尿サンプル中の無細胞DNAインテグリティ解析

A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.

血漿または血清中の無細胞循環DNAの存在は、広く多くの種類の癌のためのバイオマーカーの適切な供給源であることが示されているが、いくつかの研究は、尿、無細胞（UCF）DNAの潜在的な使用に焦点を当ててきました。正常なアポトーシス細胞が高度に細分化DNAを作製し、その癌細胞はより長いDNAを解放仮説から出発し、UCF DNAの完全性の潜在的な役割は、前立腺や膀胱癌および健康な個体の患者とを区別することが可能な早期診断マーカーとして評価しました。

C-MYC、BCAS1、HER2、およびAR：UCF DNAの完全性の分析は、250塩基対よりも長い4系統の4定量的リアルタイムPCRのもとに提案されています。しばしば、膀胱および前立腺癌において増加したDNAのコピー数を有する配列は、分析のために選択したが、この方法は柔軟性があり、そしてこれらの遺伝子は、INTEの他の遺伝子で置換することができ残り。バイオマーカーの供給源としてUCF DNAの潜在的な有用性は、すでにこのようにUCF DNAの特性化に関するさらなる研究のための道を開く、泌尿器科悪性腫瘍のために実証されています。 UCF DNAの完全性試験は、非侵襲的、迅速、かつ実行が容易で、分析を行うために必要な尿のわずか数ミリリットルであるという利点を有します。

無細胞DNAは、アポトーシスまたは壊死の機構によって、血液および細胞死に起因する尿中で検出することができます。血中の無細胞DNAは、広く様々な疾患における診断および予後目的、特に癌¹のために研究されています。ただし、以下は、尿、無細胞（UCF）DNAの役割について知られています。 UCF DNAは、糸球体濾過システムを介して、または、この体液^2（ 例えば、尿路上皮細胞または前立腺細胞）との接触に直接来て、細胞から通過する血液に由来し得ます。バイオマーカーの供給源としてUCF DNAの使用は、主に尿路細胞^3,4から直接UCF DNAの割合が高いと、腎、膀胱、前立腺癌の早期診断のために検討されています。

リトルは、UCF DNA単離とそれを特徴付けるための最良の方法について知られています。腫瘍細胞は正常細胞よりも長いDNA断片を放出するという仮説評価与えられました無細胞DNAの完全性は、血液循環⁵にDNAの起源を解明する試みにおいて研究されてきました。いくつかの研究は、血液中の無細胞DNAの完全性は、癌⁶多くの種類のための良好な診断テストを表し、同じ仮説が尿^7-9に関連して提案されていることを実証しました。

本稿では、膀胱および前立腺癌の検出への適用の可能性とともに、UCF DNAインテグリティ解析のための新しい方法を説明します。具体的には、UCF DNAの完全性は、より長い250bpのが前立腺癌および膀胱癌を含む固形腫瘍において増大したDNAコピー数を有することが知られている4つの領域において試験したよりフラグメント：C-MYC（8q24.21）、HER2を （17q12.1 ）、BCAS1（20q13.2）、および^{AR（Xq12）10-14。}特定の癌遺伝子ではなく、ランダムな配列は、癌患者の無細胞画分でそれらを発見する確率を高めるために選択しました。の主な利点の一つこの方法は、柔軟であり、他の領域は、腫瘍の種類や特性に基づいて選択することができるということです。

プロトコルは、IRSTヒューマン研究倫理委員会のガイドラインに従います。

注：この手順では、UCF DNAの完全性の分析を実行するために尿試料からDNAを単離しました。 LNCaPおよびMRC細胞株は、標準を構築するために使用しました。このような特定の癌遺伝子のためのDNAの抽出、DNAの定量（コントロール遺伝子について分光光度計、リアルタイムPCR、STOX1）、及びリアルタイムPCRのような技術は、（ 図1）を行いました。

1.尿収集および処理

1. 清潔で乾燥し、プラスチックカップでクリーンキャッチ最初の朝の尿サンプルを入手します。尿サンプルの少なくとも50ミリリットルを収集します。
2. 3時間の最大4℃で尿を維持し、同じ温度で実験室に送信します。
3. 2つの50 mLコニカル底ポリプロピレンチューブに研究室や転送に到着するとすぐにそれを2回反転させることにより、各サンプルを混ぜます。
4. チューブを遠心4℃または室温で10分間、850×gで。
5. 慎重に細胞ペレットの上の上清のうちの少なくとも2ミリリットルを残して、2つの5 mLのチューブに、尿上清の上部10ミリリットルを転送します。
   注：上清の上部を転送するには、細胞または細胞破片による汚染のリスクを低減します。上部と下部との間には明確な描写はありません。
6. ペレットを捨て、すぐに使用するまで-80℃上清を凍結します。

尿上清および細胞株から2 DNA単離

注：市販のキットを用い、製造業者の指示に従って細胞系（膀胱癌のための前立腺癌またはMRCために、例えば、LNCAP）からDNAを単離します。尿上清からのDNAの単離は、以下のように修正された、商業的プロトコルを使用して行われるべきです。

1. 室温で尿上清の1つのアリコートを解凍します。
2. 明確な5-mLのチューブに尿サンプルと転送尿上清1mLのを渦と混ぜます。 -80℃で残尿をフリーズします。
3. サンプルに直接プロテイナーゼkの100μLを加えます。
4. サンプルにAL緩衝液の1 mLを加え、ピペッティングによりよく混ぜます。
5. チューブを閉じ、15分間56℃でサンプルをインキュベートします。
6. インキュベーションの間、各サンプルごとに1カラムを作製し、製造業者の説明書（100％エタノールの指示された量を加える）に従って、洗浄バッファー、AW1およびAW2を準備します。
7. 室温に戻し、サンプルを持参し、無水エタノール1mLを追加。ピペッティングにより完全に混和します。
8. 列にステップ2.7で得られた混合物の650μLを加え、1分間6000×gでそれを遠心します。
9. フロースルーを含むチューブを捨て、新しい、クリーンなコレクションチューブにカラムを配置します。サンプル混合物のすべてが（5回）に使用されるまで繰り返し、2.8と2.9の手順。
10. 500＆を追加＃181;カラムの縁を濡らさないようにバッファAW1のL。 1分間6000×gでそれを遠心。
11. フロースルーを含むチューブを捨て、新しい、クリーンなコレクションチューブと交換してください。
12. カラムの縁を濡らさないようにバッファAW2の500μLを追加します。 3分間フルスピード（2万XG）でそれを遠心。
13. フロースルーを含むチューブを捨て、新しい、クリーンなコレクションチューブと交換してください。
14. 任意の残留洗浄バッファーを除去するための手順を繰り返し2.12。
15. きれいな1.5 mLチューブにカラムを置きます。溶出バッファーAEの50μLを加え、カラムを濡らすバッファことを確認するために、7分を待ちます。
16. 1分間8000×gでそれを遠心。
17. ミニカラムにステップ2.15から溶離液をピペットとDNAの最大の回収率を確保するために、1分間最大速度でそれを遠心します。

3. DNA定量化および希釈

1. 分光光度計を使用して、ボットからのDNAの定量化を行いますH細胞株および尿上清試料。製造元の指示に従って、ベンチトップ分析計で試料を2μLを使用してください。
2. 1ng /μLの濃度を取得し、DNAの完全性の分析まで-20℃でDNAを保存するためにUCF DNAサンプルを希釈します。
   注：DNA量をリアルタイムPCR（少なくとも100 ngの）を続行するのに十分でない場合、新たなDNAの単離処理を行います。
3. 0.001 0.01、0.1、1、0.5、2 NG /μL、100μL（ST1、ST2、ST3、ST4、ST5の体積でそれぞれ、および：異なる濃度の6水準を得るために、細胞株サンプルからDNAを希釈ST6）。 DNAの完全性の分析まで-20℃で細胞株DNA標準を保管してください。

4. DNA完全性試験 - PCR

1. プライマー（濃度はアッセイの種類によって異なります）、グリーンスーパーミックス、細胞株のDNA標準、および氷上でUCF DNA希釈した試料を解凍します。
2. プレートFのストリップチューブを準備または72ウェルロータディスク。小分けした各標準および希釈サンプルおよび陰性対照のためのRNaseフリー水10μLの重複で10μL。
3. 各サンプルについて、各プライマーの1μL（濃度は表1に示されている）、グリーンスーパーミックスの12.5μL、およびRNaseフリー水6.5μLのミックスを調製します。 2複製のための6の標準、2反復のサンプル数、2複製、および2エキストラサンプルの陰性対照：ミックスを調製する場合、サンプルの次の番号を使用します。
4. 各ウェルにミックスのアリコート15μL。ピペット又はチューブをスピンしないでください。
5. 表1に示したPCR条件でプロトコルを起動します。
   注：29×2サンプル+ 6×2標準+ネガティブコントロール×2 = 72（UCF DNA値）：UCF DNA値の場合、29のDNAサンプルを72ウェルのロータディスクを使用して、各リアルタイム実験のために処理しました。
   注：UCF DNAインテグリティ解析のためのプロトコルもすることができます（他のデバイスを使用する場合、ROX色素を添加する必要があるかもしれない）他のリアルタイムPCR装置を用いて行きました。

5. DNA完全性試験 - データ分析と解釈

注：以前に^7-9（ 図2）に記載のように各サンプルのUCF DNA値は、各個々のPCR遺伝子の評価のための標準曲線の構築を用いて、標準曲線の補間を使用してリアルタイム機器検出システムソフトウェアによって得ました。

1. 複製を評価します。サンプルはCtは破棄され、第二の実験で再評価されなければならない≥1違いで複製します。
2. 各試料についての中央値のCtを計算し、36≤Ct値とサンプルを検討してください。
3. 融解分析を使用して、PCR産物の特異性を評価します。
4. 標準曲線との補間によって各アンプリコンの濃度を評価します。各アンプリコンのための濃度値（ngの/μL）を得ました。

全遊離DNA濃度は、1.51の間および138 ngの/μLの範囲を示す、分析したすべてのサンプルについて、分光光度法により定量可能でした。五対照試料は、データの再現性のために使用した二つの独立したリアルタイムの実験は、C-MYC、HER2、BCAS1、AR、及びSTOX1について実施しました。変動（CV）の係数は、2つの独立した実験間の再現性の良好度（ 表2）を用いて、各遺伝子（ 表2）を計算しました。

125-bpのSTOX1配列は、PCR阻害剤の存在を除外するために分析されました。サンプルはSTOX1の増幅が認められた場合は、UCF DNAの完全性試験を実施しました。増幅の欠如は、DNA量がTを繰り返す必要性を示し、UCF DNAの完全性試験を行うのに十分ではなかったことを意味し新しい採尿と彼は分析。膀胱および前立腺癌におけるSTOX1の増幅または欠失についての利用可能なほとんどの情報があるので、この遺伝子は、これらの腫瘍型のための制御配列として使用することができます。最後に、UCF DNAの完全性評価を併せて3癌遺伝子（ 図3）について得られた値を加算することにより行いました。

C-MYC、AR、およびHER2は前立腺癌^7,8ために提案されたが、C-MYC、HER2、およびBCAS1遺伝子の合計を使用することは、膀胱癌の検出⁹提案されています。膀胱および前立腺癌の検出のために識別最良のカットオフ値は、それぞれ0.1 ngの/μL0.04 NG /μLです。これらのカットオフ値を使用して、73％の感度および84％の特異性が、症候性の個体に対する膀胱癌を検出する際に得られた58％の感度および44％の特異的性は、良性尿生殖路の疾患^7-9の患者に対して前立腺癌を検出する際に観察されました。結論として、UCF DNAの完全性試験は、柔軟であるため、本研究で使用した遺伝子は、疾患に応じて、他の目的の長い配列で置換することができます。

図1.尿無細胞DNAのIntegrityワークフローとタイムライン。この方法のワークフローは異なるステップと回に分割されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

c-MYCアンプリコン分析のための図2.レポート。融解分析、増幅プロットの例、および標準曲線は、C-MYCの評価のために報告されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3. UCF DNAインテグリティ解析のワークフロー。 UCF DNAインテグリティ解析のためのシンプルなワークフローが報告されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

表1のプライマー配列およびアッセイ条件。

各遺伝子の表2リアルタイムPCR再現。
*結果はNG /μLとして報告します
CV、変動係数。 NE、評価可能ではありません

前立腺と膀胱癌の早期診断のために得られた結果の表3の概要。

UCF DNAの完全性の分析は、尿中のDNAの完全性を評価するための新しい、非侵襲的方法です。最近、膀胱⁹および前立腺癌^7,8の早期診断のために提案されました。 UCF DNA完全性テストの利点と欠点の数は、一緒に将来の見通しで、ここで説明されています。

アプローチの主な利点は、それが安価で、非侵襲的な方法と分子生物学的手法の基本的な知識を必要とするバイオマーカーの潜在的な供給源として尿を研究するためのシンプルなプロトコルを提供することです。テストは、2作業日後に実行するために迅速、かつその結果、利用可能です （ 図1）は 、容易に医師の助けを借りずに解釈することができます。唯一のDNA単離プロセスおよび2リアルタイムPCRをからなる、アプローチはまた、良好な費用便益比を有します。精度の点では、UCF DNAの完全性を検出する高感度（73％）及び特異度（84％）を有します症状のある患者⁹における膀胱癌。最後に、この方法は柔軟性があり、提案の遺伝子は容易に限りが250塩基対よりも長いように、関心対象の他の遺伝子で置換することができます。

テストは、多くの制限があります。まず、DNA分光光度定量法は、多くの場合、不正確であり、他の、より正確な、蛍光のアプローチ（ 例えば、量子ビットまたはピコグリーン）で置き換えることができます。 DNAの品質はしばしば低260/280と260/230比によって示されるように、また、かなり貧弱です。さらに、我々の研究の一つでは、非常に低い特異度（44％）は、おそらく循環へより完全なDNAを放出良性炎症性壊死細胞の結果であった尿生殖路⁷の良性疾患の患者に対して前立腺癌患者で観察されました。良性疾患の両方の前立腺癌患者および個人がUで炎症性成分を有することができるので、これは重要な問題ですrinary細胞。したがって、前立腺癌の早期診断のコンテキスト内で、UCF DNAの完全性分析の結果は、誤解を招く可能性があります。

UCFのDNAの完全性は、314尿、前立腺や膀胱癌患者からのサンプル、健康および症候性の個人、および尿生殖路の良性疾患を有する患者で評価しました。大きいケースシリーズ上の前向き研究は、より良好な尿生殖路の癌の早期診断マーカーとしてこのアプローチの役割を定義するのに必要とされています。

ほとんどが癌のためのバイオマーカーの供給源としてUCF DNAの対象に公開されているが、この分野への関心が高まっています。最近、Togneri ら。 ^図4は、膀胱癌患者の尿の上清から抽出された無細胞DNAは無細胞画分の研究を示唆し、尿のペレットから単離した細胞のDNAのより高い腫瘍ゲノム負荷を示している興味深い論文を発表しました尿中のDNAの泌尿器癌を特徴づけることが有用である可能性があります。

我々の経験では、UCF DNAの完全性試験は、前立腺癌のための良好な早期診断テストであることを証明していませんでした。従来の尿細胞診との組み合わせで使用される場合、逆に、それは、膀胱癌の早期発見のためのマーカーとしての可能性を示しました。より大きな前向きのケースシリーズの確認試験は、現在計画されています。

The authors declare no competing financial interests.

The authors thank Gráinne Tierney and Silvia Bellissimo for their editorial assistance.