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Este protocolo describe la reconstitución de los nucleosomas que contienen histonas hermana marcados con isótopos diferencialmente. Al mismo tiempo, los nucleosomas asimétricamente después de la traducción modificados pueden ser generados después de usar una copia de la histona premodified. Estas preparaciones se pueden utilizar fácilmente para estudiar los mecanismos de modificación de diafonía, simultáneamente en ambos histonas hermanas, mediante el uso de la espectroscopia de RMN de alta resolución.
nucleosomas asimétricamente modificados contienen las dos copias de una histona (histonas hermana) decoradas con distintos conjuntos de modificaciones post-traduccionales (PTMs). Son especies recién identificadas con medios desconocidos de establecimiento y consecuencias funcionales. métodos analíticos actuales son insuficientes para detectar la aparición-copia específica del PTM de las histonas del nucleosoma hermanas. Este protocolo presenta un método bioquímico para la reconstitución in vitro de los nucleosomas que contienen histonas hermanas marcados con isótopos diferencialmente. El complejo generada puede ser también modificado de forma asimétrica, después de que incluye una piscina de histonas premodified durante el replegamiento de Subcomplejos histonas. Estas preparaciones de nucleosomas asimétricos pueden ser fácilmente reaccionar con enzimas modificadoras de histonas para estudiar los mecanismos de modificación de diafonía impuestas por el PTM asimétricamente pre-constituida mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN). En particular, las reacciones de modificación enEn tiempo real se puede asignar de forma independiente en los dos histonas hermanas mediante la realización de diferentes tipos de experimentos de correlación de RMN, adaptados para el tipo de isótopo. Esta metodología proporciona los medios para estudiar los mecanismos de diafonía que contribuyen a la formación y propagación de los patrones de PTM asimétricos en complejos nucleosomal.
DNA eucariótico está estrechamente empaquetados dentro de los núcleos celulares en la cromatina. El bloque de construcción fundamental de la cromatina es la partícula de núcleo nucleosoma que contiene ~ 147 pb de ADN envuelto alrededor de un complejo de octameric formado por dos copias de cada uno de los cuatro histonas del núcleo (H3, H4, H2A, H2B). Las proteínas histonas albergan una gran cantidad de modificaciones post-traduccionales (PTMs). Estas sustituciones covalentes inducen alteraciones en la estructura de la cromatina, tanto directamente al afectar a la química física del sistema e indirectamente mediante el reclutamiento de las actividades de remodelación de la cromatina 1, 2, 3. Por estos medios, PTMs histonas controlan la accesibilidad de la cromatina y, por lo tanto, regular todas las funciones celulares 4 basadas en ADN.
Las PTM se instalan de sistemas de enzimas modificadoras de histonas, principalmente en los segmentos N-terminal no estructurados (colas) de histo-nucleosoma incorporadones. Debido a los muchos sitios de modificación en la relativamente corta secuencia de las colas de las histonas, PTM influyen entre sí mediante la inducción o el bloqueo de reacciones de modificación posteriores, un efecto conocido como modificación de la diafonía 5. Debido a la arquitectura simétrica global del nucleosoma, se pensaba que reacciones de modificación y mecanismos de diafonía que se produzca de manera similar en las dos copias de cada histona nucleosomal (histonas hermana). Este concepto ha sido recientemente cuestionado y posteriormente refutada. En particular, los ensayos enzimáticos in vitro sobre las histonas H3 libre de péptidos de la cola y en nucleosomas demostraron que un conjunto de quinasas H3 fosforilación introdujo de forma asimétrica 6. Además, el análisis LC-MS / MS basados en purificación por afinidad reveló la existencia de nucleosomas asimétricamente H3-metilado en varios tipos de células eucariotas 7. Por lo tanto, los nucleosomas modificados de forma asimétrica constituyen nuevas especies, ySe necesitan herramientas para descubrir los mecanismos que controlan su formación y para analizar los efectos de diafonía que esta asimetría podría ejercer.
Comúnmente, Western Blotting (WB) y el análisis de espectrometría de masas (MS) se han utilizado para detectar PTM histonas. A pesar de su fácil aplicación, WB sufre de problemas de especificidad / reactividad cruzada. Además de eso, es incapaz de realizar simultáneamente el análisis multi-PTM y cuantificación directa de las reacciones de modificación 8. Por otro lado, el análisis de MS emplea instrumentación sofisticada que requiere una formación de alto nivel, sino que proporciona una alta especificidad, así como la cartografía y cuantificación simultánea de múltiples PTM 9. Sin embargo, ambos métodos son perjudiciales y los complejos se disocian nucleosomal antes del análisis, dando lugar a una mezcla de histonas y / o péptidos de histona-derivado. Esta manipulación elimina la capacidad de distinguir independientereacciones de modificación que se producen en cada una de las dos hermanas histonas y para informar sobre el estado de variación de la copia específica de las histonas del nucleosoma.
espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) desarrollado como un método alternativo para asignar reacciones PTM. NMR es sin interrupciones y por lo tanto permite el seguimiento de eventos PTM de una manera en tiempo real en las mezclas reconstituidas, e incluso en células intactas 10, 11. El desarrollo de las rutinas para la adquisición rápida de datos, así como para la cartografía de alta resolución basado en 2D métodos de correlación hetero-nuclear de muestras marcados con isótopos (15 N y / o 13 C) 12 permitió el mapeo simultánea de diferentes tipos de PTM, tales como serina / treonina / tirosina fosforilación, acetilación de lisina / metilación, y la metilación de arginina 13. Dependiendo de la PTM bajo investigación, 15 N- o C-13 etiquetado protocols se pueden emplear para marcar el grupo funcional de proteína que sirve como un reportero de modificación. En consecuencia, PTM cartografía puede llevarse a cabo siguiendo la característica de desplazamiento del desplazamiento químico del grupo funcional correspondiente 'detección' la alteración en el ambiente químico. En la mayoría de los casos, tanto grupos químicos CH NH y se pueden utilizar para informar de la evolución de la PTM de interés.
El protocolo actual describe la generación de nucleosomas que contienen histonas hermanas marcados con isótopos diferencialmente. Se combina la flexibilidad de la espectroscopía de RMN a mapa PTM utilizando tanto 1 H- 15 N y 1 H- 13 C espectros de correlación con la utilización de diferentes etiquetas de afinidad para la purificación de proteínas de los complejos histona reconstituidas seleccionados. En particular, el protocolo emplea dos piscinas diferentes de una histona particular para la reconstitución nucleosoma. Estas piscinas son diferencialmente marcado con isótopos (uno con 15 N, el otro con 13 C), y se fusiona a una de polihistidina y una etiqueta de afinidad de estreptavidina, respectivamente. Un esquema de purificación por afinidad en tándem con Ni-NTA y cromatografía a base de estreptavidina utilizado inicialmente por Voigt et al. 7 se emplea para purificar especies asimétrica de homólogos simétricos (Figura 1A). Octámeros histonas asimétricas se utilizan posteriormente para reconstituir los complejos nucleosomal equivalentes (Figura 1b), utilizando el método de diálisis de sal estándar 14. Además, por el mismo procedimiento y por tener una de las piscinas histonas pre-modificado, un PTM puede ser incorporado de forma asimétrica en los nucleosomas resultantes. La reacción de estos sustratos con enzimas modificadoras de histonas y la posterior RMN-mapeo de eventos de modificación permite la caracterización de los mecanismos de diafonía tanto en cis (premodified copia de histonas) y en trans (unmodified copia de histonas) (Figura 1C).
1. Reconstitución de los nucleosomas con marcado con isótopo diferencialmente (y asimétricamente modificado) de la hermana histonas
NOTA: El protocolo actual describe la reconstitución de los nucleosomas con diferencialmente histona H3 marcada con isótopo. Con este fin, se utilizaron dos piscinas de la histona H3; uno era 15 N-etiquetados y contenía una 6xHis-tag en el extremo N-terminal y el segundo fue 13 C-etiquetados y contenía el péptido Strep (WSHPQFEK) fusionada en el extremo N-terminal. Ambas marcas fueron separados de la secuencia nativa H3 con un sitio de reconocimiento de la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV). Para preparar nucleosomas adicionales asimétricamente modificados, una de las dos piscinas H3 está incluido en una forma premodified. Premodification de una piscina de histona se puede realizar haciendo reaccionar el histona marcado con isótopo de interés con la respectiva enzima histona modificadores en presencia de la necesaria para cada tipo de cofactores de reacción / donantes PTM 16. La colocación eficiente de la respectiva PTM puede evaluarse mediante espectroscopia de RMN o espectrometría de masas. Las cantidades de histonas / ADN utilizados aquí son recomendaciones en bruto para obtener una preparación nucleosoma con una concentración aproximada de 10 m (medida como concentración de ADN a 260 nm) .Este rendimiento final es suficiente para registrar los espectros NMR de buena calidad con tiempos de adquisición relativamente cortos.
2. Análisis de RMN de reacciones de modificación de las histonas Dos hermanas
NOTA: La asignación de2D espectros de 1 H-15 N correlación de colas de las histonas del nucleosoma se puede encontrar en las referencias 16, 17, 18. Además, las asignaciones de CH x grupos de lisinas, serinas y treoninas en 2D espectros de correlación 1 H- 13 C se puede encontrar en la referencia 16.
Octameric especies replegadas adecuadamente son aislados después de una carrera de la mezcla de la reconstitución través de una columna de filtración en gel (Figura 2). La piscina reconstituido octameric que contiene los tres tipos diferentes de octámeros se somete al esquema de purificación por afinidad en tándem. Las muestras se recogen a partir de todos los pasos y se analizaron por SDS-PAGE y posteriormente WB. La verificación de la correcta ejecución del protocolo que da como resultado el aislamiento de especies asimétricas se consigue después de la presencia de los dos marcadores de afinidad (His- y estreptomicina) en las diferentes muestras (Figura 3). Posteriormente, las etiquetas de afinidad se retiran después de la digestión con proteasas TEV (Figura 4). octámeros asimétricas dispuestas de etiquetas de afinidad se usan para reconstituir nucleosomas asimétricos. Inicialmente, un pequeño reconstitución prueba a gran escala se utiliza para determinar la relación molar óptima de ADN: octámero que resulta en un altoproducir formación de un complejo monodispersa. Posteriormente, se emplea la relación de mezcla optimizado para reconstituir los nucleosomas en una gran escala. Reconstituciones nucleosoma se analizan por la proteína / geles de ADN y la espectroscopía de RMN para el montaje correcto y la presencia de las histonas H3 hermanas marcados con isótopos diferencialmente respectivamente (Figura 5). Un ejemplo de aplicación se representa en la Figura 6. En particular, marcado isotópicamente diferencialmente y asimétricamente fosforilados en H3S10 nucleosomas se hacen reaccionar con Gcn5 acetiltransferasa, y la acetilación de H3K14 en ambas copias H3 se sigue en tiempo real por espectroscopía de RMN. El análisis revela que H3S10 fosforilación estimula H3K14 acetilación por Gcn5 en cis en comparación con en trans.
Figura 1: Diagrama de flujo para la preparación de diferencialmente Isótopos-labeled (y asimétricamente Modificado) Los nucleosomas. (A) La reconstitución y la afinidad de purificación de tándem diferencialmente octámeros histona marcada con isótopo (y de forma asimétrica modificada). (B) la reconstitución Nucleosoma combinando los octámeros asimétricos purificadas y una secuencia de ADN nucleosoma-posicionamiento. (C) RMN seguimiento de en-cis-trans y en la diafonía modificación después de mezclar los nucleosomas marcados con isótopos de forma asimétrica y modificados diferencialmente con enzimas modificadoras de histonas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La reconstitución de las histonas octámeros. Un perfil de elución de filtración en gel de la mezcla de la histona replegada. El pico principal a ~ 70 ml corresponde a los octámeros histonas. A 14 - 20% gel de gradiente de SDS-PAGE (tinción con azul Coomassie) de las fracciones eluidas correspondientes al pico octámero muestra la estequiometría de la histona correcta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Purificación de la histona asimétricas octámeros. gel de gradiente de 14-20% de SDS-PAGE (tinción de Coomassie) y el Banco Mundial en contra de las etiquetas de afinidad His- y estreptomicina de las muestras de las diferentes etapas del esquema de purificación por afinidad en tándem. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La eliminación de las etiquetas de afinidad. 18% de gel de SDS-PAGE (tinción de Coomassie) de octámeros histonas asimétrica purificados antes y después de la mezcla con la proteasa TEV. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Bioquímica y NMR Caracterización de los nucleosomas marcado con isótopos diferencialmente. (A) 6% de gel de ADN-PAGE nativa (tinción de bromuro de etidio) de una reconstitución nucleosoma pequeña prueba a gran escala usando diferentes relaciones molares de DNA: octámero (izquierda). gel de 6%-PAGE nativa de ADN (tinción de bromuro de etidio) la reconstitución de un nucleosoma a gran escala usando el ADN optimizada: octámero relación molar (a la derecha). (B) 18% de gel de proteína de SDS-PAGE (tinción de Coomassie) de los nucleosomas reconstituidas muestra la estequiometría correcta de las cuatro histonas del núcleo. (C) 1 H-15 N espectro SOFAST-HMQC de la copia H3 15 N-etiquetado de los nucleosomas marcados con isótopos diferencialmente (sólo H3 residuos de cola son visibles - el núcleo de la proteína es invisible debido a la tasa de volteo lenta). (D) 1 H-13 C HSQC espectro de la copia H3 13 C-etiquetado de los nucleosomas marcados con isótopos diferencialmente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Seguimiento de RMN en cis y en trans Modificación de diálogo transversal asimétrica impuesto por fosforilación de H3S10 en la acetilación H3K14 Actividad de Gcn5 acetiltransferasa. (A) Representación esquemática de diferencialmente marcados con isótopos y asimétricamente fosforilada en H3S10 nucleosomas reaccionaron con Gcn5 acetiltransferasa y la cartografía de la acetilación de H3K14, en cis y en trans. (B) 1 H-15 N-SOFAST HMQC y 1 H- 13 C espectros HSQC (regiones seleccionadas) de los nucleosomas asimétricos antes y después de la reacción con Gcn5. (C) de vigilancia RMN resuelta en el tiempo de H3K14 acetilación por Gcn5 en nucleosomas asimétricamente H3S10 fosforilados. Se muestran los promedios y la variación (barras de error) de dos experimentos independientes. Reproducido con permiso 16. Haga clic aquí para ver una versión más grande deesta figura.
Para la reconstitución de nucleosomas, el protocolo actual utiliza un molde de ADN largo de 165 pb que contenía la secuencia de posicionamiento de nucleosomas 601-Widom 20, pero un rendimiento similar se espera que el uso de diferentes longitudes de moldes de ADN. El protocolo fue diseñado y emplea el uso de tipos asimétricas de la histona H3. Con el mismo principio, el método se puede aplicar también para los otros histonas del núcleo y, además, puede ser utilizado para reconstituir los complejos que llevan dos histonas de núcleo distintos con diferentes etiquetas de isótopos. El protocolo puede ser también ligeramente modificado para reconstituir inicialmente histonas sub-complejos y no histona directamente octámeros. Después de esta modificación, tetrámeros H3-H4 asimétricos pueden reconstituirse mediante el empleo de la misma esquema de purificación tándem. Este último se mezclan con dímeros H2A-H2B reconstituidas por separado y el ADN para ensamblar nucleosomas 16. Los rendimientos finales y el rendimiento global de la protoc modificadool son similares a la original.
El protocolo es fuertemente dependiente de la capacidad de las dos columnas de afinidad para unirse de manera eficiente las especies en cuestión y por lo tanto para producir al final los complejos asimétricos de alta pureza. Es engorroso para proporcionar una prueba directa y concreta que el complejo purificado final es de hecho y sólo asimétrica. Sin embargo, el análisis del BM muestras de todas las etapas de purificación con los anticuerpos relevantes proporciona indicaciones fiables para el éxito del esquema de purificación tándem (Figura 3). Los mismos resultados, y por lo tanto garantías adicionales, se obtuvieron mediante el análisis de las mismas muestras para la presencia de los marcadores de afinidad por métodos de RMN 16. Aún así, si el análisis del Banco Mundial revela que la contaminación de las especies asimétricas con los simétricos, una pequeña variación puede ser aprobada en la primera etapa de purificación (Ni-NTA) que puede mejorar el resultado. En particular, en lugar de una elución isocrática, un gradien imidazol t de elución (10 a 250 mM) y se puede emplear entonces, sólo se agruparon las primeras fracciones de elución que están altamente enriquecidas en las especies asimétricos y ejecutar a través de la columna de afinidad. Esto se puede evaluar por análisis WB de las fracciones de elución de la presencia de la etiqueta de afinidad por estreptococos.
La selección del isótopo de la etiqueta en relación con la PTM de interés es más bien flexible, ya que para la mayoría de los casos, RMN es capaz de asignar el mismo PTM utilizando tanto 1 H- 15 N y 1 H- 13 espectros Ccorrelation. Sin embargo, para ciertos aminoácidos, como lisinas, la dispersión del desplazamiento químico de las resonancias 1 H- 13 laterales de cadena C es bastante limitado. Además, cuando los sitios diana de una enzima lisina modificadores son desconocidos, lectura de salida específica de sitio de lisina PTM no es sencillo. En estos casos, los métodos alternativos emplean 13 C-etiquetado selectiva de sitio, combinada con la producción de la histona semi-sintético"> 21 o el uso de secuencias de pulsos de RMN de nueva creación que permite la detección específica de estados de modificación a través de la excitación selectiva rutinas 22. Espectroscopía de RMN confiere más bien baja sensibilidad. En este sentido, se necesitan cantidades relativamente altas de nucleosomas (rango mu M) para llevar a cabo la reacciones enzimáticas. Esto evita que la evolución del método a una configuración de alto rendimiento.
Al mismo tiempo, un nuevo método químico ha sido introducido para la síntesis de los nucleosomas químicamente puros, asimétricamente modificados, con altos rendimientos, llevando definido PTM 23. Este enfoque ha sido utilizado, en combinación con fluorografía, para estudiar los mecanismos de diafonía PTM. Debido a la capacidad de baja resolución de los métodos de fluorografía en la detección de PTM, las conclusiones se derivaron indirectamente mediante la comparación de las actividades enzimáticas en general en un conjunto de nucleosomas que llevan diferentes combinaciones de PTM simétricos y asimétricos, en vezque por la observación directa de las reacciones PTM en los sitios correspondientes de cada una de las histonas hermana. Sin embargo, la incorporación de las histonas marcados isotópicamente y el uso de espectroscopía de RMN para PTM lectura podrían constituir el método antes mencionado una herramienta adicional para el análisis de PTM de alta resolución de los nucleosomas modificados de forma asimétrica.
En relación con la identificación de nuevos tipos de nucleosomas modificados de forma asimétrica en el futuro, el método actual pretende constituir una herramienta de alta resolución para el análisis de cis y trans en las reacciones de diafonía PTM sobre sustratos nucleosomal. En particular, de gran importancia es la decodificación de los mecanismos de diafonía que dan lugar a nucleosomas bivalentes 24 que contienen de forma asimétrica, ambos PTM transcripcionalmente activos y represivas.
The author has nothing to disclose.
El Dr. Philipp Selenko (FMP-Berlín) autor agradece a proporcionar un espacio laboratorio húmedo y la infraestructura para llevar a cabo experimentos y Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) para financiar el trabajo a través de una beca de investigación (LI 2402 / 2-1).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Guanidinium HCl | Applichem | A14199 | Use high quality Gu-HCl |
Tris | Roth | 4855.2 | |
DTT | Applichem | A1101 | |
NaCl | VWR chemicals | 27810.364 | |
EDTA | Roth | 8043.2 | |
Na2H2PO4 | Applichem | A1046 | |
NaH2PO4 | Applichem | A3902 | |
Imidazole | Applichem | A1073 | |
d-Desthiobiotin | Sigma | D1411 | |
Ni-NTA Superflow | Qiagen | 1034557 | |
Strep-Tactin Superflow | IBA | 2-1207-001 | |
His-probe antibody | Santa Cruz | sc-8036 | |
Strep-tactin conjugated HRP | IBA | 2-1502-001 | |
Hi-Load 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 28-9893-35 | |
6 - 8 kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 1, 132650 | |
50 kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 7, 132129 | |
10 kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC901024 | |
30 kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC903024 | |
Solution-state NMR spectrometer | at least 500 MHz operating frequency, equipped with a triple-resonance cryoprobe | ||
Buffer name | Component | ||
Unfolding Buffer | 7 M Guanidinium HCl | ||
20 mM Tris, pH 7.5 | |||
10 mM DTT | |||
Refolding Buffer | 10 mM Tris, pH 7.5 | ||
2 M NaCl | |||
1 mM EDTA | |||
2 mM DTT | |||
Assay Buffer | 25 mM Na2H2PO4, pH 6.8 | ||
25 mM NaCl | |||
2 mM DTT |
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