감염증에 대한 모델로 Organoids : 헬리코박터 파이로리의 인간의 문화와 쥐 위장 Organoids 및 미세 주입

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

병원균의 연구는 생체 내 감염을 모방하기 위해 적절한 모델 시스템에 의존합니다. 사용 된 시스템의 일부는 최적의에서 멀리있는 동안 일부 감염 에이전트의 경우, 적절한 모델 시스템은 부족하다. 일례 인과 위암 개발에 관한 것이다 위암 헬리코박터 파이로리 (H. 파이로리)이다. 또 다른 더욱 적합한 세포 배양 시스템의 부재하에, 목표 많은 연구 암 캐스케이드의 끝점을 나타내는 암 개발 사용 암 세포주를 기본 분자 메커니즘을 분석한다. 차, 비 형질 전환 세포는 이러한 연구를위한 더 나은 모델이 될 것입니다. 그러나, 일차 전지는 기증자의 작은 숫자 만 사용할 수 있으며, 오랜 기간 동안 배양 할 수 없습니다. 최근 몇 년 동안, 줄기 세포 연구는 감염 생물학의 연구를위한 기본 세포 배양을위한 새로운 소스를 제공하기 위해 상당한 진전을 이루었습니다.

에서 문화세 줄기 세포 공급원이 사용되었다 : 배아 줄기 세포 (ESC), 유도 된 다 능성 줄기 세포 (IPSC) 또는 성체 줄기 세포. 그들은 이러한 거대 세포 바이러스 ^{1, 2} 또는 C 형 간염 바이러스와 같은 바이러스에 감염을 모델로 사용되어왔다 ^3-7, 예컨대 Bacterioides thetaiotaomicron ¹⁰ 살모넬라 엔테 ⁽¹¹⁾ 말라리아 원충 ⁸ 톡소 포자충 ^(9), 박테리아 등의 기생충. 최근, 여러 가지 접근 방법은 H. 감염을 모델로 발표되었다 ^{15 -} ESC 또는 유도 만능 줄기 세포 ^(12), 마우스 성체 줄기 세포 ^{(21, 22)} 인간 성체 줄기 세포 ^(13)에서 파생 된 organoids와 파이로리.

성체 줄기 세포로부터 organoid 문화의 발달은 뮤린 장내 상피 세포로부터 분리 된 단일 줄기 세포는 3 차원 행렬로 시딩하는 연구로부터 유래뼈 형태 형성 단백질 (BMP) ^{16 시그널링을} 억제 Wnt 신호 및 머리를 향상 미토 겐, R-spondin로 EGF를 포함하는 장 줄기 세포의 환경을 모방 매체에 매립. 특히 이러한 문화는 중간 엽 세포와 공동 배양이 필요하지 않습니다. 이러한 조건에서, 줄기 세포는 증식 도메인 장내 소낭 세포를 형질으로 작은 구조를 형성하고, 장내 융모의 세포를 포함하는 도메인. organoids 따라서 생체 내 상황을 모방하기 위해 자체 구성 할 수 있습니다. 오늘날, 많은 쥐와 인간 조직에서 성체 줄기 세포는 시험관 및 성장 될 수있는 소장과 대장 ¹⁷ 위 ^13,18, 간, ^{19, 20로} 자신의 생체 대응을 닮은 organoids에 자기 조직, 췌장 ⁽²¹⁾ 전립선 ^(22).

여기에서 우리는 성체 줄기 CEL에서 문화 마우스 또는 인간의 위 organoids에 비디오 프로토콜을 제공LS는 H. 그들을 microinject과 파이로리. 이 프로토콜은 이전 보고서 ^13,18 기반으로합니다. 이 방법은 배양과 같은 장내 organoids 다른 organoid 배양 감염에 대해 적응 될 수있다.

위 Organoid 문화 (1) 설립

주 :이 프로토콜은 마우스 또는 인간 조직으로부터 위산 분비의 분리를 위해 사용될 수있다. 그것은 약 1 cm² 이상의 조직을 사용하는 것이 좋습니다. 인체 조직은 위 절제 또는 생검으로부터 얻을 수있다.

1. 물질의 제조
   주 : 사용 지하 매트 리겔 매트릭스이다. 항상 얼음에 지하 행렬을 유지합니다. -20 ° C에서 지하 행렬을 저장하고 사용하기 전에 얼음에 해동. 기본 배지는 HEPES가 보충 된 고급 DMEM / F12를 말한다; 이러한 루타 및 1X Primocin 적절한 항생제로 적절한 글루타민 소스. 사용되는 배양기는 표준 세포 배양 인큐베이터 (37 ℃, 가습 공기, 5 % CO ₂₎
   1. 날카로운 집게, 가위, 메스와 유리 현미경 슬라이드 : 고온 가압 멸균 또는 100 %를 이소 프로필 알코올을 사용하여 준비기구를 소독.
   2. 격리 전날, 24 아를 배치인큐베이터에서 L 세포 배양 접시입니다.
   3. 제조업체의 권장 사항에 따라 지하 행렬을 준비합니다. 반복되는 동결 해동 사이클을 방지하기 위해 1 ml를 분취 량을 준비합니다.
   4. 얼음에 버퍼와 멋진 킬레이트 500 mL로 준비합니다. HPO _4, 8.0 mM의 KH ₂ PO _4, 96.2 mM의 NaCl을, 1.6 밀리미터의 KCl 5.6 밀리미터 나 _2와 멸균 증류수에서 1X 버퍼를 준비, 43.4 MM의 자당, 54.9 mM의 D- 소르비톨, 0.5 mM의 DL-디티 오 트레이 톨 (주의), pH를 7. 여러 아이솔레이션을 계획하는 경우, DL-디티 오 트레이 톨없이 5 배 농축 용액을 제조. 살균 필터 버퍼. 분리하기 전에 배에서 바로 분리하기 전에 DL-디티 오 트레이 톨을 추가 멸균 물을 5 배 버퍼를 희석.
   5. 준비 및 제조사의 권장 사항에 따라 모든 성장 인자를 희석. 작은 크기의 분취 량을 사용하여 동결 - 해동 사이클을 피한다. 기능적 성장 인자는 결과 중요하다.
   6. 쿨 기초 얼음 매체와 4 원심 분리기를 냉각6; C.
   7. 37 ° C에 기초 배지의 또 다른 나누어지는을 따뜻하게.
2. 땀샘의 분리
   1. 차가운 얼음 기초 배지에 조직의 약 1 cm² 이상을 수집합니다. 준비까지 얼음에 보관하십시오. 그것은 가능한 한 빨리 조직을 처리하는 것이 바람직하지만, 얼음 매체에 저장 조직 필요한 경우.
   2. 10cm 페트리 접시에 조직을두고 차가운 1X의 킬 버퍼로 커버. 부드럽게 앞뒤로 이동하여 씻으십시오.
   3. 마른 10cm 페트리 접시에 조직을 배치합니다. 집게를 사용하여 조심스럽게 실체 현미경 점액뿐만 아니라 근육 층을 제거한다. 부드럽게 앞뒤로 이동하여 차가운 1X 킬레이트 버퍼에 조직을 씻으십시오.
   4. 새로운 건조한 10cm 페트리 접시에 1cm ² 조직을 놓습니다. 사용 가위는 약 2-5 mm² 인 크기의 20 ~ 50 작은 조각으로 잘라.
   5. 집게를 사용하여, 50 ㎖ 튜브에 모든 조각을 놓습니다.
   6. 멸균 10 ML의 플라스틱 피펫을 가져 가라. 1X 킬레이트 버퍼의 피펫을 젖은. 유지절차 전반에 걸쳐이 같은 피펫을 사용하여.
   7. 50 ML 튜브에 10 ml의에게 차가운 1X 킬레이트 버퍼를 추가합니다. 격렬하게 위아래로 10 회 피펫 팅하여 조각을 씻으십시오. 조각이 정착하자. 상층 액을 제거합니다.
   8. 뜨는 때까지 반복 세척 (단계 1.2.7)은 분명하다. 이것은 인체 조직의 1 cm² 이상 대략 50 ~ 100 ml의 1 배 킬레이트 버퍼의 걸립니다.
   9. 부드러운 매 2 분을 반전하여 실온에서 10 분 동안 10mM의 EDTA가 보충 된 20 ㎖ 1X 킬레이트 버퍼 조직편을 배양한다.
      주 :이 인큐베이션 시간 및 온도는 속도 및 / 또는 선의 구조의 보존 중 위해 최적화 될 수있다. 그들은 200 RPM과 통에서 37 ℃에서 5 분에 롤링 플랫폼에서 4 ° C에서 몇 시간 배양에 이르기까지 다양 할 수 있습니다. 마우스 위를위한 좋은 출발점은 구름 플랫폼에서 4 ° C에서 인간의 위장 30 분, 실온에서 10 분입니다.
   10. 피펫 한 번 부드럽게하고 10 ml의 피펫을 사용하여 아래로. 파이 허용eces 정착한다. 상층 액을 버린다.
   11. 피펫을 사용하여, 깨끗한 10cm 페트리 접시에 조각을 전송합니다. 액체를 제거합니다.
   12. 조직 조각의 상단에 유리 현미경 슬라이드를 놓습니다. 10 배의 배율 세포 배양을위한 반전 현미경 손상 조직을 관찰한다.
   13. 유리 슬라이드와 페트리 접시에 압력을 적용합니다. 모두 (멸균 장갑) 손과 엄지 손가락으로 유리를 눌러를 잡습니다. 조직의 가장자리는 땀샘이 조직에서 출시되는 것을 나타내는 흐린 나타납니다.
   14. 10 배의 배율 세포 배양을위한 반전 현미경 발표 분비를 관찰한다.
   15. 30 ml의 차가운 기초 매체에 땀샘과 조직을 수집합니다. 큰 조직 파편이 정착하자.
   16. 이 15 ml의 튜브에 땀샘이 포함 된 상층 액을 수집합니다.
   17. 200 XG, 4 ° C에서 원심 분리기 5 분. 폐기 뜨는. 펠렛은 고립 된 땀샘이 포함되어 있습니다. 얼음에 보관하십시오.
3. 땀샘의 시드
   1. 시드를 들어, 지하 행렬은 얼음처럼 차가운 항상 유지, 그래서 액체를 유지됩니다.
   2. (1) 대안 : 씨 희석 행의 6 우물.
      1. 지하 행렬의 60 μL에 펠렛을 일시 중단합니다.
      2. 지하 행렬의 각 포함 50 μL와 얼음에 5 멸균 1.5 ml의 튜브를 준비합니다. 전송 최초의 1.5 ML 튜브에 땀샘 / 지하 매트릭스 현탁액의 10 μL. 땀샘을 일시 중단하고, 다음 1.5 ML 튜브에이 용액 10 μl를 전송합니다. 다음 튜브에 대해 반복합니다.
   3. 방법 2 : 잘 당 땀샘의 계산 된 금액을 시드. 24 웰 플레이트 잘 하나에 50 μL 지하 매트릭스 100 땀샘 시작합니다.
      1. 조심스럽게 10 ml의 기초 배지에서 펠렛 분비를 일시 중지합니다. 깨끗한 10 ml의 배양 접시에 50 μl를 놓습니다. 10 배의 배율 세포 배양을위한 반전 현미경으로 땀샘의 수를 계산합니다.
      2. 용액의 분비 농도를 계산한다. 볼륨을 그 접점 이동인 새로운 15 ML 튜브에 400 땀샘.
      3. 200 XG, 4 ° C에서 원심 분리기 5 분. 뜨는을 취소하고 얼음에 튜브를 유지. 200 μL 지하 행렬을 추가하고 조심스럽게 재현 탁. 얼음에 보관하십시오.
   4. 37 ° C 따뜻한 24 웰 플레이트를 타고 인큐베이터에서 (단계 1.1.2 참조). 잘의 중심에 지하 매트릭스 50 μL 땀샘의 한 방울을 놓습니다. 드롭 돔을 형성 할 것이다.
   5. 주의 깊게 다시 세포 배양 용 인큐베이터에 플레이트를 옮긴다. 지하 행렬은 10 분을 공고히하자.
   6. 모든 성장 인자와 따뜻한 매체를 준비합니다.
      1. 인간의 분비를 들어 인간 위 organoids에 대한 다음과 같은 성장 인자에 기초 배지를 보충 : 50 NG / ㎖ EGF, 10 %의 머리 에어컨 매체, 10 % R-spondin1 에어컨 매체, 50 %의 Wnt 에어컨 매체, 200 NG / ml의 섬유 아세포 성장 인자 (FGF) 10, 1 나노 가스트린 및 2 μM TGFbeta 억제제 및 10 μM RHO 회합을 형성 꼬인 코일 단백질 세린 / 트레오닌 키나제 억제제 (RHOKi).
      2. 뮤린 땀샘 : 마우스 위 organoids 대해 다음 성장 인자와 함께 기초 배지 보충 : 50 NG / ㎖ EGF, 10 % 머리 - 조정 배지 매체 R-spondin1가 에어컨 10 %, 50 %의 Wnt-조정 배지 100 NG / ml의 FGF10, 10 나노 가스트린, 0.5 mM의 TGFbeta 억제제 및 10 μm의 RHOKi.
   7. 인큐베이터에서 접시를 가져 가라. 조심스럽게 잘 지하 행렬을 방해하지 않고 각각의 모든 성장 인자 (1.3.6) 500 μL 매체를 추가 할 수 있습니다. 인큐베이터에 배치합니다.
   8. 주당 매체 3 회 (2-3 일마다)을 새로 고칩니다. 매체를 새로 고침은 그대로 지하 행렬의 드롭을 떠나와 기존의 매체를 제거합니다. 조심스럽게 모든 성장 인자 신선한, 따뜻한 매체를 추가합니다. RHOKi를 추가하지 마십시오. 만 직접 땀샘의 파종 후 또는 organoids (2 단계)의 분할 후 RHOKi를 추가합니다.

미세 주입하기 전에 위 Organoid 문화 2. 통과.

1. 물질의 제조
   1. 오토 클레이브 파스퇴르 피펫.
   2. 날이 통과하기 전에, 37 ° C에서 인큐베이터에서 4 웰 세포 배양 플레이트를 놓습니다. 4 잘 접시 낮은 가장자리가와 미세 조작을 할 수 있습니다.
   3. 제조업체의 권장 사항에 따라 지하 행렬을 준비합니다. passagi의 날NG, 얼음에 지하 행렬을 해동.
   4. 준비 및 제조사의 권장 사항에 따라 모든 성장 인자를 희석.
   5. 쿨 기초 얼음에 중간은 4 ° C에서 원심 분리기를 냉각.
2. Organoid 문화의 통로
   1. 인큐베이터에서 organoids으로 판을 가져 가라. 한 우물에서 매체를 제거합니다.
   2. 잘 지하 행렬에 차가운 기저 매체의 1 ML을 추가합니다. 1 ML의 마이크로 피펫을 사용하여, 적극적으로 피펫과 지하 행렬이 깨진 될 때까지 아래로. 15 ML 튜브로 전송합니다. 얼음에 놓습니다.
   3. 유리 파스퇴르 피펫과 분젠 버너 등 화재 소스를 가져 가라.
      1. 팁의 개구가 0.5 mm (그림 1) 1.5 mm에서 축소 될 때까지 불에 피펫의 끝을 잡고. 실온으로 냉각 피펫을 보자.
      2. 기초 배지에서 피펫을 젖은. 최적 축소 피펫 않은 좁혀 피펫에 비해 눈에 띄게 느린 매체를 취할 것입니다,하지만 여전히 모든아야 잘 피펫 팅.
   4. 피펫에 organoids을 가지고 적극적으로 위아래로 10 배를 피펫. organoids의 파괴는 눈으로 관찰 할 수있다.
   5. 200 XG에서 5 분, 4 ℃로 차가운 기초 배지 및 원심 분리기의 9 ML을 추가합니다.
   6. 조심스럽게 모든 상층 액을 버린다. 250 μL 지하 행렬의 펠렛을 일시 중단합니다. 얼음에 보관하십시오.
   7. 37 ° C 따뜻한 4 웰 배양 판을 가지고도 각 50 μL의 organoids / 지하 행렬의 드롭 놓습니다.
   8. 조심스럽게 다시 인큐베이터에 접시를 전송합니다. 지하 행렬은 10 분 동안 37 ℃에서 고화하자.
   9. 단계 1.3.6에 나와있는 마우스 또는 사람 중 하나 organoids에 적합한 매체를 준비합니다.
   10. 인큐베이터에서 접시를 타고 500 μL 매체와 각 지하 매트릭스 드롭 오버레이.
   11. 인큐베이터에 접시를 전송합니다.
   12. 2-3 일마다 매체를 주 3 회 새로 고침 (1.3.8를 참조하십시오.).
   13. organoids의 동결, mechan 들어이 프로토콜에서 분할에 기재 한 바와 같이 ically organoids을 방해 (단계 2.2.1-2.2.5.). 매체를 동결 500ml의에서 organoid 조각을 일시 중단 및 C 사용 cryotubes 및 냉동 컨테이너 -80 ° 얼어. 장기간 저장을 위해 액체 질소에 튜브를 전송.
   14. 단계 1.1.2, 1.1.3., 1.1.5., 1.1.6., 1.1.7에 설명 된대로 organoids의 해동을 위해, 문화 플레이트, 지하 매트릭스, 성장 인자, 추위와 따뜻한 매체를 준비합니다. 즉시 10 ㎖ 차가운 기본 배지와 15 ㎖의 튜브에 해동 후 냉동 수욕을 사용하여 바이알 및 전송 세포를 가온. 2.2.12에 2.2.5에 설명 된대로 원심 분리기 세포를 플레이트.
       참고 : organoids의 미세 주입이 힘든이지만, 독특한 가능성이 3D로 상호 작용을 연구 할 수 있습니다.
   15. 3D 과정이 필요하지 않은 경우, 이차원 organoids 시드. 단계 2.2.6에 2.2.1에 배치로이를 위해 organoids을 방해. 지하 엄마의 250 μL에 모든 성장 인자와 2,250 μL 차가운 매체 추가organoid 파편 TRIX.
       1. 물론 당 500 μL와 24 웰 플레이트의 5 우물에 씨. 방해받지 판의 맨 아래에있는 지하 행렬을 유지하기 위해주의 깊게 만 상위 400 μl를 교체하는 중간 3 회를 변경합니다.
          참고 : Organoids는 세포 배양 접시에 부착 및 2D로 확장됩니다. 전자 현미경은 세포의 선단 측이 잘 매체 대향 것을 보여 주었다 (데이터는 미도시).
       2. 감염 전에 박테리아가 세포에 부착 할 수 있도록, 지하 매트릭스를 포함한 모든 매체를 교환한다. 유사한 프로토콜은 또한 H. 감염에 대해 기재 한 내용 파이로리 ^(14). 2D 셀 층은하지 3D organoids에 존재하는 모든 종류의 세포를 함유 할 수있다.

Organoid 문화 3. 미세 주입.

주 :이 프로토콜은 organoids 내로 박테리아 microinject하는데 사용될 수있다. 그것은 organoids에 주입을 시작하는 것이 도움이 될 수 있습니다미세 주입에 더 허용됩니다. 예를 들어, 마우스 위 organoids는 대상이 용이 매우 큰 낭성 organoids로 성장할 수 있습니다.

1. 물질의 제조
   1. 제조업체의 권고에 따라, 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 두 개의 주사 바늘에 유리 모세관을 당겨. 마이크로 피펫 풀러는 중간에 유리 모세관을 가열하고 이에 두 유리 바늘을 생성, 두 부분으로 모세관을 끌어. 그것은 여러 바늘을 당겨 깨끗한 페트리 접시에 보관하는 실용적이다.
   2. , 세균 감염을 허용 최소 3 매체의 변화 (= 일주)에 대한 모든 매체에서 항생제를 제거하십시오. 이 지하 매트릭스에서 항생제를 희석합니다. 특정 항생제에 내성 균주를 사용하는 경우, 오염 가능성을 최소화하기 위해이 특정 항생제를 추가합니다.
   3. microinjections에 대한 작업 벤치를 준비합니다. 다른 바이오 안전성 수준의 작업을 위해 그것은 스테레오를 배치 할 필요가있다멸균 벤치 내부 현미경. 이 프로토콜에서는, H.를 주입 2 조건 멸균 벤치 내부 실체 현미경 하에서 바이오 안전성 수준에서 파이로리.
   4. 배양 ^{13, 23} 표준 프로토콜에 따른 박테리아.
   5. 박테리아의 수와 organoid 당 세포의 수 아래 설명과 같이 감염 (MOI)의 다양성을 평가하기 위해, 두 개의 매개 변수를 추정한다. MOI는 호스트 IL-8 mRNA 발현 ⁽¹³⁾ 예를 들어, 결과와 상관 관계가있다.
      1. 감염 용액에서 박테리아의 밀도를 계산하기 위해, 제 ²⁴ 표준 프로토콜에 따른 광학 밀도 및 콜로니 형성 단위의 표준 곡선 (CFU)을 확립한다. 550 nm에서의 0.1의 광학 밀도는 대략 ¹⁰⁷ CFU / ㎖를 수득한다.
      2. organoid 당 세포의 수를 추정하기 위해,도 1에 organoids의 개수를 카운트. 단계에 설명 된대로 organoids을 방해 2.2.1-2.2.4. 원심 5 분 200 XG에 후 4 ° C,효소 분해 용액을 Resuspend 1 ㎖를 추가합니다.
         1. 반복 5 ~ 10 분 동안 진탕 37 ° C에서 품어. 세포가 (10 배 배율에서 같은 라이카 DMIL으로 거꾸로 현미경) 현미경으로 단일 세포로 해리 여부를 결정합니다. 필요하면 배양을 연장.
         2. 혈구를 사용 organoid 당 세포를 세어 organoid 당 세포의 수를 계산한다. 약 200 μm의 직경 인간의 위 organoids은 약 4,000 세포를 가지고있다. (50)의 대략의 MOI로 ml의 결과 당 1 × ¹⁰⁹ 박테리아와 세균 용액 0.2 μL를 주입.
2. Organoids 사출.
   주 : 마이크로 인젝션 들어 유리 바늘 미세 조작기에 의해 3 차원 적으로 조작 될 수있는 홀더에 안정화된다. Organoids는 잘 내 지하 매트릭스 내에 남아 있습니다. 때문에 잘 크기 및 위치에, 모든 organoids 동등하다주입 menable. 일반적으로, 하나의 웰 (30)은 큰 organoids 5 분에 타겟팅 할 수있다.
   1. 수확 박테리아와 표준 프로토콜 ^(24)에 따른 기저 매체에 씻어.
   2. 광학 농도에 따른 당 ㎖의 박테리아의 수를 계산한다 (단계 3.1.5.1 참조). 기본 배지에서 ㎖의 당 1 × ¹⁰⁹ 박테리아 박테리아 희석.
   3. 유리 바늘을 가져 가라. 오프닝은 약 10 μm의 폭 될 수 있도록 사용 집게는 팁을 휴식.
   4. 주입 홀더에 바늘을 삽입하고는 미세 조작기에 고정합니다.
   5. 바늘로 약 10 μL 세균 솔루션을 차지합니다.
   6. 실체 현미경 하에서 organoid 문화를 포함하는 낮은 가장자리 4 웰 플레이트를 놓습니다.
   7. 미세 조작기로 탐색, 바늘 하나 organoids을 대상으로. organoid에 가까운 바늘을 배치하고 하나의 빠른 움직임에 organoid에 바늘을 삽입합니다. approximatel를 주입Y로 각각 0.2 μL 균액은 마이크로 인젝터를 사용 organoid.
3. 모든 분석을위한 수확 Organoids.
   1. 예를 들어, 4 시간 후 organoids를 해결. 상층 액을 제거하고 1 ml의 2 % 포름 알데히드를 추가하고 4 ℃에서 RT 또는 O / N에서 20 분을 품어. Organoids 표준 절차 ^(25)에 따른 면역 조직 화학을 위해 처리 될 수있다.

이 프로토콜은 위 글 랜드 (그림 2)의 분리를 할 수 있습니다. 땀샘은 organoids에 분비가 증가 수 있도록 라미닌과 콜라겐이 풍부한 3 차원 프레임 워크 (그림 3)를 제공, 잘 내에서 드롭으로 굳어 지하 행렬에 씨앗을 품고있다. Organoids는 일반적으로 작은 낭종을 시작 12-16 일 이내에, 그들은 50-300 μm의 (그림 4)의 직경 분야로 확장합니다. 일부 organoids는 일부 작은 buddings을 개발, 낭성 유지됩니다. 후자는 일반적으로 건강한 성장 문화의 상징이다. 이 프로토콜에서 24 웰 플레이트 잘 하나 100 땀샘, 지하 행렬의 50 μL와 매체의 500 μL에 사용됩니다. 그러나,이 업 또는 다운 스케일링 할 수 있습니다.

흐린, 박테리아 용액 organoid (도 5)로 채워 마이크로 인젝션의 성공 용이 실체 현미경 관찰 될 수있다. 적절한 배양 시간 후, organoids는 수원하는 임의의 분석 방법을 위해 처리 될 수있다. 예를 들어, organoids 파라핀에 매립 될 수 있고, 절단 단면은 표준 면역 조직 화학 기술을 이용하여 염색 할 수있다. 면역 염색 organoids의 현미경 분석 (그림 6) 박테리아의 성공적인 주입을 보여줍니다.

그림 organoids의 통과를 위해 사용 파스퇴르 피펫 1. 이미지. 각 패널에서, 상부 피펫은, 전에 화재로 축소 후 낮은 피펫입니다. 상단과 오른쪽 패널의 규모는 CM 및 mm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2. 대표 이미지 고립 된 인간의 위 땀샘의. 스케일 바 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 우물과 인간의 위 organoids의 대표 이미지 3. 계획. 고립 된 인간의 위 분비가 지하 매트릭스에 분배하고, 24 웰 플레이트의 우물에 방울로 배치했다. 왼쪽 하단 : 십일일 파종 후 대표도의 개요. 오른쪽 아래 : 표시된 영역의 확대. 스케일 바 100 μm의. 위 마우스 organoids ¹⁸ 빠른을 확장합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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인간의 위 organoids 그림 4. 일반적인 성장. 글 랜드는 지하 매트릭스와 같은 organoid의 이미지로 접종하고 12 일 동안 촬영했다. 스케일 바 100 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

위 organoids 그림 5. 미세 주입. 전 (왼쪽)과 루멘으로 세균 (오른쪽) 미세 주입 동안 위 organoid의 입체경 이미지. 박테리아는 organoid 내부 클라우드 볼 수 있습니다. 스케일 바 200 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6. 면역 염색 organoids. 인간의 위 organoids는 H.에 미세 주입했다 파이로리. 4 시간 후, organoids는 파라 포름 알데히드에서 수정 된 파라핀에 포함. 섹션 표준 조직학 방법 ^25에 따라 박테리아 세포 독성 단백질 관련 유전자 (cagA 유전자)을 타겟팅하는 항체를 이용하여 염색 하였다. 위 왼쪽 : 대표 organoid의 이미지. 낮은 패널 : 박스 영역의 높은 배율. 오른쪽 상단 :. 상피 세포에 가까운 하나의 박테리아와 박스 영역의 높은 배율 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

This protocol describes the use of ever-expanding, untransformed primary organoids from adult stem cells for infection biology. Critical steps are i) the isolation of viable glands, ii) expansion of organoids and iii) the microinjection. Below are some suggestions for modifications, troubleshooting and technical considerations.

Compared to other isolation methods, which use vigorous shaking or pipetting to release glands and can be equally successful, the technique presented here has the advantage, that the release of the glands from the tissue can directly be observed under the microscope (step 1.2.14.). If glands are not released, incubation in EDTA can be varied (see step 1.2.9.). If preferred, try to isolate glands using vigorous shaking and control the presence of glands in the supernatant under the microscope as described for mouse intestinal crypts²⁶. It is not critical, if isolated glands disintegrate during the washing steps. Organoids will still initiate from fragments or even single stem cells, as demonstrated previously^{13,18, 27}.

When glands have been isolated and seeded, but organoids are not expanding as expected, troubleshooting should start with testing activity of Wnt and R-spondin. These factors are crucial for expansion of the organoids and it is advised to test the functionality of these two factors by an in vitro assay, for example the TOP flash reporter construct using Luciferase²⁸. It is important that all growth factors are diluted and handled following manufacturers’ recommendation and kept in small aliquots to avoid freeze-thaw cycles.

The microinjection into organoids is comparable to injection of fish eggs or murine oocytes. Needles are pulled from glass capillaries and can be broken using tweezers directly before use to result in a tip end of about 10 µm. Smaller tips penetrate the organoids more easily but they also bear the risk that bacterial accumulations may clog the needle. For micromanipulation, different systems have specific advantages and limitations. It is practical to use a 3- dimensional manipulator instead of a 2 dimensional manipulator to allow maximal flexibility to reach into the wells. Oil-based microinjectors (such as Celltram, or IM-5B) provide a finer and slower manual control compared to air-based microinjectors (such as FemtoJet¹¹, or Nanojet microinjector¹⁰). In turn, the latter have the important advantage that a precise injection volume can be programmed. If microinjection is initially difficult, it may be helpful practice with large mouse gastric organoids and a dye. With practice, also smaller organoids such as mouse intestinal organoids are amenable to microinjection.

Microinjection of organoids is technically limited to a small experimental size because every organoid has to be targeted manually. Positioning or size may not render all organoids equally amenable to injection, thus the technique is limited to applications that can tolerate some heterogeneity in a well. Reflux from the injection hole is minimal^10,11, but should also be considered.

Comparing the different sources for new gastric stem cell derived cell cultures, it is evident that each of the systems has its own advantages. iPSC have been used to generate antral gastric organoids and allow following of the developmental steps towards the antral gastric lineages¹². The cultures described here can be derived from antrum or corpus. While long-term corpus cultures as described here do not contain parietal cells¹³, very early passages as well as co-cultures with mesenchymal cells have been reported to contain parietal cells^15,29.

The protocol described here has been developed for optimal long-term culture and allows unlimited maintenance of organoids (1 year tested). The organoids have typical advantages of cell lines: They can be expanded to allow larger experiments (split 1:5 every 2 weeks for human, every week for mouse organoids). They can be frozen and thawed. Human gastric organoids contain stem cells next to differentiated cells that express markers of mucous pit cells, mucous neck cells, chief cells and enteroendocrine cells. Differentiation to the lineages can be directed using Wnt and Nicotinamide. It is also possible to generate organoids from biopsies of cancers and thus organoids from healthy and cancerous tissue can be compared^13,21,33. Generally, organoids are also amenable to genetic modification and intestinal or gastric organoids have been genetically modified using bacterial artificial chromosomes (BAC) transgenes³⁰, retrovirus^26,31, lentivirus¹⁴ and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9³². Organoids have been used for various imaging techniques^13,14,29, RNA analysis¹³, Western Blot³³, Immunoprecipitation³⁴ and drug screening³³.

In summary, organoids grown from adult stem cells provide a valuable new tool for infection biology. The here provided protocol for gastric organoids may serve as basis to establish other new infection models.

Hans Clevers is an inventor on several patents for organoid culture. Otherwise the authors have nothing to disclose.

This work was supported by EU Marie Curie Fellowship (EU/300686-InfO) to S.B. and a Research Prize from the United European Gastroenterology Foundation to H.C. We would like to thank Harry Begthel, Jeroen Korving and the Hubrecht Imaging Center for technical assistance, Meritxell Huch for help with initial organoid culture and Yana Zavros for discussion.