Cell-gratuit Analyse d'intégrité de l'ADN dans des échantillons d'urine

A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.

Bien que la présence de l'ADN circulant exempt de cellules dans le plasma ou le sérum a été largement démontré être une source appropriée de biomarqueurs pour de nombreux types de cancer, peu d'études se sont concentrées sur l'utilisation potentielle de (ICU) un ADN acellulaire de l'urine. En partant de l'hypothèse que les cellules apoptotiques normaux produisent de l'ADN très fragmentée et que les cellules cancéreuses relargage plus de l'ADN, le rôle potentiel de l'intégrité de l'ADN ICU a été évaluée en tant que marqueur de diagnostic précoce capable de distinguer entre les patients atteints de la prostate ou le cancer de la vessie et les individus sains.

Une analyse de l' intégrité UCF ADN est proposée sur la base de quatre PCR quantitative en temps réel de quatre séquences de plus de 250 pb: c-MYC, BCAS1, HER2 et AR. Des séquences qui ont fréquemment une augmentation du nombre de copies d'ADN dans les cancers de la vessie et de la prostate ont été choisies pour l'analyse, mais le procédé est flexible, et ces gènes peuvent être substitués par d'autres gènes d'intele repos. L'utilité potentielle de UCF ADN comme une source de biomarqueurs a déjà été démontrée pour les tumeurs malignes urologiques, ouvrant ainsi la voie à d'autres études sur la caractérisation UCF ADN. Le test d'intégrité de l'ADN UCF a l'avantage d'être non-invasive, rapide et facile à réaliser, avec seulement quelques millilitres d'urine nécessaires pour effectuer l'analyse.

acellulaire d'ADN peut être détectée dans le sang et l'urine en raison de la mort cellulaire par des mécanismes apoptotiques ou nécrotiques. ADN acellulaire du sang a été largement étudiée à des fins diagnostiques et pronostiques dans diverses maladies, notamment le cancer ^1. Cependant, on connaît moins le rôle de (UCF) ADN libre-cellulaire urinaire. UCF ADN peut provenir de passage du sang à travers le système de filtration glomérulaire ou de cellules qui entrent directement en contact avec ce fluide corporel ² (par exemple, des cellules urothéliales et des cellules de la prostate). L'utilisation d'ADN ICU comme source de marqueurs biologiques a été étudiée principalement pour le diagnostic précoce du rein, de la vessie et le cancer de la prostate en raison du pourcentage élevé de l' ICU ADN provenant directement à partir de cellules des voies urinaires ^3,4.

On connaît peu UCF l'ADN et les meilleures méthodes pour isoler et caractériser. Compte tenu de l'hypothèse selon laquelle les cellules tumorales libèrent des fragments d'ADN plus longs que les cellules normales, l'évaluationl'intégrité de l' ADN acellulaire a été étudiée dans le but d'élucider l'origine de l' ADN dans la circulation sanguine ^5. Certaines études ont démontré que l' intégrité de l' ADN acellulaire du sang représente un bon test de diagnostic pour plusieurs types de cancer ^6, et la même hypothèse a été proposée par rapport à l' urine ^7-9.

Cet article décrit une nouvelle méthode pour l'analyse de l'intégrité UCF ADN avec une application potentielle à la détection de la vessie et de la prostate. En particulier, l'intégrité de l' ICU fragments d' ADN de plus de 250 pb a été testé en 4 régions connues pour avoir un nombre accru de copies d'ADN dans des tumeurs solides, y compris de la prostate et le cancer de la vessie: c-myc (8q24.21), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2) et AR (Xq12) ^10-14. oncogènes spécifiques, plutôt que des séquences aléatoires, ont été choisis pour augmenter la probabilité de les trouver dans la fraction exempte de cellules de patients atteints de cancer. L'un des principaux avantages dece procédé est qu'il est flexible et que d'autres régions peuvent également être sélectionnés sur la base du type de tumeur et ses caractéristiques.

Le protocole suit les directives du Comité d'éthique de la recherche humaine IRST.

NOTE: Dans ce protocole, nous avons isolé l'ADN à partir d'échantillons d'urine pour effectuer une analyse de l'intégrité UCF ADN. LNCaP et de cellules MRC lignes ont été utilisées pour construire des normes. Des techniques telles que l' extraction d'ADN, quantification de l' ADN (spectrophotomètre et PCR en temps réel pour le gène de contrôle, STOX1), et la PCR en temps réel pour oncogènes spécifiques ont été réalisées (Figure 1).

1. Collecte d'urine et de traitement

1. Procurez-vous un nettoyage prises premier matin échantillon d'urine dans un gobelet en plastique propre et sec. Recueillir au moins 50 ml de l'échantillon d'urine.
2. Maintenir l'urine à 4 ° C pendant un maximum de 3 heures et l'envoyer au laboratoire à la même température.
3. Mélanger chaque échantillon en inversant deux fois immédiatement après leur arrivée dans le laboratoire et le transfert en deux tubes en polypropylène à fond conique de 50 ml.
4. Centrifuger les tubesà 850 g pendant 10 min à 4 ° C ou à la température ambiante.
5. transférer avec précaution 10 ml de la partie supérieure du surnageant d'urine dans deux tubes de 5 ml, en laissant au moins 2 ml du surnageant au-dessus du culot cellulaire.
   REMARQUE: Le transfert de la partie supérieure du surnageant réduit le risque de contamination par des cellules ou des débris cellulaires. Il n'y a pas de délimitation claire entre les parties supérieure et inférieure.
6. Jeter le culot et geler immédiatement le surnageant à -80 ° C jusqu'à utilisation.

2. Isolement de l'ADN à partir du surnageant de l'urine et des lignées cellulaires

REMARQUE: Isoler l'ADN provenant d' une lignée cellulaire (par exemple, LNCaP de cancer de la prostate ou du MRC pour le cancer de la vessie) en utilisant un kit commercial et en suivant les instructions du fabricant. Isolement de l'ADN à partir du surnageant d'urine doit être effectuée en utilisant le protocole du commerce, modifié comme suit:

1. Décongeler une aliquote du surnageant d'urine à température ambiante.
2. Vortex et mélanger l'échantillon d'urine et de transférer 1 mL du surnageant d'urine dans un tube transparent de 5 ml. Geler l'urine résiduelle à -80 ° C.
3. Ajouter 100 pi de proteinase K directement à l'échantillon.
4. Ajouter 1 ml de tampon AL à l'échantillon et bien mélanger par pipetage.
5. Fermer les tubes et incuber les échantillons à 56 ° C pendant 15 min.
6. Pendant l'incubation, préparer une colonne pour chaque échantillon et préparer les tampons de lavage, AW1 et AW2, selon les instructions du fabricant (ajouter la quantité de 100% d'éthanol indiqué).
7. Amener les échantillons à température ambiante et ajouter 1 ml d'éthanol absolu. Mélanger entièrement par pipetage.
8. Ajouter 650 ul du mélange obtenu à l'étape 2.7 dans la colonne et centrifuger à 6000 g pendant 1 min.
9. Jeter le tube contenant l'écoulement et placer la colonne sur un nouveau tube collecteur, propre. Répétez les étapes 2.8 et 2.9 jusqu'à ce que le mélange d'échantillon a été utilisé (5 fois).
10. Ajouter 500 &# 181; l de tampon AW1 sans mouiller le pourtour de la colonne. Centrifuger à 6000 g pendant 1 min.
11. Jeter le tube contenant l'écoulement et le remplacer par un nouveau tube de collecte, propre.
12. Ajouter 500 pi de tampon AW2 sans mouiller le pourtour de la colonne. Centrifugeuse à pleine vitesse (20 000 xg) pendant 3 min.
13. Jeter le tube contenant l'écoulement et le remplacer par un nouveau tube de collecte, propre.
14. Répétez l'étape 2.12 pour éliminer tout tampon de lavage résiduel.
15. Placer la colonne dans un tube propre de 1,5 ml. Ajouter 50 pi de tampon d'élution AE et attendre 7 min pour garantir que les tampons humidifie la colonne.
16. Centrifuger à 8000 g pendant 1 min.
17. Pipeter l'éluant de l'étape 2.15 dans la mini-colonne et centrifuger à vitesse maximale pendant 1 min pour assurer la récupération maximale de l'ADN.

3. ADN Quantification et Dilution

1. L'utilisation d'un spectrophotomètre, effectuer la quantification de l'ADN du both, la lignée cellulaire et les échantillons d'urine de surnageant. En utilisant 2 pi de l'échantillon sur un spectromètre de paillasse, selon les instructions du fabricant.
2. Diluer les échantillons d'ADN ICU pour obtenir une concentration de 1 ng / pl et stocker l'ADN à -20 ° C jusqu'à ce que l'analyse de l'intégrité de l'ADN.
   NOTE: Si la quantité d'ADN ne suffit pas de procéder à PCR en temps réel (au moins 100 ng), effectuer un nouveau processus d'isolement de l'ADN.
3. Diluer l'ADN à partir d'échantillons de lignées cellulaires pour obtenir six étalons avec des concentrations différentes: 0,001, 0,01, 0,1, 1, 0,5 et 2 ng / ul, chacun ayant un volume de 100 ul (ST1, ST2, ST3, ST4, ST5, et ST6). Stocker les standards d'ADN de lignée cellulaire à -20 ° C jusqu'à ce que l'analyse de l'intégrité de l'ADN.

4. ADN Test d'intégrité - PCR

1. Décongeler les amorces (la concentration dépend du type d'essai), SUPERMIX vert, les normes d'ADN de lignées cellulaires, et des échantillons d'ADN UCF dilués sur la glace.
2. Préparer des tubes de bande dans la plaque fou le disque de rotor 72 puits. Aliquote de 10 pi en double pour chaque standard et échantillon dilué et 10 pi d'eau sans RNase pour le contrôle négatif.
3. Préparer un mélange de 1 ul de chaque amorce (les concentrations sont indiquées dans le tableau 1), 12,5 pi de supermix vert, et 6,5 pi d'eau sans RNase pour chaque échantillon. Lors de la préparation du mélange, utiliser le nombre d'échantillons: 6 normes pour 2 répétitions, nombre d'échantillons pour 2 répétitions, contrôle négatif pour 2 répétitions, et 2 échantillons supplémentaires.
4. Aliquoter 15 ul du mélange dans chaque puits. Ne pas pipeter ou tourner les tubes.
5. Démarrer le protocole de PCR avec les conditions indiquées dans le tableau 1.
   NOTE: Pour la valeur UCF ADN, 29 échantillons d'ADN ont été traités pour chaque expérience en temps réel en utilisant le 72 puits disque de rotor: 29 x 2 échantillons + 6 x 2 normes + contrôle x 2 = 72 (valeur UCF ADN) négatif.
   NOTE: Le protocole pour l'analyse de l'intégrité UCF ADN peut également êtreréalisée à l'aide d'un autre instrument-PCR en temps réel (en utilisant un autre appareil, ROX colorant peut être nécessaire d'ajouter).

5. ADN Test d'intégrité - Analyse et interprétation des données

NOTE: La valeur UCF ADN pour chaque échantillon a été obtenu par un logiciel de système instrument de détection en temps réel en utilisant une construction de courbe standard pour chaque évaluation génétique PCR individuelle et en utilisant l' interpolation de la courbe standard, comme décrit précédemment ^7-9 (Figure 2).

1. Évaluer les répétitions; échantillon réplique avec une différence ≥1 Ct doit être éliminé et re-évaluée dans une seconde expérience.
2. Calculer le Ct médian pour chaque échantillon et examiner des échantillons avec une valeur Ct ≤ 36.
3. Évaluer la spécificité des produits de PCR en utilisant une analyse de fusion.
4. Évaluer la concentration de chaque amplicon, par interpolation avec la courbe d'étalonnage; obtenir une valeur de concentration (ng / ul) pour chaque amplicon.

La concentration totale d'ADN libre était quantifiable par spectrophotométrie pour tous les échantillons analysés, montrant une plage comprise entre 1,51 et 138 ng / ul. Cinq échantillons témoins ont été utilisés pour la reproductibilité des données: deux expériences en temps réel indépendantes ont été effectuées pour c-myc, HER2, BCAS1, AR, et STOX1. Les coefficients de variation (CV) ont été ensuite calculées pour chaque gène ( voir le tableau 2), avec un bon degré de reproductibilité entre les deux expériences indépendantes (tableau 2).

La séquence d'STOX1 125 pb a été analysé afin d' exclure la présence d'inhibiteurs de PCR. Si les échantillons ont montré une amplification de STOX1, le test d'intégrité ICU ADN a été effectué. Un manque d'amplification signifie que la quantité d'ADN n'a pas été suffisante pour effectuer le test d'intégrité UCF l'ADN, ce qui indique la nécessité de répéter til analyse avec une nouvelle collection d'urine. Comme il y a peu d'informations sur l'amplification ou la suppression de STOX1 dans la vessie et de la prostate, ce gène pourrait être utilisé comme une séquence de contrôle pour ces types de tumeurs. Enfin, l'évaluation de l' intégrité ICU ADN a été effectué en additionnant les valeurs obtenues pour les trois oncogènes (figure 3).

L'utilisation de la somme des gènes c-myc, HER2, et BCAS1 a été proposée pour la détection du cancer de la vessie ^9, tandis que c-myc, AR, et HER2 ont été suggérés pour le cancer de la prostate ^7,8. Les meilleures valeurs limites identifiées pour la vessie et la détection du cancer de la prostate sont de 0,1 ng / pl et 0,04 ng / ul, respectivement. En utilisant ces valeurs de coupure, une sensibilité de 73% et une spécificité de 84% ont été obtenus dans la détection du cancer de la vessie par rapport à des individus symptomatiques, alors que 58% de sensibilité et 44% spécifiquelité ont été observées dans la détection du cancer de la prostate par rapport aux patients souffrant de maladies urogénitales bénignes ^7-9. En conclusion, le test d'intégrité ICU ADN est flexible, de sorte que les gènes utilisés dans la présente étude pourrait être remplacée par d'autres séquences longues d'intérêt, en fonction de la maladie.

Figure 1. Urine ADN libre Cell-Integrity Workflow et Timeline. Le flux de travail de la méthode est divisée en différentes étapes et les temps. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Rapport de l'amplicon Analyse c-MYC. Un exemple de l'analyse de fusion, graphique d'amplificationEt courbe standard sont signalées pour l'évaluation c-MYC. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. UCF DNA Integrity Analysis Workflow. Un workflow simple pour l'UCF analyse de l'intégrité de l'ADN est rapporté. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1. Séquences d' amorces et conditions Assay.

Tableau 2. Reproductibilité PCR en temps réel pour chaque gène.
* Les résultats rapportés comme ng / ul
CV, coefficient de variation; NE, pas évaluables

Tableau 3. Résumé des résultats obtenus pour le diagnostic précoce de la prostate et la vessie Cancers.

UCF analyse de l'intégrité de l'ADN est une nouvelle méthode non invasive pour l'évaluation de l'intégrité de l'ADN dans l'urine. Il a été récemment proposé pour le diagnostic précoce de la vessie et de la prostate ⁹ cancers ^7,8. Un certain nombre d'avantages et inconvénients du test d'intégrité UCF ADN sont discutés ici, ainsi que les perspectives d'avenir.

Le principal avantage de cette approche est qu'elle offre une méthode non-invasive et peu coûteuse un protocole simple pour étudier l'urine comme une source potentielle de biomarqueurs, nécessitant seulement une connaissance de base des techniques de biologie moléculaire. Le test est rapide à réaliser, et les résultats, disponibles après 2 jours de travail (Fig. 1), peut facilement être interprété sans l'aide d'un médecin. Composé de seulement les processus d'isolement de l'ADN et 2 PCR en temps réel, l'approche a également un bon rapport coût-bénéfice. En termes de précision, l'intégrité de l'ADN UCF a une sensibilité élevée (73%) et la spécificité (84%) dans la détectionle cancer de la vessie chez les patients symptomatiques ^9. Enfin, le procédé est flexible, et les gènes proposés peut facilement être remplacé par d'autres gènes d'intérêt, tant qu'ils sont plus longs que 250 pb.

Le test a également un certain nombre de limitations. Tout d' abord, le procédé de quantification de l' ADN par spectrophotométrie est souvent imprécise et pourrait être remplacé par d' autres méthodes fluorométriques plus précises (par exemple, qubit ou PicoGreen). La qualité de l'ADN est également assez pauvre, comme le montrent les fréquemment faibles rapports 260/280 et 260/230. En outre, dans une de nos études, une très faible spécificité (44%) a été observée chez les patients atteints de cancer de la prostate par rapport aux patients atteints de maladies bénignes du tractus urogénital ^7, ce qui était probablement le résultat de cellules nécrotiques inflammatoires bénignes libérant plus d' ADN intact dans la circulation. Ceci est une question cruciale, parce que les deux patients atteints de cancer de la prostate et les personnes atteintes de maladies bénignes peuvent avoir une composante inflammatoire dans leur ucellules rinary. Ainsi, dans le cadre d'un diagnostic précoce du cancer de la prostate, les résultats d'une analyse de l'intégrité de l'ADN ICU pourrait induire en erreur.

l'intégrité de l'ADN ICU a été évaluée dans 314 échantillons d'urine provenant de patients atteints de cancer de la prostate ou de la vessie, des individus sains et symptomatiques, et les patients atteints de maladies bénignes du tractus uro-génital. Une étude prospective sur une série de cas plus grande est nécessaire pour mieux définir le rôle de cette approche comme un marqueur de diagnostic précoce des cancers des voies urogénitales.

Bien que peu a été publié sur le sujet de l'ADN UCF comme source de biomarqueurs pour le cancer, l'intérêt dans ce domaine est en augmentation. Récemment, Togneri et al. ⁴ a publié un article intéressant dans lequel l' ADN acellulaire extrait à partir du surnageant d'urine de patients atteints d' un cancer de la vessie a montré une masse tumorale du génome supérieure à celle de l' ADN cellulaire isolé à partir du culot de l' urine, ce qui suggère que l'étude de la fraction acellulairede l'ADN dans l'urine pourraient être utiles pour caractériser les cancers urologiques.

Dans notre expérience, le test d'intégrité UCF l'ADN n'a pas prouvé être un bon test de diagnostic précoce du cancer de la prostate. A l'inverse, il a montré un potentiel en tant que marqueur pour la détection précoce du cancer de la vessie lorsqu'il est utilisé en combinaison avec la cytologie urinaire classique. Une étude de confirmation sur une plus grande série de cas prospective est en cours de planification.

The authors declare no competing financial interests.

The authors thank Gráinne Tierney and Silvia Bellissimo for their editorial assistance.