Identificazione di progenitori eritromieloidi e loro progenie nell'embrione del mouse dalla citometria del flusso

Mentre i macrofagi infiltranti vengono reclutati continuamente nei tessuti adulti da precursori circolanti, i macrofagi residenti seminano il loro tessuto durante lo sviluppo, dove vengono mantenuti senza ulteriori input da progenitori. I progenitori per i macrofagi residenti sono stati recentemente identificati. Qui presentiamo metodi per la mappatura genetica dei fenomeni genetici dei progenitori macrofagi.

I macrofagi sono fagociti professionali dal braccio innato del sistema immunitario. In steady state, i macrofagi sessili si trovano nei tessuti adulti dove agiscono come sentinelle di linea frontali di infezione e danni ai tessuti. Mentre altre cellule immunitarie sono continuamente rinnovate da staminali ematopoietiche e cellule progenitrici (HSPC) situate nel midollo osseo, una linea di macrofagi, conosciuta come macrofagi residenti, è stata dimostrata autopulita nei tessuti senza l'ingresso di HSPC di midollo osseo. Questa linea è esemplificata da microglia nel cervello, cellule Kupffer nel fegato e cellule di Langerhans nell'epidermide tra gli altri. La lamina propria intestinale e colon è l'unico tessuto adulto privo di macrofagi residenti indipendenti da HSPC. Recenti indagini hanno identificato che i macrofagi residenti provengono dall'emotopoiesi extra-embrionale di tuorlo da progenitori distinti dalle cellule staminali ematopoietiche fetali (HSC). Tra l'ematopoiesi definitivo del sacco di tuorlo, eI progenitori ritmicoeloidi (EMP) danno origine a cellule eritroidiche e mieloide, in particolare macrofagi residenti. EMP vengono generati solo all'interno del sacco di tuorlo tra E8.5 e E10.5 giorni di sviluppo e migrano verso il fegato fetale già quando la circolazione è collegata, dove si espandono e si differenziano fino a almeno E16.5. La loro progenie comprende eritrociti, macrofagi, neutrofili e mastociti, ma solo i macrofagi derivanti da EMP persistono fino all'età adulta nei tessuti. La natura transitoria dell'emergere dell'EMP e la sovrapposizione temporale con la generazione HSC rendono difficile l'analisi di questi progenitori. Abbiamo stabilito un protocollo di mappatura dell'induzione di tamoxifene-indottabile basato sull'espressione del promotore di Csf1r del recettore dei citocinosi del macrofago per caratterizzare in vivo le cellule EMP e le cellule EMP mediante citometria a flusso.

Ci sono diverse ondate successive ma sovrapposte di progenitori ematopoietici durante lo sviluppo, la cui progenie mieloide rimane nell'età adulta. Innanzitutto, i progenitori "primitivi" unipotenti emergono nel sacco di tuorlo del topo ^{1 , 2} tra E7.5-E8.25 e danno origine a macrofagi embrionali senza alcuna intermedia monocitica. Sia che i macrofagi derivati ​​da progenitori primitivi persistano nel cervello adulto come microglia rimane un soggetto di indagine attiva. In secondo luogo, i precursori eritro-mieloidi (EMP) sorgono nel sacco di tuorlo all'E8.5, entrano nel flusso sanguigno e colonizzano l'embrione. EMP emergono dall'endotelio hemogenico del tuorlo in una transizione endoteliale-ematopoietica dipendente da Runx1 ^{3 , 4} . Mentre l'EMP può differenziarsi in macrofagi all'interno del sacco di tuorlo, colonizzano anche il fegato fetale dalla giornata embrionale (E) 9 ⁵ e differenTiatriciti, macrofagi, monociti granulociti e cellule digestive ⁶ . I macrofagi che derivano da EMP presentano capacità proliferativa nei tessuti di sviluppo e nei tessuti adulti. Se i macrofagi derivati ​​da EMP superano lo stadio di differenziazione monocitaria, è ancora controversa poiché non si sa molto sul loro percorso di differenziazione ^{7 , 8} . Infine, le cellule staminali ematopoietiche (HSCs) emergono a E10.5 all'interno dell'embrione corretto dalla regione aorta-gonad-mesonephros e migrano verso il fegato fetale. HSCs con capacità di ripopolamento a lungo termine sono rilevati solo dopo E11 (alla fase di coppia pari a 24) ⁹ . Essi si espandono e differenziano da E12.5 fino a che l'ematopoietica definitiva inizia a spostarsi verso il midollo osseo, che diventa il sito predominante della produzione di cellule del sangue per tutta la durata della vita postnatale ¹⁰ .

La spLa sovrapposizione aziale e temporale in emergenza, nonché i marcatori immuno-fenotipici condivisi ha finora ostacolato la nostra capacità di distinguere i contributi specifici di queste onde di progenitori ematopoietici embrionali. Mentre entrambi EMP e HSC sono generati in modo dipendente da Runx1 ed esprimono il fattore di trascrizione Myb e il recettore del fattore di crescita Csf1r (Colony-Stimulating Factor 1 Receptor, noto anche come Macrophage Colony Stimulating Factor Receptor), tra gli altri, EMPs possono essere distinti da HSC per la loro mancanza di potenziale linfoide, sia in vitro che in vivo , la loro mancanza di potenziale repopulante a lungo termine e la mancanza di espressione superficiale del marcatore di lineage Sca- ¹¹ . I modelli di mappatura genetica sono necessari per caratterizzare l'ontogenesi dei macrofagi in quanto consentono di mirare i progenitori embrionali in modo specifico e specifico per le celle. Qui presentiamo il protocollo di mappatura del destino usato nel nostro laboratorio per discriminare i due lignaggiDei macrofagi trovati nella maggior parte dei tessuti adulti: macrofagi infiltrati derivanti da HSC e macrofagi residenti indipendenti da HSC.

I macrofagi residui del tessuto sono stati ricondotti a cellule precursori indipendenti da Myb che esprimono il recettore del citocino Csf1r ¹² e sono presenti nell'embrione a E8.5-E10.5 utilizzando tre strategie complementari di mappatura dei fatti ⁶ . Al fine di studiare l'ematopoiesi sacchi di tuorlo senza etichettatura di HSC fetali, utilizziamo un ceppo transgenico, Csf1r ^MeriCreMer , che esprime una proteina di fusione indotta da tamoxifene di recombinasi " ^Crea " migliorata e due recettori di estrogeni del mouse (Mer-iCre-Mer) sotto il controllo di Il promotore Csf1r. Quindi, la ricombinasi Cre sarà attiva nelle cellule esprimenti Csf1r durante una finestra temporale limitata. Se utilizzato con un ceppo di reporter contenente una proteina fluorescente a valle di una cassetta lox-STOP-lox (Rosa26 ^LSL-eYFP ),Etichettatura genetica delle cellule presenti al momento dell'induzione, ma anche della loro progenie. L'amministrazione a E8.5 della forma attiva di tamoxifene, 4-idrossimetossifene (OH-TAM), etichette EMP e macrofagi, senza etichettatura di progenitori "primitivi" o di HSC fetali. Di conseguenza, abbiamo caratterizzato l'immunofenotipo di EMP e la loro progenie durante lo sviluppo embrionale, oltre a valutare il contributo dei macrofagi derivanti dal tuorlo da zucchero nei pool di macrofagi adulti. Ulteriori lavori sono necessari per caratterizzare se i macrofagi primitivi derivanti da progenitori sono anche etichettati utilizzando questo approccio e se possono contribuire a pool di macrofagi adulti.

Le procedure animali sono state eseguite in conformità con il comitato istituzionale approvato per l'assistenza e l'istruzione degli animali dell'Istituto Pasteur (CETEA).

1. In etichettatura a impulsi di Utero in Csf1r ^MeriCreMer Rosa ^LSL-YFP Embryos

1. Preparare la soluzione di base di 4-idrossi-tamoxifene (OH-TAM, 50 mg / mL).
   1. Sotto il vapore, aprire il flaconcino da 25 mg di OH-TAM e aggiungere 250 μL di etanolo (100%).
   2. Trasferire la soluzione OH-TAM in un tubo di microcentrifuga da 2 mL con una punta troncata e vortexa alla velocità massima per 10 minuti.
   3. Sonicare 30 min in un bagno sonicator.
   4. Aggiungere 250 μl di olio di ricino PEG-35 sotto il fumogeno per ottenere una soluzione di stock di 50 mg / ml.
      NOTA: L'olio di ricino PEG-35 è un solvente con proprietà amfifiliche che lega le molecole idrofobe e li solubilizza in solventi acquosi.
   5. Vortex per circa 5 minAlla velocità massima e sonicare 30 minuti in un bagno di sonicatore.
   6. Aliquota 90 μL (4,5 mg) per tubo microcentrifuga (1 aliquota per iniezione).
   7. Conservare a 4 ° C per 1 settimana oa -20 ° C per un lungo periodo come descritto in precedenza ¹³ .
2. Preparare la soluzione di base di progesterone (10 mg / mL)
   1. Aggiungere 250 μl di 100% etanolo a 25 mg di progesterone per preparare una sospensione da 10 μg / 100 μl sotto il fumo. Vortex dolcemente.
   2. Aggiungere 2250 μL di olio di girasole autoclavato per ottenere una soluzione di progesterone da 10 mg / ml sotto il cappuccio.
   3. Vortex per circa 5 min alla velocità massima, aliquota e conservazione a 4 ° C. Si noti che la soluzione è chiara quando viene memorizzata.
3. Somministrazione di tamoxifene
   NOTA: lo sviluppo dell'embrione è stato stimato considerando il giorno della formazione di spina vaginale come giorno embrionale (E) 0,5. La ricombinazione è indotta da singola iniezione a E8.5^Nelle femmine di ^MeriCreMer in stato di gravidanza ¹² . Supplemento OH-TAM con 37,5 μg per g di progesterone per ridurre i tassi di aborto dopo la somministrazione di tamoxifene. Iniettare alle 13 (per la spina vaginale osservata al mattino).
   1. La mattina dell'iniezione, sonicare una aliquota della soluzione OH-TAM per 10 minuti (o fino a quando completamente riorganizzata).
   2. Aggiungere 360 ​​μl di NaCl 0,9% sotto il fumetto per ottenere una soluzione OH-TAM da 10 mg / ml e vorticarsi accuratamente. Sonicate fino a quando la soluzione è chiara e completamente risospessa (almeno 30 minuti).
   3. Progesterone pre-caldo a temperatura ambiente.
   4. Mescolare 450 μL di OH-TAM e 225 μL di progesterone in un tubo di microcentrifuga. Vortice.
   5. Sonicare almeno 10 min e caricare su una siringa da 1 ml con un ago da 25G.
   6. Nella struttura degli animali, pesare la femmina incinta (le femmine di Csf1r ^MeriCreMer sono in un background genetico FVB inbred e pesano tra loro tipicoEn 25 e 33 g).
   7. Eseguire un'iniezione intraperitoneale iniettando lentamente il volume calcolato nel mouse. Dopo aver ritirato l'ago, premere delicatamente la ferita di puntura e massaggiare l'addome per distribuire l'OH-TAM.
      NOTA: La dose di iniezione OH-TAM è di 75 mg / kg e la dose di progesterone è di 37,5 mg / kg. La Tabella 1 fornisce il volume da iniettare in femmine in gravidanza.

Tabella 1: Volume di iniezione di 4-OH-tamoxifene (OH-TAM). Volume richiesto per una singola iniezione a E8,5 di 75 μg per g (peso corporeo) di OH-TAM completato con 37,5 μg per g di progesterone.

2. Dissezione del Yolk Sac (YS) e del fegato fetale (FL)

NOTA: Le tecniche sterili rigorose non sono necessarie per manipolare gli embrioni a meno che non siano utilizzati per una cultura a lungo termine. Tuttavia, l'area di lavoro deve essere pulita e coperta di fogli di carta sotto assorbente.

1. Preparare la miscela di digestione (PBS) e miscela digestiva (PBS contenente 1 mg / mL collagenasi D, 100 U / mL Deoxyribonuclease I (DNase I) e 3% serum bovino fetale).
2. Sacrificare le femmine incinte di cerDislocazione vica al giorno di gravidanza richiesto ( ad es. Stadio embrionale E10.5).
3. Pinch la pelle appena sopra i genitali e fare una piccola incisione alla linea mediana con le forbici. Tirare la pelle verso la testa per esporre completamente la parete del corpo senza pellicce. Tagliare i muscoli addominali per esporre gli organi interni e spingere l'intestino per esporre le due corna uterine.
4. Con le pinze a media taglia, afferrare il grasso-pad attaccato all'ovaio e tirare delicatamente l'utero. Tagliare al livello cervicale delle corna uterine e sollevare le corna dalla cavità peritoneale. Rimuovere il grasso-pad per liberare completamente le corna uterine e tagliare le corna dall'ovario da ogni lato.
5. Mettete le corna in PBS ghiacciato in un piatto di Petri da 10 mm. Prendi rapidamente gli strati muscolari dell'utero ad una estremità (fine cervicale) e scorri le forbici sottili tra lo strato muscolare e il tessuto deciduo per liberare gli embrioni con il tessuto deciduo circostante.
   NOTA: I muscoli tendono a contratto rapidamenteR l'estrazione, quindi questo passo deve essere il più veloce possibile.
6. Usare una coppia di pinze fine per tagliare la membrana del Reichert e la placenta.
7. Rimuovere delicatamente il sacco di tuorlo e metterlo in una piastra di coltura da 24 pozzetti con 0,5 ml di miscela di digestione.
   NOTA: a questo passo può essere raccolto il sangue embrionale.
   1. Subito dopo aver interrotto i vasi ombelicali e vitellini, trasferire l'embrione in una piastra di coltura da 12 pozzetti contenenti 10 mM acido etilenediammetratoacetico ghiaccio freddo (EDTA). Decapitate l'embrione utilizzando forbici raffinate, cercando di limitare il più possibile la dilacerazione dei tessuti. Incubare su ghiaccio per 10-15 min e raccogliere l'EDTA contenente il sangue.
8. Rimuovere l'amnione che circonda l'embrione.
9. Per le fasi
10. Tagliate la testa dell'embrionePinze o forbici. Trasferire la testa su una piastra da 24 pozzetti con 0,5 ml di digestione.
    NOTA: il neuroectoderm e il cervello in fase successiva vengono ulteriormente disseccati per l'analisi della citometria a flusso; Rimuovete attentamente il plesso vascolare circostante.
11. Tagliate l'embrione sopra il dorso e rimuovete i forelimbs.
12. Per isolare il fegato, aprire il torace usando un paio di pinze fine. Pinch anteriormente al cuore e tirare delicatamente usando la seconda pinza per liberare gli organi dal corpo.
    1. Separare con cautela il fegato fetale dal cuore e dall'intestino. Trasferire il fegato fetale in un piatto da 24 pozzetti con 0,5 ml di digestione. Monitorare attentamente il trasferimento sotto il microscopio di dissezione.
13. Raccogliere la regione di coda (o qualsiasi altra parte embrionale) per la genotipizzazione mediante il processo di reazione a catena della polimerasi (PCR).
    NOTA: Altri tessuti e organi possono essere raccolti da embrioni E10.5 per un'analisi simile usando la citometria a flusso. Sangue, sci di testaN, regione aorta-gonad-mesonephros (AGM), cuore e neuroectoderm possono essere raccolti a E10.5. Nelle fasi successive possono essere raccolti anche polmone, rene, milza e pancreas. Una descrizione dettagliata della dissezione dell'AGM in diverse fasi di sviluppo è stata precedentemente descritta ¹⁴ .

3. Elaborazione di tessuti embrionali per la citometria di flusso

1. Incubare gli organi (posizionati nella miscela di digestione) per 30 minuti a 37 ° C.
2. Trasferire il tessuto e la soluzione enzimatica su un filtro da 100 μm posto in una piastra di coltura da 6 pozzetti riempita con 6 ml di FACS buffer (0,5% Bovine Serum Albumin (BSA) e 2 mM EDTA in 1x PBS). Dissociare meccanicamente accuratamente schiacciando con il pistone in gomma nero di una siringa da 2 ml per ottenere una sospensione a singola cellula.
   NOTA: Da ora in poi tutti i passaggi devono essere eseguiti a 4 ° C.
3. Raccogliere la sospensione cellulare con una pipetta Pasteur e trasferirla in un tubo da 15 mL.
4. SpiN per 7 minuti a 320 xg a 4 ° C. Scartare il surnatante mediante aspirazione.
5. Resuspendere il pellet in 60 μl di Fc-bloccante tampone (CD16 / CD32 bloccante anticorpo diluito 1/50 in FACS buffer).
   1. Trasferire 50 μL della sospensione a cellula singola per pozzetto in una lastra rotonda a 96 piastre a più pozzetti. Incubare per almeno 15 minuti in ghiaccio.
      NOTA: La colorazione può essere eseguita anche in 5 mL di polistirolo FACS quando si tratta di un piccolo numero di campioni.
   2. Trasferire il restante 10 μL in un tubo FACS da 5 ml di polistirolo per ottenere una raccolta di campioni da ciascun tessuto. Questa piscina servirà come controlli ( es. Campioni non conservati e controlli fluorescenti meno uno (FMO) per ogni fluorochrome). Trasferire 50 μL della piscina per ogni controllo fluorescente meno uno (FMO) (uno per fluorochrome) alla piastra a 96 piastre.
      NOTA: Ogni controllo FMO contiene tutti gli anticorpi collegati al fluorocromo dal pannello anticorpale, tranne quelloChe viene misurato. Le FMO sono utilizzate per identificare i confini delle porte e per controllare la sovrapposizione spettrale nei pannelli multicolori. Per correggere correttamente le variazioni di sfondo e autofluorescenza tra diversi tessuti, è importante preparare questi controlli dalla raccolta di campioni di ciascun tessuto. Il controllo appropriato per l'espressione di YFP sarà il campione di embrioni Cre-negativi, che sono confermati dalla genotipizzazione PCR.

4. Colorazione di antigeni superficiali

1. Preparare il mix di anticorpi nel buffer FACS (Tabella 2). Preparare 50 μL di miscela di anticorpi per campione.
   1. Utilizzare i seguenti anticorpi accoppiati con fluorocromo: anti-CD45.2 (clone 104); Anti-CD11b (clone M1 / ​​70); Anti-F4 / 80 (clone BM8); Anti-AA4.1 (clone AA4.1); Anti-Kit (clone 2B8); E anti-Ter119 (clone Ter119).
   2. Preparare sei miscele anticorpali per i controlli FMO nel buffer FACS. Preparare 50 μL di miscela di anticorpi per campione di controllo.
      NOTE: La diluizione degli anticorpi nel miscuglio anticorpale è due volte più concentrata rispetto alla concentrazione finale indicata nella tabella dei materiali. Per un pannello con sei anticorpi accoppiati con fluorochrome, vengono preparati sei controlli FMO. La Tabella 2 fornisce la composizione del mix di anticorpi e dei controlli FMO per un tubo.

Tabella 2: Volume degli anticorpi che utilizzano per la colorazione e fluorescenti meno uno (FMO) controlli. Volume (μL) di anticorpo richiesto per un volume finale di 50 μL.

2. Aggiungere 50 μL di miscela anticorpale ai campioni nella piastra a 96 piastre (il volume finale durante la colorazione è di 100 μL). Pipettare delicatamente pipette due volte e incubare sul ghiaccio per 30 minuti.
3. Spin la piastra a 96 piastre per 7 minuti a 320 xg a 4 ° C e scartare il supernatante. Resuspendere in 200 μL di buffer FACS.
4. Ripetere la procedura di lavaggio (punto 4.3) due volte con 150 μL di buffer FACS.
5. Filtrare i campioni ei controlli (FMO e campioni non campionati) in 5 ml di polistirolo attraverso un filtro da 70 μm. Conservare sul ghiaccio fino all'acquisto.

5. Identificazione di EMP e Macrofagi derivanti da YS da citometria a flusso

NOTA: Questo protocollo è stato ottimizzato utilizzando un citometro a flusso laser 4 eqDotato di un laser viola 405 nm, di un laser blu a 488 nm, di un laser giallo da 562 nm e di un laser rosso da 638 nm.

1. Preparare le perle di compensazione per ogni anticorpo accoppiato seguendo le istruzioni del produttore. Utilizzare campioni non colorati e perle di compensazione per ottimizzare le intensità laser.
2. Per identificare i confini delle porte, utilizzare controlli FMO (Fluorescenza meno uno) per ciascun anticorpo.
3. Al fine di escludere le cellule morte, aggiungere 1 μL di DAPI (1 mg / ml) al tubo (contenente 200 μL di sospensione cellulare) 1 min prima dell'acquisizione. Utilizzare il forte segnale DAPI e il parametro sparso in avanti (FSC) per eseguire l'esclusione di cellule morte e detriti.
   NOTA: Utilizzare il software dal citometro di flusso per disegnare i cancelli durante l'acquisizione. La matrice di compensazione e l'analisi possono essere eseguite dopo l'acquisizione del campione utilizzando altri software commercialmente disponibili.
4. Utilizzare lo spostamento avanti e laterale (FSC vs SSC) per eseguire la discriminazione delle cellule vive e dei doppi dall'evento totale.
5. Creare grafici a punti di fluorescenza in asse log-scala e disegnare cancelli figlia, da un lato, esclude eritrociti (Ter119 ⁺⁾ e, quindi, per identificare le cellule progenitrici (Kit ⁺⁾ e cellule ematopoietiche (CD45 ⁺ Kit ^neg) (vedi figura 1).
6. Crea istogrammi di fluorescenza per quantificare l'efficacia di etichettatura della YFP tra le differenti popolazioni identificate nella YS ( Figura 2 ), nel fegato fetale ( Figura 3 ) e nel cervello ( Figura 4 ).

La mappatura del destino genetico è stata ottenuta mediante somministrazione a E8.5 di OH-TAM nelle femmine Csf1r-Mer-iCre-Mer accoppiate con maschi con un giornalista Rosa26-LSL-eYFP. In presenza di OH-TAM, l'escissione della cassetta di stop porta all'espressione permanente di YFP nelle cellule che esprimono Csf1r . Abbiamo raccolto due tessuti ematopoietici: il sacco di tuorlo e il fegato fetale e un tessuto non ematopoietico, il neuroectoderm, dagli embrioni a E10.5. Le sospensioni a cellule singole sono state ottenute per dissociazione enzimatica e meccanica ei campioni sono stati analizzati mediante citometria a flusso dopo la colorazione con anticorpi fluorescenti. Dopo l'esclusione di cellule morte e doppi, sono state analizzate sospensioni singole cellule ( Figura 1 ). Tutte le porte sono state definite con controlli Fluorescence Minus One (FMO). Si raccomanda inoltre di eseguire un'esclusione di eritrociti (cellule Ter119 ⁺ ) per migliorare la chiarezza dell'analisi ( Figura 1B ). Utilizzando il Kit marker di superficie cellulare (marker progenitor) e CD45 (marker di cellule ematopoietiche) abbiamo potuto distinguere tre popolazioni di cellule di interesse: Kit ⁺ CD45 ^neg ; Kit ⁺ CD45 ^basso e Kit ^neg CD45 ⁺ ( Figura 1 ). I progenitori sono stati ulteriormente analizzati sulla base della loro espressione di AA4.1 ( figure 2-4 ). Infatti, AA4.1 è un marcatore di superficie che consente l'arricchimento della popolazione progenitrice nei progenitori eritromielidi nel sacco di tuorlo, come dimostrato nei test di formazione della colonia ¹⁵ . Una volta identificate le popolazioni di interesse, abbiamo quantificato l'efficacia di etichettatura di YFP in ogni popolazione usando gli istogrammi. Tra il sacco vitellino Kit ⁺ progenitori, sia CD45 ^neg (Figura 2A) e popolazioni di cellule CD45 ^basso (Figura 2B) contenere cellule AA4.1 ⁺ YFP ^+. Tuttavia, AA4.1 ⁺ YFP + nel fegato e nel cervello sono presenti solo nella popolazione progenitrice ^bassa Kit ⁺ CD45 ( Figura 3B e 4B ). Poiché il cervello non è un sito attivo dell'ematopoiesi, i progenitori trovati in questo tessuto potrebbero corrispondere a progenitori circolanti. Ciò suggerisce anche un processo di maturazione del progenitore mentre migrano dal sacco di tuorlo al fegato fetale e ai tessuti periferici. Kit ⁺ progenitori esprimono espressamente AA4.1, indipendentemente dall'espressione CD45, ma nel momento in cui raggiungono la circolazione e il fegato fetale, tutti i progenitori AA4.1 ⁺ YFP ⁺ esprimono livelli rilevabili della superficie cellulare CD45. Macrofagi, definiti come F4 / 80 ^luminosi CD11b ⁺ , sono stati trovati nella porta ^negativa CD45 ⁺ ( figura 2-4 ). Macrofagi nel sacco di tuorlo E10.5, nel fegato e nel cervello sono stati etichettati in modo efficiente (60-80% di F4 / 80 le cellule ^luminose CD11b ⁺ sono YFP ⁺ ) b Ya singola amministrazione OH-TAM a E8.5 ( Figura 2C , 3C e 4C ).

Per confrontare l'efficacia di etichettatura tra i conigli, si consiglia di utilizzare un controllo interno per l'efficienza della ricombinazione. La variabilità nel livello di espressione del reporter può essere osservata tra gli esperimenti, a causa delle variazioni nel tempo di sviluppo tra litter e ceppi del mouse quando OH-TAM viene iniettato in utero . Quindi consigliamo che l'embrione di staminali da embrioni E8.5 a E11.5 sia eseguito con un conteggio di somite. In questo protocollo, si propone di utilizzare l'efficacia di etichettatura nei macrofagi residenti nel cervello (microglia) come riferimento per confrontare l'efficacia della ricombinazione Cre tra diversi esperimenti e ceppi ( Figura 4C ). Potrebbero essere utilizzati altri macrofagi residenti, tuttavia microglia erano le prime cellule da descrivere come macrofagi derivanti da saccarosio di vitelloEf>> 16 e rappresentano la popolazione più ricca di macrofagi residenti in tessuto a E10.5. Pertanto, l'etichettatura di YFP in microglia può essere usata per valutare l'efficacia di mappatura di fatica in ciascun esperimento e confrontare i dati di diverse leghe.

Figura 1: Strategia di diagnosi per identificare le cellule progenitrici (Kit ⁺ CD45 ^neg e Kit ⁺ CD45 a ^basso ) e cellule ematopoietiche differenziate (Kit ^neg CD45 ⁺ ). ( A ) La discriminazione di cellule vive e singole viene eseguita utilizzando i parametri DAPI colorazione e Forward e Side scatter (FSC / SSC). ( B ) Dopo l'esclusione dei globuli rossi (Ter119 ^neg ), sono identificate tre popolazioni di cellule di interesse basate sull'espressione della superficie cellulare di Kit e CD45: Kit ⁺ CD45 ^neg ; Kit ⁺ CD45 ^basso e Kit ^neg CD45 ⁺ . ( C ) Le cellule esprimenti Csf1r presenti quando viene iniettato OH-TAM e le loro progenie sono identificate negli embrioni positivi di Cre-recombinase come esprimono YFP rispetto agli embrioni negativi Cre-ricombinasi (confermati in seguito da un test di reazione a catena polimerica, PCR). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Efficacia di etichettatura nel sacco di tuorlo da E10.5 Csf1r ^MeriCreMer Rosa26 ^LSL-eYFP embryospulsati con OH-TAM a E8.5. ( A ) Le cellule ^{negate del} kit ⁺ CD45 sono gated in base all'espressione di Kit e CD45 sulle cellule di sacco vivo di tuorlo (cancello blu, pannello sinistro). AA4.1 e Kit di espressione sulle cellule ^neg Kit ⁺ CD45. Blue porta racchiude cellule ^neg Kit ⁺ CD45 (pannello centrale) AA4.1 ^+. Confronto di etichettatura YFP nelle cellule ^neg Kit ⁺ CD45 (pannello di destra) a Cre controlli negativi (nero) e campioni positivi Cre (verde) AA4.1 ^+. Gli istogrammi rappresentano la percentuale di celle (asse y) positivo per il segnale YFP (asse x). ( B ) I kit ^{bassi +} CD45 sono basati su kit e espressione CD45 (cancello blu, pannello sinistro). AA4.1 e espressione Kit sulle celle ^basse Kit ⁺ CD45. Il cancello blu racchiude EMP, come definito come celle ^basse AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 (pannello centrale). Confronto di etichettatura YFP in ^basse cellule AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 (pannello destro) nei controlli Cre negativi (nero) e Cre positivi (verde). Gli istogrammi rappresentano la percentuale di celle (asse y) positivo per il segnale YFP (asse x). ( C ) Le cellule ematopoietiche sono definite come Kit ^neg CD45 ^{+ e gated in blu (pannello sinistro). F4 / 80 e CD11b su cellule negativi CD45 + . Macrofagi sono definiti come F4 / 80 celle luminose CD11b + (pannello centrale). Confronto di etichettatura YFP in F4 / 80 lucidi CD11b + macrofagi (pannello destro) nei controlli Cre negativi (nero) e Cre positivi campioni (verde). Gli istogrammi rappresentano la percentuale di celle (asse y) positivo per il segnale YFP (asse x). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.}

Figura 3: Efficacia di etichettatura nel fegato da E10.5 Csf1r ^MeriCreMer Rosa26 ^LSL-eYFP embrionato con OH-TAM a E8.5. ( A ) Kit ⁺ CD45 ^neg negativi sono gated basati su Kit e CD45Espressione su cellule epatiche vive (cancello blu, pannello sinistro). AA4.1 e Kit di espressione sulle cellule ^neg Kit ⁺ CD45. Cancello blu racchiude AA4.1 ⁺ cellule CD45 ^neg (pannello centrale) Kit ^+. Confronto di etichettatura YFP nelle cellule ^neg Kit ⁺ CD45 (pannello di destra) a Cre controlli negativi (nero) e campioni positivi Cre (verde) AA4.1 ^+. Gli istogrammi rappresentano la percentuale di celle (asse y) positivo per il segnale YFP (asse x). ( B ) I kit ^{bassi +} CD45 sono basati su kit e espressione CD45 (cancello blu, pannello sinistro). AA4.1 e espressione Kit sulle celle ^basse Kit ⁺ CD45. Il cancello blu racchiude EMP, come definito come celle ^basse AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 (pannello centrale). Confronto di etichettatura YFP in ^basse cellule AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 (pannello destro) nei controlli Cre negativi (nero) e Cre positivi (verde). Gli istogrammi rappresentano la percentuale diCellule (asse y) positivo per il segnale YFP (asse x). ( C ) Le cellule ematopoietiche sono definite come Kit ^neg CD45 ⁺ e gated in blu (pannello sinistro). F4 / 80 e CD11b su cellule ^negativi CD45 ⁺ . Macrofagi sono definiti come F4 / 80 celle ^luminose CD11b ⁺ (pannello centrale). Confronto di etichettatura YFP in F4 / 80 ^lucidi CD11b ⁺ macrofagi (pannello destro) nei controlli Cre negativi (nero) e Cre positivi campioni (verde). Gli istogrammi rappresentano la percentuale di celle (asse y) positivo per il segnale YFP (asse x). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Efficacia di etichettatura nel cervello da E10.5 Csf1r ^MeriCreMer Rosa26 ^LSL-eYFP embryospuCon OH-TAM a E8.5. ( A ) Le cellule ^{nega del} kit ⁺ CD45 sono gated sulla base dell'espressione Kit e CD45 sulle cellule cerebrali vive (cancello blu, pannello sinistro). AA4.1 e Kit di espressione sulle cellule ^neg Kit ⁺ CD45. Cancello blu racchiude AA4.1 ⁺ cellule CD45 ^neg (pannello centrale) Kit ^+. Confronto di etichettatura YFP nelle cellule ^neg Kit ⁺ CD45 (pannello di destra) a Cre controlli negativi (nero) e campioni positivi Cre (verde) AA4.1 ^+. Gli istogrammi rappresentano la percentuale di celle (asse y) positivo per il segnale YFP (asse x). ( B ) I kit ^{bassi +} CD45 sono basati su kit e espressione CD45 (cancello blu, pannello sinistro). AA4.1 e espressione Kit sulle celle ^basse Kit ⁺ CD45. Il cancello blu racchiude EMP, come definito come celle ^basse AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 (pannello centrale). Confronto di etichettatura YFP in AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^basso (pannello destro) nei controlli Cre negativi (nero) e Cre positivi (verde). Gli istogrammi rappresentano la percentuale di celle (asse y) positivo per il segnale YFP (asse x). ( C ) Le cellule ematopoietiche sono definite come Kit ^neg CD45 ⁺ e gated in blu (pannello sinistro). F4 / 80 e CD11b su cellule ^negativi CD45 ⁺ . Macrofagi sono definiti come F4 / 80 celle ^luminose CD11b ⁺ (pannello centrale). Confronto di etichettatura YFP in F4 / 80 ^lucidi CD11b ⁺ macrofagi (pannello destro) nei controlli Cre negativi (nero) e Cre positivi campioni (verde). Gli istogrammi rappresentano la percentuale di celle (asse y) positivo per il segnale YFP (asse x). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Le diverse onde delle cellule precursori ematopoietiche si sovrappongono parzialmente in un breve lasso di tempo, il che rende tecnicamente molto impegnativo l'analisi del contributo di ogni onda di ematuria di sviluppo a cellule immunitarie.

I sistemi Cre creati da tamoxifene offrono l'opportunità di tagliare cellule specifiche in modo temporaneamente iniettato e di eseguire analisi di lineage in embrioni o adulti, senza la necessità di cultura ex vivo o in vitro o trapianto. Nei ceppi Cre creati da tamoxifene-inducibili, si crea un gene di fusione tra una recombinasi di Cre e batterica e una forma mutante del dominio legante del legante del recettore umano estrogeno (CRE-ER) o tra un recettore di un solo punto mutato Cre e due recettori del mielo estrogeno (Mer-iCRE-Mer). La fusione di Cre con i recettori dell'estrogeno porta al sequestro citoplasmatico di Cre da Hsp90, impedendo così la ricombinazione nucleare Cre-mediata. Tamoxifen (TAM) è metabolizzato da thIl fegato in 4-idrossidoxifene (OH-TAM), il suo metabolita attivo con elevata affinità di legame per il recettore dell'estrogeno. Il legame con OH-TAM alla fusione Cre porta alla rottura dell'interazione con Hsp90, permettendo la sua traslocazione al nucleo e l'iniziazione di Cre-mediata ricombinazione. L'iniezione di TAM o OH-TAM in utero nelle donne in gravidanza ha dimostrato di attivare la ricombinazione nell'embrione in via di sviluppo. La somministrazione di tamoxifene durante la gravidanza può portare ad un aborto e quindi ridurre la dimensione del lettiere, ma impedisce anche la nascita dopo la metà gestazione, nel qual caso è necessaria la consegna del cucciolo attraverso un'operazione cesarea. Per controbilanciare gli effetti del tamoxifene durante la gravidanza, aggiorniamo la somministrazione di OH-TAM con una mezza dose di progesterone, al fine di migliorare la sopravvivenza degli embrioni e ridurre il rischio di aborti ¹⁷ .

Diverse vie possono essere impiegate per consegnare TAM o OH-TAM in femmine in gravidanza. Attualmente gava oraleGe o intra peritoneale (ip) viene impiegata per tamoxifene. OH-TAM ha il vantaggio di essere immediatamente disponibile, in quanto non richiede di essere metabolizzato dal fegato della diga incinta. Tuttavia, mentre il tamoxifene è molto facile da dissolvere in olio di mais, OH-TAM è molto difficile da preparare usando la stessa tecnica e provoca un'emulsione. Questo è stato un passo limitante nell'impiego di OH-TAM per l'etichettatura di polso dell'utero . Abbiamo adattato il protocollo per la preparazione di OH-TAM sviluppato dal gruppo di JF Nicolas ¹³ , dove usano olio di ricino PEG-35, un solvente con proprietà amfifiliche per solubilizzare OH-TAM, poiché la dissoluzione del tamoxifene è una delle fasi più critiche Nella procedura. Ciò consente una preparazione ripetibile e ottimale di OH-TAM e riduce considerevolmente il tempo di preparazione del tamoxifene. Inoltre, è necessario adattare la concentrazione di OH-TAM per iniettare quando si utilizzano diversi tipi di ceppi Cre. La combinazione di un colorante di vitalità (DAPI) e dimensione (FSC) è fondamentale per rimuovere le cellule morte e detriti cellulari, rispettivamente. Celle morti e detriti sono altamente autofluorescenti nella maggior parte dei rivelatori laser viola, blu e rossi e possono ostacolare l'analisi citometrica a flusso. Inoltre, non consigliamo di fissare le celle dopo la colorazione prima dell'analisi con il citometro di flusso. La fissazione può portare a cambiamenti nella morfologia delle cellule e rende pertanto difficile la discriminazione delle dimensioni basata su Forward e Side Scatter (FSC vs SSC). Inoltre, la fissazione di campioni con PFA porta ad una perdita significativa dell'intensità fluorescente di YFP.

La limitazione principale all'interno di questo protocollo è che le popolazioni non sono testate sulla loro funzionalità e sul potenziale di differenziazione. Al fine di superare questo, le cellule possono essere ordinate seguendo un protocollo simile utilizzando un fluorescente-attivato cellule sorter (FACS) per eseguire colonia-formando il saggio. In questo caso, la procedura deve essere eseguita in condizioni sterili e l'uso di siero fetale fetale (FBS) nel buffer FACS, anziché BSA, è altamente raccomandato. La bassa efficacia di etichettatura ottenuta con questa tecnica e il conseguente basso numero di cellule di interesse YFP ⁺ per tessuto embrionale è una sfida importante nello studio del fenotipo dell'EMP. Questo protocollo utilizza un citometro a flusso a 4 laser. È inoltre possibile utilizzare un citometro a flusso con 3 laser, ma è importante adattare il pannello anticorpale per tener conto dell'aumento della sovrapposizione spettrale tra i coloranti. Inoltre, la titolazione degli anticorpi è necessaria per trovare la concentrazione appropriata quando si modifica il pannello anticorpale e si consiglia di effettuare titolazione degli anticorpi e la convalida del nuovo pannello anticorpale in un esperimento pilota in cui tutti gli embrioni per tessuto vengono riuniti, al fine di aumentare il numero di Cellule analizzate per tessuto.

Il campo della biologia dello sviluppo è stato rivoluzionato dal metodo Cre / Lox, che consente l'etichettatura permanente delle cellule in situ . Questo approccio raggiungeSpecifico di tessuto o di cellule mediante espressione della Cre ricombinasi sotto il controllo di un promotore specifico. Nel nostro caso, abbiamo scelto di studiare l'espressione della Cre-ricombinasi sotto il controllo del promotore di Csf1r (Colony Stimulating Factor 1 Receptor), un importante fattore mitogeno e fattore di crescita per i macrofagi ei loro progenitori, utilizzando un ceppo sviluppato dal gruppo Di J. Pollard ¹⁸ . Il vantaggio di una strategia di mappatura di sfortuna basata sull'espressione di Csf1r rispetto ad altre strategie pubblicate è che consente l'etichettatura di cellule ottenute da sacchi di tuorlo (EMP e macrofagi) senza etichettare qualsiasi HSCs fetale ¹² . Il ceppo Creered2 ^Cx3cr1 può anche etichettare le cellule ^{saciche di} tuorlo senza etichettatura di HSCs ¹⁹ , tuttavia può solo etichettare i macrofagi e i precursori del macrofago, ma non contrassegna i progenitori EMP ¹ . Il ceppo Cx3cr1 ^CreERT2 ha lo stesso caveat del Csf1r ^{La linea MerCreMer, in quanto non riesce a distinguere tra macrofagi derivanti da progenitori primitivi macrofagi unipotenti o da EMP. Quando tamoxifene viene somministrato già in E7.5 sia in Runx1 MerCreMer 16 che in Kit MerCreMer 20 , le cellule del sangue periferico sono sempre etichettate negli adulti, anche se ad un rendimento molto basso, dimostrando così l'etichettatura di HSC durante lo sviluppo. Inoltre, Kit MerCreMer suddivide mappe etichette yolk sac Kit + Sca1 + progenitori mentre EMP sono Kit + Sca1 negativo 11 . Il ceppo MterCreMer di Csf1r non è un bussare ma è stato generato dalla transgenesi addizionale classica, quindi l'espressione del Cre non può ricapitolare completamente l'espressione endogena di Csf1r. Tuttavia, questo ha il vantaggio di evitare eventuali difetti di sviluppo evolutivi a causa dell'espressione eterozigote di Csf1r. Questo è un fattore importante da tenere in conto durante l'analisiAltre strategie di mappatura di fatti utilizzate per gli studi di sviluppo ematopoietico, come Runx1 MerCreMer , Kit MerCreMer e Cx3cr1 CreERT2 , dove è inserito il Cre indicibile nel loco endogeno. Per Runx1 MerCreMer e Kit MerCreMer sono stati descritti difetti ematopoietici dello sviluppo in embrioni eterozigoti. Insieme, il metodo qui presentato consente di indagare la biologia di sacco di tuorlo durante lo sviluppo e anche i macrofagi derivati ​​dal tuorlo di zucchero trovati nei tessuti adulti e distinti dai macrofagi derivanti da HSC. Ciò migliorerà la nostra attuale comprensione di questa linea di macrofagi residenti e delle loro funzioni specifiche in età adulta. La caratterizzazione immunofenotipica degli EMP è stata migliorata recentemente utilizzando saggi di selezione delle cellule e colonie, dimostrando che il tuorlo sac EMP espressamente esprime CD41 e CD16 / 32 nelle prime fasi di sviluppo 11 . Tuttavia, la specificità dell'espressione del CD41E CD16 / 32 necessita di ulteriori caratterizzazione da E10.5 in poi, specialmente nella nicchia del fegato fetale, utilizzando modelli di mappatura di fatti. Infatti, se l'espressione CD41 e CD16 / 32 è ancora specifica per EMP se confrontata con HSCs fetali e progenitori derivati ​​da HSC nel E10.5-E14.5 fegato fetale, occorre chiarire. Il metodo presentato consente di etichettare l'EMP generato nel sacco di tuorlo e di seguirli durante lo sviluppo embrionale e contribuirà ad una caratterizzazione più dettagliata del fenotipo EMP quando seminano il fegato fetale.}

Questo metodo potrebbe essere importante nel prossimo futuro per studiare percorsi di differenziazione dell'EMP. Mentre gli EMP emergono dall'endotelio sacro di tuorlo da E8,5 a E10,5 4, questo metodo consente solo di etichettare una frazione dei progenitori emergenti tra E8.5-E9.5. Pertanto, una limitazione di questo metodo è che solo una piccola frazione di EMP è etichettata, rendendo così difficile l'analisi negli studi classici di perdita di funzioni con alleli bloccati per cAndidate i geni. In alternativa, l'etichettatura sparse potrebbe diventare un vantaggio negli studi clonali della differenziazione EMP in vivo , utilizzando il reporter clonale. Tuttavia, l'efficienza di etichettatura deve essere caratterizzata per ogni reporter flouted o allele floccato utilizzato, in quanto l'efficacia di ricombinazione dei costrutti floated dipende da locus genomico (alleli bloccati) o dal costruttore reporter Rosa26. Infatti, sono disponibili diverse linee di reporter Rosa26 con diversi promotori ed è stato riferito che il ceppo ^{Rosa26 tdTomato} e Rosa26 ^mTmG hanno un'efficienza di ricombinazione più elevata rispetto alla linea Rosa26 ^LSL-eYFP . Il ceppo del mouse reporter utilizzato in questo protocollo è la linea Rosa26 ^LSL-eYFP , che non può fornire informazioni sul processo dinamico della maturazione progenitore menzionata nella sezione risultati. La questione del processo di maturazione può essere parzialmente affrontata utilizzando differenti ceppi di reporter come la Rosa26 ^mTmG . In tale ceppo, le cellule possono distingueZato in base al tempo trascorso dall'evento di ricomposizione. Tutte le cellule del ceppo Rosa26 ^mTmG esprimono la proteina fluorescente tdTomato legata alla membrana e Cre ricombinazione eccede la cassetta tdTomato e consente l'espressione di GFP legato alla membrana. Dal momento che tdTomato ha una lunga emivita, le celle che contengono ancora tdTomato ma hanno iniziato ad esprimere la GFP (poco dopo la ricombinazione) sono tdTomato ⁺ GFP ^{bassa / int} e può essere distinto da tdTomato ^neg GFP ⁺ cellule che non esprimono più tdTomato e Esprimere livelli superiori di GFP (successivamente dopo la ricombinazione).

Come sopra discusso, la preparazione OH-TAM è un passo fondamentale per fornire costantemente dosi simili di OH-TAM tra gli esperimenti e per ridurre gli effetti collaterali di tamoxifene. La somministrazione di progesterone è utile anche per limitare l'effetto deleterio del tamoxifene sulla gravidanza. Un altro elemento critico del protocollo è la redditività della sospensione singola cellulaN ottenuto da diversi tessuti embrionali. Solitamente otteniamo> 90% di cellule vitali per l'analisi citometrica a flusso. Per raggiungere questo obiettivo, è fondamentale seguire rapidamente tutti i passi e mantenere tutti i campioni in ghiaccio dopo la raccolta dei tessuti. Sono necessari controlli appropriati, come campioni non conservati, singole macchie e fluorescenti meno uno (FMO) per identificare i confini delle porte e per controllare la sovrapposizione spettrale nei pannelli multicolori. Le modifiche dell'anticorpo devono essere convalidate in termini di titolazione degli anticorpi e sovrapposizione di spettri. Infine, la scelta del ceppo del giornalista Rosa26 deve essere adattata alla domanda scientifica che viene indagata.

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Gli autori ringraziano Prof. Frederic Geissmann e Prof. Christian Schulz per approfondite discussioni; Dr Hannah Garner per la lettura critica del manoscritto, il dottor Xavier Montagutelli e il dottor Jean Jaubert e il personale dell'istituzione degli animali Institut Pasteur per il sostegno con la gestione del mouse; E Pascal Dardenne e Vytaute Boreikaite, un Amgen Scholar, per la loro assistenza tecnica. La ricerca nel laboratorio EGP è finanziata dall'Istituto Pasteur, dal CNRS, dal Cercle FSER (FRM e da un pacchetto iniziale dell'Istituto Pasteur e dal consorzio REVIVE. LI è sostenuto da una borsa di studio del consorzio REVIVE.