通过流式细胞术鉴定小鼠胚胎中的红细胞生成素及其后代

当浸润的巨噬细胞从循环前体连续招募到成体组织时，驻留的巨噬细胞在发育过程中种植其组织，在那里它们被维持而无需进一步从祖细胞输入。最近确定了居民巨噬细胞的祖细胞。在这里，我们提出了驻地巨噬细胞祖细胞的遗传命运映射方法。

巨噬细胞是免疫系统固有的专业吞噬细胞。在稳态状态下，无性巨噬细胞在成体组织中发现，其中它们作为感染和组织损伤的前线哨点。虽然其他免疫细胞从位于骨髓中的造血干细胞和祖细胞（HSPC）不断更新，但已经显示出巨噬细胞谱系，被称为驻留巨噬细胞，而不是从骨髓HSPC输入的组织中自我维持。这个谱系的例子是脑中的小胶质细胞，肝脏中的枯否细胞和表皮中的朗格汉斯细胞等。肠和结肠固有层是唯一没有HSPC独立的巨噬细胞的成体组织。最近的研究已经确定，存在的巨噬细胞来自不同于胎儿造血干细胞（HSC）的祖细胞的胚外卵黄囊造血。在卵黄囊定型造血中，红细胞生成素祖细胞（EMP）会引起红细胞和骨髓细胞，特别是驻极体巨噬细胞。 EMP仅在发育E8.5和E10.5天之间的蛋黄囊内产生，并且早在循环连接时迁移到胎肝，其中它们扩展和分化直到至少E16.5。他们的后代包括红细胞，巨噬细胞，嗜中性粒细胞和肥大细胞，但只有EMP来源的巨噬细胞持续到组织中成年。 EMP出现的瞬态性和与HSC生成的时间重叠使得这些祖细胞的分析困难。我们建立了基于巨噬细胞因子受体Csf1r启动子表达的他莫昔芬诱导的命运映射方案，通过流式细胞术在体内表征EMP和EMP来源的细胞。

造血祖细胞在发育过程中有几个相继但重叠的波浪，其骨髓后代保持成年。首先，单能的"原始"祖细胞出现在E7.5-E8.25之间鼠标卵黄囊^1,2和产生胚胎的巨噬细胞而没有任何单核细胞的中间。来自原始祖细胞的巨噬细胞是否持续存在于成年大脑中，因为小神经胶质细胞仍然是主动调查的一个主题。第二，红血球前体（EMPs）出现在E8.5的卵黄囊中，进入血液并定殖胚胎。从环境管理计划卵黄囊hemogenic内皮在Runx1的依赖性的内皮到造血过渡^3,4出现。虽然EMP可以分化成卵黄囊中的巨噬细胞，但它们也从胚胎期（E）9 ⁵定殖于胎肝，并且不同分化成红细胞，巨核细胞，巨噬细胞，单核细胞粒细胞和肥大细胞⁶ 。来自EMP的巨噬细胞在发育和成体组织中表现出增殖能力。是否EMP源性巨噬细胞分化绕过的单核细胞级仍有争议非常知之甚少其分化途径^7,8。最后，造血干细胞（HSCs）在E10.5出现在主动脉 - 性腺 - 中肾区域内的胚胎中，并迁移到胎儿肝脏。长期再增殖能力的HSC仅检测到E11后（在42体节对阶段^）9。在那里，他们扩大和区分E12.5直到明确的造血开始转移到骨髓，这在产后生活期间成为血细胞生产的主要部位¹⁰ 。

sp妊娠和时间重叠的出现以及共同的免疫表型标志物迄今阻碍了我们区分这些胚胎造血祖细胞波的特异贡献的能力。虽然EMP和HSC都以Runx1依赖性方式产生，并表达转录因子Myb和生长因子受体Csf1r（集落刺激因子1受体，也称为巨噬细胞集落刺激因子受体）等，EMP可以区分为HSC由于缺乏淋巴细胞的潜力， 体外和体内都缺乏长期的重建潜力，缺乏表型谱系Sca- ^11的表达 。需要遗传命运映射模型来表征巨噬细胞个体发育，因为它们允许以细胞特异性和时间特异性方式靶向胚胎祖细胞。我们在这里介绍我们实验室使用的命运映射协议来区分两个谱系在大多数成年组织中发现的巨噬细胞:HSC衍生的浸润巨噬细胞和不依赖HSC的宿主巨噬细胞。

组织定居巨噬细胞已被追溯到表达细胞因子受体¹² CSF1R的Myb独立前体细胞和存在于使用三个互补命运-映射策略⁶在E8.5-E10.5胚胎。为了研究没有标记胎儿HSC的卵黄囊造血，我们使用转基因株式Cs r ^r r ^re re ^re er ^er of of of of of of of of of of of of of of of of of of of of of of of of of of of of of of of of of of of of Csf1r启动子。因此，Cre重组酶在有限的时间窗口内将在Csf1r表达细胞中活跃。当与含有lox-STOP-lox盒（Rosa26 ^LSL-eYFP ）下游的荧光蛋白的报道菌株一起使用时，它将导致永久性在诱导时存在的细胞的遗传标记，也是其后代。给予E8.5活性形式的他莫昔芬，4-羟基他莫昔芬（OH-TAM），标记EMP和巨噬细胞，而不标记卵黄囊单能"原始"祖细胞或胎儿HSC。因此，我们已经描述了胚胎发育过程中EMPs及其后代的免疫表型，并评估了卵黄囊衍生的巨噬细胞对成年巨噬细胞池的贡献。需要进一步的工作来表征原始祖细胞来源的巨噬细胞是否也使用这种方法进行标记，以及它们是否可以促成成年巨噬细胞池。

根据巴斯德研究所（CETEA）批准的机构动物护理和使用委员会进行动物手术。

1. 在 CSF1R ^MeriCreMer 罗莎 ^LSL-YFP胚胎子宫脉冲标记

1. 准备4-羟基他莫昔芬（OH-TAM，50 mg / mL）的储备溶液。
   1. 在通风柜下，打开25毫克小瓶的OH-TAM，加入250μL乙醇（100％）。
   2. 将OH-TAM溶液转移到具有截头的2mL微量离心管中，并以最大速度涡旋10分钟。
   3. 在超声波浴中超声30分钟。
   4. 在通风柜内加入250μL的PEG-35蓖麻油，得到50mg / mL的储备溶液。
      注意:PEG-35蓖麻油是具有两亲性质的溶剂，其结合疏水性分子并将其溶解在含水溶剂中。
   5. 漩涡约5分钟在超声波浴中以最大速度超声处理30分钟。
   6. 每个微量离心管（每次注射1次）分装90μL（4.5mg）。
   7. 储存于4℃下放置1周或在-20℃下长期先前描述的^13。
2. 准备孕酮（10mg / mL）
   1. 向25mg孕酮中加入250μL的100％乙醇以在通风柜下制备10mg /100μL悬浮液。轻轻旋转
   2. 加入2250μL高压消毒的向日葵油，在罩下制成10mg / ml孕酮溶液。
   3. 以最大速度涡旋约5分钟，等分并储存在4°C。请注意，存储时解决方案是清晰的。
3. 他莫昔芬
   注意:胚胎发育估计考虑阴道栓塞形成的日子为胚胎日（E）0.5。 E8.5单次注射诱导重组进入孕妇Csf1r ^MeriCreMer女性 ¹² 。补充OH-TAM与37.5μg/ g孕酮，以降低他莫昔芬给药后的流产率。下午1点注射（早晨观察阴道塞）。
   1. 在注射的早晨，将OH-TAM溶液的等分试样超声处理10分钟（或直到完全重悬）。
   2. 在通风柜内加入360μLNaCl 0.9％，得到10mg / mL OH-TAM溶液，并彻底涡旋。超声处理直到溶液澄清并完全重悬（至少30分钟）。
   3. 预热孕酮至室温。
   4. 在微量离心管中混合450μL的OH-TAM和225μL的孕酮。涡流。
   5. 超声处理至少10分钟，并用25G针装入1 mL注射器。
   6. 在动物设施中，称重怀孕的雌性（ Csf1r ^MeriCreMer女性处于近交的FVB遗传背景和典型的体重en 25和33g）。
   7. 通过将计算出的体积缓慢注入鼠标来进行腹膜内注射。取出针后，轻轻按压穿刺伤口，按摩腹部分布OH-TAM。
      注意:OH-TAM注射剂量为75 mg / kg，孕酮剂量为37.5 mg / kg。 表1提供注射到怀孕女性的体积。

表1:4-OH-他莫昔芬（OH-TAM）的注射体积。单次注射的单次注射量为75μg/ g（体重）的补充有37.5μg/ g孕酮的OH-TAM。

2.卵黄囊（YS）和胎肝（FL）的解剖

注意:严格的无菌技术在操作胚胎时是不必要的，除非它们将被用于长期培养。然而，工作区域必须清洁，并在吸收纸上覆盖箔。

1. 制备冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）和消化混合物（含有1mg / mL胶原酶D，100U / mL脱氧核糖核酸酶I（DNase I）和3％胎牛血清的PBS）。
2. 牺牲怀孕的女性由cer在所需的妊娠日（ 例如胚胎阶段E10.5）的动脉脱位。
3. 将皮肤紧贴在生殖器上，并用剪刀在中线做一个小切口。将皮肤拉向头部，完全暴露身体，无毛皮。切开腹肌露出内脏，推动肠道露出两个子宫角。
4. 用中等大小的镊子抓住附着在卵巢上的脂肪垫，轻轻拉出子宫。在子宫颈的颈部切开并从腹腔抬起角。去除脂肪垫以完全释放子宫角，并从每侧的卵巢切割角。
5. 将角状物置于10毫米培养皿中的冰冷PBS中。在一个末端（颈部末端）快速抓住子宫肌层，并在肌肉层和蜕膜组织之间滑动精细剪刀，以释放与周围蜕膜组织的胚胎。
   注意:肌肉倾向于快速收缩提取，所以这一步必须尽可能快。
6. 使用一对细镊子切断Reichert膜和胎盘。
7. 轻轻取出卵黄囊，并将其置于含有0.5mL消化混合物的24孔组织培养板中。
   注意:在这一步，可以收集胚胎血液。
   1. 在切断脐带和卵黄血管后立即将胚胎转移到含有10mM冰冷的乙二胺四乙酸（EDTA）的12孔组织培养板中。使用锋利的精细剪刀斩断胚胎，尽量限制组织扩张。在冰上孵育10-15分钟，收集含有血液的EDTA。
8. 取出胚胎周围的羊膜
9. 对于阶段
10. 切胚胎我们的头镊子或精剪刀。将头部转移到具有0.5mL消化混合物的24孔板中。
    注意:进一步解剖晚期阶段的神经外胚层和脑，用于流式细胞术分析;小心清除周围血管丛。
11. 切割后肢上方的胚胎并移除前肢。
12. 要隔离肝脏，用一对精细的镊子打开胸部。夹住心脏前方，轻轻拉动，同时使用第二镊子将器官从身体释放出来。
    1. 仔细分离胎儿肝脏与心脏和肠道。将胎肝转移到具有0.5mL消化混合物的24孔板中。仔细监测解剖显微镜下的转移。
13. 通过聚合酶链反应测定（PCR）收集尾区（或任何其他胚胎部分）进行基因分型。
    注意:可以从E10.5胚胎收获其他组织和器官，以使用流式细胞术进行类似的分析。血，头滑雪n，主动脉 - 性腺 - 中肾区（AGM），心脏和神经外胚层可以在E10.5收集。在晚期阶段，也可以收集肺，肾，脾和胰腺。以前描述了不同发展阶段AGM解剖的详细描述¹⁴ 。

3.流式细胞术的胚胎组织加工

1. 在37℃下将器官（置于消化混合物中）孵育30分钟。
2. 将组织和酶溶液转移到置于装有6ml FACS缓冲液（0.5％牛血清白蛋白（BSA））和2mM EDTA的1×PBS中的6孔组织培养板中的100μm筛管上。通过用2mL注射器的黑色橡胶活塞轻轻地糖化来机械解离以获得单细胞悬浮液。
   注意:从现在开始，所有步骤应在4°C进行。
3. 用巴斯德移液管收集细胞悬浮液，并转移到15 mL管中。
4. SPI在4℃下，320℃，n进行7分钟。通过抽吸弃去上清液。
5. 将沉淀物重悬于60μLFc阻断缓冲液（CD16 / CD32阻断抗体，在FACS缓冲液中稀释1/50）。
   1. 将50μL单孔细胞悬浮液每孔转移到圆底96多孔板中。在冰上孵育至少15分钟。
      注意:处理少量样品时，也可以在5 mL聚苯乙烯FACS管中进行染色。
   2. 将剩余的10μL转移到5 mL聚苯乙烯FACS管中，以获得每个组织的样品池。该池将用作对照（ 即每个荧光染料的未染色样品和荧光减去一个（FMO）对照）。将每个荧光灯减去一个（FMO）对照（每个荧光染料一个）50μL的池转移到96多孔板。
      注意:每个FMO对照包含来自抗体面板的所有荧光染料偶联抗体，除了该抗体正在测量。 FMO用于识别门边界，并控制多色面板中的光谱重叠。为了正确地解决不同组织之间的背景和自发荧光的变化，重要的是从每个组织的样品池中制备这些对照。 YFP表达的适当对照是来自Cre阴性胚胎的样品，通过PCR基因分型证实。

表面抗原染色

1. 在FACS缓冲液中制备抗体混合物（表2）。每个样品准备50μL抗体混合物。
   1. 使用以下荧光染料偶联的抗体:抗CD45.2（克隆104）;抗CD11b（克隆M1 / 70）;抗F4 / 80（克隆BM8）;抗AA4.1（克隆AA4.1）;抗体试剂盒（克隆2B8）;和抗Ter119（克隆Ter119）。
   2. 在FACS缓冲液中为FMO对照制备六种抗体混合物。每个对照样品准备50μL抗体混合物。
      没有TE:抗体混合物中的抗体稀释浓度比材料表中指定的最终浓度高两倍。对于具有6个荧光染料偶联抗体的小组，制备6个FMO对照。 表2提供了一个管的抗体混合物和FMO对照的组成。

表2:用于染色和荧光减1（FMO）对照的抗体体积。最终体积为50μL所需抗体积（μL）。

2. 向96孔多孔板中的样品中加入50μL抗体混合物（染色时的最终体积为100μL）。轻轻移液两次，并在冰上孵育30分钟。
3. 在4℃下以320×g旋转96孔多孔板7分钟，弃去上清液。重悬于200μLFACS缓冲液中。
4. 用150μLFACS缓冲液重复洗涤步骤（步骤4.3）两次。
5. 将样品和对照（FMO和未染色的池样品）通过70μm过滤器过滤到5 ml聚苯乙烯管中。存放在冰上直到获得。

5.通过流式细胞术鉴定EMP和YS衍生的巨噬细胞

注意:该协议使用4激光流式细胞计数器等式进行了优化使用405nm紫激光，488nm蓝色激光，562nm黄色激光和638nm红色激光。

1. 按照制造商的说明准备每个偶联抗体的补珠。使用未染色的样品和补偿珠来优化激光强度。
2. 为了识别门边界，对每个抗体使用FMO（荧光减去一个）对照。
3. 为了排除死细胞，在获取前1分钟向管（含有200μL染色细胞悬液）中加入1μLDAPI（1mg / ml）。使用强DAPI信号和前向散射参数（FSC）来排除死细胞和碎屑。
   注意:使用流式细胞仪的软件在采集过程中绘制门。补偿矩阵和分析可以在使用其他市售软件进行采样后进行。
4. 使用前向和侧向散射（FSC vs SSC）来执行活体细胞和双倍体歧视从总事件。
5. 在对数刻度轴上创建荧光点图，绘制子门，首先排除红细胞（Ter119 ⁺ ），然后识别祖细胞（Kit ⁺ ）和造血细胞（CD45 ⁺ Kit ^neg ）（参见图1 ）。
6. 创建荧光直方图以量化YS（ 图2 ），胎肝（ 图3 ）和脑（ 图4 ）中不同确定群体之间YFP的标记效率。

通过将OH-TAM的E8.5施用于与携带Rosa26-LSL-eYFP报告物的雄性配对的Csf1r-Mer-iCre-Mer雌性中实现遗传命运测绘。在存在OH-TAM的情况下，切除盒可导致表达Csf1r的细胞中YFP的永久表达。我们从E10.5的胚胎收集了两个造血组织:卵黄囊和胎肝以及非造血组织（神经外胚层）。通过酶学和机械解离获得单细胞悬浮液，并用荧光偶联抗体染色后通过流式细胞术分析样品。排除死细胞和双倍体后，分析单细胞悬浮液（ 图1 ）。所有门均使用荧光减少一（FMO）对照进行定义。建议还要执行红细胞排除（Ter119 ⁺细胞）以提高分析的清晰度（ 图1B ）。使用细胞表面标记Kit（祖细胞标记）和CD45（造血细胞标记），我们能够区分感兴趣的细胞的三个群体:Kit ⁺ CD45 ^neg ; Kit ⁺ CD45 ^低和Kit ^neg CD45 ⁺ （ 图1 ）。根据AA4.1的表达进一步分析祖细胞（ 图2-4 ）。实际上，AA4.1是一种表面标记物，其可以在蛋黄囊中的红细胞生成祖细胞内富集祖细胞群，如菌落形成试验^15所示 。一旦确定了感兴趣的群体，我们使用直方图量化每个群体的YFP标记效率。在卵黄囊Kit ⁺祖细胞中，CD45 ^阴性 （ 图2A ）和CD45 ^低 （ 图2B ）细胞群含有AA4.1 ⁺ YFP ⁺细胞。但是，AA4.1 ⁺ YFP ⁺ CD45 ^低祖细胞中发现（ 图3B和4B ）。由于大脑不是造血的活跃部位，在这种组织中发现的祖细胞可能对应于循环的祖细胞。这也表明当他们从卵黄囊迁移到胎肝和外周组织时，祖细胞成熟的过程。 Kit ⁺祖细胞首先表达AA4.1，与CD45表达无关，但是当它们达到循环和胎肝时，所有AA4.1 ⁺ YFP ⁺祖细胞表达可检测水平的细胞表面CD45。在Kit ^neg CD45 ⁺门中发现巨噬细胞，定义为F4 / 80 ^亮 CD11b ⁺ （ 图2-4 ）。 E10.5卵黄囊，肝脏和脑中的巨噬细胞被有效标记（60〜80％的F4 / 80 ^亮 CD11b ⁺细胞为YFP ⁺ ）b在E8.5中单次施用OH-TAM（ 图2C ， 3C和4C ）。

为了比较芯片之间的标签效率，我们建议使用重组效率的内部控制。在实验之间可以观察到报告基因表达水平的变异性，这是由于当在子宫内注射OH-TAM时，胚胎与小鼠品系之间发育时间的变化。因此，我们建议胚胎分期从E8.5到E11.5胚胎是通过体细胞计数进行的。在本方案中，我们建议使用脑驻极体巨噬细胞（小胶质细胞）中的标记效率作为比较不同实验和菌株之间Cre重组效率的参考（ 图4C ）。可以使用其他驻极体巨噬细胞，但小胶质细胞是首先被描述为卵黄囊衍生巨噬细胞的细胞ef"> 16，它们代表E10.5组织中存在巨噬细胞的最丰富的群体，因此，小胶质细胞中的YFP标记可用于评估每个实验中的命运映射效率，并比较不同细胞的数据。

图1:鉴定祖细胞（Kit ⁺ CD45 ^neg和Kit ⁺ CD45 ^低 ）和分化造血细胞（Kit ^neg CD45 ⁺ ）的门控策略。 （ A ）使用DAPI染色和正向和侧向散射（FSC / SSC）参数进行活细胞和单体的鉴别。 （ B ）根据红细胞排除（Ter119 ^neg ），基于Kit和CD45:Kit ⁺ CD45 ^neg的细胞表面表达鉴定了三个感兴趣的细胞群; Kit ⁺ CD45 ^低 和Kit ^neg CD45 ⁺细胞。 （ C ）当注射OH-TAM时存在的Csf1r表达细胞，并且它们的后代在Cre重组酶阳性胚胎中被鉴定为与Cre重组酶阴性胚胎相比表达YFP（通过聚合酶链反应测定，PCR证实）。 请点击此处查看此图的较大版本。

图2:来自E10.5 ^Csf1r MeriCreMer Rosa26 ^LSL-eYFP卵黄囊的标记效率在E8.5时用OH-TAM进行胚胎刺激。 （ A ）Kit ⁺ CD45 ^neg细胞基于Kit和CD45在活卵黄囊细胞上的表达（蓝门，左图）门控。在Kit ⁺ CD45 ^neg细胞上的AA4.1和Kit表达。蓝光e门包围AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^neg电池（中间面板）。在Cre阴性对照（黑色）和Cre阳性样品（绿色）中比较AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^阴性细胞中YFP标记（右图）。直方图表示YFP信号（x轴）为正的细胞百分比（y轴）。 （ B ）Kit ⁺ CD45 ^低细胞基于Kit和CD45表达门控（蓝门，左图）。在Kit ⁺ CD45 ^低细胞上的AA4.1和Kit表达。蓝门包围EMP，定义为AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^低电池（中间面板）。在Cre阴性对照（黑色）和Cre阳性样品（绿色）中比较AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^低细胞（右图）中YFP标记。直方图表示YFP信号（x轴）为正的细胞百分比（y轴）。 （ C ）造血细胞定义为Kit ^neg CD45 ^{+并选择蓝色（左图）。上套件NEG CD45 +细胞F4 / 80和CD11b表达。巨噬细胞定义为F4 / 80 明亮 CD11b +细胞（中图）。在Cre / C阴性对照（黑色）和Cre阳性样品（绿色）中比较F4 / 80 明亮 CD11b +巨噬细胞（右图）中YFP标记。直方图表示YFP信号（x轴）为正的细胞百分比（y轴）。 请点击此处查看此图的较大版本。}

图3:来自E10.5 ^Csf1r MeriCreMer Rosa26 ^LSL-eYFP肝脏的标记效率在E8.5时用OH-TAM进行胚胎刺激。 （ A ）Kit ⁺ CD45 ^neg细胞基于Kit和CD45门控在活肝细胞上表达（蓝门，左图）。在Kit ⁺ CD45 ^neg细胞上的AA4.1和Kit表达。蓝门包围AA4.1 ⁺套件⁺ CD45 ^负电池（中间板）。在Cre阴性对照（黑色）和Cre阳性样品（绿色）中比较AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^阴性细胞中YFP标记（右图）。直方图表示YFP信号（x轴）为正的细胞百分比（y轴）。 （ B ）Kit ⁺ CD45 ^低细胞基于Kit和CD45表达门控（蓝门，左图）。在Kit ⁺ CD45 ^低细胞上的AA4.1和Kit表达。蓝门包围EMP，定义为AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^低电池（中间面板）。在Cre阴性对照（黑色）和Cre阳性样品（绿色）中比较AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^低细胞（右图）中YFP标记。直方图代表百分比YFP信号（x轴）的单元（y轴）为正。 （ C ）造血细胞定义为Kit ^neg CD45 ^+，并以蓝色门控（左图）。上套件^NEG CD45 ⁺细胞F4 / 80和CD11b表达。巨噬细胞定义为F4 / 80 ^明亮 CD11b ⁺细胞（中图）。在Cre / C阴性对照（黑色）和Cre阳性样品（绿色）中比较F4 / 80 ^明亮 CD11b ⁺巨噬细胞（右图）中YFP标记。直方图表示YFP信号（x轴）为正的细胞百分比（y轴）。 请点击此处查看此图的较大版本。

图4:来自E10.5 ^Csf1r MeriCreMer Rosa26 ^LSL-eYFP胚胎的脑中的标记效率在E8.5被OH-TAM淘汰。 （ A ）Kit ⁺ CD45 ^neg细胞基于活体脑细胞上的Kit和CD45表达（蓝门，左图）门控。在Kit ⁺ CD45 ^neg细胞上的AA4.1和Kit表达。蓝门包围AA4.1 ⁺套件⁺ CD45 ^负电池（中间板）。在Cre阴性对照（黑色）和Cre阳性样品（绿色）中比较AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^阴性细胞中YFP标记（右图）。直方图表示YFP信号（x轴）为正的细胞百分比（y轴）。 （ B ）Kit ⁺ CD45 ^低细胞基于Kit和CD45表达门控（蓝门，左图）。在Kit ⁺ CD45 ^低细胞上的AA4.1和Kit表达。蓝门包围EMP，定义为AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^低电池（中间面板）。 AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45中YFP标记的比较^低 细胞（右图）。直方图表示YFP信号（x轴）为正的细胞百分比（y轴）。 （ C ）造血细胞定义为Kit ^neg CD45 ^+，并以蓝色门控（左图）。上套件^NEG CD45 ⁺细胞F4 / 80和CD11b表达。巨噬细胞定义为F4 / 80 ^明亮 CD11b ⁺细胞（中图）。在Cre / C阴性对照（黑色）和Cre阳性样品（绿色）中比较F4 / 80 ^明亮 CD11b ⁺巨噬细胞（右图）中YFP标记。直方图表示YFP信号（x轴）为正的细胞百分比（y轴）。 请点击此处查看此图的较大版本。

造血前体细胞的不同波浪在短时间内部分重叠，这使得每次发育造血波对免疫细胞的贡献的分析技术上非常具有挑战性。

他莫昔芬诱导型Cre系统提供了以时间可诱导的方式标记特定细胞并在胚胎或成年人中进行谱系分析的机会，而不需要离体或体外培养或移植。在他莫昔芬诱导的Cre菌株中，在细菌Cre重组酶和人雌激素受体（CRE-ER）的配体结合结构域的突变形式之间或改进的单点突变体Cre和两只小鼠雌激素受体之间产生融合基因（默克ICRE聚体）。 Cre与雌激素受体的融合导致Hsp90对Cre的细胞质螯合，从而防止核Cre介导的重组。他莫昔芬（TAM）被th代谢将肝脏转化为4-羟基他莫昔芬（OH-TAM），其对雌激素受体具有高结合亲和力的活性代谢物。 OH-TAM与融合物Cre结合导致与Hsp90相互作用的破坏，允许其迁移到细胞核并引发Cre介导的重组。已经显示在怀孕女性中将子宫内 TAM或OH-TAM注射到发育中的胚胎中的重组。怀孕期间的他莫昔芬治疗可导致堕胎，从而减少产仔数，但如果在妊娠中期后分娩，也可以避免出生，在这种情况下需要通过剖腹手术进行小孩分娩。为了抵制怀孕期间的他莫昔芬的影响，我们用半剂量的孕酮来补充OH-TAM给药，以改善胚胎的存活并降低堕胎的风险¹⁷ 。

可以使用几种途径将TAM或OH-TAM递送到怀孕的雌性中。目前口头嘉瓦ge或腹膜内（ip）注射用于他莫昔芬。 OH-TAM具有立即可用的优点，因为它不需要被怀孕大坝的肝脏代谢。然而，当他莫昔芬非常容易溶解在玉米油中时，OH-TAM很难用相同的技术制备并产生乳液。这是使用OH-TAM进行子宫颈脉冲标记的限制步骤。我们已经调整了由JF Nicolas ¹³开发的OH-TAM制备方案，其中它们使用PEG-35蓖麻油，具有两亲性质的溶剂来溶解OH-TAM，因为他莫昔芬溶解是最关键的步骤之一在程序中。这允许OH-TAM的可重现和最佳制备，并大大缩短了三苯氧胺制备的时间。此外，当使用不同的诱导型Cre菌株时，必须适应OH-TAM的浓度以进行注射。活性染料的组合（DAPI）和大小（FSC）分别是去除死细胞和细胞碎片的关键。大多数紫色，蓝色和红色激光探测器中死细胞和碎片都具有高度自动荧光，并且可能阻碍流式细胞分析。此外，我们不建议在用流式细胞仪分析之前，在染色后固定细胞。固定可能导致细胞形态的变化，从而使得基于正向和侧向散射（FSC与SSC）的难度大小鉴别。此外，用PFA固定样品导致YFP荧光强度的显着损失。

该协议中的主要限制是不对其群体的功能和分化潜力进行测试。为了克服这一点，可以使用荧光激活的细胞分选仪（FACS），按照类似的方案对细胞进行分类，以进行集落形成测定。在这种情况下，该程序必须在无菌条件下进行，并使用胎牛血清（FBS）在FACS缓冲区中，而不是BSA。用这种技术实现的低标记效率以及由此导致的每个胚胎组织感兴趣的YFP ⁺细胞数量是在EMP表型研究中的主要挑战。该协议使用4激光流式细胞仪。还可以使用具有3个激光器的流式细胞仪，但重要的是使抗体面板适应于考虑染料之间增加的光谱重叠。另外，在改变抗体组时需要滴定抗体以找到合适的浓度，我们建议在每个组织中汇集所有胚胎的试验实验中进行抗体滴定和新抗体组的验证，以增加抗体的数目细胞每组织分析。

发育生物学领域已经通过Cre / Lox方法革新了，该方法允许原位永久标记细胞。这种方法实现了通过在特异性启动子的控制下表达Cre重组酶的组织或细胞类型特异性。在我们的例子中，我们选择研究Cre重组酶在Csf1r（集落刺激因子1受体）的启动子控制下的表达，这是巨噬细胞及其祖细胞的一种重要的促有丝分裂和生长因子受体，使用该组开发的菌株J. Pollard ¹⁸ 。与其他发表的策略相比，基于Csf1r表达的命运映射策略的优点是它允许标记卵黄囊来源的细胞（EMP和巨噬细胞）而不标记任何胎儿HSC ¹² 。 Cx3cr1 ^CreERT2菌株也可以标记卵黄囊细胞而不标记HSC ¹⁹ ，但它只能标记巨噬细胞和巨噬细胞前体，但不标记EMP祖细胞¹ 。 Cx3cr1 ^CreERT2菌株与^Csf1r具有相同的警告 ^{MerCreMer系列，因为它不能区分衍生自单能原始巨噬细胞祖细胞或EMP的巨噬细胞。当他莫昔芬在Runx1 MerCreMer 16和Kit MerCreMer 20中早期给予E7.5时 ，外周血细胞总是在成年人中标记，尽管效率非常低，从而在开发过程中证明了HSC的标记。此外，Kit MerCreMer命运映射标签蛋黄囊Kit + Sca1 +祖细胞，而EMP是Kit + Sca1阴性11 。 Csf1r MeriCreMer菌株不是敲入的，而是由经典的添加剂转基因产生，因此Cre的表达可能不能完全显示Csf1r的内源性表达。然而，这具有避免由Csf1r的杂合表达引起的潜在发育缺陷的优点。这是分析时要考虑的重要因素用于发育造血研究的其他命运映射策略，如Runx1 MerCreMer ，Kit MerCreMer和Cx3cr1 CreERT2 ，其中可诱导的Cre插入内源基因座。对于Runx1 MerCreMer和Kit MerCreMer ，发育性造血缺陷已经在杂合胚中描述。总而言之，本文提出的方法可以在发育过程中调查卵黄囊EMP生物学，以及在成体组织中发现的卵黄囊衍生的巨噬细胞，与HSC衍生的巨噬细胞不同。这将提高我们目前对这个住院巨噬细胞谱系及其在成年期间的具体功能的了解。环境管理计划的免疫表型表征最近已使用细胞分选和集落形成测定法，证实卵黄囊EMP在发展11的早期阶段特异性表达CD41和CD16 / 32的改善。但是，CD41表达的特异性CD16 / 32需要从E10.5起进一步表征，特别是在胎肝利基中，使用命运映射模型。实际上，与E10.5至E14.5胎儿肝脏中的胎儿HSC和HSC来源的祖细胞相比，CD41和CD16 / 32表达是否仍然对EMP特异性有待进一步阐明。所提出的方法允许标记卵黄囊中产生的EMP并在胚胎发育过程中跟踪它们，并且当它们种子胎肝时，它将有助于更详细地表征EMP表型。}

这种方法在不久的将来可能是重要的研究EMP分化途径。 EMPs从E8.5到E10.5 4从卵黄囊内皮出现，但这种方法只允许标记E8.5-E9.5之间出现的一部分祖细胞。因此，该方法的局限性在于仅标记了一小部分EMP，因此在经典的功能损失功能研究中难以分析使用带有等位基因c安慰剂基因。或者，使用克隆报告基因，稀释标记可能成为体内 EMP分化克隆研究的优势。然而，标记效率需要用于每个带叶片的报告物或使用的floxed等位基因，因为填充的构建体的重组效率取决于基因组位点（floxed等位基因）或Rosa26报道构建体。事实上，不同的Rosa26报道系列可用不同的启动子，据报道，Rosa26 ^tdTomato和Rosa26 ^mTmG株具有比Rosa26 ^LSL-eYFP系更高的重组效率。本方案中使用的记者小鼠品系为Rosa26 ^LSL-eYFP系，不能提供结果部分提及的祖细胞成熟动态过程信息。成熟过程的问题可以使用不同的报告者菌株如Rosa26 ^mTmG部分解决。在这种菌株中，细胞可以被分散根据重组事件以来经过的时间。 Rosa26 ^mTmG菌株中的所有细胞表达膜结合的tdTomato荧光蛋白，Cre重组切除tdTomato盒，并允许表达膜结合的GFP。由于tdTomato具有较长的半衰期，仍然含有tdTomato但已经开始表达GFP的细胞（重组后不久）是tdTomato ⁺ GFP ^{low / int} ，可以区别于不再表达tdTomato的tdTomato ^neg GFP ⁺细胞，表达较高水平的GFP（复合后）。

如上所述，OH-TAM制备是在实验之间持续递送类似剂量的OH-TAM并减少他莫昔芬副作用的关键步骤。孕激素共同给药也可用于限制他莫昔芬对怀孕的有害作用。协议的另一个关键因素是单细胞悬浮液的可行性n从不同的胚胎组织获得。我们通常获得> 90％的活细胞用于流式细胞术分析。为了实现这一点，关键是要快速跟踪所有步骤，并在组织收集后将所有样品保持在冰上。需要适当的控制，例如未染色样品，单染色体和荧光减去一个（FMO）对照以识别门边界并控制多色面板中的光谱重叠。需要根据抗体滴定和光谱重叠来验证抗体的变化。最后，Rosa26记者应变的选择需要适应被调查的科学问题。

作者没有什么可以披露的。

作者感谢Frederic Geissmann教授和Christian Schulz教授进行了深入的讨论;汉娜·加纳博士对手稿的批判性阅读，Xavier Montagutelli博士和Jean Jaubert博士以及巴斯德研究所动物设施的工作人员，以支持畜牧业;以及他们的技术援助Pascal Dardenne和一名安进学者Vytaute Boreikaite。 EGP实验室的研究由巴斯德研究机构，CNRS，Cercle FSER（FRM和来自巴斯德研究所和REVIVE联盟的起始包）资助，LI由REVIVE联盟的博士研究生资助。