In Vitro Crescita dei follicoli preantrali Mouse sotto condizioni di microgravità simulata

Una tecnica molto promettente per generare tessuto costruisce senza utilizzo di matrice consiste di cellule di coltura in condizioni di microgravità simulata. Utilizzando un sistema rotativo cultura, abbiamo esaminato il follicolo ovarico crescita e la maturazione degli ovociti in termini di sopravvivenza del follicolo, morfologia, crescita e funzione degli ovociti sotto la condizione di microgravità simulata.

14 tessuto ovarico giorno-vecchio mouse e follicoli preantrali isolate da topi della stessa età sono state incubate in un sistema di coltura di microgravità simulata. Abbiamo quantitativamente valutata follicolo sopravvivenza, follicolo misurato e diametri degli ovociti ed esaminato l'ultrastruttura degli ovociti prodotta dal sistema. Abbiamo osservato la sopravvivenza in diminuzione del follicolo, downregulation di espressioni di proliferazione delle cellule antigene nucleare e fattore di differenziazione di crescita 9, come indicatori per lo sviluppo di cellule della granulosa e di ovociti, rispettivamente e ultrastrutturali degli ovociti anomalie nella circostanza di microgravità simulata. Apparato sperimentale di microgravità simulata deve essere ottimizzato per fornire un modello di indagine dei meccanismi coinvolti nello sviluppo in vitro degli ovociti/follicolo.

In vitro sviluppo del follicolo ovarico e la maturazione degli ovociti sono stati raggiunti utilizzando metodi tradizionali per la cultura 2-dimensionale, come sulla superficie delle piastre di Petri e tre dimensionale matrix (3D), ad esempio alginato e idrogel^{1 ,2,3}. Un sistema di coltura 3D efficacemente mantenuto follicoli in una struttura del tessuto e tenuto i profili di espressione genica simile come in vivo⁴ follicoli e prodotto meiotically competenti ovociti^5,6. Sistemi di coltura 3D possono essere stabilite anche in uno stato privo di matrice, ad esempio, sospensione goccia sospensione e rotolamento dei vasi. La nave di parete rotante (RWV) sviluppata dalla National Aeronautics and Space Administration (NASA) genera una microgravità simulata (s-µg) per le cellule coltivate all'interno la nave⁷. La microgravità simulata condizione fornisce un sistema di cultura unica per proliferazione e differenziazione cellulare a causa della mancanza di sedimentazione per convezione. È stato dimostrato che microgravità simulata promosso la formazione del vaso endoteliale di cellule endoteliali^8,9, tessuto tiroideo assemblaggio da tiroide cellule¹⁰e chondrogenesis da adiposo-derivate cellule staminali mesenchimali in RWV dispositivi¹¹. Tuttavia, altri studi hanno indicato che la microgravità simulata ha indotto gli apoptosi in cellule gastriche e simulato B linfoblasti^12,13,14, suggerendo gli effetti della microgravità sulla lesione cellulare può essere il cellulare a seconda del tipo. Microgravità simulata potrebbe anche causare cambiamenti a livello ultrastrutturale, come riportato nell'organizzazione mandrino disturbato e indotto blebbing citoplasmico in ovociti¹⁵. Le condizioni di microgravità simulata ottimizzata e i meccanismi che inducono lesioni cellulari o ingegneria del tessuto sotto il sistema richiedono ulteriori indagini. Esperimenti in vitro di follicoli ovarici/ovociti utilizzando dispositivi RWV in crescita possono fornire informazioni preziose su espressioni geniche ovocita e ultrastrutture degli organelli ovocita. In questo studio, tessuto ovarico contenente follicoli preantrali e follicoli preantrali isolati è stato usato per studiare gli effetti della microgravità simulatasulla maturazione del follicolo sviluppo e ovocita.

In questo studio, tessuto ovarico contenente follicoli preantrali e follicoli preantrali isolati sono stati utilizzati per studiare gli effetti della microgravità simulata su sviluppo e ovocita maturazione del follicolo. Nel nostro studio, RWV, un dispositivo di microgravità simulata, rotazioni attorno ad un asse orizzontale all'interno di un incubatore a CO₂ 5%, fornendo una condizione di microgravità simulata con ossigenazione efficiente e molto bassa sollecitazione di taglio. Abbiamo analizzato le espressioni geniche di antigene nucleare delle cellule di proliferazione (PCNA) e fattore di differenziazione di crescita 9 (GDF-9) come indicatori per lo sviluppo di cellule della granulosa e di ovociti, rispettivamente. Abbiamo dimostrato che le espressioni di PCNA e GDF-9 sono stati soppressi nelle cellule della granulosa e ovociti, rispettivamente, quando coltivate nel dispositivo RWV, e vi abbiamo mostrato il ritiro dei microvilli ovocita da zona pellucida nei follicoli coltivati sotto il s-µ g condizione, che era simile a quella di GDF-9-carenti del mouse follicoli¹⁶.

Approvazione etica per questo studio è stata ottenuta dal animale ricerca etica Comitato di Wen Zhou Medical College.

1. preparazione di terreni di coltura e di alginato idrogel

1. Preparare il tessuto ovarico e movimentazione follicolo mezzo mezzo L-15 con 10% siero bovino fetale, 100 UI/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina. Conservare a 4 ° C per due settimane.
2. Preparare il tessuto ovarico e follicolo terreno di coltura costituito da Alfa-minimal essenziale supplementato [α-MEM] con 5% di siero fetale bovino [FB], 1% insulina-selenio-transferrina, 10 rFSH mIU/ml, 100 UI/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina. Conservare a 4 ° C per due settimane.
3. Preparare idrogel di alginato utilizzando soluzione di alginato di sodio 0,8% (p/v) in PBS sterile, quindi cadere 10 µ l di questa soluzione la soluzione di incapsulamento (140 mM NaCl 50 mM CaCl₂) per creare perle di alginato.
   Nota: Il formato del branello di alginato è stato circa 3 mm di diametro.

2. mouse follicolo isolamento e incapsulamento

1. Abbattere il 14 giorno-vecchi topi femminili di ICR di dislocazione cervicale, rimuovere ovaie asetticamente con delle forbici, pinze e mettere le ovaie in 2 mL di movimentazione media.
2. Tagliare le ovaie a metà usando un bisturi. Il tessuto ovarico miniatura era circa 1 mm di spessore per coltura in terreno di coltura.
3. Manualmente isolare follicoli dalle ovaie usando gli aghi di calibro 26 1/2 sotto uno stereomicroscopio X 2-4 e raccogliere i follicoli selezionati per coltura in terreno di coltura.
   Nota: Criteri di selezione del follicolo: 1) follicoli erano in tondo con gli ovociti nel mezzo e 2-3 strati di cellule della granulosa che circondano gli ovociti, 2) follicoli avevano una membrana basale intatta associata con alcune cellule della teca e dimensione 3) follicolo era 90-100 µm di diametro
4. Creare perline di alginato per passaggio 1.3. Lavare i follicoli con soluzione di alginato e quindi dispensare un singolo follicolo nel mezzo di ogni branello di alginato per assicurarti che ogni perla contiene un singolo follicolo sotto un microscopio stereoscopico. Dopo il risciacquo in terreno di coltura, cultura l'alginato perline in 150 µ l di terreno di coltura in un 35 × 10 cultura mm piatto o un dispositivo RWV.

3. tessuto ovarico o follicolo cultura sotto condizioni di microgravità simulata

1. Utilizzare un dispositivo RWV per la generazione di microgravità simulata. Riempire il serbatoio con olio di paraffina leggera (~ 10 mL), inserire l'olio 150 µ l di terreno di coltura in una goccia, poi trasferire un pezzo di tessuto ovarico o tre perle di alginato con follicoli incapsulati nella gocciolina media. Chiudere il tappo del vaso porta e fissare la nave sulla base rotante del dispositivo.
2. In controllo gruppi, luogo perline di alginato contenente follicoli o tessuto ovarico in 150 µ l di terreno di coltura in una gocciolina ricoperte di olio di paraffina leggera in 35 × 10 piatti di cultura mm.
3. Incubare le piastre di coltura e il dispositivo RWV in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO₂ nell'aria.
4. Per modificare il terreno di coltura in dispositivo RWV: versare l'olio e mezzo dalla nave in una piastra di coltura del mm di 20 di 150 ×, trasferire le perle ovariche di tessuto o alginato a una piastra di coltura con terreno di coltura. Ristabilire il sistema cultura del vaso al punto 3.1.

4. decapsulation e recupero del follicolo

1. Dopo 4 giorni di coltura, versare l'olio e mezzo dalla nave in una piastra di coltura del mm di 20 di 150 ×. Raccogliere perle di alginato e follicoli estrae dalle perle di alginato incubando nel maneggiamento supplementato con 10 liasi di alginato U/mL per 30 min a 37 ° C.
2. Raccogliere i follicoli e poi lavarli in movimentazione mezzo sotto un microscopio stereoscopico.

5. tessuto ovarico e valutazione del follicolo

1. Analisi di attuabilità delle cellule
   1. Lavare i follicoli decapsulato tre volte in D-PBS e poi li Incubare in 150 µ l di reagenti analisi di attuabilità delle cellule combinati (2 µM calceina e 4 µM EthD-1) a temperatura ambiente per 45 min.
   2. Trasferire i follicoli ad un vetrino pulito con 10 µ l D-PBS, coprire con un vetrino coprioggetti e quindi sigillare con smalto per unghie trasparente.
   3. Conte verde e globuli rossi nei vetrini con un microscopio a fluorescenza confocale (400 X).
      Nota: In questa analisi di attuabilità, verde cellule sono cellule vive, e globuli rossi sono le cellule morte. Follicoli con meno di 10% di eritrociti (morti) sono considerati come follicoli è sopravvissuti.
2. Ematossilina ed eosina (H & E) la macchiatura del tessuto ovarico e follicolo
   1. Difficoltà fresco 14-giorno-vecchio mouse ovaie e follicoli preantrali isolate da topi 14-giorno-vecchio in soluzione di Bouin come campioni di giorno 0. Difficoltà coltivato tessuto ovarico dopo cultura 2- o 4-giorno e singoli follicoli all'interno delle perle di alginato dopo 4 giorni cultura come campioni sperimentali.
   2. Incorporare tutti i campioni in paraffina, sezione in serie a 5 µm di spessore e quindi macchia con H & E secondo le istruzioni del produttore.
3. Follicolo di conteggio e misurazione del diametro
   1. Nelle sezioni di tessuto ovarico macchiate con H & E, contare tutti i follicoli e follicoli preantrali sani all'interno dell'area di sezione dei tessuti al microscopio (ingrandimento 400x). Calcolare la densità di follicolo dividendo il numero dei follicoli preantrali per il numero totale dei follicoli.
      Nota: i follicoli preantrali sani sono quelli con almeno due strati di cellule della granulosa.
   2. Misura diametro del follicolo e dell'ovocita dei follicoli giorno 0 e 4 ° giorno coltivate follicoli.
4. Immunohistochemistry
   1. Difficoltà tessuto ovarico in paraformaldeide al 4%, incorporare in paraffina, sezione a 5 µm di spessore e montare le sezioni di tessuto su vetrini. Sparaffinatura le sezioni, reidratare e incubare in tampone citrato per 15 min. blocco della perossidasi endogena in 3% di perossido di idrogeno, smascherare antigene nel siero di capra del 5% e poi incubare con gli anticorpi primari a temperatura ambiente per 3 h.
      1. Lavate in PBS per 3 min, quindi incubare i vetrini con 1: 500 diluito perossidasi di rafano (HRP)-coniugato capra anti-coniglio IgG (H + L) per 1 h a temperatura ambiente.
         Nota: Gli anticorpi primari utilizzati nello studio erano anticorpo di coniglio anti-GDF-9 (diluizione 1: 500) e l'anticorpo di coniglio anti-PCNA (diluizione 1: 200).
   2. Incubare i vetrini sezione ovarico con 3, 3'-diaminobenzidina [DAB] per rilevare l'attività di perossidasi e Monte sulle lastre di vetro con montaggio acquoso.
   3. Osservare diapositive sezione ovarico con un microscopio a 400 ingrandimenti.
5. Microscopia elettronica di trasmissione [TEM]
   1. Difficoltà follicoli in glutaraldeide al 2,5% per 3 ore a temperatura ambiente, poi post-fissare in tetrossido di osmio 1% per 1 h a 37 ° C.

6. elaborazione statistica

1. Presentare tutti i dati in formato media ± SEM. Determinare che le differenze tra gruppi di analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) seguirono da Tukey più test di confronto. La soglia α per il significato del risultato di prova è stata fissata a p < 0.05.

Figura 1A Mostra un RWV con olio all'interno del recipiente. Una gocciolina di 150 mezzo di µ l contenente un pezzo di tessuto ovarico o tre perle di alginato con follicoli incapsulati è stato messo nell'olio. La gocciolina media è stata mantenuta in uno stato di velocità terminale a causa della resistenza fluida sulle goccioline all'interno l'olio rotante a velocità di 25 giri al minuto, che ha generato una condizione di microgravità simulata (s-µg). In un esperimento di controllo, tessuto ovarico o capsulated follicoli sono state coltivate in una gocciolina di 150 µ l mezzo coperto con olio minerale in 35 × 10mm piatti (Figura 1B), che ha generato un 1 - condizione dig .

Per studiare gli effetti della microgravità simulata il follicolo preantrali sviluppo in vitro, abbiamo coltivato il tessuto ovarico 14 giorno-vecchio mouse sotto 1 - condizioni di s-µ g og (esperimento di controllo). Abbiamo contato il numero di follicoli sani nella H & E sezioni in due condizioni macchiate dopo 0, 2 e 4 giorni di coltura (Figura 2). Abbiamo trovato che la sopravvivenza del follicolo in tessuto ovarico trattato nella s-µg condizione era notevolmente inferiore a quello sotto 1 - condizioneg al giorno 2 e 4 giorno di coltura (p < 0,05, ANOVA). Inoltre, abbiamo non scoperto che nessun PCNA positivo segnali sono stati rilevati nel tessuto ovarico nella circostanza dig s-µ (Figura 3). Nella cultura dei follicoli preantrali isolati incapsulato in perline di alginato, abbiamo rivelato che significativamente più follicoli sopravvissero sotto 1 - condizioneg (76,8% ± 5,3%, n = 227) rispetto a s-µg condizione (54,4% ± 6,7%, n = 249) il giorno 4 di coltura . Inoltre, ovocita dimensioni non aveva alcun aumento significativo dopo 4 giorni di coltura, anche se il follicolo dimensione aumentata significativamente in entrambi condizioni di gravità (Figura 4). Tuttavia, follicoli con meno di 10% di cellule della granulosa morto (Figura 5) erano significativamente più bassi sotto la 1 -g condizione (81,5 ± 5%, n = 10) rispetto a s-µg nella circostanza (90 ± 8%, n = 10) (p < 0.05).

Per studiare gli effetti della microgravità simulata sulla funzionalità degli ovociti, abbiamo esaminato l'espressione del marcatore specifico ovocita GDF-9. Abbiamo dimostrato che l'espressione GDF-9 era notevolmente down-regolata in tessuto ovarico in condizione di s-µg (Figura 6). Inoltre, abbiamo dimostrato frequenti anomalie ultrastrutturali degli organelli di ovociti nei follicoli incapsulati al giorno 4 della cultura sotto la condizione di s-µg (Figura 7).

Figura 1 : Installazione di s -µg e 1-g cultura condizioni. (A) s-µg è stato creato il ruotando la nave parete e mantenendo i soggetti di cultura in uno stato di costante caduta libera all'interno l'olio commovente. (B) A 1 -g condizione è stato creato da coltura di tessuto ovarico o follicoli sulla superficie di una piastra Petri coperta con olio minerale. La freccia indica una gocciolina di mezzo. Barra della scala = 1 cm. Questa figura è stata modificata da Zhang et al. ¹⁷ Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Effetti di s-µ g sulla cultura del tessuto ovarica. (A) sezioni di tessuto ovarico coltivate sotto 1 -g o s-µg condizioni per 0, 2 e 4 giorni. Barra della scala = 50 µm. (B) densità di follicolo nelle sezioni di tessuto ovarico. Errore bar rappresenta 1 SEM, *: p < 0.05. Questa figura è stata modificata da Zhang et al. ¹⁷ Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Immunohistochemistry di PCNA. Espressione della proteina PCNA è stata esaminata nelle cellule della granulosa in tessuto ovarico coltivate sotto 1 -g o s-µg condizioni per 0, 2 e 4 giorni. Barra della scala = 50 µm. Questa figura è stata modificata da Zhang et al. ¹⁷ Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : Effetti di s-µg sulla cultura dei follicoli preantrali incapsulati in perline di alginato. (A) morfologia dei follicoli preantrali coltivate sotto 1 -g o s-µg condizioni per 0 giorni e 4 giorni. Barra della scala = 50 µm. (B) diametro di ovocita e follicolo (C) sono stati confrontati fra 1 g e s-µg condizioni. Errore bar rappresenta 1 SEM, *: p < 0.05. Questa figura è stata modificata da Zhang et al. ¹⁷ Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5 : Analisi di attuabilità delle cellule. Immagini rappresentative sono state scattate con un microscopio a 400 ingrandimenti. Il test utilizza calceina visualizzare cellule vive tinto in verde ed EthD-1 per visualizzare i nuclei delle cellule morte tinto in rosso. (A): un follicolo con le cellule della granulosa dal vivo ~ 100% (verde). (B): un follicolo con cellule della granulosa dal vivo (verde), come pure più di 10% di cellule morte (rosso). Barra della scala = 50 µm.Questa figura è stata modificata da Zhang et al. ¹⁷ Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6 : Immunohistochemistry di GDF-9. Espressione della proteina GDF-9 è stato esaminato negli ovociti in tessuto ovarico coltivate sotto 1 -g o s-µg condizioni per 0, 2 e 4 giorni. Barra della scala = 50 µm. Questa figura è stata modificata da Zhang et al. ¹⁷ Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7 : Analisi ultrastrutturale dei follicoli preantrali isolati in coltura sotto 1 - g o s-µ g condizioni il giorno 4 di cultura. (A) un ovocita con i microvilli (frecce) che si estende nella zona pellucida (1 -g condizione). (B-F) Gli ovociti con grandi vacuoli (*), corpi multilamellari (#), le goccioline del lipido (frecce), vacuolati mitocondri mancano i cristae (freccia) e disperdente apparato di Golgi (freccia), rispettivamente (s-µg condizione). O: ovocita; ZP: zona pellucida. Questa figura è stata modificata da Zhang et al. ¹⁷ Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I passaggi critici per la coltura di successo dei follicoli preantrali sono: 1) correttamente selezionando i follicoli preantrali secondo i criteri di selezione che sono stati descritti nel protocollo testo 2.1); 2) tutte le procedure in una condizione di scettica di preformatura e mantenere una cultura sterile; e 3) impostare correttamente il sistema di coltura RWV.

La salvaguardia della consistenza delle osservazioni sperimentali negli esperimenti replicati consiste nell'utilizzare materiali simili o identici. I criteri per la selezione dei follicoli preantrali del mouse ha rivelato che i follicoli hanno avuti 1) ovociti sani nella fase di ripartizione (GVBD) della vescicola germinale circondato da una sottile zona pellucida; 2) 2-3 strati di cellule della granulosa, racchiuse da una membrana basale; e 3) alcune cellule tecali attaccati alla membrana basale. Così, i follicoli selezionati ha avuto non solo tutti i tre comparti funzionali di un follicolo ovarico per sostenere la crescita di ovociti, ma anche una simile identificazione morfologica con un diametro di 90-100 µm.

Questo è il primo tentativo di coltivare il follicoli preantrali mouse alla maniera di 3D coltura sotto la microgravità simulata. Diversi sistemi di coltura sono stati sviluppati per follicoli preantrali del mouse. Gli ovociti ottenuti dal follicolo coltivato su una superficie piana delle capsule di Petri, la cosiddetta cultura 2D, potrebbero essere fecondati e prodotto prole dal vivo. Inoltre, culture 3D, quali culture dei follicoli in perline di alginato, mantengono una struttura di tessuto simile a quello che il corpo produce in alta percentuale di ovociti meiotically competente. Tuttavia, il processo di sviluppo dei follicoli ovarici/ovociti in un campo di gravità zero è sconosciuto. RWV, un dispositivo che sta attirando l'attenzione notevole nell'ingegnerizzazione del tessuto, in grado di generare un ambiente di microgravità simulata e fornire un ambiente ideale per lo studio degli effetti della microgravità simulata sulla crescita del follicolo ovarico/ovociti in vitro.

È importante impostare l'apparecchio RWV correttamente per la coltura delle cellule. Le bolle d'aria nel serbatoio deve essere rimosso. Il metodo per rimuovere le bolle d'aria, se generato nel vaso, è come segue: inserire due siringhe da 0,5 mL di olio in ciascuna delle porte due siringa. Aprire le valvole di controllo delle porte di siringa. Manovrare le bolle d'aria sotto la porta di siringa. Tirare le bolle nella siringa durante l'iniezione di circa lo stesso volume di media attraverso l'altra porta di siringa. Dopo aver rimosso tutte le bolle, chiudere le valvole, togliere le siringhe e sostituire i tappi porta siringa. È anche fondamentale per trovare la velocità di rotazione corretto, che impedisce alle cellule di sedimentazione tramite una rotazione costante. Ottimizzazione della velocità di rotazione è determinato dal peso specifico delle cellule, la densità del fluido e la viscosità.

I profili di espressione di PCNA e GDF-9, che erano simili a quelli di GDF-9-carenti del mouse follicoli¹⁶, ha rivelato che microgravità simulata ha avuto effetti nocivi sullo sviluppo delle cellule della granulosa e ovociti. La nave del dispositivo RWV filata intorno ad un asse orizzontale all'interno di un incubatore 5% CO₂ , permettendo per permeazione di ossigeno e anidride carbonica attraverso una membrana nella parte posteriore, fornendo l'ossigenazione efficiente e molto bassa sollecitazione di taglio, che era improbabile che sia il causa di lesioni del follicolo/ovocita. Ottimizzazione della messa a punto sperimentale e ulteriori analisi sono necessari per studiare il meccanismo degli effetti negativi.

Ulteriori studi sono necessari per indagare la potenziale inerente allo sviluppo degli ovociti in vitro derivato dal sistema cultura RWV. Maturazione in vitro degli ovociti alla fase MII è attualmente in corso. La capacità di fecondazione degli ovociti Estratto esaminerà la validazione finale di questo sistema di cultura.

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Gli autori vorrei ringraziare Yilong Wang e Yanlin Zhao per la loro assistenza nel mantenere gli animali, Chan Zhang per la sua assistenza nella preparazione dei campioni istologici e Dr. Songtao He per leggere criticamente questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal Foundation di scienze naturali della provincia di Zhejiang (concessione numero: LY13C120002).