Идентификация эритромиелоидных прародителей и их потомство в мышечном эмбрионе методом проточной цитометрии

В то время как инфильтрирующие макрофаги непрерывно набираются во взрослые ткани из циркулирующих предшественников, резидентные макрофаги засевают свою ткань во время развития, где они поддерживаются без дальнейшего введения от предшественников. Недавно были определены прародители для резидентных макрофагов. Здесь мы представляем методы картирования генетической судьбы резидентных предшественников макрофагов.

Макрофаги являются профессиональными фагоцитами из врожденного плеча иммунной системы. В стационарных, сидячих макрофагах встречаются во взрослой ткани, где они выступают в качестве фронтальных часовых инфекций и повреждения тканей. В то время как другие иммунные клетки постоянно обновляются из гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников (HSPC), расположенных в костном мозге, показано, что линия макрофагов, известных как резидентные макрофаги, сохраняется в тканях без введения HSPC из костного мозга. Эта линия представлена ​​микроглиями в мозге, клетками Купфера в печени и клетками Лангерганса в эпидермисе среди других. Протеины кишечника и толстой кишки являются единственными взрослыми тканями, лишенными HSPC-независимыми резидентными макрофагами. Недавние исследования выявили, что резидентные макрофаги происходят от гемопоэза экстра-эмбрионального желточного мешка от предшественника (-ов), отличного от эмбриональных гемопоэтических стволовых клеток (HSC). Среди желчного мешка окончательный гемопоэз, eRythromyeloid progenitors (EMP) вызывают как эритроидные, так и миелоидные клетки, в частности резидентные макрофаги. EMP генерируются только в желчном мешке между E8.5 и E10.5 дней развития, и они мигрируют в фетальную печень уже в процессе циркуляции, где они расширяются и дифференцируются, по крайней мере, до E16.5. Их потомство включает эритроциты, макрофаги, нейтрофилы и тучные клетки, но только макрофаги, полученные из EMP, сохраняются до взрослого состояния в тканях. Временная природа возникновения ЭМП и временное перекрытие с генерацией HSC затрудняют анализ этих предшественников. Мы установили протокол картирования тамоксифен-индуцибельной судьбы, основанный на экспрессии промотора Csf1r рецептора макрофагов цитокинов, чтобы охарактеризовать клетки EMP и EMP in vivo с помощью проточной цитометрии.

Есть несколько последовательных, но перекрывающихся волн гемопоэтических предшественников во время развития, чье миелоидное потомство остается во взрослой жизни. Во-первых, унипотентные «примитивные» предшественники появляются в мешке желтка мыши ^{1 , 2} между E7.5-E8.25 и вызывают эмбриональные макрофаги без какого-либо моноцитарного промежуточного соединения. Являются ли макрофаги, полученные из примитивных предшественников, сохраняющимися во взрослом мозге, поскольку микроглия остается объектом активного исследования. Во-вторых, эритро-миелоидные прекурсоры (ЭМП) возникают в желчном мешке на E8.5, попадают в кровоток и колонизируют эмбрион. EMP выходят из эндогенного желчного мешка эндометрия в белково-зависимом эндотелиаль-гемопоэтических переходах ^{3 , 4} . Хотя EMP может дифференцироваться в макрофаги в желчном мешке, они также колонизируют фетальную печень из эмбрионального дня (E) 9 ⁵ и дифференцируютВ эритроциты, мегакариоциты, макрофаги, моноциты гранулоцитов и тучных клеток ⁶ . Макрофаги, происходящие от ЭМП, проявляют пролиферативную способность в тканях развития и взрослых. Независимо от того, что макрофаги, полученные из EMP, обходят моноцитарную стадию дифференциации, все еще противоречивы, поскольку очень мало известно об их пути дифференциации ^{7 , 8} . Наконец, гематопоэтические стволовые клетки (HSCs) появляются на E10.5 внутри собственно эмбриона из области аорта-гонад-мезонефроса и мигрируют в фетальную печень. HSC с долговременной репопуляционной способностью обнаруживаются только после E11 (на стадии 42 сомитовой пары) ⁹ . Там они расширяются и отличаются от E12.5 до тех пор, пока окончательный гематопоэз не начнет переходить в костный мозг, который становится преобладающим местом производства клеток крови в течение постнатальной жизни ¹⁰ .

SpА также общие иммунофенотипические маркеры до сих пор мешали нашей способности различать специфический вклад этих волн эмбриональных гемопоэтических предшественников. В то время как как EMP, так и HSC генерируются в зависимом от Runx1 образом и экспрессируют транскрипционный фактор Myb и рецептор фактора роста Csf1r (Colon-Stimulating Factor 1 Receptor, также известный как Macrofage Colony Stimulating Factor Receptor), среди прочих, EMP можно отличить от HSC по их отсутствию лимфоидного потенциала, как in vitro, так и in vivo , отсутствие долговременного потенциала репопуляции и отсутствие поверхностной экспрессии маркера линии Sca-1 ¹¹ . Генетические модели картирования судьбы необходимы для характеристики онтогенеза макрофагов, поскольку они позволяют нацеливать эмбриональных предшественников на специфические для клеток и специфичные по времени. Здесь мы представляем протокол сопоставления судьбы, используемый в нашей лаборатории, для различения двух линийС макрофагами, обнаруженными в большинстве взрослых тканей: HSC-производные инфильтрирующие макрофаги и HSC-независимые резидентные макрофаги.

Живые макрофаги тканей были прослежены до Myb-независимых клеток-предшественников, экспрессирующих цитокиновый рецептор Csf1r ¹² и присутствующих в эмбрионе на E8.5-E10.5 с использованием трех дополнительных стратегий картирования судьбы ⁶ . Для изучения гептапоэза желточного мешка без маркировки эмбриональных HSCs мы используем трансгенный штамм Csf1r ^MeriCreMer , экспрессирующий индуцируемый тамоксифеном слитый белок «улучшенной» рекомбиназы Cre и двух рецепторов эстрогена мыши (Mer-iCre-Mer) под контролем Промотор Csf1r. Следовательно, рекомбиназа Cre будет активна в Csf1r-экспрессирующих клетках в течение ограниченного временного окна. При использовании с репортерным штаммом, содержащим флуоресцентный белок ниже кассеты lox-STOP-lox (Rosa26 ^LSL-eYFP ), это приведет к постоянномуГенетической маркировки клеток, присутствующих во время индукции, но также и их потомства. Введение в E8.5 активной формы тамоксифена, 4-гидрокситамоксифена (OH-TAM), метки EMP и макрофагов, без маркировки желточных мешочков, унипотентных «примитивных» предшественников или эмбриональных HSC. Таким образом, мы характеризовали иммунофенотип ЭМП и их потомство во время эмбрионального развития, а также оценивали вклад макрофагов, полученных из желточного мешка, в взрослые бассейны макрофагов. Требуется дальнейшая работа, чтобы охарактеризовать, можно ли маркировать макрофаги примитивных предшественников, используя этот подход, и могут ли они вносить вклад в пулы взрослых макрофагов.

Процедуры животных проводились в соответствии с утвержденным комитетом по уходу и использованию животных в Институте Пастера (CETEA).

1. В Utero Pulse Labeling в Csf1r ^MeriCreMer Rosa ^{LSL-YFP Embryos}

1. Подготовьте исходный раствор 4-гидрокситамоксифена (ОН-ТАМ, 50 мг / мл).
   1. Под дымностью откройте 25 мг флакона OH-TAM и добавьте 250 мкл этанола (100%).
   2. Перенесите раствор ОН-ТАМ в 2 мл микроцентрифужную пробирку с усеченным наконечником и вихрем с максимальной скоростью в течение 10 мин.
   3. Сонайтите 30 минут в ванне с ультразвуком.
   4. Добавьте 250 мкл касторового масла ПЭГ-35 под дымоход, чтобы получить исходный раствор 50 мг / мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Касторовое масло PEG-35 является растворителем с амфифильными свойствами, который связывает гидрофобные молекулы и растворяет их в водных растворителях.
   5. Вихрь в течение примерно 5 мин.С максимальной скоростью и ультразвуком 30 минут в ванне с ультразвуком.
   6. Аликвота 90 мкл (4,5 мг) на микроцентрифужную пробирку (1 аликвота на инъекцию).
   7. Хранить при температуре 4 ° C в течение 1 недели или при -20 ° C в течение длительного времени, как описано ранее ¹³ .
2. Подготовьте исходный раствор прогестерона (10 мг / мл)
   1. Добавьте 250 мкл 100% этанола в 25 мг прогестерона для получения суспензии 10 мг / 100 мкл под дымкой. Вихрь мягко.
   2. Добавить 2250 мкл автоклавного подсолнечного масла, чтобы сделать раствор прогестерона 10 мг / мл под капотом.
   3. Вихрь в течение приблизительно 5 мин при максимальной скорости, аликвоте и хранении при 4 ° C. Обратите внимание, что решение сохраняется при сохранении.
3. Администрация Тамоксифена
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбриональное развитие оценивалось с учетом дня образования влагалищной пробки в виде эмбрионального дня (E) 0,5. Рекомбинация индуцируется однократной инъекцией на E8.5В беременных женщин Csf1r ^{MeriCreMer 12} . Дополнение OH-TAM 37,5 мкг / г прогестерона для снижения частоты абортов после введения тамоксифена. Инъекция в 13:00 (для вагинального штепселя, наблюдаемого утром).
   1. Утром инъекции раздайте аликвоту раствора OH-TAM в течение 10 минут (или до полного ресуспендирования).
   2. Добавляют 360 мкл NaCl 0,9% под дымкой, чтобы получить раствор 10 мг / мл OH-TAM и полностью вихрь. Сонайтете до тех пор, пока раствор не станет прозрачным и полностью ресуспендированным (по меньшей мере 30 минут).
   3. Предварительно нагрейте прогестерон до комнатной температуры.
   4. Смешайте 450 мкл ОН-ТАМ и 225 мкл прогестерона в микроцентрифужной пробирке. Vortex.
   5. Соносите по меньшей мере 10 минут и загружайте в 1 мл шприц с иглой 25G.
   6. В животноводческом средстве взвесьте беременную женщину (женщины Csf1r ^MeriCreMer находятся в инбредном генетическом фоне FVB и имеют типичный вес betwe25 и 33 г).
   7. Выполните внутрибрюшинную инъекцию, медленно впрыскивая вычисленный объем в мышь. После снятия иглы осторожно нажмите на проколотую рану и массируйте живот, чтобы распределить ОН-ТАМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Инъекционная доза OH-TAM составляет 75 мг / кг, а доза прогестерона - 37,5 мг / кг. В таблице 1 приведен объем введения в беременных женщин.

Таблица 1: Объем инъекции 4-OH-тамоксифена (OH-TAM). Объем, необходимый для однократной инъекции при E8,5, 75 мкг / г (масса тела) ОН-ТАМ, дополненной 37,5 мкг на г прогестерона.

2. Рассечение желточного сахара (YS) и фетальной печени (FL)

ПРИМЕЧАНИЕ. Строгие стерильные методы не нужны при манипулировании эмбрионами, если только они не будут использоваться для долгосрочной культуры. Тем не менее рабочая зона должна быть чистой и покрыта фольгой под абсорбирующей бумагой.

1. Подготовьте ледяной фосфатный буферный солевой раствор (PBS) и пищеварительную смесь (PBS, содержащую 1 мг / мл коллагеназы D, 100 ед. / Мл дезоксирибонуклеазы I (ДНКаза I) и 3% фетальной бычьей сыворотки).
2. Жертвоприношение беременных женщин( Например, эмбриональная стадия E10.5).
3. Зажмите кожу чуть более половых органов и сделайте небольшой разрез на средней линии ножницами. Потяните кожу к голове, чтобы полностью обнажить стенку корпуса без меха. Вырежьте мышцы живота, чтобы разоблачить внутренние органы и подтолкните кишечник, чтобы выставить два рога матки.
4. С тупым щипцом среднего размера, возьмите жироуловитель, прикрепленный к яичнику, и осторожно потяните матку. Вырезать на шейном уровне рогов матки и поднимать рожки из брюшной полости. Удалите жироуловитель, чтобы полностью освободить рожки матки и вырезать рога с яичника с каждой стороны.
5. Поместите рога в ледяную PBS в 10-миллиметровую чашку Петри. Быстро захватите мышечные слои матки на одной конечности (шейный конец) и сдвиньте мелкие ножницы между мышечным слоем и децидуальной тканью, чтобы освободить эмбрионы с окружающей децидуальной тканью.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Мышцы имеют тенденцию к быстрому сокращениюR извлечение, поэтому этот шаг должен быть как можно быстрее.
6. Используйте одну пару тонких щипцов, чтобы отрезать мембрану Рейхерта и плаценту.
7. Аккуратно удалите мешок с желтком и поместите его в 24-луночный планшет для культуры тканей с 0,5 мл пищеварительной смеси.
   ПРИМЕЧАНИЕ. На этом этапе можно собрать эмбриональную кровь.
   1. Сразу же после отделения пупочных и желточных сосудов перенесите эмбрион в 12-луночный планшет для тканевой культуры, содержащий 10 мМ ледяной этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Обезглавьте эмбрион с помощью острых тонких ножниц, пытаясь ограничить как можно больше размягчение тканей. Инкубируйте на льду в течение 10-15 мин и собирайте ЭДТА, содержащую кровь.
8. Удалите амнион, окружающий эмбрион.
9. Для этапов
10. Сократите голову эмбриона у насЩипцы или тонкие ножницы. Перенесите голову в 24-луночный планшет с 0,5 мл пищеварительной смесью.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Нейроэктодерму и мозг на более поздних стадиях дополнительно расчленены для анализа проточной цитометрии; Тщательно удалите окружающее сосудистое сплетение.
11. Вырежьте эмбрион выше задней конечности и удалите передние конечности.
12. Чтобы изолировать печень, откройте грудную клетку, используя пару тонких щипцов. Зажмите вперед к сердцу и осторожно потяните, используя второй пинцет, чтобы освободить органы от тела.
    1. Тщательно отделите фетальную печень от сердца и кишечника. Перенесите фетальную печень в 24-луночный планшет с 0,5 мл диетического раствора. Тщательно контролируйте передачу под рассекающим микроскопом.
13. Соберите область хвоста (или любую другую часть эмбриона) для генотипирования с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Другие ткани и органы могут быть собраны у эмбрионов E10.5 для аналогичного анализа с использованием проточной цитометрии. Кровь, головаN, область аорта-гонад-мезонефроса (AGM), сердце и нейроэктодерма могут быть собраны в E10.5. На более поздних стадиях можно также собирать легкие, почки, селезенку и поджелудочную железу. Подробное описание вскрытия AGM на разных этапах развития было описано ранее ¹⁴ .

3. Обработка эмбриональных тканей для проточной цитометрии

1. Инкубируйте органы (помещенные в пищеварительную смесь) в течение 30 мин при 37 ° C.
2. Перенесите ткань и ферментативный раствор на сетчатый фильтр размером 100 мкм, помещенный в 6-луночный планшет для культивирования ткани, заполненный 6 мл буфера FACS (0,5% альбумина бычьей сыворотки (BSA) и 2 мМ EDTA в 1x PBS). Механически диссоциировать, осторожно затирая черным резиновым поршнем 2 мл шприца, чтобы получить суспензию с одной клеткой.
   ПРИМЕЧАНИЕ. С этого момента все шаги должны выполняться при температуре 4 ° C.
3. Соберите суспензию клеток с помощью пипетки Пастера и перенесите в пробирку объемом 15 мл.
4. СпиN в течение 7 мин при 320 × g при 4 ° С. Отбросьте супернатант путем аспирации.
5. Ресуспендируют гранулу в 60 мкл Fc-блокирующего буфера (CD16 / CD32-блокирующее антитело, разведенное 1/50 в буфере FACS).
   1. Перенесите 50 мкл одноклеточной суспензии на лунку в 96-луночном планшете с круглым дном. Инкубируйте в течение как минимум 15 минут на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Окрашивание также может быть выполнено в 5-миллилитровых трубах FACS из полистирола при обработке небольшого количества образцов.
   2. Перенесите оставшиеся 10 мкл в 5-миллилитровую трубку FASS из полистирола, чтобы получить пул образцов из каждой ткани. Этот пул будет служить в качестве элементов управления ( то есть, незакрашенные образцы и флуоресцентные минус единицы (FMO) для каждого флуорохрома). Передайте 50 мкл пула для каждого флуоресцентного минус одного (FMO) контроля (по одному на флюорохром) на 96-луночный планшет.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Каждый контроль FMO содержит все антитела, связанные с флуорохромом, с панели антител, за исключением одногоКоторый измеряется. FMO используются для определения границ ворот и для контроля спектрального перекрытия в многоцветных панелях. Чтобы правильно учитывать изменения фона и аутофлуоресценции между различными тканями, важно подготовить эти контрольные образцы из пула образцов каждой ткани. Соответствующим контролем экспрессии YFP будут образцы из Cre-отрицательных эмбрионов, которые подтверждены генотипированием ПЦР.

4. Покрытие поверхностного антигена

1. Подготовьте смесь антител в буфере FACS (таблица 2). Подготовьте 50 мкл смеси антител на образец.
   1. Используйте следующие антитела, связанные с флуорохромом: анти-CD45.2 (клон 104); Анти-CD11b (клон M1 / ​​70); Анти-F4 / 80 (клон BM8); Анти-AA4.1 (клон AA4.1); Anti-Kit (клон 2B8); И анти-Ter119 (клон Ter119).
   2. Подготовьте шесть антител для контроля FMO в буфере FACS. Подготовьте 50 мкл смеси антител на контрольный образец.
      НЕТTE: Разведение антител в смеси антител в два раза более концентрированное, чем конечная концентрация, указанная в таблице материалов. Для панели с шестью антителами, связанными с флуорохромом, готовится 6 контролей FMO. В таблице 2 представлен состав смеси антител и FMO для одной трубки.

Таблица 2: Объем антител, используемых для окрашивания, и флуоресцентный минус один (FMO). Объем (мкл) антитела, необходимый для конечного объема 50 мкл.

2. Добавьте 50 мкл смеси антител к образцам в 96-многолуночной планшете (конечный объем при окрашивании составляет 100 мкл). Осторожно пипетируйте вверх и вниз дважды и инкубируйте на льду в течение 30 минут.
3. Вращайте 96-многолуночную пластинку в течение 7 мин при 320 × g при 4 ° С и отбрасывайте супернатант. Ресуспендируют в 200 мкл буфера FACS.
4. Повторите процедуру стирки (шаг 4.3) дважды с помощью 150 мкл буфера FACS.
5. Отфильтруйте образцы и контрольные образцы (FMO и необработанные образцы пула) в 5 мл полистироловых труб через фильтр размером 70 мкм. Хранить на льду до момента приобретения.

5. Идентификация EMP и макрофагов YS с помощью проточной цитометрии

ПРИМЕЧАНИЕ. Этот протокол был оптимизирован с использованием 4-х лазерного проточного цитометра eqС лазером на 405 нм, фиолетовым лазером 488 нм, 562 нм желтым лазером и красным лазером 638 нм.

1. Подготовьте компенсационные шарики для каждого связанного антитела в соответствии с инструкциями производителя. Используйте неокрашенные образцы и компенсационные шарики для оптимизации интенсивности лазера.
2. Чтобы определить границы ворот, используйте FMO (флуоресценция минус один) для каждого антитела.
3. Чтобы исключить мертвые клетки, добавьте 1 мкл DAPI (1 мг / мл) в пробирку (содержащую 200 мкл суспензии окрашенных клеток) за 1 мин до получения. Используйте сильный сигнал DAPI и параметр прямого рассеяния (FSC), чтобы выполнить исключение мертвых клеток и мусора.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Используйте программное обеспечение из проточного цитометра для рисования ворот во время захвата. Матрица компенсации и анализ могут быть выполнены после получения образца с использованием другого коммерчески доступного программного обеспечения.
4. Используйте прямой и боковой разброс (FSC vs SSC), чтобы выполнять живые ячейки и дублетную дискриминацию из общих событий.
5. Создайте флуоресцентные точечные графики на оси логарифмической шкалы и вытяните дочерние ворота, чтобы, во-первых, исключить эритроциты (Ter119 ⁺ ), а затем идентифицировать клетки-предшественники (Kit ⁺ ) и гемопоэтические клетки (CD45 ⁺ Kit ^neg ) (см. Рис. 1 ).
6. Создайте гистограммы флуоресценции для количественной оценки эффективности маркировки YFP среди различных идентифицированных популяций YS ( рис. 2 ), печени плода ( рис. 3 ) и мозга ( рис. 4 ).

Картирование генетической судьбы достигалось введением на E8.5 ОН-ТАМ в самок Csf1r-Mer-iCre-Mer, связанных с самцами, несущими репортер Rosa26-LSL-eYFP. В присутствии OH-TAM удаление стоп-кассеты приводит к постоянной экспрессии YFP в клетках, экспрессирующих Csf1r . Мы собрали две гемопоэтические ткани: желточный мешок и фетальную печень и негемопоэтическую ткань, нейроэктодерму, из эмбрионов на E10.5. Одноцепочечные суспензии были получены путем ферментативной и механической диссоциации, и образцы анализировали с помощью проточной цитометрии после окрашивания флуоресцентными антителами. После исключения мертвых клеток и дублетов были проанализированы одноцепочечные суспензии ( рисунок 1 ). Все ворота были определены с помощью флуоресценции Минус One (FMO). Также рекомендуется выполнять исключение эритроцитов (клетки Ter119 ⁺ ) для улучшения ясности анализа ( рисунок 1B ). Используя маркеры клеточной поверхности Kit (маркер предшественника) и CD45 (маркер гемопоэтических клеток), мы смогли выделить три популяции интересующих клеток: Kit ⁺ CD45 ^neg ; Kit ⁺ CD45 ^low и Kit ^neg CD45 ⁺ ( рисунок 1 ). Прогнето- ры были дополнительно проанализированы на основе их экспрессии АА4.1 ( рис. 2-4 ). Действительно, AA4.1 является поверхностным маркером, который позволяет обогащать популяцию предшественников внутри эритромиелоидных предшественников в желточном мешке, как показано в анализах колонии ¹⁵ . Когда выявленные популяции были идентифицированы, мы подсчитали эффективность меток YFP в каждой популяции с использованием гистограмм. Среди желточного мешка Kit ⁺ предшественники, как CD45 ^neg ( Рисунок 2A ), так и CD45 ^low ( Рисунок 2B ) клеточные популяции содержат клетки AA4.1 ⁺ YFP ⁺ . Однако AA4.1 ⁺ YFP ^{+ клетки в печени и головном мозге встречаются только в популяции низшего предшественника Kit + CD45 ( рис. 3B и 4B ). Поскольку мозг не является активным участком гемопоэза, предшественники, обнаруженные в этой ткани, могут соответствовать циркулирующим предшественникам. Это также предполагает процесс созревания предшественников, когда они мигрируют из желточного мешка в печень плода и периферические ткани. Kit + предшественники сначала выражают AA4.1, независимо от экспрессии CD45, но к тому времени, когда они достигают циркуляции и печени плода, все предшественники AA4.1 + YFP + экспрессируют обнаруживаемые уровни клеточной поверхности CD45. Макрофаги, обозначенные как яркий CD11b + F4 / 80, были обнаружены в затворе Kit neg CD45 + ( рисунок 2-4 ). Макрофаги в мешке желчного желтка E10.5, печени и головном мозге были эффективно маркированы (от 60 до 80% ярких клеток CD11b + F4 / 80 были YFP + ) b Ya единственное введение OH-TAM на E8.5 ( фиг. 2C , 3C и 4C ).}

Чтобы сравнить эффективность маркировки между пометами, мы рекомендуем использовать внутренний контроль эффективности рекомбинации. Изменчивость уровня экспрессии репортера может наблюдаться между экспериментами из-за изменений в сроках развития между литрами и штаммами мыши при инъекции ОН-ТАМ внутриутробно . Следовательно, мы рекомендуем, чтобы эмбрионная постановка от E8.5 до E11.5 эмбрионов выполнялась подсчетом сотовой пары. В этом протоколе мы предлагаем использовать эффективность маркировки в резидентных макрофагах мозга (microglia) в качестве ссылки для сравнения эффективности рекомбинации Cre между различными экспериментами и штаммами ( рис. 4C ). Могут использоваться другие резидентные макрофаги, однако микроглия были первыми клетками, которые были описаны как макрофаги, полученные из желточного мешкаEf "> 16, и они представляют собой наиболее распространенную популяцию жировых макрофагов в ткани на E10.5. Таким образом, маркировка YFP в микроглии может использоваться для оценки эффективности картирования судьбы в каждом эксперименте и сравнения данных из разных пометов.

Рисунок 1: Стратегия Gating для идентификации клеток-предшественников (Kit ⁺ CD45 ^neg и Kit ⁺ CD45 ^low ) и дифференцированных гемопоэтических клеток (Kit ^neg CD45 ⁺ ). ( A ) Дискриминация живых клеток и синглетов выполняется с использованием параметров DAPI и параметров прямого и бокового рассеяния (FSC / SSC). ( B ) После исключения эритроцитов (Ter119 ^neg ) три популяции клеток, представляющих интерес, идентифицируются на основе экспрессии клеток Kit и CD45: Kit ⁺ CD45 ^neg ; Kit ⁺ CD45 ^low и Kit ^neg CD45 ⁺ . ( C ) Csf1r-экспрессирующие клетки, присутствующие при инъекции OH-TAM, и их потомство идентифицировано в положительных эмбрионах Cre-рекомбиназы как экспрессирующих YFP по сравнению с отрицательными эмбрионами Cre-рекомбиназы (подтвержденными позже анализом полимеразной цепной реакции, ПЦР). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Эффективность маркировки в желточном мешке из E10.5 ^Csf1r MeriCreMer Rosa26 ^LSL-eYFP эмбриоспользуется с OH-TAM на E8.5. ( A ) Kit ⁺ CD45 ^{отрицательные} клетки строятся на основе экспрессии Kit и CD45 на клетках живого желточного мешка (синие ворота, левая панель). AA4.1 и Kit в клетках Kit ⁺ CD45 ^neg . BluE закрывает AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^минус- ячейки (средняя панель). Сравнение маркировки YFP в AA4.1 ^{+ NEG} клетки Kit ⁺ CD45 (правая панель) в Cre отрицательного контроля (черный) и Cre положительных образцах (зеленый цвет). Гистограммы представляют процент клеток (по оси Y) для сигнала YFP (ось x). ( B ) ^Низкие ячейки Kit ⁺ CD45 строятся на основе выражения Kit и CD45 (синие ворота, левая панель). Выражение AA4.1 и Kit на Kit ⁺ CD45 клеток с ^{низким уровнем.} Синие ворота окружают EMP, как определено как AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^low cells (средняя панель). Сравнение маркировки YFP в AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 клеток с ^{низким уровнем} (правая панель) в Cre отрицательный контроль (черный) и Cre положительных образцов (зеленый цвет). Гистограммы представляют процент клеток (по оси Y) для сигнала YFP (ось x). ( C ) Гемопоэтические клетки определяются как Kit ^neg CD45 ^{+ и стробируется синим цветом (левая панель). F4 / 80 и CD11b на клетках Kit neg CD45 + . Макрофаги определяются как яркие клетки CD11b + F4 / 80 (средняя панель). Сравнение меток YFP в ярких CD11b + макрофагах F4 / 80 (правая панель) в негативных средах Cre (черный) и Cre положительных образцов (зеленый). Гистограммы представляют процент клеток (по оси Y) для сигнала YFP (ось x). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.}

Рисунок 3: Эффективность маркировки в печени из E10.5 ^Csf1r MeriCreMer Rosa26 ^LSL-eYFP эмбрионаспользуется с OH-TAM на E8.5. ( A ) Kit ⁺ CD45 ^{отрицательные} клетки стробируются на основе Kit и CD45Выражение на живых клетках печени (синие ворота, левая панель). AA4.1 и Kit в клетках Kit ⁺ CD45 ^neg . Синие ворота закрывают ячейки AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^neg (средняя панель). Сравнение маркировки YFP в AA4.1 ^{+ NEG} клетки Kit ⁺ CD45 (правая панель) в Cre отрицательного контроля (черный) и Cre положительных образцах (зеленый цвет). Гистограммы представляют процент клеток (по оси Y) для сигнала YFP (ось x). ( B ) ^Низкие ячейки Kit ⁺ CD45 строятся на основе выражения Kit и CD45 (синие ворота, левая панель). Выражение AA4.1 и Kit на Kit ⁺ CD45 клеток с ^{низким уровнем.} Синие ворота окружают EMP, как определено как AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^low cells (средняя панель). Сравнение маркировки YFP в AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 клеток с ^{низким уровнем} (правая панель) в Cre отрицательный контроль (черный) и Cre положительных образцов (зеленый цвет). Гистограммы представляют собой процентЯчейки (ось y) положительны для сигнала YFP (ось x). ( C ) Гемопоэтические клетки определяются как Kit ^neg CD45 ⁺ и строятся синим цветом (левая панель). F4 / 80 и CD11b на клетках Kit ^neg CD45 ⁺ . Макрофаги определяются как ^яркие клетки CD11b ⁺ F4 / 80 (средняя панель). Сравнение меток YFP в ^ярких CD11b ⁺ макрофагах F4 / 80 (правая панель) в негативных средах Cre (черный) и Cre положительных образцов (зеленый). Гистограммы представляют процент клеток (по оси Y) для сигнала YFP (ось x). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Эффективность маркировки в головном мозге от E10.5 ^Csf1r MeriCreMer Rosa26 ^LSL-eYFP embryospuС ОН-ТАМ при Е8.5. ( A ) Kit ⁺ CD45 ^{отрицательные} клетки строятся на основе экспрессии Kit и CD45 на живых клетках мозга (синие ворота, левая панель). AA4.1 и Kit в клетках Kit ⁺ CD45 ^neg . Синие ворота закрывают ячейки AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^neg (средняя панель). Сравнение маркировки YFP в AA4.1 ^{+ NEG} клетки Kit ⁺ CD45 (правая панель) в Cre отрицательного контроля (черный) и Cre положительных образцах (зеленый цвет). Гистограммы представляют процент клеток (по оси Y) для сигнала YFP (ось x). ( B ) ^Низкие ячейки Kit ⁺ CD45 строятся на основе выражения Kit и CD45 (синие ворота, левая панель). Выражение AA4.1 и Kit на Kit ⁺ CD45 клеток с ^{низким уровнем.} Синие ворота окружают EMP, как определено как AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^low cells (средняя панель). Сравнение маркировки YFP в AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^low Ячейки (правая панель) в Cre отрицательных элементах управления (черный) и Cre положительных образцов (зеленый). Гистограммы представляют процент клеток (по оси Y) для сигнала YFP (ось x). ( C ) Гемопоэтические клетки определяются как Kit ^neg CD45 ⁺ и строятся синим цветом (левая панель). F4 / 80 и CD11b на клетках Kit ^neg CD45 ⁺ . Макрофаги определяются как ^яркие клетки CD11b ⁺ F4 / 80 (средняя панель). Сравнение меток YFP в ^ярких CD11b ⁺ макрофагах F4 / 80 (правая панель) в негативных средах Cre (черный) и Cre положительных образцов (зеленый). Гистограммы представляют процент клеток (по оси Y) для сигнала YFP (ось x). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Различные волны гемопоэтических клеток-предшественников частично перекрываются в течение короткого периода времени, что делает анализ вклада каждой волны гематопоэза развития в иммунные клетки технически очень сложным.

Системы, индуцируемые тамоксифеном Cre, предлагают возможность маркировать определенные клетки во временном индуцибельном режиме и проводить анализ линии у эмбрионов или взрослых без необходимости в культуре ex vivo или in vitro или трансплантации. В индуцируемых тамоксифеном штаммах Cre создается гибридный ген между бактериальной Cre рекомбиназой и мутантной формой связывающего лиганда домена рецептора эстрогена человека (CRE-ER) или между улучшенным одноточечным мутантом Cre и двумя рецепторами эстрогена мыши (Мер-МСВЗ-Мер). Слияние Cre с эстрогенными рецепторами приводит к секреции цитоплазмы Cre по Hsp90, тем самым предотвращая ядерную Cre-опосредованную рекомбинацию. Тамоксифен (ТАМ) метаболизируетсяE печень в 4-гидрокситамоксифен (OH-TAM), его активный метаболит с высокой аффинностью связывания для рецептора эстрогена. Связывание OH-TAM с плавлением Cre приводит к нарушению взаимодействия с Hsp90, позволяя его транслокацию в ядро ​​и инициирование Cre-опосредованной рекомбинации. Было показано, что инъекция ТАМ или ОН-ТАМ в матке у беременных женщин активирует рекомбинацию в развивающемся эмбрионе. Администрация тамоксифена во время беременности может привести к аборту и, таким образом, уменьшить размер помета, но также предотвращает роды, если их доставить после середины беременности, и в этом случае требуется доставка щенка через операцию кесарева сечения. Чтобы уравновесить эффекты тамоксифена во время беременности, мы дополняем администрацию ОН-ТАМ полудозой прогестерона, чтобы улучшить выживание эмбрионов и снизить риск абортов. ¹⁷ .

Для доставки ТАМ или ОН-ТАМ беременным женщинам можно использовать несколько маршрутов. В настоящее время устная гаваГе или внутрибрюшинная (ip) инъекция используется для тамоксифена. Преимущество OH-TAM заключается в том, что он немедленно доступен, так как он не требует метаболизма печенью беременной плотины. Однако, в то время как тамоксифен очень легко растворяется в кукурузном масле, ОН-ТАМ очень трудно приготовить, используя тот же метод, и приводит к эмульсии. Это было предельным шагом в использовании ОН-ТАМ для мечения с помощью маточного импульса. Мы адаптировали протокол для подготовки OH-TAM, разработанный группой JF Nicolas ¹³ , где они используют касторовое масло PEG-35, растворитель с амфифильными свойствами для солюбилизации OH-TAM, поскольку растворение тамоксифена является одним из наиболее важных этапов В процедуре. Это позволяет воспроизводить и оптимально готовить ОН-ТАМ и значительно сокращает время подготовки тамоксифена. Кроме того, необходимо адаптировать концентрацию ОН-ТАМ для инъекции при использовании разных индуцибельных Cre-штаммов. Сочетание красителя (DAPI) и размер (FSC) имеет решающее значение для удаления мертвых клеток и клеточного мусора, соответственно. Мертвые клетки и мусор сильно аутофлуоресцентны в большинстве фиолетовых, синих и красных лазерных детекторов и могут препятствовать проточному цитометрическому анализу. Кроме того, мы не рекомендуем фиксировать клетки после окрашивания до анализа с помощью проточного цитометра. Фиксация может привести к изменениям в морфологии клеток и, таким образом, делает сложную дискриминацию по размеру на основе прямого и бокового рассеяния (FSC против SSC). Кроме того, фиксация образцов с PFA приводит к значительной потере интенсивности флуоресценции YFP.

Основное ограничение в этом протоколе заключается в том, что популяции не тестируются по их функциональности и потенциалу дифференциации. Чтобы преодолеть это, клетки можно сортировать по аналогичному протоколу с использованием флуоресцентно-активированного клеточного сортировщика (FACS) для проведения колониеобразующего анализа. В этом случае процедура должна выполняться в стерильных условиях и использовании эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) в буфере FACS, а не BSA. Низкая эффективность этикетирования, достигнутая этой методикой, и, следовательно, небольшое количество клеток YFP ^+, представляющих интерес для эмбриональной ткани, является серьезной проблемой при изучении фенотипа ЭМП. В этом протоколе используется 4-лазерный проточный цитометр. Также можно использовать проточный цитометр с 3 лазерами, но важно адаптировать панель антител, чтобы учесть увеличенное спектральное перекрытие между красителями. Кроме того, требуется титрование антител, чтобы найти соответствующую концентрацию при смене панели антител, и мы рекомендуем выполнять титрование антител и проверку новой панели антител в экспериментальном эксперименте, где все эмбрионы на ткань объединяются, чтобы увеличить количество Клетки анализировали на ткань.

Область биологии развития была революционизирована с помощью метода Cre / Lox, который позволяет проводить постоянную маркировку клеток in situ . Такой подход достигаетСпецифичность тканес- или клеточного типа посредством экспрессии рекомбиназы Cre под контролем конкретного промотора. В нашем случае мы решили изучить экспрессия рекомбиназы Cre под контролем промотора Csf1r (рецептор стимулятора колонии 1), важного рецептора митогенного и фактора роста для макрофагов и их предшественников с использованием штамма, разработанного группой Дж. Полларда ¹⁸ . Преимущество стратегии картирования судьбы, основанной на выражении Csf1r по сравнению с другими опубликованными стратегиями, заключается в том, что она позволяет маркировать клетки, полученные из желточного мешка (EMP и макрофаги), без маркировки каких-либо эмбриональных HSC ¹² . Штамм Cx3cr1 ^CreERT2 может также маркировать клетки желточного мешка без маркировки HSC ¹⁹ , однако он может только маркировать макрофаги и предшественники макрофагов, но он не маркирует предшественников EMP ¹ . У штамма Cx3cr1 ^CreERT2 есть такая же оговорка, как и Csf1r ^{MerCreMer, так как он не может различать макрофаги, полученные из однопотенциальных примитивных предшественников макрофагов или из EMP. Когда тамоксифен вводят уже в E7.5 как в Runx1 MerCreMer 16, так и в Kit MerCreMer 20 , клетки периферической крови всегда маркируются у взрослых, хотя и с очень низкой эффективностью, что демонстрирует маркировку HSC во время развития. Кроме того, Kit MerCreMer определяет соответствие букв ярлыков Kit + Sca1 + предшественников, тогда как EMP являются Kit + Sca1 минус 11 . Штамм Csf1r MeriCreMer не является детонацией, но он генерируется классическим аддитивным трансгенезом, поэтому экспрессия Cre не может полностью повторить эндогенную экспрессию Csf1r. Однако это имеет то преимущество, что можно избежать любых потенциальных дефектов развития вследствие гетерозиготной экспрессии Csf1r. Это важный фактор, который следует учитывать при анализеДругие стратегии картирования судьбы, используемые для исследований гематопоэза развития, такие как Runx1 MerCreMer , Kit MerCreMer и Cx3cr1 CreERT2 , где индуцибельный Cre вставлен - в эндогенный локус. Для Runx1 MerCreMer и Kit MerCreMer гемопоэтические дефекты развития описаны у гетерозиготных эмбрионов. В совокупности представленный здесь метод позволяет исследовать биологию желчного мешка EMP во время развития, а также макрофаги, полученные из желточного мешка, обнаруженные во взрослых тканях и отличающиеся от макрофагов, полученных из HSC. Это улучшит наше нынешнее понимание этой линии резидентных макрофагов и их конкретных функций во взрослой жизни. Недавно была улучшена иммунофенотипическая характеристика ЭМП с использованием методов сортировки клеток и колоний, демонстрирующих, что желточный мешок ЭМП специфически выражает CD41 и CD16 / 32 на ранних стадиях развития 11 . Однако специфика экспрессии CD41И CD16 / 32 нуждается в дальнейшей характеристике от E10.5 и выше, особенно в нише печени плода, используя модели картирования судьбы. Действительно, независимо от того, является ли экспрессия CD41 и CD16 / 32 по-прежнему специфичной для ЭМП по сравнению с эмбриональными HSC и предшественниками HSC в печени эмбрионов E10.5 - E14.5, необходимо выяснить. Представленный метод позволяет маркировать EMP, сгенерированный в желточном мешке, и следовать им во время эмбрионального развития, и это будет способствовать более детализированной характеристике фенотипа EMP, когда они высевают фетальную печень.}

Этот метод может быть важен в ближайшем будущем для изучения путей дифференцировки ЭМП. В то время как EMP появляются из эндотелия желточного мешка с E8.5 до E10.5 4, этот метод позволяет только маркировать долю предшественников, возникающих между E8.5-E9.5. Таким образом, ограничение этого метода заключается в том, что помечена только небольшая часть EMP, что затрудняет анализ в классических исследованиях потери функции с использованием floxed alleles для cАндитатных генов. Альтернативно, разреженная маркировка может стать преимуществом в клональных исследованиях дифференциации EMP in vivo с использованием клонального репортера. Тем не менее, эффективность маркировки должна быть охарактеризована для каждого используемого релята floxed или floxed allele, поскольку эффективность рекомбинации конструкций с плавающей точкой зависит от геномного локуса (floxed alleles) или конструкции репортера Rosa26. Действительно, различные репортерные линии Rosa26 доступны с различными промоторами, и сообщается, что штаммы ^{Rosa26 tdTomato} и Rosa26 ^mTmG обладают большей эффективностью рекомбинации, чем линия Rosa26 ^LSL-eYFP . В этом протоколе используется штамм-репортер мыши, который представляет ^собой линию Rosa26 ^LSL-eYFP , которая не может предоставить информацию о динамическом процессе созревания предшественника, упомянутом в разделе результатов. Вопрос о процессе созревания может быть частично рассмотрен с использованием различных репортерных штаммов, таких как Rosa26 ^mTmG . В таком штамме клетки могут отделятьсяВ зависимости от времени, прошедшего со времени события рекомбинации. Все клетки штамма Rosa26 ^mTmG экспрессируют связанный с мембраной флуоресцентный белок tdTomato и рекомбинацию Cre реплицируют кассету tdTomato и позволяют экспрессировать связанный с мембраной GFP. Поскольку tdTomato имеет длительный период полураспада, ячейки, которые все еще содержат tdTomato, но начали экспрессировать GFP (вскоре после рекомбинации), являются tdTomato ⁺ GFP ^{low / int} и могут быть отличены от tdTomato ^neg GFP ⁺ клеток, которые больше не выражают tdTomato и Выражают более высокие уровни GFP (позже после рекомбинации).

Как обсуждалось выше, препарат ОН-ТАМ является критическим шагом для последовательной доставки аналогичных доз ОН-ТАМ между экспериментами и уменьшения побочных эффектов тамоксифена. Совместное введение прогестерона также полезно для ограничения вредного воздействия тамоксифена на беременность. Другим критическим элементом протокола является жизнеспособность одноклеточного суспензииN, полученных из разных эмбриональных тканей. Обычно мы получаем> 90% жизнеспособных клеток для проточного цитометрического анализа. Для достижения этой цели крайне важно быстро следовать всем шагам и поддерживать все образцы на льду после сбора ткани. Для идентификации границ ворот и управления спектральным перекрытием многоцветных панелей требуются соответствующие элементы управления, такие как незакрашенные образцы, одиночные пятна и флуоресцентные минус один (FMO). Изменения в антителе должны быть проверены с точки зрения титрования антител и спектрального перекрытия. Наконец, выбор репортерского штамма Rosa26 должен быть адаптирован к исследованному научному вопросу.

Авторам нечего раскрывать.

Авторы благодарят профессора Фредерика Гейссмана и профессора Кристиана Шульца за проницательные дискуссии; Д-р Ханна Гарнер за критическое чтение рукописи, д-ра Ксавьера Монтагутелли и д-ра Жана Жюберта и сотрудников животного объекта Institut Pasteur для поддержки с мышами; И Паскаль Дарденн и Вытаут Борейкайте, научный сотрудник Amgen, за их техническую помощь. Исследования в лаборатории EGP финансируются Институтом Пастера, CNRS, Cercle FSER (FRM) и стартовым пакетом от Institut Pasteur и консорциума REVIVE. LI поддерживается стипендией PhD от консорциума REVIVE.