Enfeksiyon Hastalıkları Modeli Olarak Organoids: Helicobacter Pylori ve İnsan Kültür ve kemirgen Mide Organoids ve Mikroenjeksiyon

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

Patojenlerin çalışma, in vivo enfeksiyon taklit etmek için yeterli bir model sistemler kullanır. Kullanılan sistemlerin bazı optimum uzak iken bazı enfektif ajanlar için yeterli model sistemler eksiktir. Bir örnek nedensel mide kanseri gelişimi ile ilgilidir mide bakterisi Helicobacter pylori (H. pylori) 'dir. Yine daha uygun bir hücre kültürü sisteminde yokluğunda amacı birçok çalışma, kanserli kaskadının son nokta temsil kanser gelişimi kullanımı kanser hücre çizgisi altında yatan moleküler mekanizmaların, analiz etmek. Primer, dönüştürülmemiş hücreler bu çalışmalar için daha iyi bir model olabilir. Bununla birlikte, birincil hücreler donör az sayıda kullanılabilir ve daha uzun süreler boyunca kültüre olamaz. Son yıllarda, kök hücre araştırmaları enfeksiyon biyoloji çalışma için primer hücre kültürleri için yeni kaynaklar sağlamak için önemli bir ilerleme kaydetmiştir.

Dan KültürlerÜç kök hücre kaynağı kullanılmıştır: Embriyonik kök hücreler (ESC), uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSC) ya da erişkin kök hücreler. Bunlar, ^{Sitomegalovirüs, 1,2 veya} Hepatit C virüsü gibi virüsler, enfeksiyonlar modellemek için kullanılmıştır ^3-7, örneğin Bacterioides thetaiotaomicron ¹⁰ veya Salmonella enterica ¹¹ olarak Plasmodium falciparum ^{8 veya 9,} Toxoplasma gondii ve bakteriler gibi parazitler. En son, çeşitli yaklaşımlar H. enfeksiyonu modellemek için yayınlanmıştır ^{15 -} ESC veya iPS hücrelerinin ^12, fare yetişkin kök hücrelerin ^21,22 ya da insan erişkin kök hücreleri ¹³ türetilen organoids ile pylori.

Yetişkin kök hücrelerinden organoid kültürlerinin gelişmesi sıçangil bağırsak epiteli izole tek kök hücre, bir 3-boyutlu bir matris içine ekildi bir çalışmada, gelen veKemik morfojenik protein (BMP) ¹⁶ sinyalizasyon inhibe Wnt sinyalizasyon ve Noggin geliştirmek için mitojendir, R-spondin olarak EGF içeren bağırsak kök hücrelerin çevreye taklit ortamda gömülü. Özellikle, bu kültürler mezenkimal hücreler ile birlikte kültür gerektirmez. Bu koşullar altında, kök hücreler çoğalmaya ve etki bağırsak kript hücreleri barındıran küçük yapılar oluşturur, ve bağırsak villuslarının hücreleri içeren alan. Organoids böylece in vivo durumu taklit etmek kendini düzenliyoruz. Bugün birçok fare ve insani dokulardan yetişkin kök hücrelerin in vitro ve yetiştirilebilir gibi ince bağırsak ve kolon ^17, mide ^13,18, karaciğer ^19,20 olarak in vivo meslektaşı benzeyen organoids içine kendini organize pankreas ²¹ ve Prostat ^22.

Burada yetişkin kök cel kültür fare veya insan mide organoids bir video protokol sağlarls H. ile Microinject ve pylori. Bu protokol daha önceki raporlarda ^13,18 dayanmaktadır. Bu yöntem, kültürlenmesi ve intestinal organoids gibi diğer organoid kültürleri enfekte edilmesi için adapte edilebilir.

Mide organoid Kültür 1. kurulması

Not: Bu protokol, fare veya insan dokusundan gastrik bezleri izolasyonu için de kullanılabilir. Yaklaşık 1 cm² doku kullanılması tavsiye edilir. İnsan dokusu gastrik rezeksiyonu veya biyopsiler elde edilebilir.

1. Malzemenin Hazırlanması
   Not: Kullanılan bodrum matris Matrigel olduğunu. Her zaman buz üzerinde bodrum matrisi tutun. -20 ° C 'de taban matrisi saklayın ve kullanımdan önce buz üzerinde eritin. Bazal ortam HEPES Gelişmiş DMEM / F12 belirtir; Böyle Glutamax ve 1x Primocin uygun antibiyotikler gibi uygun bir glutamin kaynağıdır. Kullanılan kuluçka standart hücre kültürü kuluçka olan (37 ° C, nemlendirilmiş atmosfer,% 5 _CO2)
   1. Keskin forseps, makas, neşter ve bir cam mikroskopisi slayt: otoklav veya% 100 izopropil alkol kullanarak hazırlama kapları sterilize edin.
   2. Izolasyon gün önce, 24 wel yerleştirininkübatör l hücre kültürü plakası.
   3. Üretici firmaların tavsiyelerine uygun olarak bodrum matrisi hazırlayın. Tekrarlanan donma erime döngülerinden kaçınmak için, 1 ml hacimde hazırlayın.
   4. Buz üzerinde tampon ve serin kenetleme 500 ml hazırlayın. HPO _4, 8,0 mM KH ₂ PO _4, 96.2 mM NaCI, 1.6 mM KCI 5,6 mM Na _{2 ile} steril damıtılmış su 1x tamponu hazırlayın, 43,4 mM sakaroz, 54,9 mM, D-sorbitol, 0.5 mM DL-ditiyotreitol (DİKKAT), pH 7. Birkaç izolasyonların planlama ise, DL-ditiyotreitol olmaksızın 5x konsantre solüsyon hazırlanır. Steril filtre tamponu. Izolasyon önce, 1x ve sadece izolasyon önce DL-dithiothreitol eklemek için steril su ile 5x tampon sulandırmak.
   5. Hazırlayın ve üreticinin önerileri doğrultusunda tüm büyüme faktörlerini sulandırmak. Küçük boyutlu alikotları kullanın ve donma-çözülme döngüleri kaçının. Fonksiyonel büyüme faktörleri sonuçlar için çok önemlidir.
   6. Serin bazal buz üzerinde orta ve 4 santrifüj soğutmak6 ° C.
   7. 37 ° C'ye kadar bazal ortam ayrı bir bölüntüsünün, ısıtın.
2. Bezlerin izolasyonu
   1. Buz soğukluğunda bazal ortamda dokusunun yaklaşık 1 cm² toplayın. Hazırlık kadar buz üzerinde tutun. O kısa sürede doku işlemek için tercih edilir olsa da, buz üzerinde orta mağaza dokusu gerekirse.
   2. 10 cm'lik Petri kabındaki doku yerleştirin ve soğuk 1x şelasyon tamponu ile örtün. Yavaşça ileri geri hareket ettirerek yıkayın.
   3. Kuru bir 10 sm Petri kabındaki doku yerleştirin. Forseps kullanarak, dikkatli bir stereomikroskop altında mukus yanı sıra kas katmanı kaldırmak. Yavaşça ileri geri hareket ettirerek soğuk 1x kıskaç tamponunda doku yıkayın.
   4. Yeni, kuru bir 10 cm Petri kabı 1 ^cm2 doku yerleştirin. Kullanımı makas yaklaşık 2-5 mm² boyutu 20-50 küçük parçalar halinde kesilmiş.
   5. Forseps kullanarak, 50 ml'lik bir tüp içine tüm parçaları yerleştirin.
   6. Steril 10 ml plastik pipet alın. 1x kıskaç tamponunda pipet ıslatın. Keepişlem boyunca aynı pipet kullanarak.
   7. 50 ml'lik bir tüpe 10 ml soğuk 1 x kenetleme tamponu ekleyin. Şiddetle yukarı ve aşağı 10 kez pipetleme parçaları yıkayın. Parçalar dinlendiriniz. Süpernatantı.
   8. Süpernatant yineleyerek yıkama (adım 1.2.7) açıktır. Bu insan dokusunun 1 cm² yaklaşık 50-100 ml 1x kıskaç tampon alır.
   9. Yumuşak her 2 dakikada tersini, 10 dakika boyunca oda sıcaklığında, 10 mM EDTA ile takviye edilmiş 20 ml 1 x kenetleme tamponu içinde doku parçaları inkübe edin.
      Not: Bu inkübasyonun zaman ve ısı hızı ve / veya bez mimarisinin korunmasında biri için optimize edilebilir. Bunlar 200 rpm'lik bir çalkalayıcıda olmak üzere 37 ° C 'de 5 dakika için haddeleme platformunda 4 ° C'de birkaç saat kuluçkalamadan arasında olabilir. Fare midesinde için iyi bir başlangıç ​​noktası bir yuvarlanma platformun üzerinde 4 ° C de ve insan mide için 30 dakika, oda sıcaklığında 10 dk.
   10. Pipet kez yavaşça yukarı ve 10 ml pipet kullanarak aşağı. Pi izin vereces yerleşmek. Süpernatantı atın.
   11. Pipeti kullanarak, temiz bir 10 sm petri diş parçaları aktarın. Sıvı çıkarın.
   12. Doku parçaları üstüne bir cam mikroskop slayt yerleştirin. 10X büyütme ile hücre kültürü için bir ters mikroskop altında sağlam dokuyu uyun.
   13. Cam slayt ve Petri kabı basınç uygulayın. Hem (steril eldiven ile), el ve başparmak ile cam presleme tutun. Doku jant bezleri dokusunun dışarı salınır belirten bulutlu görünecektir.
   14. 10X büyütme ile hücre kültürü için ters bir mikroskop altında yayımlanan bezleri uyun.
   15. 30 ml soğuk bazal ortamda bezleri ve doku toplayın. Büyük doku parçaları dinlendiriniz.
   16. İki 15 ml tüpler bezleri içeren süpernatant toplayın.
   17. 200 xg ve 4 ° C'de santrifüje 5 dak. Atın süpernatant. Pelet izole bezleri içerir. Buz üzerinde tutun.
3. Bezlerin Tohum
   1. Tohumlama için, bodrum matris buz gibi soğuk her zaman tutmak, bu yüzden sıvı kalır.
   2. Alternatif 1: Tohum bir seyreltme satır 6 kuyu.
      1. Bodrum matris 60 ul pelet Askıya.
      2. Temel matrisinin her biri 50 ul buz üzerinde 5 steril 1,5 ml tüpler hazırlayın. Transferi ilk 1.5 ml tüp içine bezleri / bodrum matris süspansiyonu 10 ul. Bezleri Askıya ve sonraki bir 1.5 ml'lik tübe Bu çözeltinin 10 ul transfer. Bir sonraki borular için tekrarlayın.
   3. Alternatif 2: kuyu başına bezlerinin bir hesaplanmış miktarda Tohum. 24 plaka bir kuyuya 50 ul bodrum matrisinin başına 100 bezleri ile başlayın.
      1. Dikkatle 10 ml bazal ortamda topak haline bezleri askıya. Temiz bir 10 ml Petri kabı 50 ul yerleştirin. 10X büyütme ile hücre kültürü için ters bir mikroskop altında bezlerinin sayısını.
      2. Çözelti içinde bezlerinin konsantrasyonu hesaplanır. Sesini o conta aktarınins yeni bir 15 ml tüp 400 bezleri.
      3. 200 xg ve 4 ° C'de santrifüje 5 dak. Süpernatantı atın ve buz üzerinde tüp tutun. 200 ul bodrum matrisi ekleyin ve dikkatlice tekrar süspansiyon. Buz üzerinde tutun.
   4. 37 ° C sıcak bir 24-çukurlu plaka al inkübatör (adım 1.1.2'ye bakınız). Kuyunun merkezinde taban matris içinde 50 ul bezlerinin bir damla yerleştirin. Damla kubbe oluşturacak.
   5. Dikkatle geri hücre kültürü inkübatör plaka transfer. Bodrum matrisi 10 dk katılaşmaya edelim.
   6. Tüm büyüme faktörleri ile sıcak ortamı hazırlayın.
      1. İnsan bezleri için: İnsan gastrik organoids aşağıdaki büyüme faktörleri ile bazal ortamı Ek: 50 ng / ml EGF,% 10 noggin-koşullandınlmış madde içinde,% 10 R-spondin1-koşullandınlmış madde içinde,% 50, Wnt-koşullandınlmış madde içinde, 200 ng / mi fibroblast büyüme faktörü (FGF), 10, 1 nM gastrin ve 2 uM TGFbeta önleyicisi ve 10 uM rho-birleşik biçim verme sarmal bobin protein serin / treonin kinaz önleyicisi (RHOKi).
      2. Sıçangil bezleri için: fare gastrik organoids aşağıdaki büyüme faktörleri ile bazal ortamı Ek: 50 ng / ml EGF,% 10 noggin-koşullandınlmış madde içinde, orta R-spondin1 Koşulları 10,% 50,% Wnt-koşullandınlmış madde içinde, 100 ng / FGF10 mi, 10 nM gastrin, 0.5 mM TGFbeta önleyicisi ve 10 uM RHOKi.
   7. Inkübatör plaka almak. Dikkatle iyi bodrum matris bozmadan her bütün büyüme faktörleri (1.3.6) ile 500 ul orta ekleyin. Geri inkübatör yerleştirin.
   8. Haftada 3 kez orta (2-3 gün) yenileyin. Orta ferahlatıcı için, sağlam bodrum matris damla bırakarak eski orta kaldırmak. Dikkatle tüm büyüme faktörleri ile taze, sıcak orta ekleyin. RHOKi katmayın. Sadece, doğrudan bezlerinin tohumlama sonra veya organoids (aşama 2) arasında bölmeden sonra RHOKi ekleyin.

Mikroenjeksiyon öncesi Mide organoid Kültür 2. Passage.

1. Malzemenin Hazırlanması
   1. Otoklav Pastör pipetleri.
   2. Günlük geçirilmesinden önce, 37 ° C 'de inkübatör 4 hücre kültür plakası yerleştirin. 4 kuyu plakalar düşük kenarları ve mikromanipülasyon sağlar.
   3. Üretici firmaların tavsiyelerine uygun olarak bodrum matrisi hazırlayın. Passagi günündeng, buz üzerinde bodrum matrisi Çözülme.
   4. Hazırlayın ve üreticinin önerileri doğrultusunda tüm büyüme faktörlerini sulandırmak.
   5. Serin bazal buz üzerinde, orta ve 4 ° C'ye kadar santrifüj soğutun.
2. Organoid Kültürlerin Passage
   1. Inkübatör organoids ile plaka almak. Tek kuyudan orta çıkarın.
   2. De bazal matris soğuk bazal maddesi 1 ml ilave edilir. 1 ml mikropipet kullanarak, şiddetle yukarı pipet ve bodrum matris bozuldu kadar aşağı. 15 ml'lik bir tüpe transfer. Buz üzerine yerleştirin.
   3. Bir cam Pasteur pipeti ve Bunsen beki gibi yangın kaynağını atın.
      1. Ucunun açılması yaklaşık 0.5 mm (Şekil 1) 1,5 mm ila daralmış kadar ateşin içine pipet ucu tutun. RT serin pipet edelim.
      2. Bazal ortamda pipet ıslatın. Optimal daralmış pipet un-daralmış pipet daha gözle görülür yavaş orta alacak, ama yine de olacak tümow iyi pipetlenerek.
   4. Pipet organoids alın ve şiddetle yukarı ve aşağı 10x pipetle. Organoids kırılma gözle gözlemlenebilir.
   5. 200 x g'de 5 dakika 4 ° C'de soğuk bazal ortam ve santrifüj 9 ml ekleyin.
   6. Dikkatle tüm süpernatant atın. 250 ul bodrum matris içinde pelet Askıya. Buz üzerinde tutun.
   7. 37 ° C sıcak 4 kuyu kültür plaka almak ve iyi, her 50 ul organoids / bodrum matris bir damla yerleştirin.
   8. Dikkatle tekrar inkübatör plaka aktarın. Temel matrisi 10 dakika boyunca 37 ° C'de katılaşmaya edelim.
   9. Adım 1.3.6 listelenen fare ya da insan ya organoids için uygun ortamı hazırlayın.
   10. Kuvöz plaka almak ve 500 ul ortam ile her bodrum matris damla kaplaması.
   11. Inkübatör plaka aktarın.
   12. Her 2-3 günde orta haftada 3 kez Yenile (1.3.8 bkz.).
   13. Organoids dondurulması için mechanBu protokol bölme için anlatıldığı gibi ically organoids bozabilir (Merdivenleri 2.2.1-2.2.5.). Orta donma 500 ml organoid parçaları Askıya ve C kullanarak cryotubes ve dondurma kabının ° -80 dondurma. Uzun süreli saklama için sıvı nitrojen tüpleri aktarın.
   14. Adımlarla 1.1.2, 1.1.3., 1.1.5., 1.1.6., 1.1.7 de belirtildiği gibi organoids çözülme için, kültür plakası, bodrum matrisi, büyüme faktörleri, soğuk ve sıcak ortam hazırlar. Hemen 10 ml soğuk bazal ortam ile 15 ml tüp çözündükten sonra dondurulmuş bir su banyosu kullanılarak şişe ve aktarım hücreleri ısıtın. 2.2.12 ile 2.2.5 özetlendiği gibi Santrifüj hücreleri plaka ve.
       Not: organoids Mikroenjeksiyon zahmetli, ama benzersiz olasılık 3D etkileşim çalışma sağlar.
   15. 3D çalışmalara ihtiyaç değilse, iki boyutta organoids tohum. Adımlarla 2.2.6 2.2.1 ortaya koydu olarak Bunun için, organoids bozabilir. Bodrum ma 250 ul tüm büyüme faktörleri ile 2250 ul soğuk orta ekleorganoid fragmanları ile matrisidir.
       1. Oyuk başına 500 ul, 24 gözlü bir levhanın 5 kuyularda tohum. Bozulmamış plakanın altındaki bodrum matris tutmak için, dikkatli bir şekilde sadece üst 400 ul değiştirilmesi ile, orta, haftada 3 kez değiştirin.
          Not: Organoids hücre kültürü plakasına takmak ve 2D artıracaktır. Elektron mikroskopisi hücrelerinin apikal yan kuyudaki ortam karşı karşıya olduğunu göstermiştir (veriler gösterilmemiştir).
       2. Enfeksiyon önce bakteri hücreleri takmak için izin, bodrum matrisinin dahil olmak üzere tüm orta alışverişinde. Benzer bir protokol, aynı zamanda H. ile enfeksiyon için tarif edilmiştir pylori ^14. 2B hücre tabakaları 3 boyutlu organoids içinde mevcut olan tüm hücre tipleri içerebilir.

Organoid Kültür 3. mikroenjeksiyonu.

Not: Bu protokol organoids bakterileri Microinject için kullanılabilir. Bu organoids ile enjeksiyon başlamak yararlı olabilirMikroenjeksiyon daha hoşgörülü olduklarını. Örneğin, fare gastrik organoids hedef kolay çok büyük kistik organoids dönüşebilir.

1. Malzemenin Hazırlanması
   1. Üretici firmaların tavsiyelerine uygun olarak, bir mikropipet çektirmenin kullanarak iki enjeksiyon iğne içine cam kılcal çekin. Mikropipet çektirmenin ortada cam kılcal ısı ve böylece iki cam iğneler üreten, iki bölüme kılcal çeker. Birkaç iğneler çekin ve temiz bir petri bunları saklamak için pratiktir.
   2. Bakteriyel enfeksiyon izin en az 3 orta değişiklikler (= bir hafta) tüm medya antibiyotik kaldırmak için. Bu bodrum matris antibiyotik sulandırmak. Belirli bir antibiyotiğe dirençli bakteri suşu kullanılarak, kirlilik için şansı en aza indirmek için bu özel antibiyotik ekleyin.
   3. Microinjections için çalışma tezgahı hazırlayın. Farklı biyogüvenlik seviyelerinde çalışma için bir stereo yerleştirmek gerekebilirsteril bir tezgah içinde mikroskop. Bu protokolde, H. enjekte 2 koşullar steril tezgah içinde bir stereomikroskop altında biyogüvenlik düzeyi altında pylori.
   4. Kültür standart protokollere göre ^13,23 bakteriler.
   5. Bakteri sayısını ve organoid başına hücre sayısını aşağıda özetlenen: enfeksiyon (İB) çokluğu tahmin etmek için, iki parametre tahmin ediyoruz. MOI ana, IL-8 mRNA ekspresyonu ^13, örneğin, sonuçlar ile ilişkili olabilir.
      1. Enfeksiyon çözeltisi bakteriyel yoğunluğunu hesaplamak için, ilk olarak, standart protokollere göre, ²⁴ optik yoğunluk ve koloni oluşturan birimlerin standart bir eğrisi (CFU) oluşturmaktadır. 550 nm'de 0.1'lik bir optik yoğunluğu yaklaşık 10 ⁷ cfu / ml elde edilmelidir.
      2. Organoid başına hücre sayısını tahmin etmek, iyi 1'de organoids sayısını. Adımlarda tarif edilen organoids bozabilir 2.2.1-2.2.4. Santrifüj 5 dakika 200 x g'de sonra ve 4 ° C'de,enzimatik ayrışma çözüm ve tekrar süspansiyon 1 ml ekleyin.
         1. Tekrar 5-10 dakika boyunca çalkalama ile 37 ° C'de inkübe edin. Hücreler (10 X büyütme gibi Leica DMIL olarak ters mikroskop) bir mikroskop altında, bir hücre içine ayrışmış olup olmadığını belirler. Gerekirse inkübasyon uzatır.
         2. Hemasitometre kullanarak organoid başına hücre sayımı ve organoid başına hücre sayısını hesaplamak. Yaklaşık 200 um bir çapa sahip insan gastrik organoids yaklaşık 4000 hücreleri vardır. 50 yaklaşık MOI'de ml sonuçları başına 1 x 10 ⁹ bakterilerle bakteriyel çözelti 0,2 ul enjeksiyonu.
2. Organoids enjeksiyonu.
   Not: Mikroenjeksiyon için, cam iğne bir micromanipulator tarafından 3 boyutlu manevra edilebilen bir tutucu, stabilize edilir. Organoids oyuk içindeki temel matris içinde kalır. Nedeniyle kuyudaki boyutu ve konumlandırma, tüm organoids eşit bir vardırenjeksiyon menable. Genellikle, tek bir kuyuda 30 büyük organoids 5 dakika içinde hedeflenebilir.
   1. Hasat bakteri ve standart protokoller ^{24'e göre} bazal ortamda yıkayın.
   2. Optik yoğunluğuna göre, ml başına bakteri sayısını hesaplayın (adım 3.1.5.1 bakınız). Bazal ortam içinde, ml başına 1 x 10 ^9, bakteride bakteriye seyreltilir.
   3. Bir cam iğne atın. Açılış yaklaşık 10 mikron genişliğinde olacak şekilde kullanılması forseps ucu bölünürler.
   4. Enjeksiyon tutucu içine iğne takın ve mikromanipülatör düzeltmek.
   5. Iğne içine yaklaşık 10 ul bakteri çözümü alın.
   6. Stereomicroscope altında organoid kültürleri içeren düşük kenarlı 4 plaka koyun.
   7. Mikromanipülatör ile gezinme, iğne ile tek organoids hedef. Organoid yakın iğne yerleştirin ve sonra bir hızlı hareketi ile organoid içine iğne takın. Approximatel enjekteher birine y 0,2 ul bakteri solüsyonu mikroenjektör kullanılarak organoid.
3. Herhangi Analiz Hasat Organoids.
   1. Örnek olarak, 4 saat sonra organoids düzeltin. Süpernatantı ve 1 ml% 2 formaldehid ilave edildi ve 4 ° C'de, oda sıcaklığında ya da O / N 20 dakika inkübe edilir. Organoids, standart prosedürlere uygun olarak ²⁵ immünohistokimya için işlenebilir.

Bu protokol, gastrik bezleri (Şekil 2) ayrılmasına izin verir. Bezler organoids içine bezleri büyümeye izin laminin ve kolajen bakımından zengin bir 3 boyutlu bir çerçeve (Şekil 3) sağlanması, bir kuyu içinde damla olarak katılaşan temel matris içine ekilir. Organoids tipik haliyle küçük kistler başlar ve 12-16 gün içinde, bunlar 50-300 um (Şekil 4) bir çapa sahip olan küreler genişletmek. Bazı organoids bazı küçük buddings geliştirecek, kistik kalacak. İkincisi, genellikle sağlıklı büyüyen bir kültür işaretidir. Bu protokol, bir 24 yuvalı plakanın bir de 100 bezleri, temel matrisin 50 ul ortam 500 ul için kullanılmaktadır. Bununla birlikte, bu yukarı ya da downscaled olabilir.

Bulutlu, bakteriyel solüsyon organoid (Şekil 5) doldurur gibi mikroenjeksiyon başarısını kolaylıkla stereomikroskop altında görülebilir. Yeterli inkübasyon süresinden sonra, organoids canİstediğiniz herhangi bir analiz yöntemi için işlenebilir. Örneğin, organoids parafine gömülü olabilir, bölümler kesilmiş ve standart immünohistokimyasal teknikleri kullanılarak boyandı. Immunohistokimyasal organoids mikroskobik analizi (Şekil 6) bakteri başarılı bir enjeksiyon göstermektedir.

Şekil organoids geçişi için kullanılan Pasteur pipeti 1. Görüntü. Her panelde, üst pipet, daha önce yangın daralma sonra alt pipet olduğunu. Üst ve sağ panellerde ölçek cm ve mm'dir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2. Temsilcisi görüntü İzole insan mide bezlerinin. Ölçek bar 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil kuyu ve insan gastrik organoids temsili görüntü 3. Şema. Izole edilmiş insan gastrik bezleri bazal matris içinde dağıtılmış ve 24 gözlü bir plaka gözlerine damla olarak yerleştirilmiştir. Sol alt: 11 gün tohumlama sonra temsili bir kuyunun bakış. Alt sağ: Belirtilen alanın Genişleme. Ölçek çubuğu 100 mikron. Mide fare organoids ¹⁸ daha hızlı genişletin. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

4 "src =" / files / ftp_upload / 53359 / 53359fig4.jpg "/>
İnsan gastrik organoids Şekil 4. tipik büyümesi. Bezleri temel matris ve aynı organoid görüntüleri serpildi 12 günlük bir süre boyunca alındı. Ölçek çubuğu 100 mikron bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Mide organoids Şekil 5. Mikroenjeksiyon. Önce (solda) ve lümen içine bakteri (sağda) mikroenjeksiyon sırasında mide organoid bir Stereoskop görüntüler. Bakteriler organoid içinde bulut gibi görebilir. Ölçek çubuğu 200 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6. İmmüno organoids. İnsan gastrik organoids H. mikroenjeksiyon yapıldı pylori. 4 saat sonra, organoids paraformaldehid içinde sabitlendi ve parafin içine gömülmüştür. Bölümler standart histoloji yöntemlerine ^{25'e göre} bakteriyel protein Sitotoksisite ilişkili gen A (CagA) hedefleyen antikorlar kullanılarak boyandı. Üst sol: temsili organoid İmajının. Alt panel: kutulu alanın yüksek büyütme. Sağ üst:. Epitel hücrelerine yakın tek bir bakteri ile kutulu alan yüksek büyütme bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

This protocol describes the use of ever-expanding, untransformed primary organoids from adult stem cells for infection biology. Critical steps are i) the isolation of viable glands, ii) expansion of organoids and iii) the microinjection. Below are some suggestions for modifications, troubleshooting and technical considerations.

Compared to other isolation methods, which use vigorous shaking or pipetting to release glands and can be equally successful, the technique presented here has the advantage, that the release of the glands from the tissue can directly be observed under the microscope (step 1.2.14.). If glands are not released, incubation in EDTA can be varied (see step 1.2.9.). If preferred, try to isolate glands using vigorous shaking and control the presence of glands in the supernatant under the microscope as described for mouse intestinal crypts²⁶. It is not critical, if isolated glands disintegrate during the washing steps. Organoids will still initiate from fragments or even single stem cells, as demonstrated previously^{13,18, 27}.

When glands have been isolated and seeded, but organoids are not expanding as expected, troubleshooting should start with testing activity of Wnt and R-spondin. These factors are crucial for expansion of the organoids and it is advised to test the functionality of these two factors by an in vitro assay, for example the TOP flash reporter construct using Luciferase²⁸. It is important that all growth factors are diluted and handled following manufacturers’ recommendation and kept in small aliquots to avoid freeze-thaw cycles.

The microinjection into organoids is comparable to injection of fish eggs or murine oocytes. Needles are pulled from glass capillaries and can be broken using tweezers directly before use to result in a tip end of about 10 µm. Smaller tips penetrate the organoids more easily but they also bear the risk that bacterial accumulations may clog the needle. For micromanipulation, different systems have specific advantages and limitations. It is practical to use a 3- dimensional manipulator instead of a 2 dimensional manipulator to allow maximal flexibility to reach into the wells. Oil-based microinjectors (such as Celltram, or IM-5B) provide a finer and slower manual control compared to air-based microinjectors (such as FemtoJet¹¹, or Nanojet microinjector¹⁰). In turn, the latter have the important advantage that a precise injection volume can be programmed. If microinjection is initially difficult, it may be helpful practice with large mouse gastric organoids and a dye. With practice, also smaller organoids such as mouse intestinal organoids are amenable to microinjection.

Microinjection of organoids is technically limited to a small experimental size because every organoid has to be targeted manually. Positioning or size may not render all organoids equally amenable to injection, thus the technique is limited to applications that can tolerate some heterogeneity in a well. Reflux from the injection hole is minimal^10,11, but should also be considered.

Comparing the different sources for new gastric stem cell derived cell cultures, it is evident that each of the systems has its own advantages. iPSC have been used to generate antral gastric organoids and allow following of the developmental steps towards the antral gastric lineages¹². The cultures described here can be derived from antrum or corpus. While long-term corpus cultures as described here do not contain parietal cells¹³, very early passages as well as co-cultures with mesenchymal cells have been reported to contain parietal cells^15,29.

The protocol described here has been developed for optimal long-term culture and allows unlimited maintenance of organoids (1 year tested). The organoids have typical advantages of cell lines: They can be expanded to allow larger experiments (split 1:5 every 2 weeks for human, every week for mouse organoids). They can be frozen and thawed. Human gastric organoids contain stem cells next to differentiated cells that express markers of mucous pit cells, mucous neck cells, chief cells and enteroendocrine cells. Differentiation to the lineages can be directed using Wnt and Nicotinamide. It is also possible to generate organoids from biopsies of cancers and thus organoids from healthy and cancerous tissue can be compared^13,21,33. Generally, organoids are also amenable to genetic modification and intestinal or gastric organoids have been genetically modified using bacterial artificial chromosomes (BAC) transgenes³⁰, retrovirus^26,31, lentivirus¹⁴ and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9³². Organoids have been used for various imaging techniques^13,14,29, RNA analysis¹³, Western Blot³³, Immunoprecipitation³⁴ and drug screening³³.

In summary, organoids grown from adult stem cells provide a valuable new tool for infection biology. The here provided protocol for gastric organoids may serve as basis to establish other new infection models.

Hans Clevers is an inventor on several patents for organoid culture. Otherwise the authors have nothing to disclose.

This work was supported by EU Marie Curie Fellowship (EU/300686-InfO) to S.B. and a Research Prize from the United European Gastroenterology Foundation to H.C. We would like to thank Harry Begthel, Jeroen Korving and the Hubrecht Imaging Center for technical assistance, Meritxell Huch for help with initial organoid culture and Yana Zavros for discussion.