תא ללא DNA Integrity ניתוח בדגימות שתן

A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.

למרות הנוכחות של מחזורי DNA ללא תא פלזמה או בסרום הוכחה נרחב להיות מקור מתאים של סמנים ביולוגיים עבור סוגים רבים של סרטן, כמה מחקרים התמקדו את הפוטנציאל של השימוש ללא תא שתן (UCF) DNA. החל מ ההשערות כי תאים אפופטוטיים נורמלי לייצר DNA מקוטעת וכי תאים סרטניים לשחרר עוד DNA, את התפקיד הפוטנציאלי של שלמות ה- DNA UCF הוערך כסמן אבחון מוקדם מסוגל להבחין בין חולים עם הערמונית או סרטן שלפוחית ​​השתן אנשים בריאים.

ניתוח שלמות UCF DNA מוצע על הבסיס ארבעה PCRs כמוני בזמן האמת של ארבעה רצפים ארוכים מ -250 נ"ב: c-myc, BCAS1, HER2, ו AR. רצפים כי לעתים קרובות יש מספר עותק דנ"א גדל ב סרטן שלפוחית ​​השתן וסרטן הערמונית נבחרו לניתוח, אבל השיטה היא גמישה, וגנים אלה יוכל להחליף אותו עם גנים אחרים של inteמנוחה. את התועלת הפוטנציאלית של UCF DNA כמקור ביומרקרים כבר הודגמה עבור ממאירויות אורולוגים, ובכך לסלול את הדרך למחקרים נוספים על אפיון DNA UCF. המבחן שלמות ה- DNA UCF יש את היתרון של להיות לא פולשנית, מהירה, וקלה לביצוע, עם רק כמה מיליליטרים של שתן צורך לבצע את הניתוח.

תא ללא DNA ניתן לאתר בדם ובשתן בשל מוות של תאים על ידי מנגנונים אפופטוטיים או נמקי. דנ"א נייד ללא בדם נחקר באופן נרחב למטרות אבחון ופרוגנוסטיים במחלות שונות, בעיקר סרטן ^1. עם זאת, פחות ידוע על התפקיד ללא תא שתן (UCF) DNA. UCF DNA עשויה מהקורן חולף דם דרך מערכת סינון גלומרולרי או מתאי שמגיעים ישירות במגע עם נוזל ² הגוף הזה (למשל, תאי urothelial או תאי ערמונית). שימוש DNA UCF כמקור ביומרקרים נחקר בעיקר לאבחון המוקדם של כליות, שלפוחית שתן, סרטן הערמונית בשל האחוז הגבוה של DNA UCF מגיע ישירות מתאי בדרך שתן ^3,4.

מעט מאוד ידוע על DNA UCF ואת השיטות הטובות ביותר לבידוד ואפיון זה. בהינתן ההשערה כי תאים סרטניים לשחרר קטעי דנ"א עוד יותר מתאים רגילים, ההערכהשל שלמות ה- DNA בתא ללא נחקרה בניסיון להבהיר את מקור ה- DNA במחזור הדם ^5. מספר מחקרים הוכיחו כי שלמות ה- DNA ללא תא דם מייצג בדיקת אבחון טוב עבור סוגים רבים של סרטן ^6, ואותו ההשערה הוצעה ביחס שתן ^7-9.

מאמר זה מתאר שיטה חדשה לניתוח שלמות UCF DNA עם יישום פוטנציאל לגילוי סרטן שלפוחית ​​השתן וסרטן הערמונית. בפרט, על שלמות ה- DNA UCF שבר יותר מ -250 נ"ב נבדקה 4 אזורים ידועים כבעל מספר עותק דנ"א מוגבר בגידולים מוצקים, כולל ערמונית וסרטן שלפוחית השתן: c-myc (8q24.21), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2), AR (Xq12) ^10-14. אונקוגנים ספציפיים, ולא רצפים אקראיים, נבחרו כדי להגדיל את ההסתברות למציאת אותם בשבריר תא ללא של חולי סרטן. אחד היתרונות העיקריים שלשיטה זו היא כי היא גמישה וכי באזורים אחרים יכולים גם להיבחר על בסיס סוג גידול ומאפיין.

הפרוטוקול פועל בהתאם להנחיות ועדת האתיקה מחקר האדם irst.

הערה: בפרוטוקול זה, אנחנו מבודדים דנ"א מדגימות השתן לבצע ניתוח שלמות UCF DNA. קווי LNCaP ותא MRC ששימשו לבניית סטנדרטים. טכניקות כגון מיצוי DNA, כימות DNA (ספקטרופוטומטר ו בזמן אמת PCR עבור הגן שליטה, STOX1), בזמן אמת PCR עבור אונקוגנים ספציפיים בוצעו (איור 1).

איסוף ועיבוד שתן 1.

1. השג דגימת שתן ראשון בבוקר נקי לתפוס בכוס נקייה ויבשה, פלסטיק. אסוף לפחות 50 מ"ל של דגימת שתן.
2. לשמור על שתן על 4 מעלות צלזיוס למשך תקופה מקסימלית של 3 שעות ולשלוח אותו למעבדה באותה הטמפרטורה.
3. מערבבים כל דגימה על ידי היפוך זה פעמיים מיד עם הגעתו במעבדה ולהעביר לשתי 50 מ"ל תחתית חרוטי צינורות פוליפרופילן.
4. בצנטריפוגה צינורותב 850 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C או בטמפרטורת החדר.
5. בזהירות להעביר 10 מ"ל של החלק העליון של supernatant שתן לשני צינורות 5 מ"ל, עוזב לפחות 2 מ"ל של supernatant מעל גלולה התא.
   הערה: העברת החלק העליון של supernatant מפחיתה את הסיכון של זיהום על ידי תאים או פסולת הסלולר. אין הגדרה ברורה בין החלקים העליונים ותחתונים.
6. וזורקים את הכדור ומיד להקפיא את supernatant ב -80 ° C עד השימוש.

בידוד DNA 2. מן Supernatant שתן שורות תאים

הערה: לבודד את ה- DNA משורת תאים (למשל, LNCaP לסרטן הערמונית או MRC בסרטן שלפוחית השתן) באמצעות ערכה מסחרית בהתאם להוראות היצרן. בידוד של DNA מן supernatant שתן צריכה להתבצע באמצעות הפרוטוקול המסחרי, שונה כדלקמן:

1. להפשיר aliquot אחד supernatant שתן בטמפרטורת החדר.
2. וורטקס ומערבבים את דגימת שתן ולהעביר 1 מ"ל של supernatant שתן לתוך צינור 5 מ"ל ברור. להקפיא את השתן שיורי ב -80 מעלות צלזיוס.
3. הוספת 100 μL של k proteinase ישירות המדגם.
4. הוסף 1 מ"ל של חיץ AL המדגם ומערבבים היטב על ידי pipetting.
5. סגור את צינורות דגירת הדגימות ב 56 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
6. במהלך הדגירה, להכין עמודה אחת עבור כל דגימה ולהכין את מאגרים לשטוף, AW1 ו AW2, על פי הוראות היצרן (להוסיף את הסכום המצוין של 100% אתנול).
7. תביאו את דגימות בחזרה לטמפרטורת החדר ומוסיפים 1 מ"ל של אתנול מוחלט. מערבבים היטב על ידי pipetting.
8. להוסיף 650 μL של התערובת שהושגה בשלב 2.7 לעמודה צנטריפוגות אותו ב -6,000 XG דקות 1.
9. מחק את הצינור המכיל את הזרימה דרך למקם את הטור על צינור אוסף חדש, נקי. חזור על שלבים 2.8 ו -2.9 עד שכל התערובת מדגם נוצל בעבר (5 פעמים).
10. הוספת 500 &# 181; L של חיץ AW1 מבלי להרטיב את שפת הטור. צנטריפוגה זה ב 6,000 XG דקות 1.
11. מחק את השפופרת המכילה את הזרימה דרך ולהחליף אותו עם צינור אוסף חדש, נקי.
12. הוספת 500 μL של חיץ AW2 מבלי להרטיב את שפת הטור. צנטריפוגה זה במלוא המהירות (20,000 XG) במשך 3 דקות.
13. מחק את השפופרת המכילה את הזרימה דרך ולהחליף אותו עם צינור אוסף חדש, נקי.
14. חזור על שלב 2.12 כדי להסיר כל חיץ כביסה שיורית.
15. מניחים את הטור לתוך צינור 1.5-מ"ל נקי. הוסף 50 μL של חיץ elution AE ולחכות 7 דקות על מנת להבטיח כי מרטיב חיץ העמודה.
16. צנטריפוגה זה ב 8000 XG דקות 1.
17. פיפטה eluent משלב 2.15 לתוך הטור-מיני צנטריפוגות אותו במהירות המרבית עבור 1 דקות כדי להבטיח את התאוששות מקסימלית של ה- DNA.

3. כימות דנ"א דילול

1. באמצעות ספקטרופוטומטר, לבצע כימות של דנ"א בוטh הקו הסלולרי לבין דגימות supernatant שתן. השתמש 2 μL של המדגם על ספקטרומטר הספסל העליון, על פי הוראות היצרן.
2. לדלל את דגימות DNA UCF כדי לקבל ריכוז של 1 ng / μL ולאחסן את ה- DNA ב -20 ° C עד לניתוח שלמות ה- DNA.
   הערה: אם כמות ה- DNA אינו מספיק כדי להמשיך עם בזמן אמת PCR (לפחות 100 נ"ג), לבצע תהליך בידוד DNA חדש.
3. לדלל את דנ"א מדגימות שורת תאים להשיג שישה תקנים עם ריכוזים שונים: 0.001, 0.01, 0.1, 1, 0.5, ו -2 ng / μL, כל אחד עם נפח של 100 μL (st1, ST2, ST3, st4, ST5, ו st6). אחסן את הסטנדרטים DNA התא קו ב -20 ° C עד לניתוח שלמות ה- DNA.

4. DNA Integrity מבחן - PCR

1. הפשרה פריימרים (ריכוז תלוי בסוג של assay), Supermix הירוק, סטנדרטי DNA התא אונליין, דגימות בדילול UCF DNA על קרח.
2. הכן צינורות רצועה בצלחת fאו הדיסק הרוטור 72-היטב. Aliquot 10 μL בשני עותקים עבור כל תקן מדגם מדולל 10 μL של מים RNase ללא עבור הביקורת השלילית.
3. להכין תערובת של 1 μL של כל צבע יסוד (הריכוזים מסומנים בטבלה 1), 12.5 μL של Supermix ירוק, ו -6.5 μL של RNase ללא מים עבור כל דגימה. כאשר מכין את התערובת, להשתמש את המספר הבא של דגימות: 6 תקני 2 משכפל, מספר דגימות עבור 2 משכפל, שליטה שלילית 2 משכפל, ו -2 דגימות נוספות.
4. Aliquot 15 μL של התערובת לתוך כל טוב. אל פיפטה או לסובב את הצינורות.
5. הפעל את הפרוטוקול עם תנאי PCR המצוינים בטבלת 1.
   הערה: לקבלת ערך DNA UCF, 29 דגימות DNA עובדו עבור כל ניסוי בזמן אמת באמצעות הדיסק הרוטור 72-היטב: 29 x 2 דגימות + 6 x 2 תקנים + שלילי מלא x 2 = 72 (UCF DNA ערך).
   הערה: הפרוטוקול לניתוח שלמות ה- DNA UCF יכול גם להיותמתבצע באמצעות מכשיר אחר בזמן אמת PCR (בעת השימוש במכשיר אחר, צבע רוקס ייתכן שיהיה צורך להוסיף).

5. DNA Integrity מבחן - ניתוח נתונים ופרשנות

הערה: ערך DNA UCF עבור כל דגימה הושגה על ידי תוכנת מערכת מכשיר איתור בזמן אמת באמצעות בניית עקומת סטנדרט עבור כל הערכת גן PCR פרט באמצעות אינטרפולציה עקומה סטנדרט, כפי שתוארה לעיל ^7-9 (איור 2).

1. להעריך את המשכפל; מדגם משכפל עם הבדל ≥1 Ct חייב להיות מושלך מחדש העריך בניסוי שני.
2. חשב את Ct החציוני עבור כל דגימה ולשקול דגימות עם ערך Ct ≤ 36.
3. להעריך את הספציפיות של מוצרי ה- PCR באמצעות ניתוח היתוך.
4. להעריך את הריכוז של כל amplicon ידי אינטרפולציה עם עקומת סטנדרט; להשיג ערך ריכוז (ng / μL) עבור כל amplicon.

ריכוז DNA חופשי הכולל היה לכימות על ידי spectrophotometry עבור כל הדגימות נותחו, מראה מגוון של בין 1.51 ו 138 ng / μL. חמש דגימות בקרה שימשו שחזור של נתונים: שני ניסויים בזמן אמת עצמאית בוצעו עבור c-myc, HER2, BCAS1, AR, ו STOX1. המקדמים של השתנות (CV) חושבו אז עבור כל גן (טבלה 2), עם תואר טוב של שחזור בין שני ניסויים בלתי תלויים (טבלה 2).

רצף STOX1 125-נ"ב נותח כדי לשלול את נוכחותו של מעכבי ה- PCR. אם הדגימות הראו הגברה של STOX1, מבחן שלמות ה- DNA UCF בוצע. חוסר ההגברה התכוון כי כמות ה- DNA לא הייתה מספיק כדי לבצע את הבדיקה התקינה DNA UCF, המעיד על הצורך לחזור על tהוא ניתוח עם אוסף שתן חדש. כאשר יש מעט מידע זמין על ההגברה או המחיקה של STOX1 בסרטן שלפוחית ​​השתן והערמונית, הגן הזה יכול לשמש כרצף בקרת סוגי גידולים אלה. לבסוף, הערכת שלמות ה- DNA UCF בוצעה על ידי הוספה ביחד את הערכים שהתקבלו עבור השלושה אונקוגנים (איור 3).

השימוש בסכום של c-myc, HER2, וגנים BCAS1 הוצע לגילוי סרטן שלפוחית השתן ^9, בעוד c-myc, AR, ו HER2 הוצעו עבור סרטן הערמונית ^7,8. הערכים החתוכים הטובים ביותר המזוהה לצורך שלפוחית ​​גילוי סרטן ערמונית הם 0.1 ng / μL ו 0.04 ng / μL, בהתאמה. שימוש בערכים חתוכים אלה, רגישות של 73% וסגוליות של 84% התקבלו ביותר לאיתור סרטן שלפוחית ​​השתן לעומת אנשים סימפטומטי, תוך רגישות 58% ו -44% ספציפיותity נצפה באבחון סרטן הערמונית לעומת חולים עם מחלות בדרכי שתן ואברי מין שפירות ^7-9. לסיכום, מבחן שלמות ה- DNA UCF הוא גמיש, כך הגנים השתמשו במחקר הנוכחי לא יוכל להחליף אותו עם רצפים ארוכים אחרים בעלי עניין, תלוי בסוג המחלה.

איור 1. שתן DNA נייד ללא Workflow יושר קו הזמן. זרימת העבודה של שיטת מחולק צעדים וזמנים שונים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

דווח איור 2. עבור ניתוח Amplicon c-myc. דוגמא של ניתוח היתוך, עלילת ההגברהעקום ורמה מדווח על הערכת תיק c-myc. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. UCF DNA Integrity ניתוח זרימת עבודה. זרימת עבודה פשוטה לניתוח שלמות ה- DNA UCF מדווחת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

טבלה 1. רצפים פריימר והגבלות Assay.

טבלה 2. שחזור PCR בזמן אמת עבור כל גן.
* תוצאות מדווחות כפי ng / μL
CV, מקדם שונה; NE, לא הוערך

סיכום טבלה 3. של התוצאות שהתקבלו עבור האבחון המוקדם של סרטן הערמונית ושלפוחית השתן.

ניתוח דנ"א שלמות UCF הוא שיטה חדשה, לא פולשנית להערכת שלמות ה- DNA בשתן. הוצע לאחרונה לאבחון המוקדם של סרטן שלפוחית השתן וסרטן הערמונית ^{9 7,8.} מספר יתרונות וחסרונות של הבדיקה התקינה DNA UCF נדונים כאן, יחד עם הזדמנות עתידית.

היתרון העיקרי של הגישה הוא שהיא מציעה שיטה זולה, לא פולשנית פרוטוקול פשוט ללמוד שתן כמקור פוטנציאלי של סמנים ביולוגיים, הדורשים ידע בסיסי בלבד של טכניקות הביולוגיה המולקולרית. המבחן הוא מהיר לביצוע, והתוצאות, זמינות לאחר 2 ימי עבודה (איור. 1), יכול להתפרש בקלות ללא סיוע של רופא. מורכב של תהליכי בידוד DNA רק ו -2 PCRs בזמן האמת, הגישה גם יש יחס עלות-תועלת טובה. במונחים של דיוק, שלמות ה- DNA UCF בעל רגישות גבוהה (73%) וסגוליות (84%) באיתורסרטן שלפוחית השתן בחולים סימפטומטיים ^9. לבסוף, השיטה היא גמישה, ואת הגנים המוצעים ניתן להחליף בקלות עם גנים אחרים בעלי עניין, כל עוד הם עוד מ -250 נ"ב.

המבחן גם יש מספר מגבלות. ראשית, שיטת כימות spectrophotometric DNA הוא לרוב לא מדוייקים יכול להיות מוחלף עם, אחרים יותר מדויק, גישות fluorometric (למשל, קיוביט או PicoGreen). איכות ה- DNA היא גם די גרועה, כפי שהודגם על ידי 260/280-נמוכים לעתים קרובות 260/230 היחסים. יתר על כן, באחד המחקרים שלנו, סגולי נמוך מאוד (44%) נצפה בקרב חולי סרטן הערמונית לעומת חולים עם מחלות שפירות של בדרכי השתן ואברי המין ^7, אשר הייתה כנראה תוצאה של תאי נימקים דלקתיים שפיר שחרור DNA השלם יותר לתוך המחזור. זהו נושא קריטי, כי הן חולי סרטן הערמונית ויחידים עם מחלות שפירות עשויים להיות מרכיב דלקתי ב u שלהםתאי וטרינרים. לפיכך, בהקשר של אבחון מוקדם של סרטן הערמונית, התוצאות מניתוח שלמות UCF DNA יכול להיות מטעה.

שלמות ה- DNA UCF הוערכה ב 314 דגימות שתן של חולים עם סרטן ערמונית או שלפוחית ​​השתן, אנשים בריאים סימפטומטי, וחולים עם מחלות שפירות של בדרכי השתן ואברי המין. מחקר פרוספקטיבי על סדרת מקרים גדולה יותר דרוש כדי להגדיר את התפקיד של גישה זו כסמן אבחון מוקדם סרטן בדרך שתן ואברי מין.

אף על פי שמעט פורסם בנושא DNA UCF כמקור סמנים לסרטן, עניין בתחום זה הולך וגדל. לאחרונה, Togneri et al. ⁴ פרסם מאמר מעניין שבו DNA תא ללא שחולצו מן supernatant שתן של חולי סרטן שלפוחית השתן הראה נטל הגנום גידול גבוה יותר מזה של ה- DNA התאי מבודד גלולה שתן, דבר המצביע על כך במחקר של השבר תא ללאדנ"א בשתן יכול להיות שימושי כדי לאפיין סרטן אורולוגים.

מניסיוננו, מבחן שלמות ה- DNA UCF לא להתברר בדיקת אבחון מוקדם טובה לסרטן הערמונית. לעומת זאת, הוא הראה פוטנציאל כסמן לגילוי המוקדם של סרטן שלפוחית ​​השתן בעת ​​שימוש בשילוב עם ציטולוגיה בשתן קונבנציונלית. מחקר מאשר על סדרת מקרים פרוספקטיבית גדולה נמצא כעת בשלב תכנון.

The authors declare no competing financial interests.

The authors thank Gráinne Tierney and Silvia Bellissimo for their editorial assistance.