Identifizierung von Erythromyeloid Progenitoren und deren Nachkommen in der Maus Embryo Durch Durchflusszytometrie

Während die Infiltrierung von Makrophagen kontinuierlich zu erwachsenen Geweben aus zirkulierenden Vorläufern rekrutiert wird, säen sich residente Makrophagen ihr Gewebe während der Entwicklung, wo sie ohne weitere Eingaben von Vorläufern aufrechterhalten werden. Die Vorläufer für Resident-Makrophagen wurden vor kurzem identifiziert. Hier stellen wir Methoden für die genetische Schicksalskartierung der residenten Makrophagen-Vorläufer vor.

Makrophagen sind professionelle Phagozyten aus dem angeborenen Arm des Immunsystems. Im stationären Zustand werden sessile Makrophagen in erwachsenen Geweben gefunden, wo sie als Frontline-Sentinels der Infektion und Gewebeschädigung wirken. Während andere Immunzellen kontinuierlich von hämatopoetischen Stammzellen und Progenitorzellen (HSPC), die sich im Knochenmark befinden, erneuert werden, wurde gezeigt, dass eine Reihe von Makrophagen, die als Resident-Makrophagen bekannt sind, in Geweben ohne Input von Knochenmark-HSPCs selbstgehalten werden. Diese Linie wird durch Mikroglia im Gehirn, Kupffer Zellen in der Leber und Langerhans Zellen in der Epidermis unter anderem veranschaulicht. Die Darm- und Colon-Lamina-Propria sind die einzigen erwachsenen Gewebe ohne HSPC-unabhängige Resident-Makrophagen. Neuere Untersuchungen haben festgestellt, dass residente Makrophagen aus der extra-embryonalen Dottersack-Hämatopoese von Progenitor (en) stammen, die sich von fetalen hämatopoetischen Stammzellen (HSC) unterscheiden. Unter Dottersack endgültige Hämatopoese, eRythromyeloid-Vorläufer (EMP) ergeben sowohl erythroide als auch myeloide Zellen, insbesondere residente Makrophagen. EMP werden nur innerhalb des Dottersackes zwischen E8.5 und E10.5 Tagen der Entwicklung erzeugt und sie wandern in die fetale Leber, sobald die Zirkulation verbunden ist, wo sie sich erweitern und differenzieren bis mindestens E16.5. Ihre Nachkommenschaft umfasst Erythrozyten, Makrophagen, Neutrophilen und Mastzellen, aber nur EMP-abgeleitete Makrophagen bestehen bis zum Erwachsenenalter in Geweben. Die vorübergehende Natur von EMP-Emergenz und die zeitliche Überlappung mit HSC-Generation macht die Analyse dieser Vorläufer schwierig. Wir haben ein Tamoxifen-induzierbares Schicksal-Mapping-Protokoll auf der Grundlage der Expression des Makrophagen-Cytokin-Rezeptor-Csf1r-Promotors zur Charakterisierung von EMP- und EMP-abgeleiteten Zellen in vivo durch Durchflusszytometrie etabliert.

Es gibt mehrere aufeinanderfolgende, aber überlappende Wellen von hämatopoetischen Vorläufern während der Entwicklung, deren myeloide Nachkommen im Erwachsenenalter bleiben. Zuerst treten in der Maus-Dottersack ^{1 , 2} zwischen E7.5-E8.25 unipotent "primitive" Vorläufer auf und geben embryonale Makrophagen ohne monozytische Zwischenstufe hervor. Ob Makrophagen aus primitiven Vorläufern im erwachsenen Gehirn bestehen, da die Mikroglia ein Gegenstand der aktiven Untersuchung bleibt. Zweitens entstehen Erythro-Myeloid-Vorläufer (EMPs) im Eigelb-Sack bei E8.5, treten in den Blutkreislauf ein und kolonisieren den Embryo. EMPs entstehen aus dem hämogenen Endothel des Dottersackes in einem Runx1-abhängigen endothelial-zu-hämatopoetischen Übergang ^{3 , 4} . Während EMP in Makrophagen im Dottersack differenzieren kann, kolonisieren sie auch die fetale Leber vom embryonalen Tag (E) 9 ⁵ und unterscheiden sichIn Erythrozyten, Megakaryozyten, Makrophagen, Monozyten Granulozyten und Mastzellen eindringen ⁶ . Die Makrophagen, die sich aus EMPs ergeben, zeigen proliferative Kapazitäten in Entwicklungs- und Erwachsenengeweben. Ob EMP-abgeleitete Makrophagen die Monozytenstadien der Differenzierung umgehen, ist noch umstritten, da sehr wenig über ihren Differenzierungsweg ^{7 , 8 bekannt ist} . Schließlich treten Hämatopoetische Stammzellen (HSCs) bei E10.5 innerhalb des Embryos aus der Aorta-Gonaden-Mesonephros-Region auf und wandern in die fetale Leber. HSCs mit Langzeit-Wiederauffüllungsvermögen werden erst nach E11 (bei der 42 Somite-Pair-Stufe) erkannt ⁹ . Dort erweitern und unterscheiden sie sich von E12.5 bis die endgültige Hämatopoese beginnt, sich auf das Knochenmark zu verlagern, das die vorherrschende Stelle der Blutzellproduktion für die Dauer des postnatalen Lebens wird ¹⁰ .

Die spAtiale und zeitliche Überlappung beim Auftauchen sowie gemeinsame immuno-phänotypische Marker hat damit unsere Fähigkeit, die spezifischen Beiträge dieser Wellen von embryonalen hämatopoetischen Vorläufern zu unterscheiden, behindert. Während sowohl EMP als auch HSC in einer Runx1-abhängigen Weise erzeugt werden und der Transkriptionsfaktor Myb und der Wachstumsfaktor-Rezeptor Csf1r (Colony-Stimulating Factor 1 Receptor, auch bekannt als Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor-Rezeptor) genannt werden, können sich EMPs unterscheiden HSCs durch ihren Mangel an lymphoiden Potenzialen, sowohl in vitro als auch in vivo , ihr Mangel an langfristigem Rezyklierungspotential und mangelnde Oberflächenexpression des Linienmarkers Sca-1 ¹¹ . Genetische Schicksal-Mapping-Modelle sind erforderlich, um Makrophagen-Ontogenese zu charakterisieren, da sie die Ausrichtung embryonaler Progenitoren in einer zellspezifischen und zeitspezifischen Weise ermöglichen. Hier stellen wir das Schicksal-Mapping-Protokoll vor, das in unserem Labor verwendet wird, um zwischen den beiden Linien zu unterscheidenS von Makrophagen, die in den meisten erwachsenen Geweben gefunden wurden: HSC-abgeleitete infiltrierende Makrophagen und HSC-unabhängige Resident-Makrophagen.

Gewebe-residente Makrophagen wurden auf Myb-unabhängige Vorläuferzellen zurückgeführt, die den Cytokinrezeptor Csf1r ¹² exprimieren und im Embryo bei E8.5-E10.5 unter Verwendung von drei komplementären Fate-Mapping-Strategien vorhanden sind ⁶ . Um die Dottersack-Hämatopoese ohne Etikettierung von fetalen HSCs zu untersuchen, verwenden wir einen transgenen Stamm, Csf1r ^MeriCreMer , der ein Tamoxifen-induzierbares Fusionsprotein von 'verbesserter' Cre-Rekombinase und zwei Maus-Östrogen-Rezeptoren (Mer-iCre-Mer) unter der Kontrolle von Der Csf1r-Promotor. Daher wird die Cre-Rekombinase in Csf1r- exprimierenden Zellen während eines begrenzten Zeitfensters aktiv sein. Bei Verwendung eines Reporterstamms, der ein fluoreszierendes Protein stromabwärts einer lox-STOP-lox-Kassette (Rosa26 ^LSL-eYFP ) enthält, führt es zu einem bleibendenEnt genetische Markierung der zur Zeit der Induktion vorhandenen Zellen, aber auch ihrer Nachkommenschaft. Die Verabreichung von E8.5 der aktiven Form von Tamoxifen, 4-Hydroxytamoxifen (OH-TAM), Etiketten EMPs und Makrophagen, ohne Etikettierung von Dottersack-Unipotenten "primitiven" Vorläufern oder fetalen HSCs. Dabei haben wir den Immunphänotyp von EMPs und ihre Nachkommen bei der embryonalen Entwicklung charakterisiert und den Beitrag von Dottersack-abgeleiteten Makrophagen zu den erwachsenen Makrophagen-Pools beurteilt. Weitere Arbeiten sind erforderlich, um zu charakterisieren, ob primitive Progenitor-abgeleitete Makrophagen auch mit diesem Ansatz markiert werden und ob sie zu erwachsenen Makrophagenpools beitragen können.

Tierische Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem anerkannten institutionellen Tierpflege- und Verwendungsausschuss des Instituts Pasteur (CETEA) durchgeführt.

1. In der Utero Pulse Markierung in Csf1r ^MeriCreMer Rosa ^LSL-YFP Embryos

1. Bereiten Sie die Stammlösung von 4-Hydroxytamoxifen (OH-TAM, 50 mg / ml) vor.
   1. Unter der Fumehood die 25 mg-Durchstechflasche OH-TAM öffnen und 250 μl Ethanol (100%) zugeben.
   2. Übertragen Sie die OH-TAM-Lösung auf ein 2-mL-Mikrozentrifugenröhrchen mit einer abgeschnittenen Spitze und drehen Sie mit maximaler Geschwindigkeit für 10 min.
   3. Sonate 30 min in einem Sonicator Bad.
   4. Füge 250 μl PEG-35-Rizinusöl unter die Fumehood hinzu, um eine 50 mg / ml Stammlösung zu erhalten.
      HINWEIS: PEG-35 Rizinusöl ist ein Lösungsmittel mit amphiphilen Eigenschaften, das hydrophobe Moleküle bindet und in wässrigen Lösungsmitteln löst.
   5. Vortex für ca. 5 minMit maximaler Geschwindigkeit und Sonate 30 min in einem Sonicator Bad.
   6. Aliquot 90 μL (4,5 mg) pro Mikrozentrifugenröhrchen (1 Aliquot pro Injektion).
   7. Bei 4 ° C für 1 Woche oder bei -20 ° C für Langzeit wie oben beschrieben ¹³ lagern.
2. Vorbereitung der Stammlösung von Progesteron (10 mg / ml)
   1. Füge 250 μl 100% Ethanol zu 25 mg Progesteron hinzu, um eine 10 mg / 100 μl Suspension unter der Fumehood herzustellen. Vortex vorsichtig
   2. Füge 2250 μl autoklaviertes Sonnenblumenöl hinzu, um 10 mg / ml Progesteronlösung unter der Haube zu produzieren.
   3. Vortex für ca. 5 min bei Höchstgeschwindigkeit, Aliquot und bei 4 ° C aufbewahren. Beachten Sie, dass die Lösung bei der Lagerung klar ist.
3. Tamoxifen-Verabreichung
   HINWEIS: Die embryonale Entwicklung wurde unter Berücksichtigung des Tages der vaginalen Plug-Bildung als embryonalen Tag (E) 0,5 geschätzt. Die Rekombination wird durch Einzelinjektion bei E8.5 induziertIn schwangere Csf1r ^MeriCreMer Frauen ¹² . Nachtrag OH-TAM mit 37,5 μg pro g Progesteron zur Verringerung der Abtreibungsraten nach der Tamoxifen-Verabreichung. Injizieren um 13.00 Uhr (für Vaginalstecker am Morgen).
   1. Am Morgen der Injektion, Sonic ein Aliquot der OH-TAM-Lösung für 10 min (oder bis vollständig resuspended).
   2. Füge 360 ​​μl NaCl 0,9% unter dem Fumehood hinzu, um eine 10 mg / mL OH-TAM-Lösung zu erhalten und gründlich zu verwirren. Sonate, bis die Lösung klar und vollständig resuspendiert ist (mindestens 30 min).
   3. Vorwärmender Progesteron auf Raumtemperatur.
   4. Mischen Sie 450 μl OH-TAM und 225 μl Progesteron in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Wirbel.
   5. Sonate mindestens 10 min und beladen auf eine 1 mL Spritze mit einer 25G Nadel.
   6. In der Tierhaltung wiegen die schwangere Frau ( Csf1r ^MeriCreMer Frauen sind in einem Inzucht-FVB genetischen Hintergrund und typische wiegen betweEn 25 und 33 g).
   7. Führen Sie eine intra-peritoneale Injektion durch langsames Einspritzen des berechneten Volumens in die Maus durch. Nach dem Abziehen der Nadel, sanft auf die Punktion Wunde drücken und massieren den Bauch, um die OH-TAM zu verteilen.
      HINWEIS: Die OH-TAM-Injektionsdosis beträgt 75 mg / kg und die Progesteron-Dosis beträgt 37,5 mg / kg. Tabelle 1 liefert das Volumen, um in schwangere Frauen einzuspritzen.

Tabelle 1: Injektionsvolumen von 4-OH-Tamoxifen (OH-TAM). Volumen für eine Einzelinjektion bei E8,5 von 75 μg pro g (Körpergewicht) von OH-TAM, ergänzt mit 37,5 μg pro g Progesteron.

2. Dissektion der Dottersack (YS) und der fetalen Leber (FL)

ANMERKUNG: Rigoröse sterile Techniken sind nicht notwendig, wenn man Embryonen manipuliert, es sei denn, sie werden für die langfristige Kultur verwendet werden. Trotzdem muss der Arbeitsbereich sauber und in der Folie unter saugfähigem Papier abgedeckt werden.

1. Bereiten Sie eiskaltes Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und die Verdauungsmischung vor (PBS, enthaltend 1 mg / ml Kollagenase D, 100 U / ml Deoxyribonuklease I (DNase I) und 3% fötales Rinderserum).
2. Opfer schwangere Frauen von cerVikale Versetzung am geforderten Schwangerschaftstag ( zB embryonale Stufe E10.5).
3. Klemmen Sie die Haut gerade über die Genitalien und machen Sie einen kleinen Einschnitt an der Mittellinie mit einer Schere. Ziehen Sie die Haut in Richtung Kopf, um die Körperwand ohne Pelz vollständig auszusetzen. Schneide die Bauchmuskeln, um die inneren Organe freizulegen und den Darm zu drücken, um die beiden Uterushörner freizulegen.
4. Mit mittelgroßen, stumpfen Pinzetten, packt das Fett-Pad an den Eierstock und sanft ziehen Sie den Uterus. Schneiden Sie auf der zervikalen Ebene der Uterushörner und heben Sie die Hörner aus der Peritonealhöhle. Entfernen Sie das Fett-Pad, um die Uterushörner vollständig zu befreien und die Hörner aus dem Eierstock auf jeder Seite zu schneiden.
5. Setzen Sie die Hörner in eiskaltes PBS in eine 10 mm Petrischale. Die Uterusmuskelschichten an einer Extremität (zervikales Ende) schnell greifen und feine Scheren zwischen der Muskelschicht und dem dezidualen Gewebe schieben, um die Embryonen mit dem umgebenden dezidualen Gewebe freizusetzen.
   HINWEIS: Muskel neigt dazu, sich schnell zu beendenDie Extraktion, so muss dieser Schritt so schnell wie möglich sein.
6. Verwenden Sie ein Paar feine Zangen, um die Reichert-Membran und die Plazenta abzuschneiden.
7. Entfernen Sie vorsichtig den Dottersack und legen Sie ihn in eine 24-Well-Gewebekulturplatte mit 0,5 ml Verdauungsmischung.
   HINWEIS: In diesem Schritt kann embryonales Blut gesammelt werden.
   1. Unmittelbar nach dem Abtrennen der Nabel- und Vitellingefäße den Embryo in eine 12-Well-Gewebekulturplatte mit 10 mM eiskalter Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) überführen. Entkapseln Sie den Embryo mit scharfen feinen Scheren, versuchen, so viel wie möglich zu beschränken Gewebe Dilatisierung. Inkubieren auf Eis für 10-15 min und sammle das EDTA mit dem Blut.
8. Entfernen Sie das Amnion um den Embryo herum.
9. Für Stufen
10. Schneide den Kopf des Embryos unsPinzette oder feine Schere. Den Kopf auf eine 24-Well-Platte mit 0,5 mL Verdauungsmischung überführen.
    ANMERKUNG: Der Neuroektoderm und das Gehirn in späteren Stadien werden weiter für die Durchflusszytometrieanalyse seziert; Den umliegenden Gefäßplexus vorsichtig entfernen.
11. Schneide den Embryo über dem Hinterbein und entferne die Forelimbs.
12. Um die Leber zu isolieren, öffne den Thorax mit einem Paar feiner Pinzette. Klemmen Sie anteriorly zum Herzen und ziehen Sie leicht, während Sie die zweite Pinzette benutzen, um die Organe vom Körper zu befreien.
    1. Die fetale Leber sorgfältig von Herz und Darm trennen. Übertragen Sie die fetale Leber auf eine 24-Well-Platte mit 0,5 ml Verdauungsmischung. Die Übertragung unter dem Sektionsmikroskop sorgfältig überwachen.
13. Sammeln Sie den Schwanzbereich (oder einen anderen Embryonteil) für die Genotypisierung durch den Polymerasekettenreaktionstest (PCR).
    ANMERKUNG: Andere Gewebe und Organe können von E10.5 Embryonen für eine ähnliche Analyse mit Durchflusszytometrie geerntet werden. Blut, Kopf SkiN, Aorta-Gonaden-Mesonephros-Region (AGM), Herz und Neuroectoderm können bei E10.5 gesammelt werden. In späteren Stadien können auch Lunge, Niere, Milz und Bauchspeicheldrüse gesammelt werden. Eine detaillierte Beschreibung der Sektion der AGM in verschiedenen Entwicklungsstadien wurde zuvor beschrieben ¹⁴ .

3. Verarbeitung von embryonalen Geweben für die Durchflusszytometrie

1. Inkubieren Sie die Organe (in den Verdauungsmischung) für 30 min bei 37 ° C.
2. Übertragen Sie das Gewebe und die enzymatische Lösung auf ein 100 μm Sieb, das in eine 6-Well-Gewebekulturplatte gefüllt ist, die mit 6 ml FACS-Puffer (0,5% Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM EDTA in 1x PBS gefüllt ist). Mechanisch dissoziieren durch sanftes Zerkleinern mit dem schwarzen Gummikolben einer 2-ml-Spritze, um eine Einzeller-Suspension zu erhalten.
   HINWEIS: Von nun an sollten alle Schritte bei 4 ° C durchgeführt werden.
3. Die Zellsuspension mit einer Pasteurpipette sammeln und in ein 15-ml-Röhrchen überführen.
4. SpiN für 7 min bei 320 xg bei 4 ° C. Verwerfe den Überstand durch Aspiration.
5. Resuspendieren des Pellets in 60 & mgr; l Fc-blockierenden Puffer (CD16 / CD32-blockierenden Antikörper, verdünnt 1/50 in FACS-Puffer).
   1. Übertragen Sie 50 & mgr; l der Einzelzell-Suspension pro Vertiefung in einer runden Boden 96 Multi-Well-Platte. Inkubieren für mindestens 15 min auf Eis.
      HINWEIS: Die Färbung kann auch bei 5 ml Polystyrol-FACS-Röhrchen durchgeführt werden, wenn eine kleine Anzahl von Proben behandelt wird.
   2. Übertragen Sie die restlichen 10 & mgr; l in ein 5 ml Polystyrol-FACS-Röhrchen, um einen Pool der Proben von jedem Gewebe zu erhalten. Dieser Pool dient als Kontrollen ( dh ungefärbte Proben und fluoreszierende minus eins (FMO) Kontrollen für jedes Fluorochrom). Übertragen Sie 50 μl des Pools für jede fluoreszierende minus eins (FMO) Kontrolle (eine pro Fluorochrom) auf die 96 Multi-Well Platte.
      HINWEIS: Jede FMO-Kontrolle enthält alle Fluorochrom-gekoppelten Antikörper aus dem Antikörper-Panel, mit Ausnahme derjenigenDas wird gemessen. FMOs werden verwendet, um Gate-Grenzen zu identifizieren und für die spektrale Überlappung in mehrfarbigen Platten zu steuern. Um die Variationen im Hintergrund und die Autofluoreszenz zwischen verschiedenen Geweben korrekt anzugehen, ist es wichtig, diese Kontrollen aus dem Pool von Proben jedes Gewebes herzustellen. Die entsprechende Kontrolle für die YFP-Expression sind die Proben von Cre-negativen Embryonen, die durch PCR-Genotypisierung bestätigt werden.

4. Oberflächen-Antigen-Färbung

1. Bereiten Sie den Antikörper-Mix in FACS-Puffer vor (Tabelle 2). 50 μl Antikörpermischung pro Probe zubereiten.
   1. Verwenden Sie die folgenden Fluorochrom-gekoppelten Antikörper: anti-CD45.2 (Klon 104); Anti-CD11b (Klon M1 / ​​70); Anti-F4 / 80 (Klon BM8); Anti-AA4.1 (Klon AA4.1); Anti-Kit (Klon 2B8); Und anti-Ter119 (Klon Ter119).
   2. Vorbereitung von sechs Antikörpermischungen für die FMO-Kontrollen im FACS-Puffer. 50 μl Antikörpermischung pro Kontrollprobe zubereiten.
      NEINTE: Die Antikörperverdünnung in der Antikörpermischung ist zweimal mehr konzentriert als die in der Materialtabelle angegebene Endkonzentration. Für ein Panel mit sechs Fluorochrom-gekoppelten Antikörpern werden 6 FMO-Kontrollen vorbereitet. Tabelle 2 liefert die Zusammensetzung der Antikörpermischung und FMO-Kontrollen für ein Röhrchen.

Tabelle 2: Volumen der Antikörper, die für die Färbung und Fluoreszenz von minus eins (FMO) Kontrollen verwenden. Volumen (& mgr; l) des Antikörpers, der für ein Endvolumen von 50 & mgr; l erforderlich ist.

2. Füge 50 μl der Antikörpermischung zu den Proben in der 96-Multiwell-Platte hinzu (Endvolumen während der Färbung beträgt 100 μl). Vorsichtig zweimal abtupfen und 30 Minuten auf Eis aufkochen lassen.
3. Die 96-Multiwell-Platte für 7 min bei 320 xg bei 4 ° C drehen und den Überstand verwerfen. Resuspend in 200 μl FACS-Puffer.
4. Wiederholen Sie den Waschvorgang (Schritt 4.3) zweimal mit 150 μL FACS-Puffer.
5. Filtriere die Proben und die Kontrollen (FMOs und ungefärbte Poolproben) in 5 ml Polystyrolröhrchen durch ein 70 μm Sieb. Auf Eis aufbewahren bis zum Erwerb.

5. Identifizierung von EMPs und YS-abgeleiteten Makrophagen durch Durchflusszytometrie

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde mit einem 4 Laser-Durchflusszytometer eqMit einem 405 nm Violett-Laser, einem 488 nm Blue Laser, einem 562 nm gelben Laser und einem 638 nm Red Laser.

1. Bereiten Sie Kompensationsperlen für jeden gekoppelten Antikörper nach den Anweisungen des Herstellers vor. Verwenden Sie ungefärbte Proben und Kompensationsperlen, um Laserintensitäten zu optimieren.
2. Um Torgrenzen zu identifizieren, verwenden Sie FMO (Fluoreszenz minus eins) Kontrollen für jeden Antikörper.
3. Um tote Zellen auszuschließen, füge 1 μl DAPI (1 mg / ml) dem Röhrchen (enthaltend 200 μl gefärbte Zellsuspension) 1 min vor der Akquisition zu. Verwenden Sie das starke DAPI-Signal und den vorwärts gestreuten Parameter (FSC), um den Ausschluss von toten Zellen und Trümmern auszuführen.
   HINWEIS: Verwenden Sie Software aus dem Durchflusszytometer, um Tore während der Akquisition zu ziehen. Kompensationsmatrix und Analyse können nach der Probenerfassung mit anderen handelsüblichen Software durchgeführt werden.
4. Verwenden Sie Vorwärts- und Seitenstreuung (FSC vs SSC), um Live-Zelle und Doublet-Diskriminierung aus Gesamtereignissen durchzuführen.
5. Erstellen Sie Fluoreszenz-Punkt-Diagramme in der Log-Skala-Achse und zeichnen Sie Tochter-Gates, um zuerst Erythrozyten (Ter119 ⁺ ) auszuschließen und dann Vorläuferzellen (Kit ⁺ ) und hämatopoetische Zellen (CD45 ⁺ Kit ^neg ) zu identifizieren (siehe Abbildung 1 ).
6. Erstellen Sie Fluoreszenzhistogramme, um die Markierungseffizienz von YFP unter den verschiedenen identifizierten Populationen im YS ( Abbildung 2 ), der fetalen Leber ( Abbildung 3 ) und des Gehirns zu quantifizieren ( Abbildung 4 ).

Die genetische Schicksal-Kartierung wurde durch Verabreichung bei E8.5 von OH-TAM in Csf1r-Mer-iCre-Mer-Weibchen, die mit Männern zusammenhingen, die einen Rosa26-LSL-eYFP-Reporter tragen, erreicht. In Gegenwart von OH-TAM führt die Exzision der Stop-Kassette zur permanenten Expression von YFP in den Zellen, die Csf1r exprimieren . Wir sammelten zwei hämatopoetische Gewebe: den Dottersack und die fetale Leber und ein nicht-hämatopoetisches Gewebe, das Neuroectoderm, von den Embryonen bei E10.5. Einzelzellige Suspensionen wurden durch enzymatische und mechanische Dissoziation erhalten und Proben wurden durch Fließzytometrie nach Färbung mit fluoreszenzgekoppelten Antikörpern analysiert. Nach Ausschluss von toten Zellen und Dubletten wurden Einzelzellsuspensionen analysiert ( Abbildung 1 ). Alle Tore wurden mit Fluoreszenz-Minus-Eins (FMO) gesteuert. Es wird empfohlen, auch einen Erythrozytenausschluss (Ter119 ⁺ Zellen) durchzuführen, um die Klarheit der Analyse zu verbessern ( Abbildung 1B ). Unter Verwendung der Zelloberflächenmarker Kit (Vorläufer Marker) und CD45 (Hämatopoetische Zellen Marker) konnten wir drei Populationen von Zellen von Interesse unterscheiden: Kit ⁺ CD45 ^neg ; Kit ⁺ CD45 ^low und Kit ^neg CD45 ⁺ ( Abbildung 1 ). Die Progenitoren wurden weiter analysiert, basierend auf ihrer Expression von AA4.1 ( Fig. 2-4 ). Tatsächlich ist AA4.1 ein Oberflächenmarker , die die Anreicherung der Vorläuferpopulation innerhalb erythromyeloid Progenitoren im Dottersack ermöglicht, wie in ¹⁵ koloniebildenden Assays gezeigt. Sobald die Populationen von Interesse identifiziert wurden, quantifizierten wir die YFP-Markierungseffizienz in jeder Population mit Histogrammen. Unter den Dottersack-Kit ⁺ Progenitoren enthalten sowohl CD45 ^neg ( Abbildung 2A ) als auch CD45 ^low ( Abbildung 2B ) Zellpopulationen AA4.1 ⁺ YFP ⁺ Zellen. Allerdings ist AA4.1 ⁺ YFP ^{+ Zellen in der Leber und im Gehirn finden sich nur in der Kit + CD45 niedrigen Progenitorpopulation ( Abbildung 3B und 4B ). Da das Gehirn keine aktive Stelle der Hämatopoese ist, können die in diesem Gewebe gefundenen Vorläufer den zirkulierenden Vorläufern entsprechen. Dies schlägt auch einen Prozeß der Progenitorreifung vor, wenn sie vom Dottersack zur fetalen Leber und den peripheren Geweben wandern. Kit + Progenitoren zuerst AA4.1 ausdrücken, unabhängig von CD45-Expression, aber durch die Zeit, in der sie die Zirkulation und die fetale Leber erreichen, exprimieren alle AA4.1 + YFP + Vorläufer die nachweisbaren Mengen an Zelloberfläche CD45. Makrophagen, definiert als F4 / 80 helle CD11b + , wurden im Kit neg CD45 + Gate gefunden ( Abbildung 2-4 ). Makrophagen im E10.5-Dottersack, Leber und Gehirn wurden effizient markiert (60 bis 80% der F4 / 80 hellen CD11b + -Zellen sind YFP + ) b Ya einzelne OH-TAM-Verabreichung bei E8.5 ( Abbildung 2C , 3C und 4C ).}

Um die Markierungseffizienz zwischen Würfen zu vergleichen, empfehlen wir, eine interne Kontrolle für die Rekombinationseffizienz zu verwenden. Die Variabilität des Expressionsgrades des Reporters kann zwischen Versuchen beobachtet werden, da Variationen des Entwicklungszeitpunkts zwischen Würfen und Mausstämmen auftreten, wenn OH-TAM in utero injiziert wird. Daher empfehlen wir, dass die Embryo-Inszenierung von E8.5 bis E11.5 Embryonen durch ein paar Pärchenzählungen durchgeführt wird. In diesem Protokoll schlagen wir vor, die Markierungseffizienz in den Gehirn residenten Makrophagen (Microglia) als Referenz zu verwenden, um die Effizienz der Cre-Rekombination zwischen verschiedenen Experimenten und Stämmen zu vergleichen ( Abbildung 4C ). Andere Resident-Makrophagen könnten verwendet werden, aber Mikroglia waren die ersten Zellen, die als Dottersack-abgeleitete Makrophagen beschrieben wurdenEf "> 16 und stellen die am häufigsten vorkommende Population von Gewebe-residenten Makrophagen bei E10.5 dar. So kann die YFP-Markierung in Mikroglia verwendet werden, um die Schicksal-Mapping-Effizienz in jedem Experiment zu bewerten und Daten von verschiedenen Würfen zu vergleichen.

Abbildung 1: Gating-Strategie zur Identifizierung von Progenitorzellen (Kit ⁺ CD45 ^neg und Kit ⁺ CD45 ^low ) und differenzierten hämatopoetischen Zellen (Kit ^neg CD45 ⁺ ). ( A ) Die Unterscheidung von lebenden Zellen und Einzelstücken erfolgt unter Verwendung von DAPI-Färbung und Vorwärts- und Seitenstreuung (FSC / SSC). ( B ) Nach dem Ausbruch der roten Blutkörperchen (Ter119 ^neg ) werden drei Populationen von interessierenden Zellen auf der Basis der Zelloberflächenexpression von Kit und CD45 identifiziert: Kit ⁺ CD45 ^neg ; Kit ⁺ CD45 ^niedrig und Kit ^neg CD45 ⁺ Zellen. ( C ) Csf1r-exprimierende Zellen, die vorliegen, wenn OH-TAM injiziert wird und deren Nachkommen in Cre-Rekombinase-positiven Embryonen als Expression von YFP im Vergleich zu den Cre-rekombinase-negativen Embryos identifiziert werden (später bestätigt durch Polymerase-Ketten-Reaktionstest, PCR). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2: Kennzeichnungseffizienz im Dottersack aus E10.5 Csf1r ^MeriCreMer Rosa26 ^LSL-eYFP embrympulsiert mit OH-TAM bei E8.5. ( A ) Kit ⁺ CD45 ^Neg- Zellen werden basierend auf Kit- und CD45-Expression auf lebenden Dottersackzellen (blaues Tor, linkes Feld) gated. AA4.1 und Kit Expression auf Kit ⁺ CD45 ^neg Zellen. BluE Tor schließt AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^neg Zellen (Mitteltafel) ein. Vergleich von YFP Kennzeichnung in AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^neg Zellen (rechtes Bild) in Cre Negativkontrollen (schwarz) und Cre - positive Proben (grün). Histogramme repräsentieren den prozentualen Anteil der Zellen (y-Achse) positiv für das YFP-Signal (x-Achse). ( B ) Kit ⁺ CD45 ^niedrige Zellen werden basierend auf Kit und CD45-Expression (blaues Gate, linkes Panel) gated. AA4.1 und Kit Ausdruck auf Kit ⁺ CD45 ^niedrigen Zellen. Blaues Tor umschließt EMP, wie definiert als AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^niedrige Zellen (Mittelfeld). Vergleich der YFP-Kennzeichnung in AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^niedrigen Zellen (rechte Seite) in Cre Negativkontrollen (schwarz) und Cre positive Proben (grün). Histogramme repräsentieren den prozentualen Anteil der Zellen (y-Achse) positiv für das YFP-Signal (x-Achse). ( C ) Hämatopoetische Zellen sind als Kit ^neg CD45 definiert ^{+ und gated in blau (linkes Panel). F4 / 80 und CD11b Expression auf Kit neg CD45 + Zellen. Makrophagen sind definiert als F4 / 80 helle CD11b + Zellen (Mittelfeld). Vergleich der YFP-Beschriftung in F4 / 80 helle CD11b + Makrophagen (rechte Seite) in Cre Negativkontrollen (schwarz) und Cre positive Samples (grün). Histogramme repräsentieren den prozentualen Anteil der Zellen (y-Achse) positiv für das YFP-Signal (x-Achse). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.}

Abbildung 3: Kennzeichnungseffizienz in der Leber aus E10.5 Csf1r ^MeriCreMer Rosa26 ^LSL-eYFP embrympulsiert mit OH-TAM bei E8.5. ( A ) Kit ⁺ CD45 ^Neg- Zellen werden basierend auf Kit und CD45 gatedAusdruck auf Leberzellen (blaues Tor, linkes Feld). AA4.1 und Kit Expression auf Kit ⁺ CD45 ^neg Zellen. Blaues Tor umschließt AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^neg Zellen (Mitteltafel). Vergleich von YFP Kennzeichnung in AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^neg Zellen (rechtes Bild) in Cre Negativkontrollen (schwarz) und Cre - positive Proben (grün). Histogramme repräsentieren den prozentualen Anteil der Zellen (y-Achse) positiv für das YFP-Signal (x-Achse). ( B ) Kit ⁺ CD45 ^niedrige Zellen werden basierend auf Kit und CD45-Expression (blaues Gate, linkes Panel) gated. AA4.1 und Kit Ausdruck auf Kit ⁺ CD45 ^niedrigen Zellen. Blaues Tor umschließt EMP, wie definiert als AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^niedrige Zellen (Mittelfeld). Vergleich der YFP-Kennzeichnung in AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^niedrigen Zellen (rechte Seite) in Cre Negativkontrollen (schwarz) und Cre positive Proben (grün). Histogramme repräsentieren den Prozentsatz vonZellen (y-Achse) positiv für YFP-Signal (x-Achse). ( C ) Hämatopoetische Zellen sind definiert als Kit ^neg CD45 ⁺ und gated in blau (linke Tafel). F4 / 80 und CD11b Expression auf Kit ^neg CD45 ⁺ Zellen. Makrophagen sind definiert als F4 / 80 ^helle CD11b ⁺ Zellen (Mittelfeld). Vergleich der YFP-Beschriftung in F4 / 80 ^helle CD11b ⁺ Makrophagen (rechte Seite) in Cre Negativkontrollen (schwarz) und Cre positive Samples (grün). Histogramme repräsentieren den prozentualen Anteil der Zellen (y-Achse) positiv für das YFP-Signal (x-Achse). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4: Kennzeichnungseffizienz im Gehirn aus E10.5 Csf1r ^MeriCreMer Rosa26 ^LSL-eYFP embryospuMit OH-TAM bei E8.5. ( A ) Kit ⁺ CD45 ^Neg- Zellen werden basierend auf Kit- und CD45-Expression auf lebenden Gehirnzellen (blaues Tor, linkes Feld) gated. AA4.1 und Kit Expression auf Kit ⁺ CD45 ^neg Zellen. Blaues Tor umschließt AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^neg Zellen (Mitteltafel). Vergleich von YFP Kennzeichnung in AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^neg Zellen (rechtes Bild) in Cre Negativkontrollen (schwarz) und Cre - positive Proben (grün). Histogramme repräsentieren den prozentualen Anteil der Zellen (y-Achse) positiv für das YFP-Signal (x-Achse). ( B ) Kit ⁺ CD45 ^niedrige Zellen werden basierend auf Kit und CD45-Expression (blaues Gate, linkes Panel) gated. AA4.1 und Kit Ausdruck auf Kit ⁺ CD45 ^niedrigen Zellen. Blaues Tor umschließt EMP, wie definiert als AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^niedrige Zellen (Mittelfeld). Vergleich der YFP-Kennzeichnung in AA4.1 ⁺ Kit ⁺ CD45 ^niedrig Zellen (rechte Tafel) in Cre Negativkontrollen (schwarz) und Cre positive Samples (grün). Histogramme repräsentieren den prozentualen Anteil der Zellen (y-Achse) positiv für das YFP-Signal (x-Achse). ( C ) Hämatopoetische Zellen sind definiert als Kit ^neg CD45 ⁺ und gated in blau (linke Tafel). F4 / 80 und CD11b Expression auf Kit ^neg CD45 ⁺ Zellen. Makrophagen sind definiert als F4 / 80 ^helle CD11b ⁺ Zellen (Mittelfeld). Vergleich der YFP-Beschriftung in F4 / 80 ^helle CD11b ⁺ Makrophagen (rechte Seite) in Cre Negativkontrollen (schwarz) und Cre positive Samples (grün). Histogramme repräsentieren den prozentualen Anteil der Zellen (y-Achse) positiv für das YFP-Signal (x-Achse). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Die verschiedenen Wellen der hämatopoetischen Vorläuferzellen überlappen sich teilweise innerhalb eines kurzen Zeitrahmens, was die Analyse des Beitrags jeder Welle der Entwicklungshämatopoese zu den Immunzellen technisch sehr anspruchsvoll macht.

Tamoxifen-induzierbare Cre-Systeme bieten die Möglichkeit, spezifische Zellen zeitlich induzierbar zu markieren und eine Abstammungsanalyse bei Embryonen oder Erwachsenen durchzuführen, ohne die Ex-vivo- oder In-vitro- Kultur oder -Transplantation zu benötigen. Bei Tamoxifen-induzierbaren Cre-Stämmen entsteht ein Fusionsgen zwischen einer bakteriellen Cre-Rekombinase und einer mutierten Form der Ligandenbindungsdomäne des humanen Östrogenrezeptors (CRE-ER) oder zwischen einer verbesserten Single-Point-Mutante Cre und zwei Maus-Östrogen-Rezeptoren (Mer-iCre-Mer). Fusion von Cre mit Östrogenrezeptoren führt zur zytoplasmatischen Sequestrierung von Cre durch Hsp90, wodurch eine nukleare Cre-vermittelte Rekombination verhindert wird. Tamoxifen (TAM) wird durch th metabolisiertE-Leber in 4-Hydroxytamoxifen (OH-TAM), dessen aktiver Metabolit mit hoher Bindungsaffinität für den Östrogenrezeptor. OH-TAM-Bindung an die Fusion Cre führt zur Störung der Wechselwirkung mit Hsp90, die ihre Translokation zum Kern und die Initiierung der Cre-vermittelten Rekombination ermöglicht. Die Injektion von TAM oder OH-TAM in utero in schwangere Frauen wurde gezeigt, um die Rekombination im sich entwickelnden Embryo zu aktivieren. Die Tamoxifen-Verabreichung während der Schwangerschaft kann zu einer Abtreibung führen und verringert so die Wurfgröße, aber sie verhindert auch die Geburt, wenn sie nach der mittleren Schwangerschaft abgegeben wird. In diesem Fall ist die Überfüllung des Kaisers durch einen Kaiserschnitt erforderlich. Tamoxifen Auswirkungen während der Schwangerschaft zum Ausgleich ergänzen wir OH-TAM - Verwaltung mit einer halben Dosis von Progesteron, um das Überleben der Embryonen zu verbessern und das Risiko von Fehlgeburten ¹⁷ zu reduzieren.

Mehrere Wege können eingesetzt werden, um TAM oder OH-TAM in schwangere Frauen zu liefern. Derzeit oral gavaGe oder intra peritoneale (ip) Injektion wird für Tamoxifen verwendet. OH-TAM hat den Vorteil, sofort verfügbar zu sein, da es nicht erforderlich ist, von der Leber des schwangeren Dammes metabolisiert zu werden. Während sich Tamoxifen jedoch sehr leicht in Maisöl auflöst, ist OH-TAM sehr schwierig unter Verwendung der gleichen Technik herzustellen und führt zu einer Emulsion. Dies war ein limitierender Schritt bei der Verwendung von OH-TAM für die utero- Puls-Etikettierung. Wir haben das Protokoll für die Vorbereitung von OH-TAM, das von der Gruppe von JF Nicolas ^{13 entwickelt wurde} , angepasst, wo sie PEG-35-Rizinusöl verwenden, ein Lösungsmittel mit amphiphilen Eigenschaften, um OH-TAM zu lösen, da Tamoxifen-Auflösung einer der kritischsten Schritte ist In der Prozedur. Dies ermöglicht eine reproduzierbare und optimale Vorbereitung von OH-TAM und verkürzt die Zeit der Tamoxifenpräparation erheblich. Weiterhin ist es notwendig, die Konzentration von OH-TAM anzupassen, um zu injizieren, wenn verschiedene induzierbare Cre-Stämme verwendet werden. Die Kombination eines Lebensfähigkeitsfarbstoffs (DAPI) und Größe (FSC) ist entscheidend, um tote Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. Tote Zellen und Trümmer sind in den meisten der violetten, blauen und roten Laserdetektoren stark autofluoreszierend und können die Durchflusszytometrieanalyse behindern. Weiterhin empfehlen wir nicht, die Zellen nach der Färbung vor der Analyse mit dem Durchflusszytometer zu fixieren. Die Fixierung kann zu Veränderungen in der Zellmorphologie führen und macht somit eine schwierige Größenunterscheidung auf der Grundlage von Vorwärts- und Seitenstreuung (FSC vs. SSC). Weiterhin führt die Fixierung von Proben mit PFA zu einem signifikanten Verlust an YFP-Fluoreszenzintensität.

Die Hauptbeschränkung in diesem Protokoll ist, dass die Populationen nicht auf ihre Funktionalität und Differenzierung Potenzial getestet werden. Um dies zu überwinden, können Zellen nach einem ähnlichen Protokoll unter Verwendung eines Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierers (FACS) sortiert werden, um einen Kolonie-bildenden Assay durchzuführen. In diesem Fall muss das Verfahren unter sterilen Bedingungen und Verwendung von fötalem Rinderserum (F.BS) im FACS-Puffer anstelle von BSA ist sehr empfehlenswert. Die mit dieser Technik erzielte niedrige Markierungseffizienz und die damit verbundene geringe Anzahl an interessierenden YFP ⁺ -Zellen pro embryonalem Gewebe stellen bei der Untersuchung des EMP-Phänotyps eine große Herausforderung dar. Dieses Protokoll verwendet ein 4-Laser-Durchflusszytometer. Es kann auch ein Durchflusszytometer mit 3 Lasern verwendet werden, aber es ist wichtig, das Antikörperpaneel anzupassen, um die erhöhte spektrale Überlappung zwischen den Farbstoffen zu berücksichtigen. Darüber hinaus ist die Titration von Antikörpern erforderlich, um die geeignete Konzentration bei der Veränderung des Antikörperpanels zu finden, und wir empfehlen, die Titration von Antikörpern und die Validierung des neuen Antikörperpanels in einem Pilotversuch durchzuführen, bei dem alle Embryonen pro Gewebe gepoolt werden, um die Anzahl zu erhöhen Zellen pro Gewebe analysiert

Das Gebiet der Entwicklungsbiologie wurde durch die Cre / Lox-Methode revolutioniert, die eine permanente Etikettierung von Zellen in situ ermöglicht . Dieser Ansatz erreichtGewebe- oder Zelltyp-Spezifität durch Expression der Cre-Rekombinase unter der Kontrolle eines spezifischen Promotors. In unserem Fall haben wir uns entschieden, die Expression der Cre-Rekombinase unter der Kontrolle des Promotors von Csf1r (Colony Stimulating Factor 1 Receptor), einem wichtigen mitogenen und Wachstumsfaktor-Rezeptor für Makrophagen und deren Vorläufer, unter Verwendung eines von der Gruppe entwickelten Stammes zu untersuchen Von J. Pollard ¹⁸ . Der Vorteil einer Schicksal-Kartierungsstrategie, die auf der Csf1r-Expression im Vergleich zu anderen veröffentlichten Strategien basiert, besteht darin, dass sie die Markierung von Dottersack-abgeleiteten Zellen (EMP und Makrophagen) ohne Markierung von fetalen HSCs ^{12 ermöglicht} . Der Cx3cr1 ^CreERT2- Stamm kann auch Eigelb-Sac-Zellen etikettieren, ohne die HSCs ^{19 zu} markieren, aber es kann nur Makrophagen und Makrophagen-Vorläufer etikettieren, aber es markiert keine EMP-Vorläufer ¹ . Der Cx3cr1 ^CreERT2- Stamm hat die gleiche Einschränkung wie der Csf1r ^{MerCreMer-Linie, da es nicht unterscheiden kann zwischen Makrophagen, die von unipotenten primitiven Makrophagen-Progenitoren oder von EMP abgeleitet sind. Wenn Tamoxifen bereits bei E7.5 sowohl im Runx1 MerCreMer 16 als auch im Kit MerCreMer 20 verabreicht wird , werden die peripheren Blutzellen immer bei Erwachsenen etikettiert, wenn auch mit einer sehr geringen Effizienz, wodurch die Markierung von HSCs während der Entwicklung demonstriert wird. Weiter, Kit MerCreMer Schicksal Mapping Etiketten Dottersack Kit + Sca1 + Vorläufer, während EMP Kit + Sca1 negativ 11 sind . Der Csf1r- MeriCreMer- Stamm ist kein Klopfen, sondern wurde durch klassische additive Transgenese erzeugt, so dass die Expression der Cre nicht endogener Expression von Csf1r rekapituliert werden kann. Dies hat jedoch den Vorteil, jegliche potentiellen Entwicklungsfehler bei der heterozygoten Expression von Csf1r zu vermeiden. Dies ist ein wichtiger Faktor, um bei der Analyse zu berücksichtigenAndere Schicksal-Mapping-Strategien für Entwicklungs-Hämatopoese-Studien, wie Runx1 MerCreMer , Kit MerCreMer und Cx3cr1 CreERT2 , wo die induzierbare Cre eingefügt wird - in den endogenen Locus. Für beide Runx1 MerCreMer und Kit MerCreMer wurden Entwicklungshämatopoetische Defekte in heterozygoten Embryonen beschrieben. Gemeinsam ermöglicht die hier vorgestellte Methode die Untersuchung von Dottersack-EMP-Biologie während der Entwicklung und auch Dottersack-abgeleitete Makrophagen, die in adulten Geweben gefunden wurden und sich von HSC-abgeleiteten Makrophagen unterscheiden. Dies wird unser gegenwärtiges Verständnis dieser Linie der residenten Makrophagen und ihrer spezifischen Funktionen im Erwachsenenalter verbessern. Die immunphänotypische Charakterisierung von EMPs wurde vor kurzem unter Verwendung von Zellsortier- und Koloniebildungsassays verbessert, was zeigt, dass Dottersack EMP spezifisch CD41 und CD16 / 32 in frühen Stadien der Entwicklung 11 ausdrückt. Allerdings ist die Spezifität der Expression von CD41Und CD16 / 32 braucht weitere Charakterisierung ab E10.5, vor allem in der fetalen Lebernische, mit Schicksal-Mapping-Modelle. In der Tat, ob CD41 und CD16 / 32-Expression für EMP noch spezifisch ist, verglichen mit fetalen HSCs und HSC-abgeleiteten Vorläufern in der E10.5 bis E14.5 fetalen Leber müssen aufgeklärt werden. Die vorgestellte Methode erlaubt es, das im Dottersack erzeugte EMP zu etikettieren und ihnen während der embryonalen Entwicklung zu folgen und es wird zu einer genaueren Charakterisierung des EMP-Phänotyps beitragen, wenn sie die fetale Leber säen.}

Diese Methode könnte in naher Zukunft wichtig sein, um EMP-Differenzierungswege zu studieren. Während EMPs aus dem Dottersack Endothel von E8.5 bis E10.5 4 entstehen, erlaubt diese Methode nur, einen Bruchteil der Vorläufer zu markieren, die zwischen E8.5-E9.5 auftauchen. Daher ist eine Beschränkung dieses Verfahrens, dass nur ein kleiner Bruchteil von EMP markiert ist, wodurch die Analyse in klassischen Funktionsstudien mit bauchigen Allelen für c erschwert wirdAndidate Gene. Alternativ könnte eine spärliche Markierung in Klonalstudien der EMP-Differenzierung in vivo , unter Verwendung eines klonalen Reporters, ein Vorteil werden. Dennoch muss die Markierungseffizienz für jeden gepoolten Reporter oder ein gepooltes Allel verwendet werden, da die Rekombinationseffizienz von floxierten Konstrukten von genomischem Locus (floxed Allele) oder dem Rosa26 Reporter-Konstrukt abhängt. In der Tat sind verschiedene Rosa26-Reporterlinien mit verschiedenen Promotoren erhältlich und es wird berichtet, dass Rosa26 ^tdTomato und Rosa26 ^mTmG- Stamm eine höhere Rekombinationseffizienz aufweisen als die Rosa26 ^LSL-eYFP- Linie. Der Reporter-Maus-Stamm, der in diesem Protokoll verwendet wird, ist die Rosa26 ^LSL-eYFP- Linie, die keine Informationen über den dynamischen Prozess der Progenitorreifung, der im Ergebnisabschnitt erwähnt wird, liefern kann. Die Frage des Reifungsprozesses kann teilweise mit unterschiedlichen Reporterstämmen wie dem Rosa26 ^{mTmG adressiert werden} . In solch einer Belastung können Zellen disting seinAuf der Grundlage der seit dem Rekombinationsereignis verstrichenen Zeit. Alle Zellen im Rosa26 ^mTmG- Stamm exprimieren membrangebundenes tdTomato fluoreszierendes Protein und Cre Rekombination die tdTomato Kassette aus und ermöglicht die Expression von membrangebundenem GFP. Da tdTomato eine lange Halbwertszeit hat, haben Zellen, die noch tdTomato enthalten, aber die GFP (kurz nach Rekombination) exprimiert haben, tdTomato ⁺ GFP ^{low / int} und können von tdTomato ^neg GFP ⁺ Zellen unterschieden werden, die nicht mehr tdTomato ausdrücken und Exprimieren höhere Ebenen von GFP (später nach Rekombination).

Wie oben diskutiert, ist die OH-TAM-Präparation ein kritischer Schritt, um konsequente ähnliche Dosen von OH-TAM zwischen Experimenten zu liefern und Tamoxifen-Nebenwirkungen zu reduzieren. Progesteron-Co-Verabreichung ist auch nützlich, um die schädliche Wirkung von Tamoxifen auf die Schwangerschaft zu begrenzen. Ein weiteres kritisches Element des Protokolls ist die Lebensfähigkeit der Single-Cell SuspensioN aus verschiedenen embryonalen Geweben erhalten. Wir erhalten in der Regel> 90% lebensfähige Zellen für die Durchflusszytometrische Analyse. Um dies zu erreichen, ist es entscheidend, alle Schritte schnell zu verfolgen und alle Proben auf Eis nach der Gewebsammlung zu pflegen. Entsprechende Kontrollen wie ungefärbte Proben, einzelne Flecken und fluoreszierende minus eins (FMO) Kontrollen sind erforderlich, um Torgrenzen zu identifizieren und für die spektrale Überlappung in Mehrfarbplatten zu steuern. Änderungen im Antikörper müssen in Bezug auf die Antikörpertitration und die spektrale Überlappung validiert werden. Schließlich muss die Wahl des Rosa26 Reporterstamms an die wissenschaftliche Frage angepasst werden, die untersucht wird.

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Autoren danken Prof. Frederic Geissmann und Prof. Christian Schulz für aufschlussreiche Diskussionen; Dr. Hannah Garner für kritische Lektüre des Manuskripts, Dr. Xavier Montagutelli und Dr. Jean Jaubert und die Mitarbeiter des Institut Pasteur Tieres zur Unterstützung bei der Maushaltung; Und Pascal Dardenne und Vytaute Boreikaite, ein Amgen Scholar, für ihre technische Unterstützung. Die Forschung im EGP-Labor wird vom Institut Pasteur, dem CNRS, dem Cercle FSER (FRM und einem Startpaket vom Institut Pasteur und dem REVIVE-Konsortium) gefördert. LI wird von einem Promotionsstipendium des REVIVE-Konsortiums unterstützt.