النووية مستضد (منها) وعامل نمو التمايز 9 (GDF-9) كمؤشرات لتنمية الخلايا granulosa وبويضات، على التوالي. أظهرنا أن تعبيرات منها وغاز فرنسا-9 تم منعها في الخلايا granulosa وبويضات، على التوالي، عندما مثقف في الجهاز روف، واظهرنا سحب البويضات زغيبات من بيلوسيدا زونا في المسام مثقف تحت s-μ ز الشرط، الذي يماثل في المسام الماوس GDF 9-تفتقر إلى16.
تم الحصول على الموافقة الأخلاقية لهذه الدراسة من "الحيوان بحوث أخلاقيات اللجنة من ون تشو كلية الطب".
1-إعداد وسائل الإعلام الثقافة والجينات المائية
2-الفأر جريب العزل والتغليف
3-المبيض الأنسجة أو الثقافة جريب تحت ظروف محاكاة الجاذبية الصغرية
4-إلغاء التغليف واسترجاع جريب
5-المبيض الأنسجة وتقييم جريب
6. التحليل الإحصائي
ويبين الشكل 1A روف مع النفط داخل السفينة. وضع قطرات من 150 ميليلتر المتوسطة التي تحتوي على قطعة واحدة من أنسجة المبيض أو ثلاث حبات الجينات مع بصيلات مغلفة بالنفط. الحبرية المتوسطة أبقى في حالة محطة السرعة نظراً لسحب السوائل في القطرات داخل النفط الدورية بمعدل 25 تناوب في الدقيقة، التي ولدت شرط محاكاة الجاذبية الصغرية (s-μg). في تجربة التحكم، كان مثقف أنسجة المبيض أو المسام كابسولاتيد في معالجة تجميعية من 150 ميليلتر المتوسطة مغطاة بالزيت المعدني في 35 × 10 مم الأطباق (الشكل 1B)، التي ولدت 1-ز الشرط.
لدراسة آثار الجاذبية الصغرية المحاكاة على جريب بريانترال التنمية في المختبر، ونحن مثقف أنسجة المبيض 14 يوم من العمر الماوس تحت 1-ز (تجربة التحكم) أو ظروف s-ميكروغرام. احصينا عدد المسام صحية في ح & ه الملون المقاطع في هذين الشرطين بعد أيام 0 و 2، و 4 من الثقافة (الشكل 2). وجدنا أن بقاء المسام في أنسجة المبيض تعامل في الشرطز s-μ كان أقل بكثير من التي تحت 1-شرطز في اليوم الثاني واليوم الرابع لاستزراع (ف < 0.05، ANOVA). وعلاوة على ذلك، وجدنا أن لا منها إيجابية تم الكشف عن الإشارات في أنسجة المبيض بشرطز s-μ (الشكل 3). في ثقافة معزولة المسام بريانترال مغلفة في الجينات الخرز، ونحن كشفت أن كبير نجا المسام أكثر تحت 1-شرطز (76.8 في المائة ± 5.3 في المائة، n = 227) من شرطز s-μ (± 54.4 في المائة 6.7%، ن = 249) في يوم 4 من استزراع . وبالإضافة إلى ذلك، حجم بويضتها كان لا زيادة كبيرة بعد 4 أيام من استزراع، على الرغم من المسام حجم زيادة كبيرة سواء في ظروف الجاذبية (الشكل 4). بيد أن المسام مع أقل من 10% granulosa الميت الخلايا (الشكل 5) كانت أقل بكثير إطار 1-شرطز (81.5 ± 5%، n = 10) من تحت شرطز s-μ (90 ± 8%، ن = 10) (ف < 0.05).
للتحقيق في آثار محاكاة الجاذبية الصغرية على وظيفة البويضيه، قمنا بدراسة التعبير عن علامة محددة البويضيه GDF-9. أظهرنا أن التعبير GDF-9 كان ملحوظا لأسفل ينظم في أنسجة المبيض تحت شرطز s-μ (الشكل 6). وباﻹضافة إلى ذلك، أثبتنا شذوذ ultrastructural متكررة من العضيات البويضات في المسام مغلفة في اليوم الرابع للثقافة بشرطز s-μ (الشكل 7).
الشكل 1 : برنامج الإعداد من s-μg و 1-ز الثقافة الشروط. (A) s-μغ تم إنشاؤه بتدوير السفينة الجدار وإبقاء المواضيع الثقافة في حالة الحرة مستمرة في نقل النفط. (ب) 1-ز الشرط تم إنشاؤه باستزراع الأنسجة المبيض أو المسام على سطح طبق بيتري مغطاة بالزيت المعدني. يشير السهم إلى معالجة تجميعية للمتوسطة. مقياس بار = 1 سم. وقد تم تعديل هذا الرقم من تشانغ et al. 17 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : آثار ميكروغرام s في زراعة أنسجة المبيض. (A) أجزاء من أنسجة المبيض شروطg أو s-μغ مثقف تحت 1-0 و 2، و 4 أيام. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ب) جريب الكثافة في المقاطع أنسجة المبيض. خطأ بار SEM يمثل 1، *: ف < 0.05. وقد تم تعديل هذا الرقم من تشانغ et al. 17 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : إيمونوهيستوتشيميستري منها. تم بحث تعبير البروتين منها في الخلايا granulosa في أنسجة المبيض شروطg أو s-μغ مثقف تحت 1-0 و 2، و 4 أيام. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من تشانغ et al. 17 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : آثار μ sز على ثقافة المسام بريانترال مغلفة في الجينات الخرز. مورفولوجيا (A) من المسام بريانترال مثقف تحت 1-g أو s-μg الشروط لأيام 0 و 4 أيام. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ب) البويضيه القطر والقطر جريب (ج) مقارنة بين ز 1 وظروفز s-μ. خطأ بار SEM يمثل 1، *: ف < 0.05. وقد تم تعديل هذا الرقم من تشانغ et al. 17 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : خلية بقاء المقايسة. وأخذت صور الممثل تحت مجهر على 400 X التكبير. استخدامات التحليل كالسين صباحا تصور الخلايا الحية الملون باللون الأخضر واتهد-1 تصور نويات الخلايا الميتة الملون باللون الأحمر. (أ): المسام مع الخلايا granulosa لايف ~ 100% (أخضر). (ب): المسام مع الخلايا granulosa لايف (الأخضر)، فضلا عن أكثر من 10% من الخلايا الميتة (أحمر). شريط المقياس = 50 ميكرومتر.وقد تم تعديل هذا الرقم من تشانغ et al. 17 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : إيمونوهيستوتشيميستري من غاز فرنسا-9- تم بحث تعبير البروتين GDF-9 في بويضات في أنسجة المبيض شروطg أو s-μغ مثقف تحت 1-0 و 2، و 4 أيام. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من تشانغ et al. 17 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 7 : تحليل ultrastructural للمسام بريانترال معزولة مثقف تحت 1- ز أو s-μ ز الظروف في يوم 4 من الثقافة- (أ) البويضات مع زغيبات (الأسهم) تمتد إلى بيلوسيدا زونا (1-ز الشرط). (إف ب) بويضات مع كبير فاكوليس (*)، مولتيلاميلار الهيئات (#)، قطيرات الدهن (الأسهم)، والرغوة الميتوكوندريا التي تفتقر إلى كريستي (السهم)، وتشتيت جهاز غولجي (سهم)، على التوالي (شرطز s-μ). O: البويضيه؛ ZP: zona pellucida. وقد تم تعديل هذا الرقم من تشانغ et al. 17 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الخطوات الحاسمة لنجاح استزراع تجاويف بريانترال: 1) بشكل صحيح تحديد المسام بريانترال وفقا لمعايير الاختيار التي وصفت في 2.1 نص البروتوكول)؛ 2) preforming جميع الإجراءات في حالة تشكك والحفاظ على ثقافة عقيمة؛ و 3) إعداد بشكل صحيح في نظام الثقافة روف.
الحفاظ على اتساق الملاحظات التجريبية في تكرار التجارب استخدام مواد متشابهة أو متطابقة. معايير لاختيار الماوس بريانترال المسام كشفت أن المسام 1) بويضات صحية في مرحلة انهيار (جفبد) حويصلة جيرمنال محاطة بيلوسيدا زونا رقيقة؛ 2) 2-3 طبقات من الخلايا granulosa محاطة بغشاء القاعدي؛ و 3) بعض الخلايا thecal يعلق على الغشاء القاعدي. وهكذا، كان المسام المحدد ليس فقط كل ثلاث مقصورات الوظيفية جريب المبيض لدعم نمو البويضات، ولكن أيضا تحديد الخصائص مورفولوجية مماثلة يبلغ قطرها 90-100 ميكرومتر.
وهذا هو أول محاولة لزراعة بصيلات بريانترال الماوس في طريقة 3D استزراع تحت ظروف محاكاة الجاذبية الصغرية. وقد وضعت عدة نظم للثقافة للمسام بريانترال الماوس. يمكن أن تكون مخصبة بويضات تم الحصول عليها من المسام مثقف على سطح مستو من أطباق بيتري، ما يسمى بثقافة ثنائية الأبعاد، وتنتج ذرية حية. وعلاوة على ذلك، الثقافات ثلاثية الأبعاد، مثل الثقافات تجاويف في الجينات الخرز، الاحتفاظ ببنية أنسجة مشابهة للجسم ما ينتج في ارتفاع النسبة المئوية بويضات ميوتيكالي المختصة. ومع ذلك، عملية التنمية في المسام/بويضات المبيض في حقل الجاذبية صفر غير معروف. روف، جهاز الذي يجتذب اهتماما كبيرا في هندسة الأنسجة، يمكن أن تولد بيئة محاكاة الجاذبية الصغرية وتوفير بيئة مثالية للتحقيق في آثار محاكاة الجاذبية الصغرية على نمو جريب المبيض/بويضات في المختبر.
من المهم إعداد أجهزة روف ثقافة الخلية بشكل صحيح. يجب إزالة فقاعات الهواء في السفينة. طريقة لإزالة فقاعات الهواء، إذا ولدت في السفينة، وكما يلي: مكان الحقن اثنين مع 0.5 مل نفط في كل من موانئ اثنين حقنه. فتح صمامات التحكم في المنافذ المحاقن. مناورة فقاعات الهواء تحت المنفذ المحاقن. سحب الفقاعات في المحاقن أثناء الحقن تقريبا نفس حجم الوسائط عن طريق ميناء حقنه أخرى. بعد إزالة جميع فقاعات، إغلاق الصمامات وإزالة الحقن، واستبدال قبعات ميناء حقنه. من المهم أيضا معرفة سرعة دوران الصحيح، مما يمنع الخلايا من تسوية عن طريق تناوب مستمر. الأمثل لسرعة دوران يتحدد بوزن محدد من الخلايا وكثافة السوائل واللزوجة.
وكشفت ملامح التعبير منها وغاز فرنسا-9، ومماثلة لتلك الموجودة في المسام الماوس GDF 9-تفتقر إلى16، أن محاكاة الجاذبية الصغرية قد آثار ضارة على التنمية للخلايا granulosa وبويضات. سفينة الجهاز روف نسج حول محور أفقي داخل حاضنة2 CO 5%، تسمح بتخلل للأكسجين وثاني أكسيد الكربون عبر غشاء في الظهر، وتوفير الأوكسجين فعالة ومنخفضة للغاية القص الإجهاد، والتي كان من المرجح أن تكون سبب الإصابة جريب/البويضات. الأمثل للإعداد التجريبية وتحاليل أخرى مطلوبة للتحقيق في الآلية آثار ضارة.
يلزم إجراء مزيد من الدراسات التحقيق في إمكانات النمو في المختبر بويضات مستمدة من نظام الثقافة روف. حاليا تجري في المختبر نضوج بويضات إلى مرحلة صناعة المعلومات. سيدرس المصادقة النهائية على هذا النظام الثقافة قدرة إخصاب بويضات تم استردادها.
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
المؤلف يود أن يشكر ييلونغ وانغ تشاو صفحاتها لمساعدتها في الحفاظ على الحيوانات وتشانغ تشان لمساعدتها في إعداد عينات نسيجية والدكتور سونجتاو أنه للغاية قراءة هذا المخطوط. هذا العمل كان تدعمها "مؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة تشجيانغ" (منح رقم: LY13C120002).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
ICR mice | SLRC Laoratory | 14-day-old female mice | |
L-15 medium | Sigma | L1518 | With L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
fetal bovine serum | Gibco | 10100147 | Origin: Australia |
Penicillin V potassium | Sigma | 1504503 | United States Pharmacopeia (USP) Reference Standard (USP) |
Streptomycin sesquisulfate hydrate | Sigma | 46754 | Analytical standard |
Universal Click Pen Needles | Penfine | 12×1/2" 0.33×12 mm | |
Alginate | Sigma | W201502 | |
alpha-minimal essential medium | Sigma | M0894 | Alpha Modification, with L-glutamine, without ribonucleosides, deoxyribonucleosides and sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture |
Insulin-selenium-transferrin | Invitrogen | 51500056 | Liquid, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
GONAL-F | Merck Serono | Recombinant follitropin alfa for injection | |
Disposable high-aspect-ratio rotating vessel | Synthecon | 10 mL | |
Culture oil | Vitrolife | Sterile light paraffin oil | |
Alginate Lyase | Sigma | A1603 | powder, >10,000 units/g solid |
26 1/2-guage needle | Becton Dickinson | ||
35×10mm dish | Becton Dickinson | ||
Viability/Cytotoxicity assay Kit | Invitrogen | L3224 | |
Bouin’s solution | Sigma | HT10132 | |
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno-Research Laboratories | 111-035-003 | |
3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride | Beyotime | P0203 | |
Aqueous mounting medium | Dako | C0563 | |
Rabbit anti-GDF-9 antibody | Beijing Biosynthesis Biotechnology | BS-175R | |
Rabbit anti-PCNA antibody | Proteintech | 24036-1-AP | |
Methylene blue | Sigma | M9140 | |
Transmission electron microscope | Hitachi | H-7500 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved