Flow Cytometry에 의한 마우스 태아의 적혈구 전구 세포 (Erythromyeloid Progenitors)와 그 자손의 동정

침입하는 대 식세포가 순환하는 전구체로부터 성인 조직으로 지속적으로 모집되는 동안, 상주하는 대 식세포는 발달 중에 그들의 조직을 뿌리고, 전구체로부터의 더 이상의 입력없이 유지된다. 상주 대 식세포의 전구 세포는 최근 확인되었다. 여기, 우리는 상주 macrophage progenitors의 유전 적 운명 매핑 방법을 제시한다.

대 식세포는 면역 체계의 본능적 인 팔에서 유래 한 전문적인 식균입니다. 정상 상태에서, 정착 성 대 식세포는 성인 조직에서 발견되며, 감염 및 조직 손상의 전조선 파수꾼으로 작용합니다. 다른 면역 세포가 골수에 위치한 조혈 모 및 전구 세포 (HSPC)로부터 지속적으로 재생되는 동안, 상주 대 식세포로 알려진 대 식세포의 혈통은 골수 HSPC로부터의 입력없이 조직 내에서 자체 유지되는 것으로 나타났다. 이 혈통은 뇌에있는 미 글로리아 (microglia), 간에서의 쿠퍼 (Kupffer) 세포 및 표피에서의 랑게르한스 (Hangerhans) 세포에 의해 예시된다. 장 및 결장 고유 층은 HSPC- 독립적 인 상주 대 식세포가없는 유일한 성인 조직이다. 최근의 연구에 따르면 상주 대 식세포는 태아 조혈 모세포 (HSC)와는 별개로 존재하는 전구 세포로부터의 난황낭 조혈 (extra-embryonic yolk sac hematopoiesis)에 기원한다. 난황낭 중 명확한 조혈, eRYthromyeloid progenitors (EMP)는 적혈구 및 골수 양 세포, 특히 상주 대 식세포를 일으킨다. EMP는 난황낭 내에서만 E8.5와 E10.5 일 사이에 발생하며 순환이 연결되면 일찍 태아 간으로 이동하여 적어도 E16.5까지 팽창하고 분화한다. 이들의 자손에는 적혈구, 대 식세포, 호중구 및 비만 세포가 포함되지만 EMP에서 유도 된 대 식세포 만 조직에서 성충까지 지속됩니다. EMP 출현의 일시적인 성격과 HSC 세대와의 일시적인 중첩은 이러한 선조의 분석을 어렵게 만든다. 우리는 유세포 분석기 로 생체 내에서 EMP 및 EMP 유래 세포를 특성화하기 위해 대 식세포 사이토 카인 수용체 Csf1r 프로모터의 발현에 기초한 타목시펜 유도 성 운명 매핑 프로토콜을 확립했다.

개발 중에는 골수 계통의 자손이 성인으로 남아있는 여러 가지 연속적인 조혈 전구 세포가 있습니다. 첫째, 단 독성 "원시"전구 세포는 E7.5-E8.25 사이의 마우스 난황낭 ^{1 , 2} 에서 출현하고 단핵구 중간체가없는 배아 대 식세포를 일으킨다. 원시 전구 세포로부터 유래 된 대 식세포가 성숙한 뇌에서 미 글로글 리아 (microglia)로 지속되는지는 적극적인 조사 대상으로 남아 있는지 여부. 둘째로, Erythro-myeloid Precursors (EMPs)는 E8.5에서 난황낭에서 발생하고, 혈류에 들어가서 배아를 식민시킨다. EMPs는 Runx1 의존 내피 - 조혈 전이 ^{3 , 4} 에서 난황낭 hemogenic endothelium에서 나온다. EMP는 난황낭 내에서 대 식세포로 분화 할 수 있지만 태아 간세포 (E) 9 ⁵ 에서 태아 간을 식민지화하고 differen적혈구, 거핵구, 대 식세포, 단구 과립구 및 비만 세포 ⁶ . EMP로부터 유도 된 대 식세포는 발달 및 성인 조직에서 증식능을 나타낸다. 여부 EMP-파생 된 대 식세포는 거의가 분화 경로 ^{7, 8에} 대해 알려진대로 차별화의 단핵구 단계는 여전히 논란이 우회. 마지막으로, 조혈 줄기 세포 (HSC)는 대동맥 - 생식기 - 중뇌 골 소 구역에서 적절한 배아 내에서 E10.5로 출현하여 태아 간으로 이동한다. 장기 재 축적 용량을 가진 HSC는 E11 (42 체절 쌍 스테이지에서) 후에 만 ​​검출됩니다 ⁹ . 그곳에서 E12.5와 확연히 구분되는 조혈이 골수로 이동하기 시작할 때까지 분화되어 출생 후 ^{10 일} 동안 혈액 세포 생산의 주요 부위가됩니다.

SP면역 반응 및 표현형 마커의 공통점뿐만 아니라 출현시의 일시적 및 일시적 중첩은 지금까지 배아 조혈 전구 세포의 이러한 파동의 특정 기여를 구별하는 우리의 능력을 방해했다. EMP와 HSC 모두 Runx1 의존적 인 방식으로 생성되고 전사 인자 Myb와 성장 인자 수용체 Csf1r (Colony-Stimulating Factor 1 Receptor, Macrophage Colony Stimulating Factor Receptor라고도 함)을 표현하는 반면, EMP는 HSC 는 생체 외 (in vitro) 와 생체 내 (in vivo) 모두 에서 림프 성 잠재력이 결여되어 있으며, 장기간 재생산 가능성이 없으며 계통 마커 Sca- ¹¹ 의 표면 발현이 부족합니다. 유전 적 운명지도 작성 모델은 세포 특이 적 및 시간별 방식으로 배아 선조를 표적으로 할 수 있으므로 대 식세포의 개체 발생을 특성화하는 데 필요합니다. 여기서 우리는 두 혈통을 구별하기 위해 실험실에서 사용 된 운명 매핑 프로토콜을 제시합니다대부분의 성인 조직에서 발견되는 대 식세포 : HSC 유래 침윤성 대 식세포 및 HSC 독립적 인 상주 대 식세포.

티슈 상주 식세포 Csf1r ¹² 사이토 카인 수용체를 발현 MYB 독립적 전구 세포로 역 추적 세 상보 운명 맵핑 ^전략을 사용하여 ^6-E8.5 E10.5에서 배아에 존재하고있다. 태아 조혈 모세포를 표지하지 않고 난황낭 조혈을 연구하기 위해 우리는 '개선 된'Cre recombinase와 2 개의 마우스 에스트로겐 수용체 (Mer-iCre-Mer)의 tamoxifen 유도 성 융합 단백질을 발현하는 형질 전환 균주 Csf1r ^{MeriCreMer를} 사용한다. Csf1r 프로모터. 따라서 Cre recombinase는 제한된 시간 동안 Csf1r 발현 세포에서 활성화 될 것이다. lox-STOP-lox 카세트 (Rosa26 ^LSL-eYFP )의 형광 단백질 하류의 형광 단백질을 포함하는 리포터 스트레인과 함께 사용하면,유도시 존재하는 세포뿐만 아니라 그들의 자손의 유전 적 표지. 난황낭 특이성 "원시"전구 세포 또는 태아 조혈 전구 세포를 표지하지 않고 활성 형태의 타목시펜, 4- 하이드 록시 타목시펜 (OH-TAM), EMP 및 대 식세포 표지의 E8.5에서의 투여. 따라서, 우리는 EMPs와 그들의 자손의 immunophenotype을 배아 발달 동안 특성화하고 노른자낭 유래 대식구가 성인 대 식세포에 기여하는지를 평가했다. 원시 전구 세포 유래 대 식세포가이 접근법을 사용하여 표지되는지 여부와 그들이 성인 대식 세포 풀에 기여할 수 있는지 여부를 특성화하기위한 추가 연구가 필요합니다.

동물 시험은 파스퇴르 연구소 (Institut Pasteur)의 승인 된 기관 동물 보호 및 사용위원회 (CETEA)에 따라 수행되었습니다.

1. Csf1r ^MeriCreMer Rosa ^LSL-YFP 태아의 Utero Pulse Labeling

1. 4- 하이드 록시 타목시펜 (OH-TAM, 50 mg / mL)의 원액을 준비하십시오.
   1. 기화기 아래에서 25 mg 바이알의 OH-TAM을 열고 250 μL 에탄올 (100 %)을 첨가하십시오.
   2. OH - TAM 솔루션을 10 분 최대 속도로 잘린 팁과 소용돌이와 2 ML의 microcentrifuge 튜브로 전송하십시오.
   3. sonication 욕조에서 30 분 Sonicate.
   4. fumehood에서 PEG-35 피마자 기름 250 μL를 첨가하여 50 mg / mL 저장 용액을 얻는다.
      주 : PEG-35 피마 자유는 소수성 분자를 결합하고 수용성 용매에 용해시키는 양친 매성 성질을 가진 용매이다.
   5. 약 5 분 동안 와동최대 속도로 초음파 분쇄기에서 30 분간 초음파 처리한다.
   6. 분취 량 튜브 당 90 μL (4.5 mg) (주사 1 회분).
   7. 일주 4 ° C에서 또는 장기 -20 ° C에서 보관 이전 ^{13 설명했다.}
2. 프로게스테론 (10mg / mL)의 원액을 준비하고,
   1. fumehood에서 10 mg / 100 μL 현탁액을 제조하기 위해 프로게스테론 25 mg에 100 % 에탄올 250 μL를 첨가하십시오. 부드럽게 소용돌이 치게하십시오.
   2. 2250 μL의 오토 클레이브 해바라기 오일을 첨가하여 10 mg / ml 프로제스테론 용액을 만듭니다.
   3. 4 ℃에서 최대 속도, 분액 및 저장시 약 5 분 동안 와동. 솔루션은 저장시 명확합니다.
3. 타목시펜 투여
   참고 : 배아 발달 날짜는 배아 일 (E) 0.5로 간주됩니다. E8.5에서 단일 주사로 재조합이 유도된다.임신 한 Csf1r ^MeriCreMer 여성 ¹² . tamoxifen 투여 후 유산 율을 줄이기 위해 OH-TAM에 프로게스테론 1g 당 37.5㎍을 보충하십시오. 오후 1시에 주사하십시오 (아침에 관찰되는 질 플러그에 대해).
   1. 주사 아침에 10 분 동안 (또는 완전히 재현 될 때까지) OH-TAM 용액의 분량을 초음파 처리하십시오.
   2. fumehood 하에서 360 μL NaCl 0.9 %를 첨가하여 10 mg / mL OH-TAM 용액과 vortex를 얻습니다. 용액이 깨끗 해지고 완전히 재현 될 때까지 초음파 처리하십시오 (최소 30 분).
   3. 프로게스테론을 실온으로 예열합니다.
   4. Microcentrifuge tube에 OH-TAM 450 μL와 프로제스테론 225 μL를 섞는다. 와동.
   5. 적어도 10 분간 sonicate하고 25G 바늘로 1 ML 주사기에로드합니다.
   6. 동물 시설에서 임신 한 여성의 몸무게를 측정하십시오 ( Csf1r ^MeriCreMer 암컷은 근친 교잡 된 FVB 유전 적 배경에 있고 전형적으로 체중이 다릅니다).ko 25 및 33 g).
   7. 계산 된 볼륨을 천천히 마우스에 주입하여 복강 내 주사를 수행하십시오. 바늘을 빼낸 후 천천히 찔린 상처를 누르고 복부를 마사지하여 OH-TAM을 분배하십시오.
      참고 : OH-TAM 주입량은 75mg / kg이고 프로제스테론 투여 량은 37.5mg / kg입니다. 표 1 은 임산부에게 주입 할 용적을 제공합니다.

표 1 : 4-OH- 타목시펜 (OH-TAM)의 주입량. 프로게스테론 1 g 당 37.5 μg을 첨가 한 OH-TAM 1 g (체중) 당 75 μg의 E8.5에서의 단일 주사에 필요한 용량.

2. Yolk Sac (YS)와 태아 간 (FL)의 절개

참고 : 장기간 배양에 사용하지 않으면 배아를 조작 할 때 엄격한 무균 기술이 필요하지 않습니다. 그럼에도 불구하고, 작업 영역은 깨끗해야하며 흡수성 종이 아래에 호일로 덮여 있어야합니다.

1. 빙냉 인산염 완충 식염수 (PBS)와 소화 혼합 (1mg / ML collagenase D, 100U / mL Deoxyribonuclease I (DNase I) 및 3 % 태아 소 혈청 함유 PBS)을 준비하십시오.
2. 임산부를 cer에 의해 희생한다.요구되는 임신일 ( 예컨대, 배아 단계 E10.5)에서의 전위.
3. 생식기 바로 위의 피부를 꼬집어 가위로 정중선에 작은 절개를하십시오. 모피없이 몸 벽을 완전히 드러내 기 위해 머리쪽으로 피부를 당깁니다. 복부 근육을 잘라 내 조직을 노출시키고 두 자궁 경적을 노출시키기 위해 창자를 밀어냅니다.
4. 중간 크기의 둔기 집게로 난소에 붙어있는 지방 패드를 잡고 부드럽게 자궁을 당깁니다. 자궁 경부의 자궁 경부 수준에서 자르고 복막강에서 뿔을 들어 올리십시오. 지방 패드를 제거하여 자궁 뿔을 완전히 풀어 각면의 난소에서 뿔을 자릅니다.
5. 10mm 페트리 접시에 얼음처럼 차가운 PBS에 뿔을 넣으십시오. 신속하게 한쪽 말단 (자궁 경부)에서 자궁 근층을 잡고 근육 층과 탈락 조직 사이의 미세한 가위를 슬라이드하여 주변의 탈락 조직으로 태아를 놓습니다.
   참고 : 근육은 빠르게 afte 계약을하는 경향이 있습니다.따라서 추출은 가능한 한 빨리해야합니다.
6. Reichert의 멤브레인과 태반을 차단하기 위해 한 쌍의 미세 포셉을 사용하십시오.
7. 부드럽게 노른 자루를 꺼내 소화 혼합 0.5 ML와 24 잘 조직 문화 플레이트에 놓으십시오.
   참고 :이 단계에서 배아 혈액을 수집 할 수 있습니다.
   1. 배꼽과 vitelline 혈관을 절단 직후, 10 MM 얼음 - 차가운 ethylenediaminetetraacetic 산성 (EDTA)을 포함하는 12 잘 조직 배양 접시에 배아를 전송하십시오. 날카로운 가위를 사용하여 배아를 처치하고 가능한 한 조직을 팽창시키는 것을 제한하십시오. 10-15 분 동안 얼음에서 품어 혈액과 EDTA를 수집합니다.
8. 배아 주변의 양막을 제거하십시오.
9. 단계
10. 배아 머리를 잘라내 라.ing 겸자 또는 좋은 가위. 0.5 ML 소화 믹스와 24 잘 접시에 머리를 전송하십시오.
    참고 : 나중에 단계에서 신경 외배엽과 뇌는 유세 세포 분석을 위해 더 해부됩니다; 조심스럽게 주변 혈관 신경총을 제거하십시오.
11. 뒷다리 위에 배아를 잘라 앞다리를 제거하십시오.
12. 간을 분리하려면, 좋은 포셉 한 켤레를 사용하여 흉부를 엽니 다. 앞쪽으로 심장을 꼬집고 두 번째 집게를 사용하여 몸에서 장기를 제거하면서 천천히 당깁니다.
    1. 조심스럽게 태아의 간을 심장과 내장에서 분리하십시오. 태아 간을 0.5 ML 소화 믹스와 24 잘 접시에 전송하십시오. 해부 현미경으로 전송을 조심스럽게 모니터링하십시오.
13. 폴리 메라 이제 연쇄 반응 분석 (PCR)에 의해 genotyping에 대한 꼬리 부분 (또는 다른 배아 부분)을 수집합니다.
    참고 : 다른 조직 및 기관은 유세포 분석을 사용하여 유사한 분석을 위해 E10.5 배아에서 수확 할 수 있습니다. 블러드, 헤드 스키n, 대동맥 - 생식기 - 중뇌 골질 영역 (AGM), 심장 및 신경 외배엽은 E10.5에서 수집 될 수있다. 나중 단계에서 폐, 신장, 비장 및 췌장을 수집 할 수 있습니다. 다른 발달 단계에서 AGM의 해부에 대한 자세한 설명은 이전에 설명되어 있습니다 ¹⁴ .

3. 유동 세포 계측법을위한 배아 조직의 처리

1. 37 ° C에서 30 분 동안 (소화 믹스에 배치) 장기를 품어.
2. FACS 버퍼 (1x PBS에 0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA)와 2mM EDTA) 6 ML로 가득 6 잘 조직 배양 접시에 배치 100 μm의 여과기에 조직과 효소 솔루션을 전송합니다. 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 2mL 주사기의 검은 고무 피스톤으로 부드럽게 매시하여 기계적으로 해리합니다.
   참고 : 이제부터는 모든 단계를 4 ° C에서 수행해야합니다.
3. 파스퇴르 피펫으로 세포 현탁액을 수집하고 15 ML 튜브로 전송할 수 있습니다.
4. 스파이4 ℃ 320 xg에서 7 분간. 흡인으로 상층 액을 버린다.
5. 60 μL Fc 차단 버퍼 (FACS 버퍼에 1/50 희석 CD16 / CD32 차단 항체)에 펠렛을 Resuspend.
   1. 둥근 바닥 96 멀티 우물 판에서 우물 당 단일 세포 현탁액 50 μL를 전송합니다. 얼음 위에서 적어도 15 분 동안 품어 낸다.
      참고 : 염색법은 적은 수의 시료를 처리 할 때 5 mL 폴리스티렌 FACS 튜브에서도 수행 할 수 있습니다.
   2. 나머지 10 μL를 5 mL 폴리스티렌 FACS 튜브에 옮겨 각 조직에서 시료 풀을 얻습니다. 이 풀은 대조군 ( 즉, 염색되지 않은 샘플 및 각 형광 색소에 대한 형광 마이너스 (FMO) 컨트롤)로 사용됩니다. 96 멀티 웰 플레이트에 각 형광 마이너스 1 (FMO) 컨트롤 (형광색 당 하나)에 대한 풀 50 μL를 전송합니다.
      참고 : 각 FMO 컨트롤에는 항체 패널의 모든 형광 색 결합 항체가 포함되어 있지만측정되고있다. FMO는 게이트 경계를 식별하고 다중 색상 패널에서 스펙트럼 겹침을 제어하는 ​​데 사용됩니다. 서로 다른 조직 사이의 백그라운드 및 자기 형광의 변화를 정확하게 해결하려면 각 조직의 샘플 풀에서 이러한 컨트롤을 준비하는 것이 중요합니다. YFP 발현에 대한 적절한 컨트롤은 Cre 유전자 음성 배아의 샘플로 PCR genotyping에 의해 확인됩니다.

표면 항원 염색

1. FACS 버퍼 (표 2)에서 항체 믹스를 준비합니다. 시료 당 50 μL의 항체 혼합물을 준비하십시오.
   1. 다음과 같은 형광 결합 항체를 사용하십시오 : 항 -CD45.2 (클론 104); 항 -CD11b (클론 M1 / ​​70); 항 -F4 / 80 (클론 BM8); 항 -AA4.1 (클론 AA4.1); 항 -Kit (클론 2B8); 및 항 -Ter119 (클론 Ter119)를 포함한다.
   2. FACS 버퍼에서 FMO 컨트롤에 대한 6 가지 항체 믹스를 준비합니다. 대조 샘플 당 50 μL의 항체 혼합물을 준비하십시오.
      아니TE : 항체 혼합물의 항체 희석은 물질 표에 표시된 최종 농도보다 2 배 농축되어 있습니다. 6 개의 형광색 결합 항체가있는 패널의 경우 6 개의 FMO 컨트롤이 준비됩니다. 표 2 는 하나의 튜브에 대한 항체 믹스 및 FMO 컨트롤의 구성을 제공합니다.

표 2 : 염색 및 Fluorescent -in- One (FMO) 컨트롤에 사용 된 항체의 부피. 50 μL의 최종 부피에 필요한 항체의 부피 (μL).

2. 96 - 멀티 웰 플레이트 (얼룩 동안 최종 볼륨 100 μL입니다)에있는 샘플에 항체 믹스의 50 μL를 추가합니다. 부드럽게 위아래로 두 번 피펫과 30 분 동안 얼음에 품어.
3. 96 - 멀티 웰 플레이트를 4 분 320 x g에서 7 분간 회전시키고 상등액을 버린다. FACS 버퍼 200 μL에 Resuspend.
4. 150 μL FACS 버퍼로 두 번 세척 절차 (단계 4.3)를 반복하십시오.
5. 샘플 및 컨트롤 (FMOs 및 unstained 풀 샘플) 70 μm의 여과기를 통해 5 ML 폴리스티렌 튜브로 필터링합니다. 획득 할 때까지 얼음에 보관하십시오.

5. 유동 세포 계측법에 의한 EMPs 및 YS 유래 대 식세포의 동정

참고 :이 프로토콜은 4 레이저 흐름 cytometer 이퀄라이저를 사용하여 최적화되었습니다405 nm 보라색 레이저, 488 nm 청색 레이저, 562 nm 황색 레이저 및 638 nm 적색 레이저를 사용합니다.

1. 제조사의 지시에 따라 결합 된 각 항체에 대한 보상 비드를 준비하십시오. 레이저 강도를 최적화하려면 염색되지 않은 샘플 및 보정 비드를 사용하십시오.
2. 게이트 경계를 확인하려면 각 항체에 대한 FMO (형광 마이너스 1) 컨트롤을 사용하십시오.
3. 죽은 세포를 제외하기 위해, 취득하기 전에 1 분 DAPI (1 MG / ML) 튜브 (스테인드 세포 현탁액 200 μL를 포함)에 1 μL를 추가합니다. 강력한 DAPI 신호와 전방 산란 매개 변수 (FSC)를 사용하여 죽은 세포와 잔해를 배제하십시오.
   참고 : 수집하는 동안 플로우 cytometer의 소프트웨어를 사용하여 게이트를 그립니다. 보정 매트릭스 및 분석은 다른 상용 소프트웨어를 사용하여 샘플을 수집 한 후에 수행 할 수 있습니다.
4. 전방 및 측방 산란 (FSC 대 SSC)을 사용하여 총 사건에서 생존 세포 및 이중 배별을 수행하십시오.
5. 로그 - 스케일 축에서 형광 도트 플롯을 만들고 daughter gate를 끌어 와서 적혈구 (Ter119 ⁺ )를 제외하고 선조 세포 (Kit ⁺ )와 조혈 세포 (CD45 ⁺ Kit ^neg )를 확인합니다 ( 그림 1 참조).
6. YS ( 그림 2 ), 태아 간 ( 그림 3 ) 및 뇌 ( 그림 4 )의 서로 다른 확인 된 개체군 중 YFP의 표지 효율을 정량화하기 위해 형광 히스토그램을 만듭니다.

유전 적 운명 매핑은 Rosa26-LSL-eYFP 리포터를 수컷과 교배 한 Csf1r-Mer-iCre-Mer 암컷으로 OH-TAM의 E8.5 투여에 의해 달성되었다. OH-TAM의 존재 하에서, 정지 카세트의 절제는 Csf1r을 발현하는 세포에서 YFP의 영구 발현을 유도한다 . 우리는 두 개의 조혈 조직, 즉 난황낭과 태아 간, 그리고 E10.5의 태아에서 조혈 모세포 이외의 조혈 조직, 즉 신경 외배엽을 채취했다. 단일 세포 현탁액은 효소 적 및 기계적 해리에 의해 얻어졌으며 샘플은 형광 결합 항체로 염색 한 후 유세포 분석에 의해 분석되었다. 죽은 세포와 이중 덩어리를 배제한 후, 단일 세포 현탁액을 분석했다 ( 그림 1 ). 모든 게이트는 Fluorescence Minus One (FMO) 컨트롤을 사용하여 정의되었습니다. 분석의 명확성을 향상시키기 위해 적혈구 배제 (Ter119 ⁺ 세포)를 수행하는 것이 좋습니다 ( 그림 1B ). 세포 표면 마커 키트 (progenitor marker)와 CD45 (조혈 세포 마커)를 사용하여 세 가지 세포를 구별 할 수있었습니다 : Kit ⁺ CD45 ^neg ; Kit ⁺ CD45 ^low 및 Kit ^neg CD45 ⁺ ( 그림 1 ). 선조는 AA4.1의 발현에 기초하여 더 분석되었다 ( 그림 2-4 ). 실제로 AA4.1은 식민지 형성 분석에서 입증 된 것처럼 난황낭의 적혈구 전구 세포 내 선조 집단의 농축을 가능하게하는 지표 표식입니다 ¹⁵ . 관심 대상 집단이 확인되면 히스토그램을 사용하여 각 집단의 YFP 표지 효율을 정량화했습니다. 난황낭 Kit ⁺ progenitors 중 CD45 ^neg ( 그림 2A ) 및 CD45 ^low ( 그림 2B ) 세포 집단에는 모두 AA4.1 ⁺ YFP ⁺ 세포가 포함되어 있습니다. 그러나, AA4.1 ⁺ YFP <간 및 뇌 SUP> + 세포만을 키트 CD45 ⁺ 선조 ^낮은 인구 (도 3B와 4B)에서 발견된다. 뇌가 조혈의 활성 부위가 아니기 때문에,이 조직에서 발견되는 전구 세포는 순환하는 전구 세포와 일치 할 수 있습니다. 이것은 또한 난황낭에서 태아 간 및 말초 조직으로 이동함에 따라 선조 성숙 과정이 있음을 시사합니다. Kit ⁺ progenitors는 먼저 CD45 발현과 관계없이 AA4.1을 발현하지만, 혈액 순환에 도달 할 때까지 모든 AA4.1 ⁺ YFP ⁺ 전구체는 검출 가능한 수준의 세포 표면 CD45를 발현합니다. F4 / 80 ^bright CD11b ⁺ 로 정의 된 Macrophages는 Kit ^neg CD45 ⁺ 게이트에서 발견되었습니다 ( 그림 2-4 ). E10.5 노른자, 간 및 뇌의 대 식세포는 효율적으로 표지되었다 (F4 / 80 ^밝은 CD11b ⁺ 세포의 60-80 %는 YFP ^+이다 ) .b 나중에 E8.5에서 단일 OH-TAM 투여 ( 그림 2C , 3C 및 4C ).

새끼들 사이의 표지 효율을 비교하기 위해 재조합 효율성을위한 내부 통제가 사용되는 것이 좋습니다. OH-TAM 을 자궁 내로 주사 할 때 쥐와 쥐의 발달시기의 차이에 기인하여 실험 사이에서 기자의 발현 수준의 다양성이 관찰 될 수있다. 따라서 우리는 E8.5에서 E11.5 태아까지의 태아 준비가 체절 쌍 계산에 의해 수행되는 것이 좋습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 다른 실험과 긴장 ( 그림 4C ) 사이 Cre 재조합의 효율성을 비교하기 위해 참조로 뇌 상주 macrophages (microglia)의 라벨 효율을 사용하는 것이 좋습니다. 다른 상주 대 식세포도 사용할 수 있었지만, 소교 세포는 난황낭 유래 대식 세포로 묘사 된 최초의 세포였다E10.5에서 조직 내성 대식 세포의 가장 풍부한 개체군을 대표하므로, 각 실험에서의 운명지도 작성 효율을 평가하고 다른 낙엽으로부터의 자료를 비교하기 위해 소교 세포에서 YFP 표지를 사용할 수있다.

그림 1 : 전구 세포 (Kit ⁺ CD45 ^neg 및 Kit ⁺ CD45 ^low ) 및 분화 된 조혈 세포 (Kit ^neg CD45 ⁺ )를 확인하는 게이팅 전략. ( A ) DAPI 염색법과 전방 및 측면 산란 (FSC / SSC) 매개 변수를 사용하여 생균 및 단일 항원의 식별을 수행합니다. ( B ) 적혈구 배제 후 (Ter119 ^neg ), 관심 세포의 세 집단은 Kit 및 CD45의 세포 표면 발현에 기초하여 동정된다 : Kit ⁺ CD45 ^neg ; 키트 ⁺ CD45 ^낮음 neg CD45 ⁺ 세포. ( C ) OH-TAM이 주입되었을 때 Csf1r 발현 세포가 존재하고 그들의 자손은 Cre-recombinase 음성 배아와 비교하여 YFP를 발현하는 Cre 재조합 효소 양성 배아에서 확인된다 (나중에 폴리 메라 이제 연쇄 반응 분석, PCR에 의해 확인 됨). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 : E10.5 Csf1r ^MerlCreMer Rosa26에서 난황낭에 라벨링 효율 E8.5에서 OH - TAM으로 embryospulsed ^{LSL - eYFP} . ( A ) 키트 ⁺ CD45 ^neg 세포 라이브 노른자 골수 세포 (파란색 게이트, 왼쪽 패널)에 키트와 CD45 표현을 기반으로 문이 있습니다. Kit ⁺ CD45 ^neg 세포에서 AA4.1 및 Kit 발현. 블루e 게이트는 AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^neg 세포 (중간 패널)를 둘러싸고있다. Cre 네거티브 컨트롤 (검정색) 및 Cre 긍정 샘플 (녹색)의 AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^neg 세포 (오른쪽 패널)에서 YFP 라벨링의 비교. 막대 그래프는 YFP 신호 (x 축)에 양성인 세포의 비율 (y 축)을 나타냅니다. ( B ) 키트 ⁺ CD45 ^낮은 세포 키트 및 CD45 표현 (블루 게이트, 왼쪽 패널)에 따라 게이트가 있습니다. Kit ⁺ CD45 ^low 세포에서의 AA4.1 및 Kit 발현. 청색 게이트는 AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^저 세포 (중간 패널)로 정의 된대로 EMP를 둘러 쌉니다. Cre 네거티브 컨트롤 (검정) 및 Cre 긍정 샘플 (녹색)의 AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^낮은 세포 (오른쪽 패널)에서 YFP 라벨링의 비교. 막대 그래프는 YFP 신호 (x 축)에 양성인 세포의 비율 (y 축)을 나타냅니다. ( C ) 조혈 모세포는 Kit ^neg CD45 ^{+ 및 gated in blue (왼쪽 패널). Kit neg CD45 + 세포에서 F4 / 80 및 CD11b 발현. Macrophages는 F4 / 80 밝은 CD11b + 세포 (중간 패널)로 정의됩니다. Cre 네거티브 컨트롤 (검정) 및 Cre 긍정 샘플 (녹색)에서 F4 / 80 밝은 CD11b + macrophages (오른쪽 패널) YFP 라벨링의 비교. 막대 그래프는 YFP 신호 (x 축)에 양성인 세포의 비율 (y 축)을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.}

그림 3 : E10.5 Csf1r ^MeriCreMer Rosa26에서 간에서 표지 효율 E8.5에서 OH - TAM으로 embryospulsed ^{LSL - eYFP} . ( A ) Kit ⁺ CD45 ^neg 세포는 Kit 및 CD45에 근거하여 게이팅됩니다.라이브 간 세포 (파란색 게이트, 왼쪽 패널)에 표현. Kit ⁺ CD45 ^neg 세포에서 AA4.1 및 Kit 발현. 청색 게이트는 AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^neg 세포 (중간 패널)를 둘러싸고 있습니다. Cre 네거티브 컨트롤 (검정색) 및 Cre 긍정 샘플 (녹색)의 AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^neg 세포 (오른쪽 패널)에서 YFP 라벨링의 비교. 막대 그래프는 YFP 신호 (x 축)에 양성인 세포의 비율 (y 축)을 나타냅니다. ( B ) 키트 ⁺ CD45 ^낮은 세포 키트 및 CD45 표현 (블루 게이트, 왼쪽 패널)에 따라 게이트가 있습니다. Kit ⁺ CD45 ^low 세포에서의 AA4.1 및 Kit 발현. 청색 게이트는 AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^저 세포 (중간 패널)로 정의 된대로 EMP를 둘러 쌉니다. Cre 네거티브 컨트롤 (검정) 및 Cre 긍정 샘플 (녹색)의 AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^낮은 세포 (오른쪽 패널)에서 YFP 라벨링의 비교. 히스토그램은셀 (Y 축)은 YFP 신호 (x 축)에 대해 양수입니다. ( C ) 조혈 세포는 Kit ^neg CD45 ⁺ 로 정의되고 파란색으로 문이 열린다 (왼쪽 패널). Kit ^neg CD45 ⁺ 세포에서 F4 / 80 및 CD11b 발현. Macrophages는 F4 / 80 ^밝은 CD11b ⁺ 세포 (중간 패널)로 정의됩니다. Cre 네거티브 컨트롤 (검정) 및 Cre 긍정 샘플 (녹색)에서 F4 / 80 ^밝은 CD11b ⁺ macrophages (오른쪽 패널) YFP 라벨링의 비교. 막대 그래프는 YFP 신호 (x 축)에 양성인 세포의 비율 (y 축)을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4 : E10.5에서 뇌에서 라벨링 효율 Csf1r ^MeriCreMer Rosa26 ^LSL-eYFP embryospuE8.5에서 OH-TAM을 사용했다. ( A ) 키트 ⁺ CD45 ^neg 세포는 라이브 뇌 세포 (파란색 게이트, 왼쪽 패널)에 키트와 CD45 표현을 기반으로 문이 있습니다. Kit ⁺ CD45 ^neg 세포에서 AA4.1 및 Kit 발현. 청색 게이트는 AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^neg 세포 (중간 패널)를 둘러싸고 있습니다. Cre 네거티브 컨트롤 (검정색) 및 Cre 긍정 샘플 (녹색)의 AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^neg 세포 (오른쪽 패널)에서 YFP 라벨링의 비교. 막대 그래프는 YFP 신호 (x 축)에 양성인 세포의 비율 (y 축)을 나타냅니다. ( B ) 키트 ⁺ CD45 ^낮은 세포 키트 및 CD45 표현 (블루 게이트, 왼쪽 패널)에 따라 게이트가 있습니다. Kit ⁺ CD45 ^low 세포에서의 AA4.1 및 Kit 발현. 청색 게이트는 AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^저 세포 (중간 패널)로 정의 된대로 EMP를 둘러 쌉니다. AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^low 에서 YFP 표지의 비교 셀 (오른쪽 패널). 막대 그래프는 YFP 신호 (x 축)에 양성인 세포의 비율 (y 축)을 나타냅니다. ( C ) 조혈 세포는 Kit ^neg CD45 ⁺ 로 정의되고 파란색으로 문이 열린다 (왼쪽 패널). Kit ^neg CD45 ⁺ 세포에서 F4 / 80 및 CD11b 발현. Macrophages는 F4 / 80 ^밝은 CD11b ⁺ 세포 (중간 패널)로 정의됩니다. Cre 네거티브 컨트롤 (검정) 및 Cre 긍정 샘플 (녹색)에서 F4 / 80 ^밝은 CD11b ⁺ macrophages (오른쪽 패널) YFP 라벨링의 비교. 막대 그래프는 YFP 신호 (x 축)에 양성인 세포의 비율 (y 축)을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

조혈 전구 세포의 다른 파동은 짧은 시간 내에 부분적으로 겹쳐서 발달 조혈의 각 파가 면역 세포에 기여하는 것을 기술적으로 매우 도전적으로 분석합니다.

Tamoxifen-inducible Cre 시스템은 ex vivo 또는 in vitro 배양이나 이식을하지 않아도 일시적으로 유도 가능한 방식으로 특정 세포에 태그를 지정하고 배아 또는 성인에서 계통 분석을 수행 할 수있는 기회를 제공합니다. 타목시펜 - 유도 성 Cre 균주에서 박테리아 Cre 재조합 효소와 인간 에스트로겐 수용체 (CRE-ER)의 리간드 결합 도메인의 돌연변이 형태 사이에 또는 개선 된 단일 점 돌연변이 Cre와 2 개의 마우스 에스트로겐 수용체 사이에 융합 유전자가 생성된다 (Mer-iCre-Mer). Cre의 에스트로겐 수용체와의 융합은 Hsp90에 의한 Cre의 세포질 분리를 유도하여 핵 Cre- 매개 재조합을 방지한다. 타목시펜 (TAM)은 the- 간을 4- 하이드 록시 타목시펜 (OH-TAM)으로 전환 시키므로 에스트로겐 수용체에 대한 높은 결합 친 화성을 갖는 활성 대사 산물이다. 융합 Cre에 대한 OH-TAM 결합은 Hsp90과의 상호 작용의 붕괴를 유도하여 핵으로의 전좌와 Cre 매개 재조합의 개시를 허용한다. utero에서 TAM 또는 OH-TAM을 임신 한 여성에게 주입하면 태아의 재조합을 활성화시키는 것으로 나타났습니다. 임신 중 타목시펜 투여는 낙태로 이어질 수 있으므로 낙엽의 크기는 줄어들지 만 태아 중반 이후에 출산하는 경우 출산을 막습니다.이 경우 제왕 절개를 통한 강아지 배달이 필요합니다. 임신 중 타목시펜 효과를 상쇄하기 위해, 우리는 낙태 ^(17)의 위험을 배아의 생존율을 향상시키고 줄이기 위해, 프로게스테론의 반 복용량 OH-TAM 관리를 보충합니다.

임산부에게 TAM 또는 OH-TAM을 전달하기 위해 여러 경로를 사용할 수 있습니다. 현재 경구 용 Gavage 또는 intra 복막 (ip) 주사는 tamoxifen에 사용됩니다. OH-TAM은 임신 댐 간에서 신진 대사를 필요로하지 않기 때문에 즉시 사용할 수있는 이점이 있습니다. 그러나, tamoxifen은 옥수수 기름에 녹기가 매우 쉽지만, OH-TAM은 같은 기술을 사용하여 준비하기가 매우 어려우며 유화액을 만듭니다. 이것은 자궁 내 펄스 라벨링 에 OH-TAM을 사용하는 것을 제한하는 단계였습니다. 우리는 타목시펜 용해가 가장 중요한 단계 중 하나이기 때문에 JF Nicolas ¹³ 그룹이 개발 한 OH-TAM 조제에 PEG-35 피마 자유를 사용하여 OH-TAM을 용해시키는 양친 매성 성질을 가진 용매를 사용했다. 절차에서. 이것은 OH-TAM의 재생 가능하고 최적의 준비를 가능하게하고 타목시펜 준비 시간을 상당히 단축시킵니다. 또한, 상이한 유도 성 Cre 균주를 사용할 때 주입 할 OH-TAM의 농도를 적응시키는 것이 필요하다. 생존 성 염료 (DAPI) 및 크기 (FSC)는 각각 죽은 세포와 세포 파편을 제거하는 데 중요합니다. 죽은 세포와 부스러기는 대부분의 보라색, 청색 및 적색 레이저 탐지기에서 높은자가 형광성을 가지며 유동 세포 계측 분석을 방해 할 수 있습니다. 또한, 우리는 유동 세포 계측기로 분석하기 전에 염색 후 세포를 고정하지 않는 것이 좋습니다. 고정은 세포 형태학의 변화로 이어질 수 있으며 따라서 전방 및 측면 산란 (FSC vs. SSC)에 근거한 어려운 크기의 차별을 만듭니다. 또한, PFA로 시료를 고정하면 YFP 형광 강도가 현저하게 감소합니다.

이 프로토콜의 주된 한계는 집단이 기능과 차별화 가능성에 대해 테스트되지 않는다는 것입니다. 이것을 극복하기 위해, 세포는 콜로니 형성 분석을 수행하기 위해 Fluorescently-activated cell sorter (FACS)를 사용하여 유사한 프로토콜을 따라 분류 할 수 있습니다. 이 경우, 절차는 무균 조건 하에서 수행되어야하며 태아 소 혈청 (FBS) 대신 FACS 버퍼에 BSA를 사용하는 것이 좋습니다. 이 기술로 얻은 낮은 라벨링 효율과 결과적으로 배아 조직 당 YFP ⁺ 세포의 수가 적기 때문에 EMP 표현형 연구에서 주요 과제입니다. 이 프로토콜은 4 레이저 유동 세포 계측기를 사용합니다. 3 개의 레이저가있는 유동 세포 계측기를 사용할 수도 있지만, 항체 패널을 염료 사이의 증가 된 스펙트럼 중첩을 고려하여 적응시키는 것이 중요합니다. 또한 항체 패널을 교체 할 때 적절한 농도를 찾기 위해 항체의 적정이 필요하며 조직 수를 늘리기 위해 조직 당 모든 배아를 모으는 파일럿 실험에서 항체의 적정 및 새 항체 패널의 검증을 수행하는 것이 좋습니다 세포는 조직마다 분석했다.

발생 생물학의 분야는 시츄 셀 영구 라벨을 허용 Cre 호텔 / 된 LOX 방법으로 혁신되어왔다. 이 접근 방식은특정 프로모터의 제어하에 Cre 재조합 효소의 발현을 통한 조직 - 또는 세포 유형 - 특이성. 우리의 경우 우리는 집단에 의해 개발 된 균주를 사용하여 대 식세포 및 그들의 전구 세포에 대한 중요한 분열 촉진 인자 및 성장 인자 수용체 인 Csf1r (Colony Stimulating Factor 1 Receptor)의 프로모터의 제어하에 Cre recombinase의 발현을 연구하기로 결정했다 J. Pollard의 ¹⁸ 게시 된 다른 전략에 비해 Csf1r 표현에 따라 운명 매핑 전략의 장점은 어떤 태아의 조혈 모세포 ^{(12) 라벨없이} 난황 유래 세포 (EMP와 대 식세포)의 라벨을 수 있다는 것입니다. Cx3cr1 ^CreERT2 균주는 또한 HSCs ¹⁹ 를 표지하지 않고 난황낭 세포를 표지 할 수 있지만 대 식세포와 대 식세포 전구 물질만을 표지 할 수 있지만 EMP 전구 세포 ^1을 표지하지는 않습니다. Cx3cr1 ^CreERT2 균주에는 ^Csf1r 과 동일한주의 사항이 있습니다 ^{MerCreMer line은 단 독성 원시성 대 식세포 전구 세포 또는 EMP에서 유래 된 대 식세포를 구별 할 수 없기 때문에 가능합니다. Runx1 MerCreMer 16 및 Kit MerCreMer 20 에서 타목시펜을 E7.5만큼 일찍 투여하면 말초 혈 세포는 매우 낮은 효율 임에도 불구하고 항상 성인에서 표지되므로 개발 중 HSC의 표지를 입증 할 수 있습니다. EMP 키트 + SCA1 11 부정적인 반면 또한, 키트 MerCreMer 운명 매핑 레이블 주머니 키트 + SCA1 + 조상 노른자. Csf1r MeriCreMer 균주는 knock-in이 아니지만 고전적 첨가제 형질 전환에 의해 생성되었으므로 Cre의 발현은 Csf1r의 내생적인 발현을 완전히 되풀이하지 못할 수 있습니다. 그러나 이것은 Csf1r의 이형성 발현으로 인한 잠재적 발달 결함을 피할 수있는 장점이있다. 분석 할 때 고려해야 할 중요한 요소입니다.같은 유도 Cre 호텔 삽입-에있는 내생 궤적 Runx1 MerCreMer, 키트 MerCreMer 및 Cx3cr1 CreERT2 등의 발달 조혈의 연구에 사용되는 다른 운명 매핑 전략. Runx1 MerCreMer 와 Kit MerCreMer 모두에서 heterozygous embryos에 발달 조혈 결함이 기술되어있다. 총체적으로, 여기에 제시된 방법은 발달 중에 난황낭 EMP 생물학을 연구 할 수 있으며 성인 조직에서 발견되고 HSC 유래 대 식세포와는 다른 난황낭 유래 대 식세포를 조사 할 수있다. 이것은 성인기에 상주 대 식세포의이 혈통과 그 기능에 대한 현재의 이해를 향상시킬 것입니다. 한 EMP의 immunophenotypic 특성은 최근 그 난황 EMP 특별히 개발 (11)의 초기 단계에서 CD41 및 CD16 / 32를 발현 보여주는 셀 정렬 및 콜로니 형성 어 세이를 이용하여 개선되어왔다. 그러나, CD41의 발현의 특이성및 CD16 / 32는 E10.5 이후, 특히 태아 간의 틈새에서, 운명 매핑 모델을 사용하여 더욱 특성화해야합니다. 실제로, CD41 및 CD16 / 32 발현이 E10.5에서 E14.5 태아 간에서 태아 HSC 및 HSC 유래 전구 세포와 비교할 때 여전히 EMP에 특이적인 것인지 여부를 밝혀야한다. 제시된 방법은 난황낭에서 생성 된 EMP를 라벨링하고 배아 발육 중에 그들을 따르도록하며, 태아 간을 파종 할 때 EMP 표현형의보다 상세한 특성화에 기여할 것이다.}

이 방법은 가까운 장래에 EMP 분화 경로를 연구하는 데 중요 할 수 있습니다. EMP가 E8.5에서 E10.5 4까지의 난황 내피로부터 출현하는 반면,이 방법은 E8.5-E9.5 사이에 나타나는 전구 세포의 일부분만을 표지 할 수 있습니다. 따라서이 방법의 한계는 EMP의 작은 부분 만 표시된다는 것인데, 따라서 c에 대한 floxed 대립 유전자를 가진 고전적 기능 상실 연구에서 분석을 어렵게 만든다andidate 유전자. 대안으로, 스파 스 표지는 클론 기자를 사용하여 생체 내에서 EMP 분화의 클론 연구에서 이점이 될 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 floxed 구조물의 재조합 효율은 genomic locus (floxed alleles) 또는 Rosa26 reporter construct에 의존하기 때문에 각 floxed reporter 또는 floxed allele에 대해 표지 효율을 특성화해야합니다. 사실, 다른 Rosa26 기자가 다른 프로모터와 함께 사용할 수 있으며 Rosa26 ^tdTomato 와 Rosa26 ^mTmG 균주는 Rosa26 ^LSL-eYFP 라인보다 높은 재조합 효율을 갖는다 고보고되었다. 이 프로토콜에 사용 된 기자 마우스 스트레인은 결과 섹션에서 언급 된 선조 성숙의 동적 과정에 관한 정보를 제공 할 수없는 Rosa26 ^LSL-eYFP 라인입니다. 성숙 과정의 문제는 부분적으로 Rosa26 ^mTmG 와 같은 다양한 기자 균주를 사용하여 해결할 수 있습니다. 그러한 변형에서, 세포는 분산 될 수있다.재조합 사건 이후 경과 된 시간에 기초하여 소급된다. Rosa26 ^mTmG 균주의 모든 세포는 막 결합 tdTomato 형광 단백질을 발현하고 Cre 재조합은 tdTomato 카세트를 제거하고 막 결합 GFP의 발현을 허용합니다. tdTomato는 긴 반감기를 가지고 있기 때문에 tdTomato를 포함하고 있지만 재조합 직후에 GFP를 발현하기 시작한 세포는 tdTomato ⁺ GFP ^{low / int} 이며 tdTomato를 더 이상 발현하지 않는 tdTomato ^neg GFP ⁺ 세포와 구별 할 수 있습니다. GFP의 높은 수준을 표현한다 (재조합 후).

상기 논의 된 바와 같이, OH-TAM 제조는 실험들 사이에 유사한 투여 량의 OH-TAM을 지속적으로 전달하고 타목시펜 부작용을 감소시키는 중요한 단계이다. 프로게스테론 동시 투여는 타목시펜이 임신에 미치는 해로운 영향을 제한하는데도 유용합니다. 프로토콜의 또 다른 중요한 요소는 단일 세포 suspensio의 생존 능력n은 다른 배아 조직으로부터 얻어진다. 우리는 일반적으로 유세포 분석을 위해 90 % 이상의 생존 세포를 얻습니다. 이를 위해서는 모든 단계를 신속히 수행하고 조직 수집 후 모든 샘플을 얼음에 유지하는 것이 중요합니다. 게이트 경계를 확인하고 여러 색상 패널에서 스펙트럼 겹침을 제어하려면 염색되지 않은 샘플, 단일 얼룩 및 형광성 마이너스 (FMO) 컨트롤과 같은 적절한 컨트롤이 필요합니다. 항체의 변화는 항체 적정 및 스펙트럼 겹침의 관점에서 유효성을 검사해야합니다. 마지막으로, Rosa26 기자 균주의 선택은 조사되는 과학적 질문에 맞춰야합니다.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

저자는 Frederic Geissmann 교수와 Christian Schulz 교수에게 통찰력있는 토론에 감사드립니다. Hannah Garner 박사는 Xavier Montagutelli 박사와 Jean Jaubert 박사와 파스퇴르 인스 트루먼 트의 동물 병원 직원을 대상으로 비료를 읽었습니다. Amgen Scholar의 Pascal Dardenne과 Vytaute Boreikaite는 기술 지원을 담당했습니다. EGP 연구소의 연구는 파스 티르 인스티튜트 (Institut Pasteur), CNRS, Cercle FSER (FRM, Institut Pasteur 및 REVIVE 컨소시엄의 시작 패키지)에서 지원됩니다 .LI는 REVIVE 컨소시엄의 PhD 펠로우쉽에 의해 지원됩니다.