Akım Sitometresi ile Fare Embriyosunda Eritromiyeloid Progenitörlerin Ve Döllerinin Belirlenmesi

Süzülen makrofajlar dolaşımdaki öncüllerden yetişkin dokulara sürekli olarak işlenirken, yerleşik makrofajlar, gelişme sırasında dokularını tohumlamakta ve burada progenitörlerden başka girdiler almadan korunmaktadırlar. Yerleşik makrofajların öncüleri yakın zamanda tanımlandı. Burada, yerleşik makrofaj öncüllerinin genetik kader haritalaması için yöntemleri sunuyoruz.

Makrofajlar bağışıklık sisteminin doğuştan gelen kolundan profesyonel fagositlerdir. Kararlı durumda, sabit makrofajlar erişkin dokularda bulunurlar ve burada enfeksiyon ve doku hasarının ön hatları olarak görev yaparlar. Diğer bağışıklık hücreleri, kemik iliğinde bulunan hematopoietik kök ve progenitör hücrelerden (HSPC) sürekli olarak yenilenirken, ikamet makrofajları olarak bilinen bir makrofaj serisinin, kemik iliği HSPC'leri girilmeden dokularda kendini idame ettirdiği gösterilmiştir. Bu soydan beyinde mikroglia, karaciğerde Kupffer hücreleri ve epidermide Langerhans hücreleri örneklenmektedir. Bağırsak ve kolon lamina propriası, HSPC'den bağımsız ikamet makrofajlarından yoksun olan tek erişkin dokudur. Yakın tarihli araştırmalar, yerleşik makrofajların, fetal hematopoietik kök hücrelerden (HSC) farklı progenitör (ler) den kaynaklanan ekstra embriyonik yolk kesesi hematopoezlerinden kaynaklandığını tespit etmiştir. Yolk kesesi kesin hematopoezisi arasındaRythromyeloid progenitörler (EMP) hem eritroid hem de myeloid hücrelere, özellikle ikamet makrofajlarına neden olur. ÇYP gelişme E8.5 ve E10.5 günleri arasında yolk kesesi içinde üretilir ve sirkülasyon bağlı olduğu yerde fetal karaciğere göç ederler; burada en azından E16.5'e kadar genişler ve ayırt edilirler. Onların soyları eritrositler, makrofajlar, nötrofiller ve mast hücreleri içerir, ancak sadece EMP'den türeyen makrofajlar dokularda yetişkinliğe kadar ısrarcı kalırlar. ÇÇ gelişinin geçici doğası ve HSC üretimi ile zamansal örtüşme, bu öncüllerin analizini zorlaştırır. Akış sitometrisi vasıtasıyla in vivo olarak EMP ve EMP türevi hücreleri karakterize etmek için makrofaj sitokin reseptörü Csf1r promotörünün ekspresyonuna dayanan bir tamoksifen-uyarılabilir kader eşleme protokolü kurduk.

Gelişmekte olan birkaç ardışık ama örtüşen hematopoietik progenitör dalgaları vardır, bunların miyeloid nesli yetişkinliğe kalmaktadır. İlk olarak, tek başlı "ilkel" öncüller ^, E7.5-E8.25 arasındaki fare yumurta sarısı ^{1 , 2'de} ortaya çıkar ve herhangi bir monositik ara madde olmadan embriyonik makrofajlara yol açar. İlkel progenitörlerden türetilen makrofajların yetişkin beyinde devam edip etmediği, yoksa mikroglia aktif bir sorunun konusudur. İkincisi, Eritrom-Myeloid Öncüleri (EMPs) E8.5'teki yolk kesesinde ortaya çıkarlar, kan dolaşımına girerler ve embriyonu kolonize ederler. EMP'ler, Runx1'e bağımlı endotel-to-hematopoietik geçiş ^{3 , 4'te} yumurta sarısı hemogenik endotelden ortaya çıkar. EMP yolk kesesi içinde makrofajlar ayırt mümkün olmakla birlikte, aynı zamanda, embriyonik gün (E) 9 ⁵ ve ayırıcı fetal karaciğer kolonizeEritrositler, megakaryositler, makrofajlar, monositler granülositleri ve mast hücreleri haline gelin ⁶ . ÇYP'lerden kaynaklanan makrofajlar gelişimsel ve erişkin dokularda proliferatif kapasite gösterir. EMP'den türeyen makrofajların, farklılaşmanın monosit safhasını bypass edip etmediği, farklılaşma yolları hakkında çok az bilginin olduğu için hala tartışmalıdır. ^{7 , 8} . Son olarak, Hematopoietik Kök Hücreler (HSC), E10.5'te aorta-gonad-mesonefroz bölgesinden uygun embriyo içerisinde ortaya çıkar ve fetal karaciğere göç eder. Uzun vadeli repopülasyon kapasitesine sahip HSC'ler yalnızca E11'den sonra (42 somite çift aşamasında) algılanır ⁹ . Orada, genişletmek ve kesin hematopoez doğum sonrası yaşamın ¹⁰ süresince kan hücresi üretiminin baskın siteyi olur kemik iliği geçiş başlayana kadar E12.5 ayrılırlar.

SpAtıonal ve temporal örtüşmenin yanı sıra paylaşılan immüno-fenotipik belirteçler, embriyonik hematopoietik progenitörlerin bu dalgalarının spesifik katkılarını ayırt etme kabiliyetimizi engellemiştir. Hem EMP hem de HSC Runx1'e bağımlı bir şekilde üretilirken ve diğerleri arasında Myb ve büyüme faktörü reseptörü Csf1r (Koloni Uyarıcı Faktör 1 Alıcı, ayrıca Makrofaj Kolonisi Uyarıcı Faktör Alıcı olarak da bilinir) ifade ederken, EMP'ler Hem in vitro hem de in vivo olarak lenfoid potansiyellerinin bulunmaması, uzun dönem repopulasyon potansiyelinin olmaması ve soyu markörü Sca- ^11'in yüzey ekspresyonunun eksikliği nedeniyle. Genetik kader haritalama modelleri, embriyonik öncüleri bir hücreye spesifik ve zamana özgü biçimde hedeflemeye izin verdiklerinden, makrofaj ontogenezini karakterize etmek için gereklidir. Burada, iki soy arasındaki ayrım yapmak için laboratuvarımızda kullanılan kaderi haritalama protokolünü sunuyoruzYetişkin dokuların çoğunda bulunan makrofajların: HSC kaynaklı sızıntı makrofajları ve HSC'den bağımsız ikamet makrofajları.

Doku ikamet makrofajları, sitokin reseptörü Csf1r ^12'yi eksprese eden Myb'den bağımsız öncü hücrelere geri izlenir ve üç tamamlayıcı kader-haritalama stratejisi ⁶ kullanarak E8.5-E10.5'deki embriyo içerisinde bulunur. Fetal HSC'leri etiketlemeden yolk sac hematopoez araştırmak için, 'geliştirilmiş' Cre rekombinazın tamoksifenle uyarılabilir bir füzyon proteini ve iki fare östrojen reseptörü (Mer-iCre-Mer) kontrolünün altında olan bir transgenik suş Csf1r MeriCreMer ^{kullanıyoruz} . Csf1r destekçisi. Dolayısıyla, Cre rekombinaz, sınırlı bir zaman aralığı boyunca CSF1R eksprese eden hücrelerde aktif olacaktır. Bir lox-STOP-lox kasetinin (Rosa26 ^LSL-eYFP ) aşağı akışta bir flüoresan proteini içeren bir muhabir suşuyla kullanıldığında, kalıcılığa yol açacaktırIndüksiyon zamanında mevcut olan hücrelerin genetik etiketlenmesi ve aynı zamanda soylarının genetik etiketlenmesi. E8.5 aktif formda tamoksifen, 4-hidroksitamoksifen (OH-TAM) uygulaması, yumurta sarısı unipotent "ilkel" öncüleri veya fetüs HSC'leri etiketlemeden, EMP'leri ve makrofajları etiketlemektedir. Böylece, embriyonik gelişim sırasında EMP'lerin ve bunların yavrularının immünofenotiplerini karakterize ettik ve aynı zamanda sarı kese kaynaklı makrofajların yetişkin makrofaj havuzlarına katkısını de değerlendirdik. İlkel atadan türetilen makrofajların bu yaklaşımı kullanarak da etiketlendiğini ve yetişkin makrofaj havuzlarına katkıda bulunup katkı sağlayamayacaklarını karakterize etmek için daha fazla çalışma gerekmektedir.

Hayvan prosedürleri Institut Pasteur (CETEA) onaylı kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesine uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Csf1r ^MeriCreMer Rosa ^LSL-YFP Embriyolarında Utero Pulse Etiketleme

1. Stok solüsyonu 4-hidroksitamoksifen (OH-TAM, 50 mg / mL) hazırlayın.
   1. Fümhür altında, 25 mg OH-TAM şişesini açın ve 250 μL etanol (% 100) ekleyin.
   2. OH-TAM solüsyonunu 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne, kesilmiş uç ve 10 dakika boyunca maksimum hızda girdapla aktarın.
   3. Sonikatör banyosunda 30 dakika sonikletin.
   4. 50 mg / mL stok solüsyonu elde etmek için fümhid altında 250 μL PEG-35 hint yağı ekleyin.
      NOT: PEG-35 hint yağı, hidrofobik molekülleri bağlayan ve bunları sulu çözücüler içerisinde çözündüren amfifilik özelliklere sahip bir solventtir.
   5. Yaklaşık 5 dakika boyunca girdapBir sonikatör banyosunda 30 dakika sonikasyon yapın.
   6. Mikro santrifüj tüpü başına 90 μL (4.5 mg) (enjeksiyon başına 1 alikot).
   7. Daha önce tarif edildiği gibi 1 hafta boyunca 4 ° C'de veya uzun süre -20 ° C'de saklayın ¹³ .
2. Progesteron stok solüsyonu hazırlayın (10 mg / mL)
   1. Fumefood altında 10 mg / 100 μL süspansiyon hazırlamak için 25 mg progesterona 250 μL% 100 etanol ilave edin. Hafifçe girdap.
   2. Kaputun altında 10 mg / ml progesteron solüsyonu yapmak için 2250 μL otoklavlanmış ayçiçeği yağı ekleyin.
   3. Maksimum hızda yaklaşık 5 dakika boyunca girdap, alikot ve 4 ° C'de saklayın. Saklandığında çözümün net olduğunu unutmayın.
3. Tamoksifen uygulaması
   NOT: Embriyonik gelişim, embriyonik gün (E) 0.5 olarak vajinal fiş oluşum gününü dikkate alarak tahmin edilmiştir. Rekombinasyon, E8.5'deki tek enjeksiyon ile indüklenirGebe Csf1r ^MeriCreMer dişilere ¹² . Tamoksifen uygulamasından sonra kürtaj oranlarını düşürmek için OH-TAM'ı 37.5 μg g Progesteron ile tamamlayın. Saat 13'te enjekte edin (sabah gözlemlenen vajinal tıkaç için).
   1. Enjeksiyon sabahı, OH-TAM solüsyonunun bir alikotunu 10 dakika boyunca sonike (veya tamamen yeniden süspansiyona alınana kadar) sonike hale getirin.
   2. 10 mg / mL OH-TAM solüsyonu elde etmek için fümehood altında 360 uL NaCl% 0.9 oranında ilave edin ve iyice girdaplayın. Solüsyon berraklaşıncaya ve tamamen yeniden süspansiyona alıncaya kadar sonikasyon yapın (en az 30 dakika).
   3. Progesteronu oda sıcaklığına ısıtın.
   4. Bir mikrosantrifüj tüpünde 450 μL OH-TAM ve 225 μL progesteron karıştırın. Girdap.
   5. En az 10 dakika Sonike edin ve 25G'lik bir iğne ile 1 mL şırıngaya yükleyin.
   6. Hayvan tesislerinde, hamile kadın ağırlığındadır ( Csf1r ^MeriCreMer dişiler, yakın bir FVB genetik altyapısına sahiptir ve tipik ağırlığıEn 25 ve 33 g).
   7. Hesaplanan hacmi fare içine yavaş yavaş enjekte ederek bir intra-peritoneal enjeksiyon uygulayın. İğneyi çektikten sonra, delici yarayı hafifçe bastırın ve karın bölgesine OH-TAM'ı dağıtmak için masaj yaptırın.
      NOT: OH-TAM enjeksiyon dozu 75 mg / kg'dır ve Progesteron dozu 37.5 mg / kg'dır. Tablo 1 , hamile dişilere enjekte edilecek hacmi göstermektedir.

Tablo 1: 4-OH-tamoksifenin (OH-TAM) enjeksiyon hacmi. E8.5'de tek bir enjeksiyon için hacim başına 75 μg (vücut ağırlığı) OH-TAM'ın, g progesteron başına 37.5 μg takviye edilmesi için gereken hacim.

2. Yolk Sac (YS) ve Fetal Karaciğerin (FL) Diseksiyonu

NOT: Embriyoları manipüle ederken, uzun vadeli kültür için kullanılacaksa, sert steril teknikler gerekli değildir. Yine de, çalışma alanı temiz ve emici kağıtların altında folyo ile kaplanmalıdır.

1. Buz gibi fosfat tamponlu salin (PBS) ve sindirim karışımı (1 mg / mL kollajenaz D, 100 U / mL Deoksiribonükleaz I (DNase I) ve% 3 fetal sığır serumu içeren PBS) hazırlayın.
2. Hamile dişileri kurbanla öldürmekGerekli gebelik haftasında vikal çıkık ( örn. Embriyonik evre E10.5).
3. Cildi sadece cinsel organların üzerine sıkıştırın ve orta hattında makasla küçük bir kesi yapın. Kürk olmaksızın vücut duvarını tamamen ortaya çıkarmak için deriyi başa doğru çekin. İç organları ortaya çıkarmak için karın kaslarını kesin ve iki uterus boynuzunu ortaya çıkarmak için bağırsağa basın.
4. Orta büyüklükte künt forseps ile, yumurtalıktaki yağ bandını tutun ve hafifçe uterusu çekin. Uterus boynuzlarının servikal seviyesinden kesin ve boynuzları periton boşluğundan kaldırın. Uterus boynuzlarını tamamen boşaltmak için yağ yastığını çıkarın ve boynuzları her iki yanındaki yumurtalıktan kesin.
5. Boynuzları 10 mm'lik bir Petri kabında buz gibi soğuk PBS'ye koyun. Bir ucunda (rahim ağzı) uterus kas katmanlarını hızlı bir şekilde tutun ve embriyoları çevreleyen desidual dokuyla serbest bırakmak için kas tabakası ile desidual doku arasında ince makasları kaydırın.
   NOT: Kas hızla daralma eğilimi gösterirR ekstraksiyon, bu nedenle bu adım mümkün olduğunca çabuk olmalı.
6. Reichert zarı ve plasentayı kesmek için bir çift ince forseps kullanın.
7. Yumruk yumurta sarısını çıkarın ve 0.5 mL sindirim karışımı ile 24-iyi bir doku kültürü plakasına yerleştirin.
   NOT: Bu aşamada, embriyonik kan toplanabilir.
   1. Göbek ve vitellin damarlarını kestikten hemen sonra embriyo, 10 mM buz soğukluğunda etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içeren 12 yuvalı bir doku kültürü plakasına aktarın. Embriyo keskin ince makas kullanarak dekapitasyon, mümkün olduğunca çok sayıda doku dilatasyonu sınırlamaya çalışıyorum. Buz üzerinde 10-15 dakika inkübe edin ve kan içeren EDTA toplamak.
8. Embriyo çevreleyen amniyon kaldırın.
9. Aşamalar
10. Embriyonun başını kesin.Forseps veya ince makas. Başlığı, 0.5 mL'lik sindirim karışımı ile 24 gözlü bir plakaya aktarın.
    NOT: Daha sonraki evrelerde nöroektoderm ve beyin, akış sitometrisi analizi için ayrılmıştır; Çevresindeki vasküler pleksus dikkatle çıkarın.
11. Embriyonu arka bacağın üstünden kesin ve forelimbleri çıkarın.
12. Karaciğerin izolasyonu için ince bir forseps kullanarak toraks açın. Anterior kalbe tutturun ve organları vücuttan kurtarmak için ikinci forsepsi kullanırken nazikçe çekin.
    1. Fetal karaciğeri kalpten ve bağırsaklardan dikkatlice ayırın. Fetal karaciğeri, 0.5 mL'lik sindirim karışımı ile 24 gözlü bir plakaya aktarın. Diseksiyon mikroskopu altında transferi dikkatle izleyin.
13. Polimeraz zincir reaksiyonu tahlili (PCR) ile genotiplendirme için kuyruk bölgesini (veya herhangi bir başka embriyo parçasını) toplayın.
    NOT: Diğer doku ve organlar akış sitometrisi kullanılarak benzer bir analiz için E10.5 embriyolarından hasat edilebilir. Kan, kafa kayağıN, aorta-gonad-mesonefros bölgesi (AGM), kalp ve nöroektoderm, E10.5'te toplanabilir. Daha sonraki aşamalarda, akciğer, böbrek, dalak ve pankreas da toplanabilir. AGM'nin farklı gelişim aşamalardaki diseksiyonunun ayrıntılı bir tarifi daha önce ¹⁴ açıklanmıştır.

3. Akış Sitometrisi için Embriyonik Dokuların İşlenmesi

1. Organları (sindirim karışımına yerleştirilir) 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
2. 6 ml FACS tamponu (1x PBS'de% 0.5 Sığır Serum Albümini (BSA) ve 2 mM EDTA) ile dolu bir 6 oyuklu doku kültürü plakasına yerleştirilmiş 100 mikron süzgece doku ve enzimatik solüsyon aktarın. Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için 2 mL'lik şırınganın siyah lastik pistonuyla hafifçe harmanarak mekanik olarak ayırın.
   NOT: Bundan böyle, tüm basamaklar 4 ° C'de yapılmalıdır.
3. Bir Pasteur pipet ile hücre süspansiyonu toplayın ve 15 mL tüp içine aktarın.
4. SpiN, 7 dakika süreyle 320 xg'de 4 ° C'de. Süpernatantı özlemle atın.
5. Pelet 60 μL Fc-bloke edici tampon (CD16 / CD32, FACS tamponu içinde 1/50 oranında seyreltilmiş antikor engelleme) içinde tekrar süspanse edin.
   1. Bir yuvarlak tabanlı 96 çok oyuklu plakaya tek tek hücre süspansiyonu başına 50 mcL aktarın. Buz üzerinde en az 15 dakika inkübe edin.
      NOT: Az miktarda numuneyi tutarken boyama 5 mL polistiren FACS tüplerinde de yapılabilir.
   2. Her dokudan alınan örneklerin bir havuzunu elde etmek için geri kalan 10 mcL'yi 5 mL'lik bir polistiren FACS tüpüne aktarın. Bu havuz, kontrol (yani, boyanmamış örnekler ve her florokrom floresan eksi bir (FMO) kontrol) olarak hizmet edecektir. 96 çoklu kuyucuklu plakaya her flüoresan eksi bir (FMO) kontrol için (florokrom başına bir) 50 mcL havuz aktarın.
      NOT: Her bir FMO kontrolü, antikor panelindeki tüm florokrom çiftli antikorları içerir;Bu ölçülüyor. FMO'lar kapı sınırlarını tanımlamak ve çok renkli panellerde spektral örtüşmeyi kontrol etmek için kullanılır. Farklı dokulardaki arka plandaki ve otofloresansdaki değişimleri doğru bir şekilde ele almak için, bu kontrolleri her dokudaki örnek havuzundan hazırlamak önemlidir. YFP ifadesi için uygun kontrol, Cre-negatif embriyoların PCR genotiplemesi ile teyit edilen örnekleri olacaktır.

4. Yüzey Antijen Boyaması

1. Antikor karışımı FACS tamponunda hazırlayın (Tablo 2). Her numune için 50 uL antikor karışımı hazırlayın.
   1. Aşağıdaki florokrom bağlı antikorları kullanın: anti-CD45.2 (klon 104); Anti-CD11b (klon M1 / ​​70); Anti-F4 / 80 (klon BM8); Anti-AA4.1 (klon AA4.1); Anti-Kit (klon 2B8); Ve anti-Ter119 (klon Ter119).
   2. FACS tamponundaki FMO kontrolleri için altı antikor karışımı hazırlayın. Kontrol numunesi başına antikor karışımı 50 mcL hazırlayın.
      YOK HAYIRTE: Antikor karışımındaki antikor seyreltmesi, malzeme tablosunda belirtilen son konsantrasyondan iki kat fazla konsantre. Altı florokroma bağlanmış antikor içeren bir panel için, 6 FMO kontrolü hazırlandı. Tablo 2 , bir tüp için antikor karışımı ve FMO kontrollerinin bileşimini sağlar.

Tablo 2: Boyama için kullanılan antikorların hacmi ve Floresan eksi bir (FMO) kontroller. Nihai 50 μL hacim için gereken antikorun hacmi (μL).

2. 96-çoklu plaka numunelerine antikor karışımı 50 mcL ekleyin (boyama sırasında son hacim 100 mcL'dir). Yavaşça iki kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve 30 dakika boyunca buzda inkübe edin.
3. 96-çoklu plakayı 4 ° C'de 320 xg'de 7 dakika döndürün ve süpernatanı atın. 200 μL FACS tamponuna tekrar süspanse edin.
4. Tekrar yıkama prosedürünü (adım 4.3) 150 μL FACS tamponu ile tekrarlayın.
5. Numuneleri ve kontrolleri (FMO'lar ve renksiz havuz örnekleri) 70 um'lik süzgeçten geçirerek 5 ml'lik polistiren tüplerine süzün. Kazanıncaya kadar buzda saklayın.

5. ÇYP'lerin ve YS kaynaklı makrofajların Akış Sitometri ile tanımlanması

NOT: Bu protokol, bir 4 lazer akış sitometresi eq405 nm Violet lazer, 488 nm Blue lazer, 562 nm Yellow lazer ve 638 nm Red lazer ile empoze edildi.

1. Üreticinin talimatları uyarınca her bir birleştirilmiş antikor için kompozisyon boncukları hazırlayın. Lazer yoğunluklarını optimize etmek için renklendirilmemiş örnekler ve kompozisyon boncukları kullanın.
2. Kapı sınırlarını belirlemek için, her bir antikor için FMO (Floresans eksi bir) kontrolleri kullanın.
3. Ölü hücreleri dışarıda bırakmak için, edinme işleminden 1 dakika önce tüpe (200 uL boyanmış hücre süspansiyonu içeren) 1 mL'lik DAPI (1 mg / ml) ekleyin. Ölü hücrelerin ve enkazın hariç tutulmasını gerçekleştirmek için güçlü DAPI sinyalini ve ileri dağılmış parametreyi (FSC) kullanın.
   NOT: edinme sırasında kapıları çizmek için akış sitometresinden yazılım kullanın. Tazminat matrisi ve analizi, piyasada bulunan diğer yazılımları kullanarak numune alımından sonra gerçekleştirilebilir.
4. Toplam olaylardan canlı hücre ve ikili ayrımcılık yapmak için ileri ve yan saçılım (FSC vs SSC) kullanın.
5. Log-ölçekli eksende floresan nokta çizelgeleri oluşturun ve kızıl kapıları çizin, önce eritrositler hariç tutun (Ter119 ⁺ ) ve daha sonra progenitör hücreleri (Kit ⁺ ) ve hematopoietik hücreleri (CD45 ⁺ Kit ^negatif ) tanımlayın (Bkz. Şekil 1 ).
6. YS ( Şekil 2 ), fetal karaciğer ( Şekil 3 ) ve beyindeki ( Şekil 4 ) farklı tanımlanan popülasyonlar arasında YFP'nin etiketleme verimliliğini ölçmek için floresan histogramları oluşturun.

Genetik kader eşleştirmesi, bir Rosa26-LSL-eYFP raportörü taşıyan erkeklerle çiftleştirilen Csf1r-Mer-iCre-Mer dişilerinde E8.5 OH-TAM ile idare edilerek gerçekleştirildi. OH-TAM'ın varlığında, durdurma kasetinin eksizyonu, Csf1r'yi ifade eden hücrelerde YFP'nin kalıcı şekilde eksprese edilmesine yol açar. İki hematopoietik dokuyu topladık: yolk kesesi ve fetal karaciğer ve E10.5 embriyolarından alınan hematopoietik olmayan bir doku, nöroektoderm. Tek hücreli süspansiyonlar, enzimatik ve mekanik ayrışma ile elde edildi ve numuneler, floresan-çiftli antikorlarla boyandıktan sonra akış sitometrisi ile analiz edildi. Ölü hücrelerin ve çiftlerin hariç tutulduktan sonra tek hücre süspansiyonları analiz edildi ( Şekil 1 ). Tüm kapılar Floresan Eksi Bir (FMO) kontrolleri kullanılarak tanımlandı. Analizin netliğini arttırmak için ayrıca bir eritrosit dışlama (Ter119 ⁺ hücreleri) yapılması önerilir ( Şekil 1B ). Hücre yüzey markörleri Kit (progenitör markör) ve CD45 (hematopoietik hücreler markörü) kullanarak, üç hücre popülasyonunu birbirinden ayırt ettik: Kit ⁺ CD45 ^neg ; Kit ⁺ CD45 ^düşük ve Kit ^negatif CD45 ⁺ ( Şekil 1 ). Progenitörler ayrıca AA4.1 ekspresyonuna dayanarak analiz edildi ( Şekil 2-4 ). Gerçekten de, AA4.1 koloni oluşturan deneylerinde ¹⁵ de gösterildiği gibi, sarısı kesesinde erythromyeloid progenitorlarda progenitör nüfusun zenginleşmesine izin verir, bir yüzey markörüdür. İlgili popülasyonlar belirlendikten sonra histogramları kullanarak her popülasyonda YFP etiketleme verimliliğini nicelleştirdik. Yolk sac Kit ⁺ öncüleri arasında hem CD45 ^neg ( Şekil 2A ) hem de CD45 ^düşük ( Şekil 2B ) hücre popülasyonları AA4.1 ⁺ YFP ⁺ hücreleri içerir. Bununla birlikte, AA4.1 ⁺ YFP + CD45 ^düşük progenitör popülasyonunda bulunur ( Şekil 3B ve 4B ). Beyin aktif hematopoez alanı olmadığından, bu dokuda bulunan ataları, dolaşımdaki progenitörlere karşılık gelebilir. Bu aynı zamanda yolk kesesinden fetal karaciğere ve periferik dokulara göç ederken progenitör olgunlaşması sürecini önerir. Kit ⁺ öncüleri önce CD45 ekspresyonuna bakılmaksızın AA4.1'i eksprese eder, ancak dolaşıma ulaştıklarında ve fetüs karaciğerlerinde, tüm AA4.1 ⁺ YFP ⁺ öncüleri, saptanabilir hücre yüzeyi CD45 seviyelerini ifade eder. F4 / 80 ^parlak CD11b ⁺ olarak tanımlanan makrofajlar Kit ^neg CD45 ⁺ kapısında bulundu ( Şekil 2-4 ). E10.5 yumurta sarısı, karaciğer ve beyindeki makrofajlar verimli bir şekilde etiketlendi (F4 / 80 ^parlak CD11b ⁺ hücrelerinin% 60 ila 80'i YFP ^{+ idi} ) b Ya E8.5'te tek OH-TAM uygulaması ( Şekil 2C , 3C ve 4C ).

Altlıklar arasındaki etiketleme verimliliğini karşılaştırmak için, rekombinasyon etkinliği için dahili bir kontrol kullanılması önerilir. OH-TAM rahim içine enjekte edildiğinde , litreler ve fare soyları arasındaki gelişme zamanlamasındaki değişiklikler nedeniyle, muhabirin ifade seviyesindeki değişkenlik deneyler arasında görülebilir. Dolayısıyla, E8.5 ile E11.5 embriyolarına embriyo evrelemesinin somit çifti sayımı ile gerçekleştirilmesini öneriyoruz. Bu protokolde, farklı deneyler ve suşlar arasındaki Cre rekombinasyonunun verimliliğini karşılaştırmak için referans olarak beyin yerleşimli makrofajların (mikrogram) etiketleme verimliliğini kullanmamızı öneriyoruz ( Şekil 4C ). Diğer ikamet makrofajları kullanılabilir, ancak mikroglia yolk sacından türeyen makrofaj olarak tanımlanan ilk hücrelerdirEf "> 16 ve bunlar E10.5'te en çok bulunan doku saklayan makrofaj popülasyonunu temsil eder. Bu nedenle, her bir deneyde kader eşleme verimliliğini değerlendirmek ve farklı çöplerden gelen verileri karşılaştırmak için mikrogliadaki YFP işaretlemesi kullanılabilir.

Şekil 1: Progenitör hücreleri (Kit ⁺ CD45 ^neg ve Kit ⁺ CD45 ^düşük ) ve ayırt edilmiş hematopoietik hücreleri (Kit ^neg CD45 ⁺ ) belirlemek için geçiş stratejisi. ( A ) Canlı hücrelerin ve singletlerin ayrımı, DAPI boyama ve İleri ve Yanlamalı dağılım (FSC / SSC) parametreleri kullanılarak yapılır. ( B ) Kırmızı kan hücrelerinin dışlanmasını takiben (Ter119 ^negatif ), ilgilenilen üç hücre popülasyonu, Kit ve CD45'in hücre yüzeyi ekspresyonuna dayanarak tanımlanır: Kit ⁺ CD45 ^neg ; Kit ⁺ CD45 ^düşük ve Kit ^negatif CD45 ⁺ hücreleri. ( C ) OH-TAM enjekte edildiğinde mevcut olan Csf1r ifade hücreleri ve yavruları, Cre-rekombinaz negatif embriyolarla (daha sonra polimeraz zincir reaksiyonu tahlili, PCR ile teyit edilen) YFP ifade eden YFP'yi ifade eden Cre-rekombinaz pozitif embriyolar içinde tanımlanır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 2: E10.5 CSF1R ^MeriCreMer Rosa26 ^LSL-EYFP gelen sarısı kesesinde Etiketleme verim E8.5 OH TAM ile embryospulsed. ( A ) Kit ⁺ CD45 ^negatif hücreler, canlı ^sarımsak hücrelerinde Kit ve CD45 ekspresyonuna dayanılarak kapalıdır (mavi kapı, sol panel). AA4.1 ve Kit ⁺ CD45 ^negatif hücreler üzerinde Kit ekspresyonu. BluE kapısı, AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^negatif hücreleri (orta panel) kapsar. Cre negatif kontrollerde (siyah) ve Cre pozitif örneklerde (yeşil) AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^negatif hücrelerde (sağ panel) YFP etiketlemesinin karşılaştırılması. Histogramlar, YFP sinyali (x ekseni) için pozitif olan hücrelerin yüzdesini (y ekseni) temsil eder. ( B ) Kit ⁺ CD45 ^düşük hücreler, Kit ve CD45 ifadesine (mavi kapak, sol panel) dayanıyordu. AA4.1 ve Kit ⁺ CD45 ^düşük hücrelerinde Kit ekspresyonu. Mavi kapak AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^düşük hücreler (orta panel) olarak tanımlanan EMP'yi kapsar. Cre negatif kontrollerde (siyah) ve Cre pozitif örneklerde (yeşil) AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^düşük hücrelerinde (sağ panel) YFP etiketlemesinin karşılaştırılması. Histogramlar, YFP sinyali (x ekseni) için pozitif olan hücrelerin yüzdesini (y ekseni) temsil eder. ( C ) Hematopoietik hücreler Kit ^neg CD45 + ve mavi kapılı (sol panel). Kit ^neg CD45 ⁺ hücrelerinde F4 / 80 ve CD11b ekspresyonu. Makrofajlar, F4 / 80 ^parlak CD11b ⁺ hücreleri (orta panel) olarak tanımlanır. Cre negatif kontrollerde (siyah) ve Cre pozitif örneklerde (yeşil) F4 / 80 ^parlak CD11b ⁺ makrofajlarda (sağ panel) YFP etiketlemesinin karşılaştırılması. Histogramlar, YFP sinyali (x ekseni) için pozitif olan hücrelerin yüzdesini (y ekseni) temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 3: E10.5 Csf1r ^{MeriCreMer'den} alınan karaciğerde etiketleme etkinliği Rosa26 ^LSL-eYFP, E8.5'de OH-TAM ile embriyospazdaydı. ( A ) Kit ⁺ CD45 ^negatif hücreler, Kit ve CD45'e dayalı olarak kapılandıCanlı karaciğer hücrelerinde ifade (mavi kapı, sol panel). AA4.1 ve Kit ⁺ CD45 ^negatif hücreler üzerinde Kit ekspresyonu. Mavi kapak AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^negatif hücreleri içerir (orta panel). Cre negatif kontrollerde (siyah) ve Cre pozitif örneklerde (yeşil) AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^negatif hücrelerde (sağ panel) YFP etiketlemesinin karşılaştırılması. Histogramlar, YFP sinyali (x ekseni) için pozitif olan hücrelerin yüzdesini (y ekseni) temsil eder. ( B ) Kit ⁺ CD45 ^düşük hücreler, Kit ve CD45 ifadesine (mavi kapak, sol panel) dayanıyordu. AA4.1 ve Kit ⁺ CD45 ^düşük hücrelerinde Kit ekspresyonu. Mavi kapak AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^düşük hücreler (orta panel) olarak tanımlanan EMP'yi kapsar. Cre negatif kontrollerde (siyah) ve Cre pozitif örneklerde (yeşil) AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^düşük hücrelerinde (sağ panel) YFP etiketlemesinin karşılaştırılması. Histogramlar,YFP sinyali (x ekseni) için pozitif hücreler (y ekseni). ( C ) Hematopoietik hücreler Kit ^neg CD45 ⁺ olarak tanımlanır ve mavi kapılıdır (sol panel). Kit ^neg CD45 ⁺ hücrelerinde F4 / 80 ve CD11b ekspresyonu. Makrofajlar, F4 / 80 ^parlak CD11b ⁺ hücreleri (orta panel) olarak tanımlanır. Cre negatif kontrollerde (siyah) ve Cre pozitif örneklerde (yeşil) F4 / 80 ^parlak CD11b ⁺ makrofajlarda (sağ panel) YFP etiketlemesinin karşılaştırılması. Histogramlar, YFP sinyali (x ekseni) için pozitif olan hücrelerin yüzdesini (y ekseni) temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 4: Beyindeki E10.5 Csf1r ^MeriCreMer Rosa26 ^LSL-eYFP embriyosu'ndan ^etiketleme etkinliğiE8.5'te OH-TAM ile atıldı. ( A ) Kit ⁺ CD45 ^negatif hücreler canlı beyin hücrelerinde Kit ve CD45 ekspresyonuna (mavi kapak, sol panel) dayalıdır. AA4.1 ve Kit ⁺ CD45 ^negatif hücreler üzerinde Kit ekspresyonu. Mavi kapak AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^negatif hücreleri içerir (orta panel). Cre negatif kontrollerde (siyah) ve Cre pozitif örneklerde (yeşil) AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^negatif hücrelerde (sağ panel) YFP etiketlemesinin karşılaştırılması. Histogramlar, YFP sinyali (x ekseni) için pozitif olan hücrelerin yüzdesini (y ekseni) temsil eder. ( B ) Kit ⁺ CD45 ^düşük hücreler, Kit ve CD45 ifadesine (mavi kapak, sol panel) dayanıyordu. AA4.1 ve Kit ⁺ CD45 ^düşük hücrelerinde Kit ekspresyonu. Mavi kapak AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^düşük hücreler (orta panel) olarak tanımlanan EMP'yi kapsar. AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^düşük YFP etiketleme karşılaştırılması hücreleri (sağ panel). Histogramlar, YFP sinyali (x ekseni) için pozitif olan hücrelerin yüzdesini (y ekseni) temsil eder. ( C ) Hematopoietik hücreler Kit ^neg CD45 ⁺ olarak tanımlanır ve mavi kapılıdır (sol panel). Kit ^neg CD45 ⁺ hücrelerinde F4 / 80 ve CD11b ekspresyonu. Makrofajlar, F4 / 80 ^parlak CD11b ⁺ hücreleri (orta panel) olarak tanımlanır. Cre negatif kontrollerde (siyah) ve Cre pozitif örneklerde (yeşil) F4 / 80 ^parlak CD11b ⁺ makrofajlarda (sağ panel) YFP etiketlemesinin karşılaştırılması. Histogramlar, YFP sinyali (x ekseni) için pozitif olan hücrelerin yüzdesini (y ekseni) temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Hematopoietik prekürsör hücrelerin farklı dalgaları kısa bir zaman çerçevesinde kısmen çakışır; bu da her gelişimsel hematopoetik dalganın katkısını teknik olarak çok zorlayıcı olan bağışıklık hücrelerine analiz eder.

Tamoksifenle indüklenebilen Cre sistemleri, spesifik hücreleri zamansal olarak indüklenebilir bir şekilde etiketleme ve ex vivo veya in vitro kültür veya transplantasyona ihtiyaç duymadan embriyolar veya yetişkinlerde soy analizleri yapma fırsatı sunar. Tamoksifenle uyarılabilir Cre soylarında, bir bakteri Cre rekombinazı ve insan östrojen reseptörünün (CRE-ER) ligandı bağlama alanının mutant bir formu arasında veya geliştirilmiş bir tek nokta mutant Cre ve iki fare östrojen reseptörü arasında bir füzyon geni yaratılır (Mer-icre-Mer). Cre'nin östrojen reseptörleri ile kaynaştırılması Cre'nin Hsp90 tarafından sitoplazmik sekestrasyonuna, dolayısıyla nükleer Cre aracılı rekombinasyonun önlenmesine yol açar. Tamoksifen (TAM),E karaciğeri, östrojen reseptörü için yüksek bağlanma afinitesi olan aktif metabolitine 4-hidroksitamoksifene (OH-TAM) dönüştürür. Füzyon Cre'ye OH-TAM bağlanması, Hsp90 ile etkileşiminin kesintiye uğramasına yol açar ve çekirdeğe yer değiştirmesine ve Cre aracılı rekombinasyonun başlatılmasına izin verir. Hamile kadınlarda içine utero TAM ya da OH- TAM enjeksiyonu gelişen embriyoda rekombinasyon aktive etmek için gösterilmiştir. Hamilelik süresince tamoksifen uygulaması kürtaja neden olabilir ve böylece çöp boyutunu azaltır, ancak gebelik ortasından sonra doğum yaparsa doğumları engeller, bu durumda doğum yapması için bir sezaryen operasyonu gerekir. Hamilelik süresince tamoksifen etkilerini dengelemek için, embriyoların hayatta kalmasını iyileştirmek ve kürtaj riskini azaltmak için OH-TAM uygulamasını yarı miktarda progesteron ile destekliyoruz ¹⁷ .

Hamile dişilere TAM veya OH-TAM vermek için çeşitli yollar kullanılabilir. Şu anda oral gavaTamoksifen için ge veya intra peritoneal (ip) enjeksiyon kullanılır. OH-TAM, hamile barajın karaciğeri tarafından metabolize edilmesini gerektirmediği için derhal kullanıma sunulması avantajına sahiptir. Bununla birlikte, tamoksifen mısır yağında çözülmesi çok kolay olsa da, OH-TAM, aynı tekniği kullanarak hazırlamak çok zordur ve bir emülsiyona neden olur. Bu, rahim içi nabız etiketlemesinde OH-TAM kullanılmasında kısıtlayıcı bir adım olmuştur. Tamoksifen çözünmesi en kritik adımlardan biri olduğu için, OH-TAM'ı çözündürmek için amfifilik özelliklere sahip bir solvent olan PEG-35 hint yağı kullandıkları JF Nicolas ¹³ grubu tarafından geliştirilen OH-TAM'ın hazırlanması için protokolü uyarladık. Prosedürde. Bu, OH-TAM'ın tekrarlanabilir ve en iyi şekilde hazırlanmasına izin verir ve tamoksifen hazırlama süresini önemli ölçüde kısaltır. Ayrıca, farklı indüklenebilir Cre soyları kullanılırken enjekte etmek için OH-TAM konsantrasyonunun ayarlanması gereklidir. Bir yaşayabilirlik boyasının kombinasyonu (DAPI) ve boyut (FSC) sırasıyla ölü hücreleri ve hücresel pislikleri temizlemek için kritik önem taşır. Ölü hücreler ve enkaz, menekşe, mavi ve kırmızı lazer dedektörlerin çoğunda yüksek otofloresan olup akış sitometrik analizini engelleyebilir. Ayrıca, akış sitometresi ile analiz öncesinde lekelenmeden sonra hücrelerin tespit edilmesini tavsiye etmiyoruz. Fiksasyon hücre morfolojisinde değişikliğe neden olabilir ve bu nedenle Forward and Side Scatter (YSK'ya karşı SSC) temel alan zor boyut ayrımcılığına neden olur. Ayrıca, numunelerin PFA ile fikse edilmesi, YFP floresan yoğunluğunda önemli bir kayba yol açar.

Bu protokolün ana sınırlaması, popülasyonların işlevsellikleri ve farklılaşma potansiyeli üzerinde test edilmemesidir. Bunun üstesinden gelmek için, hücreler, koloni oluşturma tahlilini gerçekleştirmek için Floresanla aktive edilmiş bir hücre ayırıcı (FACS) kullanarak benzer bir protokol izlenerek sıralanabilir. Bu durumda, işlem steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir ve fetal sığır serumu (FBS), BSA yerine FACS tamponunda şiddetle tavsiye edilir. Bu teknik ile elde edilen düşük etiketleme verimliliği ve dolayısıyla embriyonik doku başına ilgi konusu düşük YFP ⁺ hücresi sayısı, EMP fenotipi çalışmasında büyük bir sorun oluşturmaktadır. Bu protokol 4 lazerli akış sitometresi kullanıyor. 3 lazerli bir akış sitometresi de kullanılabilir, ancak boyalar arasındaki spektral örtüşmeyi göz önüne almak için antikor panelini uyarlamak önemlidir. Ek olarak, antikor titrasyonu, antikor panelini değiştirirken uygun konsantrasyonu bulmak için gereklidir ve antikor titrasyonunu ve yeni antikor panelinin, doku başına tüm embriyoların toplandığı bir pilot deneyde validasyonunu yapmanızı öneririz. Dokular başına analiz edilen hücreler.

Gelişim biyolojisi alanı, hücrelerin yerinde kalıcı olarak etiketlenmesine olanak tanıyan Cre / Lox yöntemi ile devrim yaratmıştır. Bu yaklaşım,Doku ya da hücre tipi-spesifikliği, özel rekombinantın kontrolü altındaki Cre rekombinazının ekspresyonu yoluyla. Olgumuzda, Cre rekombinazın ekspresyonunu, makrofajlar ve onların öncüleri için önemli bir mitojenik ve büyüme faktörü reseptörü olan Csf1r (Koloni Uyarıcı Faktör 1 Reseptörü) kontrolörü altında, grup tarafından geliştirilen bir suş kullanılarak kontrol etmeye karar verdik J. Pollard'ın ¹⁸ . Csf1r ekspresyonuna dayalı bir kader haritalama stratejisinin diğer yayınlanmış stratejilere kıyasla avantajı, herhangi bir fötal HSC'yi etiketlemeden yolk kesesi-türevi hücrelerin (EMP ve makrofaj) etiketlenmesine olanak sağlamasıdır ¹² . Cx3cr1 ^CreERT2 türü, ^{HSK'ları 19} etiketlemeden yumurta sarısı hücrelerini etiketleyebilir, ancak sadece makrofajları ve makrofaj öncülerini etiketleyebilir, ancak EMP öncüllerini ¹ etiketlememektedir. Cx3cr1 ^CreERT2 suşu, ^Csf1r ile aynı uyarıya sahiptir ^{MerCreMer çizgisi, çünkü tek başlı ilkel makrofaj progenitanlarından veya EMP'den türetilen makrofajları ayırt edemez. Tamoksifen hem Runx1 MerCreMer 16'da hem de Kit MerCreMer 20'de erken E7.5 olarak uygulandığında periferik kan hücreleri her zaman yetişkinlerde çok düşük bir verimlilikte etiketlenir, bu nedenle gelişme sırasında HSC'lerin etiketlenmesi gösterilir. Ayrıca Kit MerCreMer kaderi eşleme etiketleri yolk sac Kit + Sca1 + öncüleri, EMP ise Kit + Sca1 negatif 11'dir . Csf1r MeriCreMer suşu bir nakavt değildir, ancak klasik katıklı transgenez ile üretilmiştir, bu nedenle Cre'in ekspresyonu, Csf1r'nin endojen ifadesini tekrar tekrar ortaya koymayabilir. Bununla birlikte, bunun, Csf1r'nin heterozigot ifadesi nedeniyle olası herhangi bir gelişimsel kusurlardan kaçınmak için bir avantajı vardır. Bu, analiz ederken hesaba katılması gereken önemli bir faktördürEndojen lokusta indüklenebilir Cre'nin eklendiği Runx1 MerCreMer , Kit MerCreMer ve Cx3cr1 CreERT2 gibi gelişimsel hematopoez çalışmalarında kullanılan diğer kader haritalama stratejileri. Hem Runx1 MerCreMer hem de Kit MerCreMer için heterozigot embriyoda gelişimsel hematopoetik kusurlar tanımlanmıştır. Toplu halde, burada sunulan yöntem, gelişmekte olan yolk sac EMP biyolojisini ve yetişkin dokularında bulunan ve HSC kaynaklı makrofajlardan farklı, yolk sac kaynaklı makrofajları araştırmaya olanak tanır. Bu, ikamet eden makrofajların bu soyu ve yetişkinlik dönemindeki spesifik işlevleri hakkındaki güncel anlayışımızı geliştirecektir. EMP'lerin immünfenotipik karakterizasyonu son zamanlarda hücre ayırımı ve koloni oluşturma deneyleri kullanılarak geliştirilmiş olup, yolk kesesi EMP'nin gelişmenin erken evrelerinde CD41 ve CD16 / 32'yi spesifik olarak eksprese ettiğini gösteriyor 11 . Bununla birlikte, CD41'in ekspresyonunun özgüllüğüVe CD16 / 32, özellikle fetal karaciğer nişinde, kaderi haritalama modelleri kullanarak E10.5'den sonraki karakterizasyona ihtiyaç duyar. Gerçekten de, CD41 ve CD16 / 32 ekspresyonunun, fetal HSC'lere kıyasla hala EMP'ye spesifik olup olmadığı ve E10.5 ila E14.5 fetal karaciğerdeki HSC türevli progenitörlerin açıklığa kavuşturulması gerekir. Sunulan yöntem yumurta sarısı zarfında üretilen EMP'yi etiketlemeye ve embriyonik gelişme sırasında onları takip etmeye izin verir ve fetal karaciğeri tohumladıklarında ÇYP fenotipinin daha ayrıntılı bir şekilde tanımlanmasına katkıda bulunur.}

Bu yöntem yakın gelecekte EMP farklılaşma yollarını incelemek için önemli olabilir. EMPs E8.5 ila E10.54 arasındaki yumurta sarısı endotelinden ortaya çıkarken, bu yöntem yalnızca E8.5-E9.5 arasında ortaya çıkan progenitörlerin bir kısmını etiketlemeye izin verir. Bu nedenle, bu yöntemin kısıtlı olması, ÇYP'nin yalnızca küçük bir bölümünün etiketlenmesidir; bu nedenle, klasik fonksiyon kaybı çalışmalarında floxed allellerin cGenleri andidate edin. Alternatif olarak, seyrek işaretleme, klonal raportörü kullanarak in vivo olarak EMP farklılaşmasının klonal çalışmalarında bir avantaj haline gelebilir. Yine de, floxed yapıların rekombinasyon verimliliği, genomik lokusa (floxed aleller) veya Rosa26 muhabir yapısına bağlı olduğu için, etiketleme verimliliğinin her floxed raportör veya floxed alel için karakterize edilmesi gerekir. Aslında, farklı promotörlerle farklı Rosa26 muhabir hatları mevcuttur ve Rosa26 ^tdTomato ve Rosa26 ^mTmG suşunun Rosa26 ^LSL-eYFP hattından daha yüksek rekombinasyon verimliliğine sahip olduğu rapor edilmiştir. Bu protokolde kullanılan muhabir fare suşu, sonuç bölümünde bahsedilen progenitör olgunlaşma dinamik süreci hakkında bilgi sağlayamayan Rosa26 ^LSL-eYFP hattıdır. Olgunlaşma süreci, Rosa26 ^mTmG gibi farklı muhabir soyları kullanılarak kısmen ele ^alınabilir . Bu tür suşlarda, hücreler distansiyon halinde olabilirRekombinasyon olayından bu yana geçen zamana dayalı olarak tekrarlandı. Rosa26 mTmG ^suşundaki tüm hücreler membrana bağlı tdTomato floresan proteinini ifade eder ve Cre rekombinasyonu, tdTomato kasetini çıkarır ve membrana bağlı GFP'nin sentezlenmesine izin verir. TdTomato'nun uzun bir yarılanma ömrüne sahip olması nedeniyle hala tdTomato içeren hücreler, ancak GFP'yi ifade etmeye başlamıştır (rekombinasyondan kısa süre sonra) tdTomato ⁺ GFP ^{düşük /} int'dir ve artık tdTomato'yu ifade etmeyen tdTomato ^neg GFP ⁺ hücrelerinden ayırt edilebilir ve Daha yüksek seviyelerde GFP'yi ifade eder (rekombinasyon sonrasında daha sonra).

Yukarıda tartışıldığı gibi, OH-TAM preparasyonu, deneyler arasında benzer doz OH-TAM'ı sürekli olarak vermek ve tamoksifen yan etkilerini azaltmak için kritik bir adımdır. Progesteron birlikte uygulanması, tamoksifenin hamilelik üzerindeki zararlı etkisini sınırlamak için de yararlıdır. Protokolün bir diğer kritik unsuru, tek hücreli suspensiyonun canlılığıdırFarklı embriyonik dokulardan elde edilen n. Genellikle akış sitometrik analizi için>% 90 canlı hücreler elde ederiz. Bunu başarmak için tüm adımları hızla takip etmek ve doku toplama işleminden sonra tüm örnekleri buzda tutmak çok önemlidir. Kapısındaki sınırları belirlemek ve çok renkli panellerde spektral örtüşmeyi kontrol etmek için renklendirilmemiş örnekler, tek lekeler ve floresan eksi bir (FMO) kontrolleri gibi uygun kontroller gereklidir. Antikor titrasyonu ve spektral örtüşme açısından antikordaki değişiklikler doğrulanmalıdır. Son olarak, Rosa26 raportör suşunun seçimi, araştırılan bilimsel soruna uyarlanmalıdır.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Yazarlar fikirli tartışmalar için Prof Frederic Geissmann ve Prof Christian Schulz'a teşekkür ederler; Makale eleştirel okuma Dr Hannah Garner, Xavier Montagutelli ve Dr Jean Jaubert ve fare yetiştirme desteği Institut Pasteur hayvan tesisi personeli; Ve Pascal Dardenne ve Vytaute Boreikaite, bir Amgen Bursiyeri, teknik yardımları için. EGP laboratuarında yapılan araştırmalar, Institut Pasteur, CNRS, Cercle FSER (FRM ve Institut Pasteur ve REVIVE konsorsiyumundan bir başlangıç ​​paketi) tarafından finanse edilmektedir.LI, REVIVE konsorsiyumundan bir doktora bursuyla desteklenmektedir.