Farklı Olarak izotopla işaretli Kardeş histonlarla nükleozomlann Sulandırma

Bu protokol farklı şekilde izotop işaretli kardeş histon içeren nükleozom sulandırılması açıklar. Aynı zamanda, asimetrik translasyon sonrası modifiye edilmiş nükleozom bir premodified histon kopya kullandıktan sonra oluşturulabilir. Bu preparatlar kolaylıkla yüksek çözünürlüklü NMR spektroskopisi kullanarak, her iki kız kardeş histonlar üzerinde eş zamanlı olarak, değişiklik çapraz-karışma mekanizmaları incelemek için kullanılabilir.

Asimetrik modifiye nükleozom post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS) belirgin setleri ile dekore edilmiş bir histon iki kopyasını (kardeş histon) içerirler. Onlar yeni kurulması ve işlevsel etkileri bilinmeyen yollarla türler tanımlanır. Güncel analitik yöntemler nucleosomal kardeş histon üzerinde PTMS kopya özgü oluşumunu algılamak için yetersiz kalmaktadır. Bu protokol farklı şekilde izotop işaretli kardeş histon içeren nükleozom in vitro Sulandırma için bir biyokimyasal yöntem sunmaktadır. Oluşturulan kompleks, histon subcomplexes tekrar katlama esnasında premodified histon havuz sonra da asimetrik değiştirilmiş olabilir. Bu asimetrik nükleozom preparatlar kolaylıkla olarak, nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi kullanılarak asimetrik ön dahil PTM tarafından uygulanan modifikasyonu çapraz konuşma ile ilgili mekanizmaların çalışılmasına histon değiştirici enzimler ile de reaksiyona sokulabilir. özellikle, modifikasyon reaksiyonlarıGerçek zamanlı, ilgili izotop türü için özel NMR korelasyon deneyleri farklı, yaparak iki kardeş histon bağımsız eşlenebilir. Bu metodoloji nucleosomal kompleksleri üzerinde asimetrik PTM desen oluşumu ve yayılımı katkıda karışma mekanizmaları incelemek için araçlar sağlar.

Ökaryotik DNA sıkıca kromatin içine hücre çekirdeğinde içinde paketlenir. kromatin temel yapı taşı iki nüsha dört çekirdek histon her (H3, H4, H2A, H2B) oluşan bir oktamerik kompleks sarılı DNA ~ 147 bp içerir nucleosome çekirdek parçacık olduğunu. Histon proteini post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS) bir bolluk barındırırlar. Bu kovalent ikameler, hem doğrudan hem de sistemin fiziksel kimya etkileyerek dolaylı kromatin remodeling ^{faaliyetleri, 1, 2, 3} alımı ile kromatin yapısındaki değişiklikler neden olur. Bu sayede, histon PTMS Bu nedenle, tüm DNA bazlı hücresel fonksiyonları ⁴ düzenleyen, kromatin ulaşmak ve kontrol.

PTMS ağırlıklı nucleosome-dahil çekirdek histo yapılandırılmamış N-terminal kesimleri (kuyrukları) üzerine histon modifiye enzim sistemleri tarafından yüklenirnes. Nedeniyle histon kuyrukları nispeten kısa dizisi birçok değişiklik sitelerine, PTMS uyaran veya sonradan değişiklik reaksiyonları, modifikasyon çapraz konuşma ⁵ olarak bilinen bir etkisi bloke ederek birbirini etkilemektedir. Çünkü nükleozom genel simetrik mimarisi, modifikasyon reaksiyonları ve karışma mekanizmaları her nucleosomal histon (kardeş histon) iki nüsha üzerine benzer oluştuğu düşünülüyordu. Bu kavram son zamanlarda meydan ve sonradan yalanlandı. Özellikle, serbest histon H3 kuyruk peptidler ve nükleozom in vitro enzimatik deneyler, H3 kinazlar bir dizi asimetrik bir şekilde ⁶ fosforilasyonu ortaya olduğunu göstermiştir. Ek olarak, afinite arıtma tabanlı LC-MS / MS analizi ökaryotik hücreler ⁷ çeşitli tipler, asimetrik H3-metillenmiş nükleozom varlığını ortaya çıkarmıştır. Böylece, asimetrik değiştirilmiş nükleozom yeni türler oluşturur vearaçları kendi oluşumunu kontrol ve bu asimetri uygulamak olabilir karışma etkilerini analiz etmek mekanizmalarını ortaya çıkarmak için gereklidir.

Genel olarak, Western Blot (WB) ve kütle spektrometrisi (MS) analizi histon PTMS tespit etmek için kullanılmıştır. Kolay uygulama olmasına rağmen, WB özgünlüğü / çapraz reaktivite sorunlardan muzdarip. Bunun üzerine, bu aynı anda birden fazla PTM analiz ve modifikasyon reaksiyonları ⁸ doğrudan ölçümü gerçekleştirme yeteneğinde değildir. Öte yandan, MS analizi üst düzey eğitim gerektirir sofistike aletler kullanılır, ancak birden PTMS ⁹ yüksek özgüllük yanı sıra eşzamanlı haritalama ve ölçümü sağlar.   Bununla birlikte, her iki yöntem de yıkıcı ve nükleozomal kompleksleri histon ve / veya histon türevi peptitlerin karışımına yol açan, analizden önce ayrışmış. Bu manipülasyon bağımsız ayırt yeteneği kaldırırİki kardeş histon her biri üzerinde meydana gelen ve nucleosomal histon kopyası özgü değişiklik durumunu bildirmek için modifikasyon reaksiyonları.

PTM tepkileri eşleştirmek için alternatif bir yöntem olarak gelişti Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) spektroskopisi. ^{NMR, 11} yıkıcı olmayan ve bu nedenle de yeniden karışımlarında gerçek zamanlı bir şekilde PTM etkinlikleri izlenmesine olanak sağlar ve hatta, sağlam hücreler ^10. 2D göre, hızlı veri toplama için rutinleri yanı sıra, yüksek çözünürlüklü eşleme geliştirme izotopla işaretli ⁽¹⁵ N ve / veya ¹³ ° C) örneklerinin heteroatom nükleer korelasyon yöntemleri ^12, bu PTMS farklı eşzamanlı eşleme izin serin / treonin / tirozin fosforilasyonu, lizin asetilasyon / metilasyon ve arginin metilasyonu ¹³ olarak. Soruşturma altında PTM bağlı olarak, ¹⁵ N veya ¹³ C-etiketleme protocols bir değişiklik muhabir olarak hizmet veren protein fonksiyonel grubu işaretlemek için kullanılabilir. Sonuç olarak, PTM yerleştirme araçları kimyasal madde ortamında Değişiklik "algılama" tekabül eden fonksiyonel grup karakteristik kimyasal kayma yer değiştirme izleyerek gerçekleştirilebilir. Çoğu durumda, NH ve CH kimyasal grupların her iki ilgi PTM evrimini bildirmek için kullanılabilir.

Geçerli protokol farklı şekilde izotop işaretli kardeş histon içeren nükleozom üretimini tarif. NMR spektroskopisi esnekliği seçilmiş yeniden histon komplekslerinin saflaştırılması için farklı protein afinite etiketleri kullanımı ile hem ¹ H ¹⁵ N ve ^{1 H-13} C korelasyon spektrumları kullanılarak PTMS eşleştirmek için bir araya getirir. Bu protokol nükleozom sulandırma için belirli histon iki farklı havuzları kullanmaktadır. Bu havuzlar farklı şekilde izotop işaretli (tek ile vardır ^{15 N, 13 ° C, diğer), ve sırası ile bir polihistidin ve bir streptavidin afinite etiketi için eritilerek birleştirilir. Ni-NTA ve streptavidin bazlı kromatografi ile tandem afinite saflaştırma şeması, ilk Voigt ve arkadaşları tarafından kullanılır. 7 simetrik meslektaşları (Şekil 1A), asimetrik tür saflaştırmak için kullanılır. Asimetrik histon octamers standart tuz diyaliz yöntemi 14 ile eşdeğer nükleozomal kompleksleri (Şekil 1B) tekrar oluşturmak için, daha sonra kullanılır. Buna ek olarak, modifiye edilmiş önceden aynı prosedür aracılığıyla ve histon havuzları birine sahip olarak, bir PTM elde nükleozom üzerine asimetrik dahil edilebilir. Histon modifiye enzimler ve modifikasyon olayların ardından NMR-haritalama ile bu yüzeylerin reaksiyonu (her ikisi de-cis (premodified histon kopya) ve trans unmodifi karışma mekanizmalarının karakterizasyonu sağlayacaked histon kopya) (Şekil 1C).}

Nükleozomlardan 1. Sulandırma Farklı Olarak İzotop etiketli (ve asimetrik Modifiye) ile Kardeş Histonlar

NOT: Mevcut protokol farklı olarak izotop işaretli histon H3 ile nükleozom sulandırılması açıklar. Bu amaçla, histon H3 iki havuzu kullanıldı; Bir ¹⁵ N-etiketlenmiştir ve N-terminusta bir 6xHis-etiketi içerir ve ikinci ¹³ C-etiketli ve N-terminalinde kaynaşmış Strep peptidi (WSHPQFEK) ihtiva etmiştir. Her iki etiketler Tütün Etch Virüsü (TEV) proteaz tanıma sitesi ile nativ H3 dizisinden ayrıldı. Ek asimetrik değiştirilmiş nükleozom hazırlamak için, iki H3 havuzlarından biri bir premodified biçimde dahil edilir. Bir histon havuzunun Premodification / reaksiyon kofaktör her türü için gerekli varlığında ilgili histon-modifiye edici enzim ile birlikte PTM Donörler ¹ ilgi izotopla işaretli histon reaksiyona sokulması suretiyle gerçekleştirilebilir6. ilgili PTM etkin yerleşimini NMR spektroskopisi ya da kütle spektrometrisi ile tespit edilebilir. Burada kullanılan histonlar / DNA miktarları (260 nm 'de bir DNA konsantrasyonu olarak ölçülen) 10 uM bir konsantrasyonda .Bu Nihai verim nispeten kısa toplama süreleri ile kaliteli NMR spektrumunu kaydetme için yeterli olan bir nükleozom preparasyonunu elde edilmesi için kaba öneriler vardır.

1. Farklı şekilde izotop etiketli (modifiye asimetrik ve) histon H3 ile bir histon oktamer Sulandırma
   Not: Rekombinan histon proteinleri BL21 (DE3) pLysS hücreleri ¹⁴ mg miktarlarda üretilebilir. Izotopla işaretli histon elde etmek için, aynı ifade / saflaştırma protokolü ¹⁵ N- veya ¹³ için, bakteri büyümesi için ¹⁵ _NH4CI ve / veya azot ve karbon kaynağı olarak ^13C-glükoz ihtiva eden bir minimal ortam kullanılması dışında takip edildi Cı-etiketleme saygımdanf. Saflaştırılmış histonlar yoğun 5 mM β-merkaptoetanol karşı diyaliz edilir ve kullanımdan önce liyofilize depolanır.
   1. tampon açılma 1 mL her bir histon ~ 5 mg, liyofilize histon alikotları çözülür (7 M guanidinyum-HCI, 20 mM Tris pH 7.5, 10 mM DTT). histon H3 her iki türlerini içerir. pipetleme karışım ve vorteks yok. Tam açılma sağlamak için 30 dakika süreyle buz üzerinde tüpler tutun.
   2. tampon açılması ve EXPASY portalında ProtParam aracı ile hesaplanmış ekstinksiyon katsayısı kullanılarak karşı 280 nm'de absorbans ölçülerek, her histon tam konsantrasyonunun belirlenmesi. ¹⁵
   3. % 50 iki histon H3 havuzlarının her içerecek şekilde akılda tutarak, eşit mol oranları çekirdek histon karıştırın. daha az konsantre histon tüm içeriğini kullanarak başlayın ve buna göre tüm diğerleri ekleyin.
   4. yaklaşık olarak 1 mg nihai protein konsantrasyonu ayarlama / ml tampon açılma kullanılmıştır.
   5. transfeR 6 kDa'lık kesme diyaliz membranına karışımı soğutulmuş yeniden katlama tamponu, 4 ° C'de (10 mM Tris pH 7.5, 2 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM DTT) içinde 1-2 L karşı diyaliz. Diyaliz, 3 saat, en az sürdürüldü sonra en az bir kez bir tampon değiştirme. son diyaliz göre O / N 4 ° C'de gerçekleştirir.
   6. diyaliz edilmiş malzeme toplamak ve maksimum hızda 4 ° C de 5 dakika süreyle bir mikrofüj içinde santrifüje edilerek bir çökeltileri uzaklaştırmak (normalde hiçbir çökelme dikkat edilmelidir). 280 nm'de absorbans ölçülerek oktamer konsantrasyonunun belirlenmesi. Hesaplamalarda, çift her değere akılda tutarak, histon eklenen tükenme katsayıları kullanın.
   7. 10 kDa-kesme santrifüj filtre ünitesi kullanılarak yaklaşık 2 ml'lik bir nihai hacme konsantre edin. oktamer konsantrasyon ve tahmini kaybı yeniden hesaplayın. Bu noktada, 50 arasında bir oktamer konsantrasyonu - 100 uM elde edilmelidir.
   8. Bir üzere (Malzeme Tablo belirtilen) jel filtrasyon sütun bağlayınFPLC sistemi ve 0.22 mikron, süzüldü ve 1 ml / dakikalık bir akış oranı ve 0.5 MPa bir basınç sınırında tampon yeniden katlama gazı alınmış ve 2 kolon hacminde (CV) ile dengeye getirin.
      NOT: jel filtrasyon çalışma soğuk oda veya soğuk bir kabin içinde yapılmalıdır.
   9. 1 ml / dk'lık bir akış oranı kullanılarak konsantre edilmiş malzeme enjekte edilir ve 1.0 toplama - 1.5 ml fraksiyonlar.
   10. kromatografik profili izleyin ve ~ 65 histon oktamer elüsyon gözlemlemek - 68 ml.
       NOT: elüsyon zirvesinin küçük bir omuz ve ~ 80 mL bir zirve sırasıyla ücretsiz H3-H4 tetramers ve H2A-H2B dimerleri varlığına işaret etmektedir.
   11. bir% 18 SDS-PAGE jeli her toplanan fraksiyonun 20 uL çalıştırın.
       NOT: yüksek tuz konsantrasyonunu azaltmak ve böylece, bozulmayı önlemek jeli üzerinde yüklemeden önce, su ile en az 2 olan bir faktörle örnekleri seyreltilir. Aynı tampon yeniden katlama numune daha sonra, SDS-PAGE analizi için geçerlidir.
   12. Havuz ilgili fralekeli jel üzerinde 4 histon eşit dağılımı tarafından değerlendirilecektir ve (adım 1.1.7) daha önce olduğu gibi konsantrasyonunu belirlemek saf octamers içeren seksiyonlar.
   13. Bir FPLC sistemi için 1 ml Ni-NTA kolonu (Malzemelerin Tablo) bağlayın ve 0.22 10 CV denge mikron filtre edilmiş ve 1 ml / dk'lık bir akış oranında tampon yeniden katlama gazı alındı.
       NOT: Ni-NTA kromatografisi, soğuk oda ya da soğuk bir kabin içinde yapılmalıdır.
   14. 1 ml / dk'lık bir akış oranı kullanılarak Ni-NTA arıtıldı oktameri geçirin.
   15. Flow-through toplayın ve SDS-PAGE / WB analizi için (20 uL ve 4 uL, sırasıyla) örnekleri tutmak. Daha sonra, tampon ya da bir taban sinyali ulaşılana kadar tekrar katlama, 10 CV ile sütun yıkayın.
   16. 1 ml / dk'lık bir akış oranı kullanılarak, 250 mM imidazol ihtiva eden tampon tekrar katlama, 10 CV ile yıkayın. (20 uL ve 4 uL, sırasıyla) SDS-PAGE / WB analiz için numune tutun.
   17. AC 1 ml afinite sütunu dengeyeBir toplu / ağırlık akış kurulumu kullanarak 250 mM imidazol içeren 10 CV refolding tamponu ile ommercial streptavidin (Malzeme Tablosu).
       NOT: Bu kromatografik aşama, soğuk bir odada uygulanmalıdır.
   18. Ticari streptavidin afinite kolonu içinden Ni-NTA elüsyon geçirin.
   19. akışı toplamak ve SDS-PAGE / WB analiz için (20 uL, 4 uL, sırasıyla) örnekleri tutmak. Daha sonra, tampon yeniden katlama, 10 CV ile yıkayın.
   20. 2.5 mM destiobiyotin içeren tampon refolding 10 CV ile Zehir. (Sırasıyla 20 ve 4 uL) SDS-PAGE / WB analizi için numune tutun.
   21. , Oktamer konsantrasyonu ölçümü 10 kat daha az TEV proteaz ilave edildi ve reaksiyon, standart bir plastik santrifüj tüpü içinde 4 ° C'de bir gece boyunca devam sağlar.
       NOT: TEV gerekli miktarda tam sindirim (afinite etiketleri kaldırılması) elde etmek üzere (inşa) ve aktivitesi üzerine kökeni bağlıdır (taze yapılmış, rekombinant TEV dahaAktif de uzun süreli depolanabileceklerini göstermektedir bir oranla - 80 ° C). (Protein konsantrasyonları olarak tahmini) oktamer göre başlangıçta ekleyerek 10 kat daha az TEV deneyin ve buna göre ayarlayın.
   22. önceden karışımın 20 uL çalıştırarak ve% 18 SDS-PAGE jeli üzerinde TEV ilave edildikten sonra etkili sindirim edin. Sindirim tam değilse, daha fazla TEV proteaz ekleyebilir ve 3-4 saat boyunca inkübasyona devam edin.
   23. TEV proteaz kaldırmak ve tampon kompozisyonu ayarlamak için bir 50 kDa-kesme diyaliz membranı kullanılarak tampon refolding karşı örnek dialyze.
   24. 1.0-2.0 mL bir hacme (de kullanılabilir aşama 1.1.7 aynı filtre ünitesi), 10 kDa'lık kesme santrifüj filtre ünitesi kullanılarak saflaştırılmıştır asimetrik oktameri konsantre edilir. nihai konsantrasyon ölçülür. Her iki durumda da uzun bir süre için, -20 ° C de saklamak için (h / h) gliserol nükleozom sulandırma için kısa bir süre sonra kullanmak ya da 50% ayarlayın. Önceki adımları sırasında en azından% 70 kayıp bekliyor bu noktada ve inci50 uM - E oktamer konsantrasyonu 20 aralığında olmalıdır.
2. nucleosome sulandırma
   1. oktamer% 50 gliserol içinde depolanmıştır ise, nükleozom sulandırma ile devam etmeden önce tampon yeniden katlama karşı 4 ° C de bir gece boyunca diyaliz.
   2. 5 M NaCI stok solüsyonu kullanılarak 2 M NaCI tuz konsantrasyonu (nükleozom konumlandırma sekansı ihtiva eden) DNA ayarlayın.
      Not: birden çok istenen dizinin kopya veya içeren bir plazmidin saflaştırmadan sonra izole edilmiş ya da saflaştırılmış bir DNA PCR amplifikasyonu ile sentezlenebilir konsantre saklanmalıdır ~ 50 su içinde uM veya standart Tris-EDTA tamponu.
   3. küçük ölçekli bir testi belirlenen optimum oranını kullanarak oktameri ve DNA karıştırın. ~ 3.0 mL son hacim ayarlamak için refolding tampon kullanın. Her zaman oktameri ve <2 M tuz konsantrasyonlarında DNA karıştırma ihtimalini önlemek için son oktameri ekleyin.
      1. İlk küçük sc gerçekleştirinOptimum nucleosome verimleri yol açar DNA oranı: ale reconstitutions oktamer belirlemek için. 50-100 uL arasında bir hacim içinde oranları oktamer: 1.0, 1.0: 1.0, 1.1: 1.0, DNA Bunun için, 0.9 üç reaksiyonları bir araya getirin. Tipik olarak, 5 uM DNA konsantrasyonu kullanımı.
      2. (Adım 1.2.4-1.2.8) aşağıda tarif edildiği gibi sulandırma ile devam ve sonunda, 260 nm'de DNA konsantrasyonu ölçülerek ve% 6 nativ-PAGE DNA jel çalıştırarak çözünebilen ve iyi kalitede yeniden nükleozom miktarını tahmin , etidyum bromür, sırasıyla, (Şekil 5A) ile boyanmıştır.
   4. 6 kDa'lık kesme diyaliz membranına karışımı aktarın ve 4 ° C'de bir gece doğallaşım tamponuna 1 L karşı diyaliz.
   5. 0.85, 0.64, 2 ila adım adım bir şekilde diyaliz tamponu tuz konsantrasyonunu azaltmak ve sırası ile 0.2 M NaCl. en az 3 saat süreyle her bir tampon maddesi içinde örnek tutun. Bazı durumlarda, son geçişten sonra oluşan çökelti. Bu durumda cplanlandığı gibi diyalize ontinue ve bir sonraki aşamada sonunda mikrofüj santrifüj çökeltiyi uzaklaştırmak.
   6. Deney tamponu (25 mM NaH _{2 PO4} / Na ₂ HPO _4, pH 6.8, 25 mM NaCI, 2 mM DTT) 4 ° C'de diyaliz O / N devam 1 L bir çanak içinde Aktarım diyaliz membranı.
   7. örnek toplamak, bir maksimum hıza 4 ° C'de 5 dakika süreyle bir mikrofüj içinde santrifüje adım 1.2.5 oluşan çökelti çıkarın ve ~ 300 ul'lik nihai bir hacme kadar 30 kDa'lık bir-kesme santrifüj filtre ünitesi kullanılarak konsantre edilir.
   8. bir% 18 SDS-PAGE protein jeli (örneğin 4 uL) ve birkaç hafta boyunca 4 ° C'de% 6 nativ-PAGE DNA jel (örnek 0.2 uL) ve mağaza örnek çalıştırın, 260 nm'de DNA konsantrasyonu ölçülür. nihai konsantrasyon 10-20 uM aralığında olmalıdır.

İki Kardeş histon'lardaki Modifikasyon Reaksiyonlarının 2. NMR Analizi

NOT: DevriNucleosomal histon kuyrukları 2B ¹ H ¹⁵ N korelasyon spektrumları başvuruları ^{16, 17, 18} bulunabilir. Ayrıca, CH atamaları 2D lizinlerinin, serin ve treonin grupları _x ^{1 H-13} C korelasyon spektrumları referans ¹⁶ bulunabilir.

1. NMR kurulumu ve referans spektrumları kayıt
   Not: Enzimatik diğer numune hacmi ile 300 K farklı NMR tüpler bir 3 mm'lik NMR tüpü içinde deney tamponu içinde nükleozom numunenin 140 uL kullanılarak yapıldı de kullanılabilir. Söz konusu sıcaklık iyi kalitede nucleosomal histon kuyrukları ve iyi enzimatik faaliyetlerin ¹ H ¹⁵ N korelasyon spektrumları elde etmek uygundur. 2D-SOFAST-HMQC ^{1 H-15,} N ve ^2B-1 H-HSQC ^13C spektrumları bir kurulum t, sırasıyla kaydedildişapka benzer satın alma sürelerini bahşeder. Tipik elde etme parametreleri 1.024 ⁽¹ H), 128 geçici 1.024 128 ⁽¹⁵ N), kompleks sayı ve 32 geçiş X ^(1H) x 64 ⁽¹³ ° C) bir korelasyon spektrumları iki farklı kompleks sayı. Her iki 2D spektrumları için, satın alma süresi ~ 30 dakika oldu.
   1. spektrometre örnek sıcaklığı 300 K ayarlayın. % 10 ekleme D ₂ O (hac / hac) bir numunesi, spektrometre frekansı kilidi için kullanılmak üzere hiç.
   2. spektrometre örnek yerleştirin ve temel işlemleri (kilitleme, tuning, layneri) gerçekleştirin. Buna ek olarak, en iyi puls uzunlukları genel toplama parametrelerini belirler.
   3. Kayıt 1D ve 2D ¹ H ¹⁵ N ve ^{1 H-13} C referans spektrumları.
   4. Süreç referans spektrumları ve sinyaller değişiklik reaksiyonları haritalanması için kullanılacak sağlamak iyi çözülmüş ve iyi yoğunlukları vardır.
   5. örnek kurtarmak ve i aktarmakmikrofüj tüpüne t.
2. Enzimatik reaksiyon, NMR izleme ve kantitatif analiz Kur
   1. Kopya ve aralıklı 2D ¹ H ¹⁵ N ve ^{1 H-13} C spektrumları bir dizi düzenliyoruz. birkaç saatlik bir Toplam tarama süresi için Amaç ve birinci tepkimesinden elde edilen enzimsel oranlar temel alan yeni vadede buna göre ayarlanır.
   2. Modifikasyonu reaksiyonun her türü için örnek gerekli kofaktörlerle ekleme (1 mM ATP / 2 mM fosforilasyonu için _MgCl2, asetilasyon 1 mM asetil-CoA, metilasyon 1 mM SAM, vb.).
   3. , Pipetleme karışım, ilgilenilen enzimi ekle spektrometre (hızlı bir şekilde bu işlemleri gerçekleştirmek) geri NMR tüpü ve daha sonra örnek aktarmak.
      NOT: beklenen enzimatik aktivite konusunda hiçbir veri yoksa, substrat-to-enzim 10 molar oranı ayarlayın: 1. İlk deneme çalışması yapmak ve buna göre ayarlamakGerçek çalıştırın.
   4. hızlı otomatik shimming gerçekleştirin ve referans spektrumları parametrelerin geri kalanını kullanın.
   5. Boş yaprak eklenmiş 2D ^{1 H-15} K, ^{1 H-13C} spektrumları dizi olguyu başlatmaktadır.
   6. gerçek zamanlı olarak reaksiyonun ilerlemesini takip edildi ve reaksiyon tamamlamayı veya arzu edilen bir seviyeye ulaştığında satın durdurun.
   7. aynı parametrelerle eskisi gibi süreç spektrumları.
   8. korelasyon spektrumları iki tür için farklı bir satın alma siparişi kullanarak tüm çalıştırmak tekrarlayın. İlk deneyde ¹ H ¹⁵ N korelasyon dizisinin ilk olduysa, bir ^{1 H-13} C korelasyon şimdi başlayın. Bu her iki spektrumları aynı edinim süresine sahip olarak, arsa ve aynı zaman ölçeğinde, her iki farklı olarak, izotopla işaretli histon üzerindeki PTM reaksiyonları karşılaştırmak mümkündür. Ayrıca, ortalamalar ve arsa hata çubukları hesaplamak mümkündür.
      NOT: Bir thorougNMR sinyal analizi ve enzimatik reaksiyonlar daha sonra ölçümü için yöntemler H açıklaması burada ¹⁹ bulunabilir.
   9. reaksiyonun ilerlemesini rapor her zaman ders NMR spektrumundan NMR sinyalleri seçin ve NMR spektrumları için bir görselleştirme ve analiz yazılımı kullanılarak göreceli sinyal yoğunlukları hesaplamak. değiştirilmemiş yanı sıra modifiye durumlarını rapor sinyaller için bunu yapın. modifikasyon seviyelerini ayıklayın.
   10. Reaksiyon zamana karşı modifikasyon seviyelerinin hesaplanan değerleri çizilir.

Düzgün şekilde yeniden katlanmış oktamerik türlerin bir jel filtrasyon kolonu boyunca yeniden oluşturma karışımının bir çalışma (Şekil 2) sonra izole edilir. octamers üç farklı türde ihtiva oktamerik yeniden havuzu tandem afinite saflaştırma şeması tabi tutulur. Örnekler Tüm adımlar toplandı ve WB SDS-PAGE ile ve daha sonra analiz edilir. Asimetrik türünün izolasyonu ile sonuçlanan protokolünün doğru bir şekilde yapılması doğrulanması farklı örnek iki afinite etiketleri (His ve streptokok) varlığı (Şekil 3), aşağıdaki elde edilir. Daha sonra, afinite etiketleri TEV proteaz sindirim (Şekil 4) sonra kaldırılır. afinite etiketleri yerleştirilmiş Asimetrik octamers asimetrik nükleozom tekrar oluşturmak için kullanılır. İlk olarak, küçük bir test ölçekli bir sulandırma DNA optimum mol oranının belirlenmesi için kullanılır: bu yüksek sonuçlanır oktamerBir tek dağılımlı kompleksinin oluşumunu verir. Daha sonra, optimum karıştırma oranı, büyük ölçekli nükleozom tekrar oluşturmak için kullanılır. Nükleozom reconstitutions Uygun montaj, sırasıyla diferansiyel izotopla işaretli kardeş H3 histon mevcudiyetinde (Şekil 5) protein / DNA jeller ve NMR spektroskopi ile analiz edilmiştir. Bir uygulama örneği, Şekil 6'da gösterilmiştir. Özellikle, farklı olarak izotop etiketli ve H3S10 nükleozom ilgili asimetrik fosforile Gcn5 asetiltransferaz ile reaksiyona sokulur, ve her ikisi de H3 kopyalarda H3K14 asetilasyonu NMR spektroskopisi gerçek zamanlı olarak takip edilir. Analiz H3S10 fosforilasyon trans içinde karşılaştırıldığında cis Gcn5 tarafından H3K14 asetilasyon uyardığını ortaya koymaktadır.

Şekil 1: Farklı Olarak izotop l Preparasyon Akış Şemasıabeled Nükleozomlar (ve asimetrik Modifiye). Farklı olarak, izotopla işaretli (asimetrik değiştirilmiş) histon octamers (A) sulandırma ve tandem afinite saflaştırma. (B) saflaştırılmış asimetrik octamers ve bir DNA nükleozom konumlandırma dizisine birleştirerek Nükleozom yeniden oluşturulması. (C) NMR izleme cis ve in-trans histon değiştirici enzimler ile asimetrik değiştirilmiş ve diferansiyel izotopla işaretli nükleozom karıştırıldıktan sonra modifikasyonu çapraz-karışma. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2: Histon Octamers yeniden oluşturulması. Yeniden katlanmış histon karışımının jel filtrasyon elüsyon profilini. ~ 70 mL ana tepe histon octamers karşılık gelir. Bir 14 - oktamer pike karşılık gelen edilen parçaların% 20 gradyan SDS-PAGE jeli (Coomassie Blue lekelemesi) doğru histon stokiyometrisi gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3: Asimetrik Histon Octamers saflaştırılması. Tandem afinite saflaştırma şemasının farklı aşamalarında örneklerinin His ve streptokok afinite etiketleri karşı 14-20% gradyan SDS-PAGE jeli (Coomassie boyaması) ve DB. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4: Affinity Etiketler kaldırılması. % 18 SDS-PAGE jeli önce ve TEV proteaz ile karıştırılarak, saflaştırılmış asimetrik histon octamers arasında (Coomassie boyaması). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5: Farklı Olarak izotopla işaretli nükleozom biyokimyasal ve NMR karakterizasyonu. DNA, farklı mol oranları kullanılarak küçük bir test ölçekli bir nükleozom sulandırma (A)% 6 nativ-PAGE DNA jel (etidyum bromür boyama) (sol) oktamer. Optimize edilmiş DNA kullanılarak büyük ölçekli nükleozom sulandırıldıktan% 6 nativ-PAGE DNA jel (etidyum bromür boyama): oktamer mol oranı (sağ). Yeniden oluşturulmuş nükleozom (B)% 18 SDS-PAGE protein jeli (Coomassie boyaması) dört çekirdek histon doğru stokiyometrisi gösterir. (C) farklı şekilde izotop işaretli nükleozomlardan ¹⁵ N etiketli H3 kopya ¹ H ¹⁵ N SOFAST-HMQC spektrumu (sadece H3 kuyruk artıkları görülebilir - Protein çekirdek nedeniyle yavaş yuvarlanan hızı görünmez). (D) farklı olarak, izotopla işaretli nükleozom ^13C-etiketli H3 kopya ^{1 H-13C} HSQC spektrumu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6: In cis ve trans olarak NMR İzleme Gcn5 asetiltransferaz H3K14 asetilasyonu Aktivitesi Üzerine H3S10 Asimetrik Fosforilasyon dayattığı g> Modifikasyon Çapraz konuşma. (A) 'nın şematik temsili farklı olarak izotop etiketli ve asimetrik fosforile H3S10 ile ilgili nükleozom cis ve trans, Gcn5 asetiltransferaz ve H3K14 asetilasyon eşleme ile reaksiyona sokulmuştur. (B) ^{1 H-15} N SOFAST-HMQC öncesi ve Gcn5 ile reaksiyondan sonra, asimetrik nükleozom ^{1 H-13C} HSQC spektrumları (seçilmiş bölgeleri). (C), asimetrik H3S10 fosforile nükleozom ilgili Gcn5 ile H3K14 asetilasyon süre-çözülmüş NMR izlenmesi. iki bağımsız deneyden elde ortalamaları ve varyasyon (hata çubukları) gösterilmektedir. Izni ¹⁶ yeniden birlikte. Büyük halini görmek için buraya tıklayınızbu figür.

Nucleosome yeniden oluşturulmak üzere, mevcut protokol 601-Widom nucleosome konumlandırma dizisini ²⁰ içeren bir 165 bp uzunluğunda DNA şablonu kullanır, ancak benzer performans DNA şablonları değişik uzunluklarda kullanılarak bekleniyor. protokol histon H3 asimetrik türlerini kullanarak tasarlanmış ve kullanılmıştır. Aynı ilke ile, yöntem, diğer çekirdek histon için de uygulanabilir ve buna ek olarak farklı bir izotop etiketli iki farklı çekirdek histon taşıyan kompleksleri tekrar oluşturmak için kullanılabilir. protokol de biraz başlangıçta histon alt kompleksleri sulandırmak için modifiye ve doğrudan octamers sübstrat olarak histon değil edilebilir. Bu modifikasyon sonrasında, asimetrik H3-H4 tetramerleri, aynı ikili saflaştırma şeması kullanılarak yeniden oluşturulabilir. Ikinci nükleozom ¹⁶ monte etmek için ayrı ayrı yeniden H2A-H2B dimerler ve DNA ile karıştırılır. Nihai verim ve modifiye protoc genel performansıol orijinal birine benzer.

Protokol verimli son derece saf bir asimetrik kompleksleri elde etmek için bu şekilde, ilgili türlerin bağlanan ve iki afinite sütunları yeteneğine sıkı bir şekilde bağlıdır. Nihai arıtılmış kompleks gerçekten ve sadece asimetrik olduğu doğrudan ve somut kanıt sunmak hantal. Bununla birlikte, ilgili antikorlar ile Tüm saflaştırma işlemleri, numune WB analizi ikili saflaştırma şemasının başarı (Şekil 3) için güvenilir göstergelerini sağlar. Aynı sonuçlar, ve dolayısıyla, ek güvence NMR yöntem ¹⁶ ile afinite etiketleri varlığı aynı numunelerinin analiz edilmesi ile elde edilmiştir. WB analizi simetrik olanlar ile asimetrik türlerin bulaşmasını gösterir, hala, küçük bir varyasyon sonucu artırabilir ilk saflaştırma basamağı (Ni-NTA) kabul edilebilir. Özellikle, bunun yerine izokratik elüsyon, bir imidazol gradyan t elüsyon (10-250 mM) kullanılabilir ve daha sonra, sadece çok asimetrik türlerde zenginleştirilmiş birinci elüsyon fraksiyonları toplanmış ve afinite sütunu üzerinden çalışır. Bu Strep afinite etiketi mevcudiyetinde elüsyon fraksiyonlarının DB analizi ile tespit edilebilir.

Çevrede PTM göre izotopla etiketin seçimi çoğu için, NMR, hem ^{1 H-15} K, ¹ H ¹³ Ccorrelation spektrumları kullanarak aynı PTM eşleme yeteneğine sahip olduğu için çok esnektir. Bununla birlikte, bazı amino asitler, lisin gibi yan zincir ^{1 H-13C} rezonansların kimyasal kayma dispersiyon oldukça sınırlıdır. lisin değiştirici enzimin hedef sitesi bilinmemektedir, ayrıca, lisin PTMS site-spesifik okuma üzerinden kolay değildir. Bu gibi durumlarda, alternatif yöntemler, yarı sentetik histon üretimi ile birlikte, yer seçici ^{13C-etiketleme} kullanır"> 21 veya seçici uyarılma yoluyla değişiklik devletlerin belirli algılama sağlar yeni kurulan NMR darbe dizilerinin kullanılması ²² rutinleri. NMR spektroskopisi oldukça düşük duyarlılık bahşeder. Bu bağlamda, nükleozom (iM aralığı) nispeten yüksek miktarlarda gerçekleştirmek için gerekli olan enzimatik reaksiyonlar. Bu, yüksek verimli kurulum yöntemin evrimi önler.

Aynı zamanda, yeni bir kimyasal yöntem tarif PTMS ²³ taşıyan yüksek verimlerle, kimyasal olarak saf asimetrik değiştirilmiş nükleozom sentezi için getirilmiştir. Bu yaklaşım, PTM çapraz-karışma mekanizmaları incelemek için, fluorografi ile kombinasyon halinde, kullanılmaktadır. Nedeniyle PTMS tespit Flüorografi yöntemlerin düşük çözünürlük özelliği, sonuçlar daha çok, simetrik ve asimetrik PTMS farklı kombinasyonları taşıyan nükleozom bir dizi genel enzimatik aktivitelerini karşılaştırmak suretiyle dolaylı elde edilmiştirHer kardeş histon mukabil sitelerinde PTM reaksiyonlar doğrudan gözlem yoluyla daha. Ancak, izotopik olarak etiketlenmiş histon birleşme ve PTM okuma için NMR spektroskopisi kullanımı yukarıda belirtilen yöntemini asimetrik değiştirilmiş nükleozomlardan yüksek çözünürlüklü PTM analizi için ek bir araç teşkil edebilir.

Gelecekte asimetrik değiştirilmiş nükleozom yeni tip tanımlanması ile bağlantılı olarak, mevcut yöntem, cis ve nükleozomal yüzeylerde trans PTM karışma reaksiyonlarında analiz için yüksek çözünürlüklü bir araç oluşturmayı hedeflemektedir. Özellikle, yüksek öneme sahip, asimetrik hem transkripsiyonel olarak aktif ve baskıcı PTMS ihtiva iki değerlikli nükleozom ²⁴ doğuran karışma mekanizmalarının kod çözme.

The author has nothing to disclose.

Bir araştırma bursu aracılığıyla iş için fon deneyler ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) gerçekleştirmek için ıslak laboratuvar alanı ve altyapıyı sağlamak için yazar teşekkür Dr. Philipp Selenko (FMP-Berlin) (LI 2402 / 2-1).