İdrar Örneklerinin Hücre-Free DNA Bütünlüğü Analizi

A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.

plazma ya da serum içinde hücresiz DNA devrede olmasına yaygın birçok kanser türü için biyolojik belirteçler, uygun bir kaynağı olduğu gösterilmiş olmakla birlikte, çok az çalışma idrar hücresiz (Lake Buena Vista) DNA potansiyel kullanımı üzerinde de yoğunlaşmıştır. uzun DNA, prostat veya mesane kanseri ve sağlıklı bireyler olan hastaların ayırt edebilen bir erken tanı markeri olarak değerlendirildi UCF DNA bütünlüğü potansiyel rolü, normal apoptotik hücreler son derece parçalanmış DNA üretmek hipotez ve kanser hücrelerinden serbest bırakılmasına başlatılıyor.

C-myc, BCAS1, HER2 ve Ar: Bir Lake Buena Vista DNA bütünlüğü analizi 250 bp daha uzun dört dizilerin dört gerçek zamanlı kantitatif PCR analizleri bazında önerilmiştir. Sık sık, mesane ve prostat kanserleri artan bir DNA kopya numarası dizileri analiz için seçilmiştir, ancak yöntem esnektir ve bu genler, entegrasyon bölgesinin diğer genler ile ikame edilebilirdinlenme. biyomarkerların kaynağı olarak UCF DNA'nın potansiyel yarar zaten böylece UCF DNA karakterizasyonu üzerine ileri çalışmalar için önünü, ürolojik maligniteler için ortaya konmuştur. UCF DNA bütünlüğü testi non-invaziv, hızlı ve kolay uygulanabilir, analiz gerçekleştirmek için gerekli idrar sadece birkaç mililitre olma avantajına sahiptir.

Hücresiz bir DNA ya apoptotik ya da nekrotik mekanizma ile kan ve hücre ölümüne bağlı idrarda tespit edilebilir. Kandaki hücre-serbest DNA çok çeşitli hastalıklarda tanısal ve prognostik amaçlarla özellikle kanser ¹ çalışılmıştır. Ancak, daha az idrar hücre içermeyen (UCF) DNA'nın rolü hakkında bilinmektedir. UCF DNA glomerüler filtrasyon sistemi aracılığıyla ya da bu vücut sıvısı ² (örn ürotelyal hücreler veya prostat hücreleri) ile doğrudan temas içine gelen hücrelerden kan geçen kaynaklanabilir. Biyomarkerların kaynağı olarak UCF DNA kullanımı esas olarak idrar yolu hücrelerinden ^3,4 doğrudan gelen UCF DNA yüksek yüzdesi böbrek, mesane ve prostat kanserinin erken tanısı için incelenmiştir.

Küçük UCF DNA ve izole ve karakterize etmek için en iyi yöntemler hakkında bilinmektedir. Değerlendirme tümör hücreleri normal hücrelerden daha uzun DNA fragmanlarını serbest hipotezi göz önüne alındığındahücresiz DNA bütünlüğünü Kan dolaşımı, ⁵ DNA kökenini aydınlatmak için bir girişim olarak ele alınmıştır. Bazı çalışmalar kanda hücresiz DNA bütünlüğü kanseri ⁶ birçok türleri iyi bir tanı testi temsil eder ve aynı hipotez idrar ^7-9 ile ilişkili olarak önerilmiştir olduğunu göstermiştir.

Bu çalışma, mesane ve prostat kanserinin tespiti için potansiyel bir uygulama ile UCF DNA bütünlüğü analizi için yeni bir yöntem tarif eder. Özellikle, UCF DNA bütünlüğü daha uzun 250 bp prostat ve mesane kanseri dahil olmak üzere katı tümörlerin, artan bir DNA kopya numarası olduğu bilinen 4 bölgelerde test edildi fragmanları: c-MYC (8q24.21), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2) ve Ar (Xq12) ^10-14. Belirli onkogenler yerine rastgele diziler, kanser hastalarının hücresiz fraksiyonu bularak olasılığını arttırmak için seçilmiştir. ana avantajlarından biri,bu yöntem, esnek olduğu ve diğer bölgelerde tümör tipi ve özellikleri temelinde seçilebilir olmasıdır.

protokol IRST İnsan Araştırmaları Etik Komitesi kuralları takip eder.

NOT: Bu protokol, biz bir UCF DNA bütünlüğü analizi gerçekleştirmek için idrar örneklerinden DNA izole edilmiştir. LNCaP ve MRC hücre çizgileri standart oluşturmak için kullanıldı. Örneğin belirli onkogenlerin DNA ekstraksiyonu (kontrol geni için spektrofotometre ve gerçek zamanlı PCR, STOX1) DNA miktar, ve gerçek zamanlı PCR gibi teknikler (Şekil 1) uygulandı.

1. İdrar Toplama ve İşleme

1. Temiz, kuru, plastik bardak temiz bir-catch ilk sabah idrar örneği almak. idrar örneğinin en az 50 mL toplayın.
2. 3 saatlik bir süre için 4 ° C sıcaklıkta idrar korumak ve aynı sıcaklıkta laboratuvara gönder.
3. iki adet 50-ml konik tabanlı polipropilen tüpler içine laboratuar ve transfer girişte iki kez hemen evirerek her bir örnek karıştırın.
4. tüpleri santrifüj4 ° C sıcaklıkta ya da oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 850 x g'de.
5. Dikkatle hücre peleti üzerinde yüzen kısımların en az 2 mL bırakarak iki adet 5 ml tüpler içine idrar yüzer üst kısmının 10 mL aktarın.
   Not: yüzer üst kısmı aktarma hücreler ya da hücre döküntülerinin kirlenme riskini azaltır. Üst ve alt parçalar arasında net bir tarif bulunmamaktadır.
6. pelet atın ve hemen kullanıma kadar -80 ° C süpernatant dondurmak.

İdrar süpernatant ve Hücre Hatları 2. DNA İzolasyonu

NOT: Bir hücre hattından DNA izole (örneğin, LNCaP mesane kanseri için prostat kanseri ya da MRC için) bir ticari kit kullanılarak ve üreticinin yönergeleri izleyerek. aşağıdaki gibi idrar süpernatanından DNA izolasyonu değiştirilmiş ticari protokol kullanılarak yapılmalıdır:

1. Oda sıcaklığında idrar yüzer bir kısım çözülme.
2. Vorteks ve idrar örneği karıştırın ve berrak bir 5 ml tüp içine idrar 1 mL süpernatan aktarın. -80 ° C'de rezidüel idrar dondurun.
3. doğrudan numune için proteinaz K, 100 uL ekleyin.
4. örnek AL tamponu 1 ml ilave edilir ve pipetleme iyice karıştırın.
5. tüpleri kapatın ve 15 dakika süreyle 56 ° C'de numune inkübe edin.
6. İnkübasyon sırasında, her bir örnek için bir sütun hazırlamak ve üreticinin talimatlarına göre yıkama tamponları, Aw1 ve Aw2, (% 100 etanol belirtilen miktarda ekleyebilirsiniz) hazırlar.
7. Lütfen, oda sıcaklığına kadar örnekleri getirin ve mutlak etanol 1 ml. Pipetleme tarafından tamamen karıştırın.
8. sütun aşama 2.7 'de elde edilen karışımın 650 uL ilave edilir ve 1 dakika süre ile 6000 x g de o santrifüj.
9. flow-through içeren tüp atın ve yeni, temiz toplama tüpü sütun yerleştirin. Numune karışımının tüm (5 kez) kullanılır olmuştur yineleyerek 2.8 ve 2.9 adımları tekrarlayın.
10. Ekle 500# 181; sütunun jant ıslatmadan tampon Aw1 L. 1 dakika boyunca 6.000 xg'de bunu santrifüj.
11. flow-through içeren tüp atın ve yeni, temiz toplama tüpü ile değiştirin.
12. Sütunun çemberinin ıslatmadan tamponu Aw2 500 uL ekleyin. 3 dakika boyunca tam hızda (20.000 xg) bunu santrifüj.
13. flow-through içeren tüp atın ve yeni, temiz toplama tüpü ile değiştirin.
14. Adımı yineleyin 2.12 herhangi bir kalıntı yıkama tamponu çıkarmak için.
15. Temiz bir 1.5 mL tüp içine sütun yerleştirin. elüsyon tamponu AE 50 mcL ekleyin ve tampon ıslatır o sütunu sağlamak için 7 dakika bekleyin.
16. 1 dakika boyunca 8.000 xg'de bunu santrifüj.
17. mini sütuna adım 2.15 den eluent Pipet ve DNA'nın maksimum iyileşme sağlamak için 1 dakika boyunca maksimum hızda bunu santrifüj.

3. DNA sayısallaştırılması ve Seyreltme

1. Bir spektrofotometre kullanılarak, bot DNA ölçümü gerçekleştirmekH hücre çizgisi ve idrar süpernatan örnekleri. üreticinin talimatlarına uygun olarak, bir tezgah üstü spektrometresi üzerindeki örnekte 2 uL kullanın.
2. 1 ng / ul konsantrasyon elde DNA bütünlüğü analize kadar -20 ° C 'de DNA depolamak için Lake Buena Vista DNA örnekleri seyreltilir.
   Not: DNA miktarı gerçek zamanlı PCR (en az 100 ng) ile devam etmek için yeterli değildir, yeni bir DNA izolasyon işlemi gerçekleştirmek.
3. Farklı konsantrasyonlarda altı standartları elde etmek için hücre çizgisi örnekleri DNA seyreltilir: 0.001, 0.01, 0.1, 1, 0.5 ve 2 ng / ml, 100 uL hacimde (ST1, ST5, ST4, ST3, ST2, her biri ve ST6). DNA bütünlüğü analiz edilinceye kadar -20 ° C'de hücre çizgisi DNA standartları saklayın.

4. DNA Bütünlük Testi - PCR

1. primerler (konsantrasyon deneyi türüne bağlıdır), yeşil Supermix, hücre hattı, DNA standartları ve buz üzerinde UCF DNA, seyreltilmiş örnekler çözülme.
2. plaka f şerit tüpleri hazırlayınveya 72 oyuklu rotor diski. Kısım her bir standart ve seyreltilmiş örnek negatif kontrol için RNaz içermeyen su, 10 uL, iki kopya halinde 10 uL.
3. Her bir primerden 1 ul bir karışımını hazırlamak, (konsantrasyonları, Tablo 1 'de gösterilmiştir), yeşil Supermix 12.5 uL, ve her bir örnek için RNaz içermeyen su 6.5 uL. 2 çoğaltır, 2 çoğaltır için negatif kontrol ve 2 ekstra numuneler için numune 2 çoğaltır 6 standartları, sayı: karışımı hazırlarken, aşağıdaki örneklerin sayısını kullanın.
4. her bir kuyunun içine karışımın Kısım 15 uL. pipetle veya tüpleri dönmeye etmeyin.
5. Tablo 1 'de gösterilen PCR, aşağıdaki koşullar ile bir protokol başlatın.
   NOT: 29 x 2 numuneleri + 6 x 2 standartlarına + negatif kontrol x 2 = 72 (UCF DNA değeri): UCF DNA değeri için, 29 DNA örnekleri 72-kuyu rotor diskini kullanarak her gerçek zamanlı deney için işlendi.
   NOT: UCF DNA bütünlüğü analizi için protokol de olabilir(Başka bir cihaz kullanırken, ROX boya eklenmesi gerekebilir) başka PCR gerçek zamanlı cihazı kullanılarak yapıldı.

5. DNA Bütünlük Testi - Veri Analizi ve Yorumlanması

Not: Daha önce ^7-9 (Şekil 2) tarif edildiği gibi, her bir örnek için UCF DNA, bir değer, her bir PCR gen değerlendirilmesi için standart bir eğri yapı ile ve standart eğri interpolasyon kullanarak gerçek zamanlı cihazı algılama sistemi yazılımı ile elde edilmiştir.

1. çoğaltır değerlendirin; Örnek bir fark ile çoğaltır ≥1 Ct atılmalıdır ve bir ikinci deneyde yeniden değerlendirildi.
2. Her numune için medyan Ct hesaplayın ve 36 ≤ bir Ct değeri örnekleri göz önünde bulundurun.
3. erime analizi kullanılarak PCR ürünlerinin özgüllüğünü değerlendirin.
4. standart eğri ile enterpolasyon her amplikon konsantrasyonunu değerlendirmek; Her amplikon için konsantrasyon değeri (ng / ml) edinin.

Tüm numuneler 1.51 ila 138 ng / uL bir dizi gösteren analiz için toplam serbest DNA konsantrasyonu spektrofotometrik olarak ölçülebilir oldu. Beş kontrol numuneleri verilerin yeniden üretilebilirlik için kullanılmıştır: iki bağımsız gerçek zamanlı deneyleri, c-myc, HER2, BCAS1, AR ve STOX1 yapıldı. Varyasyon (CV) katsayılar, daha sonra, iki bağımsız deneyin arasında yeniden iyi bir derecede (Tablo 2), her gen (Tablo 2) için hesaplanmıştır.

125-bp sekansı, PCR STOX1 önleyicilerinin ekarte etmek için analiz edildi. Numuneler STOX1 bir amplifikasyon gösterdiyse UTL DNA bütünlüğü test gerçekleştirilmiştir. amplifikasyon eksikliği DNA miktarı t tekrarlamak gerektiğini belirten UCF DNA bütünlüğü testi gerçekleştirmek için yeterli değildi demekYeni bir idrar toplama o analizi. amplifikasyonu veya mesane ve prostat kanserinde STOX1 silinmesi ile ilgili mevcut az bilgi mevcut olmadığı için, bu gene, bu tümör tiplerinin için bir kontrol dizisi olarak kullanılabilir. Son olarak, UCF DNA bütünlüğü değerlendirme birlikte üç onkogenler (Şekil 3) için elde edilen değerler ilave edilerek gerçekleştirilmiştir.

C-myc, AR, ve HER2 prostat kanseri ^7,8 önerilmiştir ise c-myc, HER2 ve BCAS1 genlerinin toplamının kullanımı, mesane kanseri tespiti ⁹ önerilmiştir. mesane ve prostat kanseri tespiti için belirlenen en iyi cut-off değerleri sırasıyla 0.1 ng / ml ve 0.04 ng / ml, vardır. Bu cut-off değerleri kullanarak,% 73 duyarlılık ve% 84 özgüllük ise, semptomatik bireylerde karşı mesane kanserini saptamada elde edilmiştir% 58 duyarlılık ve% 44 spesifikSığ huylu ürogenital sistem hastalıkları ^7-9 olan hastalarda karşı prostat kanserini saptamada gözlendi. Sonuç olarak, Lake Buena Vista, DNA bütünlük testi esnektir, bu yüzden, bu çalışmada kullanılan genler hastalığa bağlı olarak ilgili diğer uzun sekanslar ile ikame edilebilir.

Şekil 1. İdrar Hücre-serbest DNA Bütünlük İş Akışı ve Zaman Çizelgesi. Yöntemin akışı farklı adımlar ve zaman ayrılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

C-MYC Amplikon Analiz Şekil 2. Raporu. Erime analizi, amplifikasyon grafik örneğiVe standart eğri c-myc değerlendirilmesi için rapor edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3. UCF DNA Bütünlüğü Analizi İş Akışı. UCF DNA bütünlüğü analizi için basit bir iş akışı bildirilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tablo 1. Primer dizileri ve analiz koşulları.

Her Gene Tablo 2. real-time PCR Tekrarlanabilirlik.
* Sonuçlar ng / uL olarak rapor
CV, değişim katsayısı; NE, değerlendirilemez durumdaydı

Prostat ve Mesane Kanserleri Erken Teşhis Edilen Sonuçlar Tablo 3. özeti.

UCF DNA bütünlüğü analizi idrar DNA bütünlüğünü değerlendirmek için yeni bir non-invaziv bir yöntemdir. Son zamanlarda mesane ⁹ ve prostat kanserleri ^7,8 erken teşhisi için önerilmiştir. avantajları ve UCF DNA bütünlüğü testi dezavantajları bir dizi birlikte geleceği ile burada tartışılır.

yaklaşımın ana avantajı ucuz, non-invazif bir yöntem ve moleküler biyoloji teknikleri sadece temel bilgi gerektiren biyomarkerların potansiyel bir kaynağı olarak idrar incelemek için basit bir protokol sunmasıdır. Test gerçekleştirmek için hızlı ve 2 iş günü sonra kullanılabilir sonuçlar (Şek. 1), kolayca bir doktor yardımı olmadan yorumlanabilir. Sadece DNA izolasyon süreçleri ve 2 gerçek zamanlı PCR'ler oluşan yaklaşım aynı zamanda iyi bir maliyet-fayda oranına sahiptir. doğruluğu açısından UTL DNA bütünlüğü tespit yüksek duyarlılık (% 73) ve özgüllüğe (% 84) sahiptirSemptomatik hastalarda ⁹ mesane kanseri. Son olarak, bu yöntem, esnek olan ve önerilen genler kolay sürece 250 bp daha uzun olduğu gibi, ilgi konusu başka genlerle ikame edilebilir.

Test ayrıca sınırlamaları bir numarası vardır. İlk olarak, DNA, spektrofotometrik olarak ölçmek yöntemi genellikle kesin ve başka, daha hassas, florometrik yaklaşımlar (ör qubit ya PicoGreen) ile değiştirilebilir. Sık düşük 260/280 ve 260/230 oranları gösterdiği DNA kalitesi de oldukça kötü. Ayrıca, çalışmaların birinde, çok düşük spesifite (% 44), muhtemelen tedavüle daha sağlam DNA bırakmadan iyi huylu inflamatuar nekrotik hücreler bir sonucudur ürogenital sistem ^7, benign hastalıklarda karşı prostat kanserli hastalarda gözlendi. Benign hastalıklar hem prostat kanseri hastaları ve bireylerin u inflamatuar bileşene sahip olabilir, çünkü bu, kritik bir konudurrinary hücreleri. Böylece, prostat kanserinin erken tanısında bağlamında, bir UCF DNA bütünlüğü analiz sonuçları yanıltıcı olabilir.

UCF DNA bütünlüğü ürogenital sistemin benign hastalıklar ile prostat veya mesane kanseri, sağlıklı ve semptomatik birey, olan hastalar ve 314 idrar örneklerinde değerlendirildi. Daha büyük bir dava dizi prospektif bir çalışma daha ürogenital sistem kanserleri için erken tanı markeri olarak bu yaklaşımın rolünü tanımlamak için gereklidir.

küçük kanser biyomarkerların kaynağı olarak UCF DNA konuyla ilgili yayınlanmış olmasına rağmen, bu alanda ilgi artmaktadır. Son zamanlarda, Togneri ve ark. ⁴ öne, mesane kanseri hastaların idrarı süpernatanından ekstre hücresiz DNA idrar pelet izole hücresel DNA daha yüksek bir tümör genom yükü gösterdi ilginç kağıt yayınlanan hücresiz fraksiyonunun çalışmadaİdrarda DNA'nın ürolojik kanserler karakterize etmek yararlı olabilir.

Bizim tecrübelerimize göre, UCF DNA bütünlüğü testi prostat kanseri için iyi bir erken tanı testi olarak ispat etmedi. Geleneksel idrar sitoloji ile birlikte kullanıldığında Tersine, mesane kanserinin erken teşhisi için bir belirteç olarak potansiyel gösterdi. Daha büyük bir prospektif vaka serisi bir doğrulayıcı bir çalışma şu anda planlanmaktadır.

The authors declare no competing financial interests.

The authors thank Gráinne Tierney and Silvia Bellissimo for their editorial assistance.