כינון של נוקלאוזום עם דיפרנציאלי איזוטופ שכותרתו היסטונים אחות

פרוטוקול זה מתאר את הכינון מחדש של נוקלאוזום המכיל היסטונים אחות איזוטופ שכותרתו דיפרנציאלי. במקביל, סימטרית שלאחר translationally נוקלאוזום שונה יכול להיווצר לאחר שימוש בעותק היסטון premodified. תכשירים אלה יכולים לשמש בקלות ללמוד מנגנוני crosstalk השינוי, בו זמנית משני ההיסטונים אחותו, באמצעות ספקטרוסקופיית NMR ברזולוציה גבוהה.

נוקלאוזום שונה סימטרית מכילים שני עותקים של היסטון (היסטונים אחות) מעוטר סדרות שונות של שלאחר translational שינויים (PTMs). הם לא מכבר מזוהה מינים באמצעים לא ידועים של קמת השלכות תפקודיות. שיטות אנליטיות נוכחיות אינן מספיקות כדי לזהות את המופע ספציפי העותק של PTMs על ההיסטונים אחות nucleosomal. פרוטוקול זה מציג שיטה ביוכימיים בריאורגניזציה במבחנה של נוקלאוזום המכיל היסטונים אחות איזוטופ שכותרתו דיפרנציאלי. הקומפלקס שנוצר יכול להיות גם סימטרית שונה, אחרי כולל בריכת היסטון premodified במהלך refolding של subcomplexes היסטון. הכנות הנוקלאוזום הסימטריות אלה יכולים להיות הגיבו בקלות עם אנזימי שינוי היסטון ללמוד מנגנוני שינוי צולב לדבר שטיל PTM מראש שולב הסימטרי באמצעות תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה (NMR). במיוחד, תגובות השינוי בניתן למפות בזמן אמת באופן עצמאי על שני היסטונים אחותו על ידי ביצוע סוגים שונים של ניסויי קורלציה NMR, המותאמים לסוג איזוטופ בהתאמה. מתודולוגיה זו מספקת את האמצעים כדי לחקור מנגנוני crosstalk שתורמים להיווצרות ההתפשטות של דפוסי PTM סימטריים על מתחמי nucleosomal.

DNA איקריוטיים ארוז היטב בתוך גרעין התא אל הכרומטין. אבן הבניין הבסיסית של הכרומטין הוא חלקיק הליבה הנוקלאוזום המכיל ~ 147 נ"ב של DNA עטוף סביב תסביך octameric מורכב משני עותקים כל אחד מארבעת ההיסטונים הליבה (H3, H4, H2A, H2B). חלבוני היסטון נמל שפע של שלאחר translational שינויים (PTMs). החלפות קוולנטיים אלה לגרום שינויים במבנה הכרומטין, הוא באופן ישיר על ידי המשפיע על הכימיה הפיסיקלית של המערכת ובעקיפין על ידי גיוס פעילויות שיפוץ-הכרומטין ^{1, 2, 3.} באמצעות אלה, PTMs היסטון לשלוט נגישות הכרומטין, ומכאן, להסדיר את כל הפונקציות הסלולר מבוססי DNA ^4.

PTMs מותקנים על ידי מערכות אנזימים שינוי היסטון בעיקר על ערוצי N-terminal לא מובנה (זנבות) של histo הליבה-משולב הנוקלאוזוםנוס. בשל באתרי השינוי הרבים על הרצף קצר יחסית זנבות היסטון, PTMs להשפיע אחד על השני על ידי גרימה או חסימת תגובות מפני עריכה, תופעה הידועה בשם ⁵ הצטלבות שינוי. בגלל הארכיטקטורה הסימטרית הכוללת של הנוקלאוזום, תגובות שינוי ומנגנוני crosstalk נחשבו להתרחש באופן דומה על שני העותקים של כל היסטון nucleosomal (היסטונים אחות). מושג זה היה לערער לאחרונה ובהמשך להפרכה. במיוחד, במבחנת מבחני האנזימטית על פפטידים זנב H3 חינם היסטון ועל נוקלאוזום הוכיחו כי קבוצה של קינאזות H3 הציגה זירחון בתוך סימטרי באופן ^6. בנוסף, זיקת טיהור מבוססת LC-MS / MS ניתוח חשף את קיומם של סימטרית נוקלאוזום-מפוגל H3 בכמה סוגים של תאים איקריוטיים ^7. לפיכך, סימטרי נוקלאוזום שונה מהווה מיני רומן,כלים נדרשים לחשוף את המנגנונים השולטים היווצרותם ולנתח את ההשפעות crosstalk שחוסר סימטריה זה עלול להפעיל.

בדרך כלל, המערבי סופג (WB) ו ספקטרומטריית מסה (MS) ניתוח שימשו כדי לזהות PTMs היסטון. למרות היישום הקל שלה, WB סובל סגוליים / בעיות תגובתיות צולבות. נוסף על כך, זה אינו מסוגל לבצע ניתוח רב-PTM סימולטני וכימות ישירה של תגובות השינוי ^8. מצד השני, ניתוח MS מעסיק מכשור מתוחכם הדורש הכשרה ברמה גבוהה, אך מספק סגולי גבוהות כמו גם מיפוי סימולטני וכימות של מספר ⁹ PTMs.   עם זאת, שתי השיטות הן משבשות מתחמי nucleosomal הם ניתקו לפני הניתוח, והולידו תערובת של ההיסטונים ו / או פפטידים שמקורם היסטון. מניפולציה זו מסירה את היכולת להבחין עצמאיתגובות שינוי המתרחשות על כל אחד משני ההיסטונים אחותו לדווח על מצב שינוי ספציפי העותק של ההיסטונים nucleosomal.

תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיה התפתחה כמו שיטה חלופית כדי למפות תגובות PTM. התמ"ג הוא הפרעה ובכך מאפשרת ניטור של אירועים PTM באופן בזמן אמת בתערובות מחדש, ואפילו תאים שלמים ^{10, 11.} הפיתוח שגר לרכישת נתונים מהירה וכן למיפוי ברזולוציה גבוהה המבוסס על 2D שיטות קורלציה הטרו-הגרעיני של שכותרתו איזוטופ ⁽¹⁵ N ו / או ¹³ ג) דגימות ¹² אפשרו המיפוי סימולטני של סוגים שונים של PTMs, כגון כמו סרין / תראונין / זירחון טירוזין, acetylation ליזין / מתילציה, ו ארגינין מתילציה ^13. בהתאם PTM תחת חקירה, ¹⁵ N- או ¹³ יח"צ C-תיוגיכול להיות מועסק otocols לסמן את הקבוצה פונקציונלי חלבון המשמש ככתב שינוי. כתוצאה מכך, מיפוי PTM יכול להתבצע על ידי ביצוע עקירת המשמרת כימית מאפיינת את הקבוצה הפונקציונלית המתאימה "חישה" השינוי על הסביבה הכימית. ברוב המקרים, הוא NH וקבוצות כימיות CH ניתן המשמשים לצורכי דיווח על האבולוציה של PTM של עניין.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הדור של נוקלאוזום המכיל היסטונים אחות איזוטופ שכותרתו דיפרנציאלי. הוא משלב את הגמישות של ספקטרוסקופיה NMR למפה PTMs הן באמצעות ספקטרום קורלציה ¹ H- ¹⁵ N ו- ¹ H- ¹³ C עם ניצול של תגי קרבה חלבון שונים לטיהור של מתחמי היסטון מחדש שנבחרו. יש לציין, כי הפרוטוקול מעסיק שתי ברכות שונות של היסטון בפרט עבור כינון מחדש הנוקלאוזום. בריכות אלו הן איזוטופ שכותרתו דיפרנציאלי (אחד עם ^{15 N, השני עם 13 C), והם התמזגו polyhistidine ותג זיקה streptavidin, בהתאמה. ערכת טיהור זיקה טנדם עם Ni-נ.ת.ע כרומטוגרפיה מבוסס streptavidin בתחילה שמוצגת וויגט et al. 7 מועסק לטהר מינים סימטריים מעמיתיהם סימטריים (איור 1 א). Octamers היסטון אסימטרית משמש לאחר מכן כדי לשקם מתחמי nucleosomal שווים ערך (איור 1B), בשיטת דיאליזת המלח הרגיל 14. בנוסף, דרך אותו ההליך ועל ידי שיש אחת הבריכות היסטון מראש שונה, PTM ניתן לשלב סימטרי על נוקלאוזום שהתקבל. התגובה של אלה מצעים עם אנזימי שינוי היסטון ו- NMR-המיפוי הבא של אירועי שינוי לאפשר אפיון מנגנוני crosstalk הוא-cis (עותק היסטון premodified) וב-טרנס (unmodifiעותק היסטון ed) (תרשים 1C).}

כינון 1. נוקלאוזום עם דיפרנציאלי איזוטופ שכותרתו (ו סימטרי השתנה) היסטונים אחות

הערה: הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הכינון מחדש של נוקלאוזום עם H3 היסטון איזוטופ שכותרתו דיפרנציאלי. לשם כך, שתי בריכות של היסטון H3 שימשו; אחד היה ¹⁵ N שכותרתו והכיל-תג 6xHis בבית הסופית- N והשני היה ¹³ C שהכותרת והכיל הפפטיד סטרפטוקוקוס (WSHPQFEK) התמזג על N- סופי. שני התגים הופרדו רצף H3 הילידים עם וירוס Etch טבק (TEV) אתר הכרה פרוטאז. כדי להכין נוקלאוזום נוסף סימטרי שונה, אחת משתי הבריכות H3 כלול צורת premodified. Premodification של בריכת היסטון יכול להתבצע על ידי מגיבים היסטון שכותרתו איזוטופ עניינים עם האנזים בהתאמה שינוי היסטון בנוכחות של צורך עבור כל סוג של קו-פקטורים התגובה / תורמים PTM ¹6. המיקום היעיל של PTM בהתאמה ניתן להעריך על ידי ספקטרוסקופיה NMR או ספקטרומטריית מסה. סכומי היסטונים / DNA משמשים הנה המלצות מחוספסות להשיג הכנת הנוקלאוזום עם ריכוז משוער של 10 מיקרומטר (כפי שנמדד ריכוז ה- DNA ב 260 ננומטר) התשואה הסופית .זהו מספיק להקליט ספקטרום NMR באיכות טובה עם פעמי רכישה קצרות יחסית.

1. כינון של octamer היסטון עם שכותרתו איזוטופ דיפרנציאלי (ו סימטרי שונה) היסטון H3
   הערה: חלבוני היסטון רקומביננטי יכולים להיות מיוצרים בכמויות מ"ג BL21 (DE3) plysS תאי ^14. כדי להשיג היסטונים שכותרתו איזוטופ, פרוטוקול ביטוי / טיהור אותה אחריו למעט באמצעות התפתחות חיידקים מדיום מינימלי המכיל ¹⁵ NH ₄ Cl ו / או ¹³ C-גלוקוז כמקורות חנקן ופחמן, במשך ¹⁵ N- או ¹³ C-תיוג respectively. היסטונים מטוהרים הם dialyzed באופן גורף כלפי 5 מ"מ β-mercaptoethanol ומאוחסנים lyophilized לפני השימוש.
   1. ממיסים aliquots היסטון lyophilized, המכיל ~ 5 מ"ג של כל היסטון ב 1 מ"ל של התגלגלות חיץ (7 M guanidinium HCl, 20 מ"מ טריס pH 7.5, 10 mM DTT). להכיל את שני סוגי היסטון H3. מערבבים על ידי pipetting לא מערבולת. שמור את הצינורות על קרח למשך 30 דקות, כדי לאפשר להשלים התגלגלות.
   2. קבע את הריכוז המדויק של כל היסטון על ידי מדידת הספיגה ב 280 ננומטר נגד התגלגלות חיץ ושימוש במקדמי הכחדה מחושבים עם כלי ProtParam של פורטל ExPASy. ¹⁵
   3. מערבבים את ההיסטונים הליבה יחסי equimolar, תוך התחשבות לכלול 50% כל אחת הבריכות H3 שתי היסטון. התחל על ידי שימוש התוכן כולו של היסטון פחות מרוכז ולהוסיף את כל האחרים בהתאם.
   4. התאם ריכוז החלבון הסופי כ 1 מ"ג / מ"ל ​​באמצעות התגלגלות חיץ.
   5. Transfer את התערובת אל קרום דיאליזה 6 kDa-גזורים dialyze נגד 1-2 ליטר של חיץ refolding מצונן (10 מ"מ טריס pH 7.5, 2 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 מ"מ DTT) בשעה 4 מעלות צלזיוס. שנה את החיץ לפחות פעם אחת אחרי הדיאליזה התקדמה למשך התקופה מינימאלית של 3 שעות. בצע O דיאליזה סופי / N ב 4 ° C.
   6. אסוף חומר dialyzed וסר משקע על ידי צנטריפוגה בתוך microfuge במשך 5 דקות ב 4 ° C על מהירות מרבית (בדרך כלל לא ממטרים יש לשים לב). קביעת ריכוז octamer על ידי מדידת הספיגה ב 280 ננומטר. בחישובים, השתמש מקדמי הכחדה המוסף של היסטונים, תוך התחשבות ללחוץ פעמיים כל ערך.
   7. תתרכז לנפח סופי של ~ 2 מ"ל באמצעות יחידת מסנן צנטריפוגלי 10 kDa-החיתוך. חישוב מחדש אובדן ריכוז אומדן octamer. בשלב זה, ריכוז octamer בין 50 - 100 מיקרומטר יש לקבל.
   8. חבר את העמודה סינון ג'ל (כאמור בטבלה של חומרים) למערכת FPLC לאזן עם 2 כרכים עמודה (CV) של 0.22 מיקרומטר-מסוננים degassed refolding חיץ בקצב זרימה של 1 מ"ל / דקה גבול הלחץ של 0.5 מגפ"ס.
      הערה: ריצת סינון ג'ל צריכה להתבצע בחדר הקר או בתוך ארון קר.
   9. להזריק חומר מרוכז באמצעות קצב הזרימה של 1 מ"ל / דקה לאסוף 1.0 - 1.5 שברים מ"ל.
   10. בצע את פרופיל chromatographic ולבחון elution היסטון octamer ב ~ 65 - 68 מ"ל.
       הערה: כתף קטנה של שיא elution ואת לשיא ב ~ 80 מיליליטר, מלמדת על קיומו של tetramers H3-H4 בחינם הדימרים H2A-H2B, בהתאמה.
   11. הפעל 20 μL של כל חלק שנאספו ג'ל 18% SDS-PAGE.
       הערה: לדלל את דגימות בפקטור של 2 לפחות עם מים לפני טעינתם על ג'ל כדי להפחית את ריכוז מלח גבוה ובכך, למנוע עיוותים. הדבר נכון גם עבור ניתוחי SDS-PAGE הבאות של דגימות refolding חיץ.
   12. בריכת FRA רלוונטיctions המכיל octamers טהור להשפט על ידי חלוקה שווה של 4 ההיסטונים על הג'ל מוכתם ולקבוע ריכוז כמו קודם (שלב 1.1.7).
   13. חבר טור מ"ל Ni-נ.ת.ע 1 (לוח של חומרים) למערכת FPLC לאזן עם 10 CV של 0.22 מיקרומטר-מסוננים degassed refolding חיץ בקצב זרימה של 1 מ"ל / דקה.
       הערה: כרומטוגרפיה Ni-נ.ת.ע צריכה להתבצע בחדר הקר או בתוך ארון קר.
   14. לעבור octamer מטוהרים באמצעות Ni-נ.ת.ע באמצעות קצב הזרימה של 1 מ"ל / דקה.
   15. אסוף זרימה דרך לשמור דגימות לבדיקת SDS-PAGE / WB (20 μL ו -4 μL, בהתאמה). בהמשך, לשטוף טור עם 10 CV של refolding חיץ או עד אות הבסיס הוא הגיע.
   16. Elute עם 10 CV של refolding מאגר המכיל 250 imidazole מ"מ באמצעות קצב הזרימה של 1 מ"ל / דקה. שמור דגימות לבדיקת SDS-PAGE / WB (20 μL ו -4 μL, בהתאמה).
   17. לאזן עמודת זיקת מיליליטר 1 של acstreptavidin ommercial (לוח של חומרים) עם 10 CV חיץ refolding המכיל 250 imidazole מ"מ באמצעות הגדרת זרימת אצווה / הכבידה.
       הערה: שלב chromatographic זה צריכה להתבצע בחדר הקר.
   18. לעבור elution Ni-נ.ת.ע דרך עמודת הזיקה המסחרית streptavidin.
   19. אסוף הזרימה דרך ולשמור דגימות לבדיקה SDS-PAGE / WB (20 μL ו -4 μL, בהתאמה). בהמשך, לשטוף עם 10 CV של refolding חיץ.
   20. Elute עם 10 CV של refolding מאגר המכיל 2.5 מ"מ desthiobiotin. שמור דגימות לבדיקת SDS-PAGE / WB (20 ו -4 μL בהתאמה).
   21. מדוד ריכוז octamer, להוסיף 10 פעמים פחות פרוטאז TEV ולתת התגובה להמשיך לילה ב 4 מעלות צלזיוס צינור צנטריפוגות פלסטיק רגיל.
       הערה: את הסכום הדרוש של TEV להשיג עיכול מלא (הסרת תגי הקרבה) תלויה המוצא (לבנות) ועל הפעילות (טרי, TEV רקומביננטי יותרפעיל לעומת אחד מאוחסן לפרקי זמן ממושכים בבית - 80 מעלות צלזיוס). נסה תחילה הוספת 10 פעמים פחות TEV לעומת octamer (שנאמד ריכוזי חלבון) ולהתאים בהתאם.
   22. בדוק לעיכול יעיל על ידי הפעלת 20 μL של התערובת לפני ואחרי בנוסף TEV על ג'ל 18% SDS-PAGE. אם העיכול אינו שלם, להוסיף עוד פרוטאז TEV ולהמשיך דגירה של 3-4 אחר h.
   23. Dialyze מדגם נגד refolding חיץ באמצעות קרום דיאליזה 50 kDa-הפסיק להסיר פרוטאז TEV ולהתאים רכב חיץ.
   24. לרכז את octamer הסימטרית מטוהר באמצעות יחידת מסנן צנטריפוגלי 10 kDa-חיתוך (באותה יחידת מסנן משלב 1.1.7 יכול לשמש גם) בהיקף של 1.0-2.0 מיליליטר. מדדו את הריכוז הסופי. או להשתמש מיד לאחר הכינון מחדש הנוקלאוזום או להסתגל 50% (v / v) גליצרול לאחסן ב -20 ° C לפרקי זמן ארוכים יותר. בשלב זה, מצפה לפחות הפסד 70% במהלך השלבים הקודמים, הריכוז דואר octamer צריך להיות בטווח של 20 - 50 מיקרומטר.
2. כינון מחדש הנוקלאוזום
   1. אם octamer אוחסן גליצרול 50%, dialyze הלילה ב 4 ° C נגד refolding חיץ לפני שתמשיך עם כינון מחדש הנוקלאוזום.
   2. התאם DNA (המכיל הנוקלאוזום מיצוב רצף) ריכוז מלח 2 M NaCl באמצעות פתרון המניה 5 M NaCl.
      הערה: ה- DNA מטוהר אם בנפרד לאחר הטיהור של פלסמיד המכיל מספר עותקים של הרצף הרצוי או מסונתז על ידי הגברת PCR יש לאחסן מרוכז ~ 50 מיקרומטר במים או חיץ טריס-EDTA סטנדרטי.
   3. מערבבים octamer ו- DNA באמצעות היחס האופטימלי נקבע מתוך ניסיון בקנה מידה קטן. השתמש חיץ refolding להתאים את נפח סופי ~ 3.0 מ"ל. תמיד להוסיף את octamer האחרון כדי למנוע כל אפשרות של ערבוב octamer והדנ"א ב <2 M ריכוזי מלח.
      1. בצע קטן sc הראשוניreconstitutions אייל לקבוע את octamer: יחס ה- DNA שמוביל תשואות הנוקלאוזום אופטימלית. לשם כך, להרכיב שלוש תגובות של 0.9: 1.0, 1.0: 1.0, ו -1.1: 1.0 DNA: octamer יחסים בנפח בין 50-100 μL. בדרך כלל, להשתמש בריכוז של DNA 5 מיקרומטר.
      2. המשך עם כינון מחדש כמתואר להלן (שלבים 1.2.4-1.2.8) ובסוף, להעריך את כמות הנוקלאוזום מחדש איכות מסיסים טוב על ידי מדידת ריכוז ה- DNA ב 260 ננומטר באמצעות הרצת ג'ל DNA 6% ילידים-עמוד , מוכתם ברומיד ethidium, בהתאמה (איור 5 א).
   4. מעבירים את תערובת אל קרום דיאליזה 6 kDa-גזורים dialyze נגד 1 ליטר של refolding חיץ לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
   5. מנמיכים את ריכוז מלח של חיץ דיאליזה באופן צעד חכם מן 2, 0.85, 0.64, ו 0.2 M NaCl בהתאמה. שמור מדגם בכל חיץ עבור שעות לפחות 3. לפעמים משקע נוצר לאחר המעבר האחרון. ב- C במקרה זהontinue דיאליזה כמתוכנן ולהסיר המשקע על ידי צנטריפוגה microfuge בסוף לשלב הבא.
   6. העברה קרום דיאליזה בכוס עם 1 ליטר של חיץ assay (25 מ"מ לאא ₂ PO ₄ / Na ₂ HPO ₄ pH 6.8, 25 mM NaCl, 2 מ"מ DTT) ולהמשיך דיאליזה O / N ב 4 ° C.
   7. אסוף מדגם, להסיר כל המשקע שנוצר בשלב 1.2.5 על ידי צנטריפוגה בתוך microfuge במשך 5 דקות ב 4 ° C על המהירות המרבית ולהתרכז באמצעות יחידת מסנן צנטריפוגלי 30 kDa-הפסקת לנפח סופי של ~ 300 μL.
   8. מדוד ריכוז ה- DNA ב 260 ננומטר, לרוץ ג'ל חלבון 18% SDS-PAGE (4 μL של המדגם) ו ג'ל DNA 6% ילידי-עמוד (0.2 μL של המדגם) מדגם ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות. הריכוז הסופי צריך להיות בטווח של 10-20 מיקרומטר.

2. ניתוח התמ"ג של תגובות שינוי על שני ההיסטונים אחות

הערה: המחאה2D ¹ H- ¹⁵ N מתאם ספקטרום של זנבות היסטון nucleosomal ניתן למצוא בכתובת אזכור ^{16, 17, 18.} בנוסף, הקצאות של CH _x קבוצות של lysines, serines ו threonines על 2D ¹ H- ¹³ C ספקטרום המתאם ניתן למצוא בכתובת התייחסות ^16.

1. התקנת NMR והקלטה של ספקטרה ההתייחסות
   הערה: מבחני אנזימתי בוצעו באמצעות 140 μL של מדגם הנוקלאוזום חיץ assay לתוך צינור NMR 3 מ"מ ב 300 צינורות NMR שונים ק עם כרכי מדגם אחרים יכולה לשמש גם. הטמפרטורה הנ"ל ראויה להשיג באיכות טובה ¹ H- ¹⁵ ספקטרה מתאם N של זנבות היסטון nucleosomal ופעילויות אנזימטיות טובות. 2D-SOFAST-HMQC ¹ H- ¹⁵ N ו- 2D-HSQC ¹ H- ¹³ ספקטרום C נרשמו בהתאמה עם חולצת ההתקנהכובע מקנה פעמי רכישה דומות. פרמטרי רכישה אופייניים הם 128 ארעיים עם 1.024 ⁽¹ H) x 128 ⁽¹⁵ N) נקודות מורכבות ו -32 הארעיים עם 1.024 ⁽¹ H) x 64 ⁽¹³ C) מורכב נקודות עבור שני הסוגים השונים של ספקטרום קורלציה. עבור שני ספקטרום 2D, בפעם הרכישה היה ~ 30 דקות.
   1. גדר 300 K כמו הטמפרטורה מדגם ב ספקטרומטר. הוסף 10% D ₂ O (v / v) מדגם לשמש את המנעול התדיר ספקטרומטר.
   2. הנח את הדוגמה ספקטרומטר ולבצע פעולות בסיסיות (נעילה, כוונון, shimming). בנוסף, לקבוע אורכי דופק אופטימלית פרמטרי רכישה בכלל.
   3. שיא 1D ו 2 ד ¹ H- ¹⁵ N ו- ¹ H- ¹³ ספקטרום C התייחסות.
   4. תהליך ספקטרה ההתייחסות ולהבטיח כי האותות לשמש למיפוי תגובות השינוי נפתרת היטב ויש להם עוצמות טובות.
   5. שחזור מדגם ולהעביר it לצינור microfuge.
2. ההתקנה של התגובה האנזימטית, ניטור NMR וניתוח כמותי
   1. העתק להסדיר שורה של 2D משולבים ¹ H- ¹⁵ N ו- ¹ H- ¹³ ספקטרום C. כוון זמן רכישה כולל של מספר שעות ולהתאים בהתאם בריצה חדשה המבוססת על שיעורי אנזימטיות המתקבל התגובה הראשונה.
   2. הוסף המדגם קו-פקטורים הדרושים בהתאמה לסוג של התגובה שינוי (1 מ"מ ATP / 2 מ"מ MgCl ₂ עבור זירחון, 1 מ"מ אצטיל-CoA עבור acetylation, 1 מ"מ SAM עבור מתילציה, וכו.).
   3. מוסיפים את האנזים של עניין, ומערבבים על ידי pipetting, להעביר את דוגמת לראש בצינור NMR וכפועל יוצא מזה ספקטרומטר (לבצע פעולות אלה במהירות).
      הערה: אם אין נתונים על הפעילות האנזימטית הצפויה, להתאים את המצע אל אנזים יחס טוחן עד 10: 1. בצע ניסוי ראשון ולהתאים בהתאם עבורבטווח האמיתי.
   4. בצע shimming אוטומטי מהיר ולהשתמש בשאר הפרמטרים של ספקטרה התייחסות.
   5. ליזום הסדרה של 2D משולבים ¹ H- ¹⁵ N ספקטרה ¹ H- ¹³ C.
   6. בצע את ההתקדמות של התגובה בזמן אמת ולהפסיק רכישה כאשר התגובה מגיעה השלמה או לרמה רצויה.
   7. תהליך ספקטרה כמו קודם עם אותם פרמטרים בדיוק.
   8. חזור בטווח כולו באמצעות צו רכישה שונה עבור שני סוגי ספקטרום קורלציה. אם בניסוי הראשון קורלציה ¹ H- ¹⁵ N היה הראשון בסדרה, להתחיל עכשיו עם מתאם C ¹ H- ^13. לפי זה ויש להם באותו זמן רכישה הוא הספקטרום, אפשר לתכנן ולהשוות תגובות PTM משני ההיסטונים איזוטופ שכותרתו דיפרנציאלי על אותה סקאלה הזמן. בנוסף, ניתן לחשב ממוצעים וברי שגיאת עלילה.
      הערה: thorougתיאור h של מתודולוגיות לניתוח אותות תמ"ג וכימות הבאות של תגובות אנזימטיות ניתן למצוא כאן ^19.
   9. בחר אותות תמ"ג מכל ספקטרום NMR זמן כמובן המדווחים על התקדמות התגובה ולחשב עוצמות האות יחסיות באמצעות תוכנה ויזואליזציה וניתוח עבור ספקטרום NMR. בצע פעולה זו עבור אותות המדווחים על ללא שינוי, כמו גם את המדינה השונה. חלץ רמות שינוי.
   10. עלילת הערכים המחושבים של רמות שינוי כנגד זמן התגובה.

כראוי וקפלו מיני octameric מבודדים אחרי ריצה של תערובת הכינון מחדש דרך עמודת סינון ג'ל (איור 2). הבריכה מחדש octameric המכיל את שלושת הסוגים השונים של octamers הוא נתון את ערכת טיהור זיקה טנדם. דוגמאות נאספות מכל המדרגות ונותחו על ידי SDS-PAGE, ובהמשך WB. אימות של הביצוע הנכון של הפרוטוקול המביא את הבידוד של מינים סימטריים מושגת על ידי ביצוע בנוכחות שני תגי הקרבה (ההיספניים ו Strep-) בדגימות השונות (איור 3). בהמשך לכך, תגי קרבה יוסרו לאחר העיכול פרוטאז TEV (איור 4). octamers אסימטרית מסולק תגי קרב משמש כדי לשקם נוקלאוזום סימטרי. בתחילה, כינון מחדש ניסיון בקנה מידה קטן משמש כדי לקבוע את היחס הטוחן האופטימלי של ה- DNA: octamer כי תוצאה הוא גבוהלהניב היווצרות קומפלקס monodisperse. כתוצאה מכך, יחס ערבוב אופטימיזציה מועסק כדי לשקם נוקלאוזום ב בקנה מידה גדול. Reconstitutions הנוקלאוזום מנותח על ידי חלבון / ג'לים דנ"א ספקטרוסקופיה NMR עבור ההרכבה הנכונה ואת הנוכחות של ההיסטונים H3 אחות איזוטופ שכותרתו דיפרנציאלי בהתאמה (איור 5). דוגמא ליישום מתוארת באיור 6. במיוחד, שכותרתו איזוטופ דיפרנציאלי סימטרית פוספורילציה על H3S10 נוקלאוזום מגיבים עם acetyltransferase Gcn5, ו acetylation של H3K14 משני עותקים H3 אחריו בזמן אמת על ידי ספקטרוסקופיה NMR. הניתוח מעלה כי זירחון H3S10 מגרה acetylation H3K14 ידי Gcn5 ב ציס לעומת טרנס.

איור 1: תרשים זרימה עבור הכנת דיפרנציאלי איזוטופ-labeled (ו סימטרי השתנה) נוקלאוזום. (א) כינון וזיקת טנדם טיהור שכותרתו איזוטופ דיפרנציאלי (ו סימטרי שונה) היסטון octamers. (ב) הכינון מחדש הנוקלאוזום על ידי שילוב של octamers סימטרית מטוהרים רצף מיצוב הנוקלאוזום DNA. (C) תמ"ג ניטור של ב-cis וב-trans crosstalk שינוי לאחר ערבוב שונה בצורה אסימטרית, דיפרנציאלי נוקלאוזום שכותרתו איזוטופ עם אנזימים שינוי היסטון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: כינון של היסטון Octamers. פרופיל elution ג'ל סינון של תערובת היסטון וקפל. השיא הגדול ב ~ 70 מיליליטר תואם את octamers היסטון. A 14 - 20% ג'ל שיפוע SDS-PAGE (מכתים הכחול Coomassie) של שברי eluted המתאימים שיא octamer מציג את stoichiometry היסטון הנכון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: טיהור אסימטרית היסטון Octamers. 14-20% ג'ל SDS-PAGE שיפוע (מכתים Coomassie) ו WB נגד תגי קרבה היספני ו Strep- של דגימות מן השלבים השונים של ערכת טיהור זיקה טנדם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4: הסרת תגיות הזיקה. 18% ג'ל SDS-PAGE (מכתים Coomassie) של octamers היסטון הסימטרי מטוהר לפני ואחרי הערבוב עם פרוטאז TEV. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5: אפיון ביוכימי התמ"ג של דיפרנציאלי איזוטופ שכותרתו נוקלאוזום. (א) 6% ג'ל DNA יליד-עמוד (ethidium ברומיד מכתים) של הכינון מחדש הנוקלאוזום ניסיון בקנה מידה קטן באמצעות יחסי טוחנת שונים של DNA: octamer (משמאל). 6% ג'ל DNA יליד-עמוד (ethidium ברומיד מכתים) של כינון מחדש הנוקלאוזום בקנה מידה גדולה באמצעות DNA אופטימיזציה: octamer יחס טוחן (מימין). (ב) 18% SDS-PAGE חלבון ג'ל (מכתים Coomassie) של נוקלאוזום מחדש מציגה את stoichiometry הנכון של היסטונים ארבע ליבות. (ג) ¹ H- ¹⁵ N SOFAST-HMQC ספקטרום של ¹⁵ N שכותרתו H3 העותק של נוקלאוזום שכותרתו איזוטופ דיפרנציאלי (רק שאריות זנב H3 גלויות - ליבת החלבון הוא בלתי נראה, בשל השיעור נופל האיטי). (ד) ¹ H- ¹³ C HSQC ספקטרום של ¹³ העותק H3 שכותרתו C של נוקלאוזום שכותרתו איזוטופ דיפרנציאלי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6: ניטור התמ"ג של ב- CIS ו בטרנס שינוי חוצה לדבר שהטילה אסימטרית זירחון של H3S10 על פעילות H3K14 acetylation של Gcn5 acetyltransferase. (א) ייצוג סכמטי של דיפרנציאלי שכותרתו איזוטופ ו סימטרי פוספורילציה על H3S10 נוקלאוזום הגיב acetyltransferase Gcn5 ומיפוי acetylation H3K14, ב cis וב טרנס. (ב) ¹ H- ¹⁵ N SOFAST-HMQC ו ¹ H- ¹³ ספקטרום C HSQC (באזורים נבחרים) של נוקלאוזום הסימטרי לפני ואחרי תגובה עם Gcn5. (C) זמן נפתרה ניטור התמ"ג של acetylation H3K14 ידי Gcn5 על סימטרית H3S10 נוקלאוזום פוספורילציה. ממוצעי וריאציה (ברי שגיאה) משני ניסויים בלתי תלויים מוצגים. לשכפל באישור ^16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר שלהדמות הזאת.

עבור הכינון מחדש הנוקלאוזום, הפרוטוקול הנוכחי מנצל תבנית ה- DNA ארוכה 165 נ"ב המכיל את רצף מיצוב הנוקלאוזום 601-Widom ^20, אבל ביצועים דומים צפוי באמצעות באורכים שונים של תבניות DNA. הפרוטוקול נועד והעסיק באמצעות סוגים סימטריים של היסטון H3. עם אותו העיקרון, השיטה ניתן ליישם גם עבור ההיסטונים ליבה האחרים ובנוסף ניתן להשתמש בו כדי לשקם מתחמי נושא שני ההיסטונים ליבה נפרדים עם תוויות איזוטופ שונות. פרוטוקול יכול גם להיות שונה מעט בתחילה כדי לשקם מתחמי משנה היסטון ולא ישירות היסטון octamers. בעקבות שינוי זה, tetramers H3-H4 אסימטרית ניתן מחדש על ידי המעסיקים את ערכת טיהור אותו טנדם. האחרון מעורבבים עם הדימרים H2A-H2B מחדש בנפרד ו- DNA כדי להרכיב נוקלאוזום ^16. התשואות הסופיות ואת הביצועים הכוללים של protoc השונהol הם דומה לזו המקורית.

הפרוטוקול תלוי מאוד על היכולת של שני טורי הזיקה לאגד המין הרלוונטי ביעילות ובכך להניב בסוף מאוד מתחמי סימטרית טהורים. זה מסורבל לספק הוכחה ישירה ובטון שמכלול המטוהרים הסופי הוא אכן ורק סימטרי. עם זאת, ניתוח WB של דגימות מכל השלבים לטיהור עם הנוגדנים הרלוונטיים מספק אינדיקציות אמינות להצלחת תכנית טיהור טנדם (איור 3). באותו תוצאות, ומכאן חיזוקים נוספים, התקבלו על ידי ניתוח הדגימות אותו לנוכחות של תגי הקרבה בשיטות תמ"ג ^16. ובכל זאת, אם ניתוח WB מציין זיהום של מינים סימטריים עם אלה סימטריים, וריאציה קצרה ניתן לאמץ את שלב הטיהור הראשון (Ni-נ.ת.ע) שיכול לשפר את התוצאה. במיוחד, במקום elution isocratic, גידול gradien imidazole elution t (10-250 מ"מ) יכול להיות מועסק ולאחר מכן, שברי elution הראשונים רק כי הם מועשרים ב המין הסימטרי הם אספו ולהפעיל דרך עמודת הזיקה. זה ניתן להעריך על ידי ניתוח WB של שברי elution עבור הנוכחות של תג זיקת סטרפטוקוקוס.

הבחירה של התווית-איזוטופ ביחס PTM עניין די גמישה משום שברוב המקרים, התמ"ג הוא מסוגל מיפוי של אותם PTM הוא באמצעות ¹ H- ¹⁵ N ו- ¹ H- ¹³ ספקטרה Ccorrelation. עם זאת, עבור חומצות אמינו מסוימות, כמו lysines, פיזור המשמרת הכימית עבור תהודות C בצד שרשרת ¹ H- ¹³ הוא מוגבל למדי. בנוסף, כאשר אתרי היעד של אנזים שינוי ליזין אינם ידועים, אתר ספציפי לקריאה מתוך ליזין PTMs אינו פשוט. במקרים אלה, שיטות חלופיות להעסיק אתר סלקטיבי ¹³ C-תיוג, בשילוב עם ייצור היסטון חצי סינטטי"> 21 או את השימוש של רצפי דופק שהוקמו NMR המאפשר זיהוי ספציפי של מדינות שינוי דרך עירור סלקטיבית שגר ^22. ספקטרוסקופיה NMR מקנה די רגישות נמוכה. בהקשר זה, כמויות גבוהות יחסי של נוקלאוזום (טווח מיקרומטר) יש צורך לבצע את תגובות אנזימטיות. זה מונע התפתחות של שיטת התקנת תפוקה גבוהה.

במקביל, שיטה כימית חדשה כבר הציגה לסינתזה של טהור מבחינה כימית, נוקלאוזום השונה סימטרי, עם תשואות גבוהות, נושאת המוגדרת ²³ PTMs. גישה זו נעשה שימוש, בשילוב עם fluorography, כדי לחקור מנגנונים crosstalk PTM. בשל יכולת ברזולוציה נמוכה של שיטות fluorographic באיתור PTMs, מסקנות הופקו בעקיפין על ידי השוואת פעילות אנזימטית הכוללת סט של נוקלאוזום נושאת שילובים שונים של PTMs סימטריות סימטרית, אלאמאשר על ידי תצפית ישירה של תגובות PTM באתרים המתאימים של כל היסטון אחותו. עם זאת, שילוב של היסטונים isotopically שכותרתו ושימוש ספקטרוסקופיה NMR עבור ההודעה PTM עלול להוות שיטת הנ"ל כלי נוסף עבור ניתוח PTM ברזולוציה גבוהה של נוקלאוזום שונה סימטרית.

בקשר עם זיהוי של סוגים חדשים של נוקלאוזום שונה סימטרית בעתיד, השיטה הנוכחית שואפת להוות כלי ברזולוציה גבוהה לניתוח ב- CIS ו בתגובות crosstalk טרנס PTM על מצעים nucleosomal. במיוחד, בעל חשיבות גבוהה הוא פענוח מנגנוני crosstalk שיוצרים נוקלאוזום דו ערכי ²⁴ המכילים סימטרי, הן PTMs פעילת דיכוי תעתיק.

The author has nothing to disclose.

המחבר מודה ד"ר פיליפ Selenko (FMP-ברלין) למתן שטח רטוב המעבדה ותשתיות לבצע ניסויים (DFG) למימון עבודה באמצעות מענק מחקר (LI 2402 / 2-1).