Organoidi come modello per le malattie infettive: cultura dei diritti dell'uomo e organoidi stomaco murini e microiniezione dell'Helicobacter Pylori

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

Lo studio di patogeni si basa su adeguati sistemi modello per imitare l'infezione in vivo. Per alcuni agenti infettivi, adeguati sistemi modello sono carenti, mentre alcuni dei sistemi utilizzati sono ben lungi dall'essere ottimale. Un esempio è il batterio gastrico Helicobacter pylori (H. pylori), che è causalmente legata alla sviluppo del cancro gastrico. Tuttavia, in assenza di un sistema di coltura cellulare più adatto, molti studi che mirano ad analizzare i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo del cancro linee cellulari tumorali uso, che rappresentano il punto finale della cascata cancerose. , Cellule non trasformate primarie sarebbe un modello migliore per questi studi. Tuttavia, le cellule primarie sono disponibili solo da un piccolo numero di donatori e non possono essere coltivate su periodi di tempo più lunghi. Negli ultimi anni, la ricerca sulle cellule staminali ha compiuto progressi significativi per fornire nuove fonti per colture cellulari primarie per lo studio della biologia infezione.

Culture disono state utilizzate tre fonti di cellule staminali: le cellule staminali embrionali (ESC), le cellule indotte pluripotenti staminali (IPSC) o le cellule staminali adulte. Essi sono stati utilizzati per modellare infezioni da virus, come il citomegalovirus ^1,2 o virus dell'epatite C ^{3 - 7,} parassiti, come Plasmodium falciparum ^{8 o 9} Toxoplasma gondii, e batteri, quali Bacterioides thetaiotaomicron ¹⁰ o Salmonella enterica ^11. Più di recente, diversi approcci sono stati pubblicati per modellare l'infezione da H. pylori con organoidi derivati ​​da ESC o iPS cellule ^12, le cellule staminali adulte del mouse ^21,22 o umani cellule staminali adulte ^{di 13 - 15.}

Lo sviluppo delle colture organoide da cellule staminali adulte origine da uno studio, in cui le cellule staminali singole isolate da murino epitelio intestinale sono state seminate in una matrice 3-dimensionale eincorporato in mezzo che imitava l'ambiente delle cellule staminali intestinali che contengono FEG mitogeno, R-spondina per migliorare la segnalazione Wnt e Noggin di inibire la proteina morfogenetica dell'osso (BMP) di segnalazione ^16. In particolare queste colture non richiedono co-coltura con cellule mesenchimali. In queste condizioni, le cellule staminali proliferano e formano piccole strutture con domini ospitare cellule delle cripte intestinali, e domini che contengono le cellule del villi intestinali. I organoidi quindi auto-organizzano per simulare la situazione in vivo. Oggi, le cellule staminali adulte da molte murino e tessuti umani possono essere coltivate in vitro e auto-organizzarsi in organoidi che ricordano la loro controparte in vivo, come l'intestino tenue e colon ^17, stomaco ^13,18, fegato ^19,20, pancreas e ^{21 22} della prostata.

Qui forniamo un protocollo video al topo cultura o organoidi gastriche umane da cel staminali adultels e li microinject con H. pylori. Questo protocollo si basa sulle precedenti relazioni ^13,18. Questo metodo può essere adattato per la coltura e infettare altre culture organoide come organoidi intestinali.

1. Istituzione di gastrico organoide Cultura

Nota: Questo protocollo può essere utilizzato per l'isolamento delle ghiandole gastriche da mouse o tessuti umani. Si consiglia di usare il tessuto di circa 1 cm². Tessuto umano può essere ottenuto da resezioni gastriche o biopsie.

1. Preparazione del materiale
   Nota: La matrice seminterrato utilizzato è Matrigel. Mantenere la matrice seminterrato su ghiaccio in ogni momento. Conservare la matrice seminterrato a -20 ° C e scongelare su ghiaccio prima dell'uso. Terreno di base si riferisce ad Avanzato DMEM / F12 integrato con HEPES; una fonte di glutammina appropriato come Glutamax e antibiotici appropriati, come 1x Primocin. L'incubatore utilizzato è un incubatore di coltura cellulare standard (37 ° C, atmosfera umidificata, 5% CO ₂₎
   1. Sterilizzare gli utensili di preparazione in autoclave o con il 100% di alcol isopropilico: pinze taglienti, forbici, bisturi e uno scivolo microscopio vetro.
   2. Il giorno prima di isolamento, posizionare un 24 well cella piastra di coltura nell'incubatrice.
   3. Preparare la matrice seminterrato secondo le raccomandazioni dei costruttori. Preparare aliquote di 1 ml di evitare ripetuti cicli di congelamento e scongelamento.
   4. Preparare 500 ml chelanti tampone e raffreddare su ghiaccio. Preparare 1x tampone da acqua distillata sterile con 5,6 mm Na ₂ HPO _4, 8,0 mm KH _{2 PO} 4, 96,2 mM NaCl, 1.6 mM KCl, saccarosio 43,4 mM, 54.9 mm D-sorbitolo, 0,5 mM DL-ditiotreitolo (ATTENZIONE), pH 7. Se la pianificazione diversi isolamenti, preparare una soluzione concentrata 5x senza il DL-ditiotreitolo. Filtro sterile buffer. Prima di isolamento, diluire il tampone 5x con acqua sterile a 1x e aggiungere DL-ditiotreitolo poco prima di isolamento.
   5. Preparare e portare tutti i fattori di crescita secondo le raccomandazioni del fabbricante. Utilizzare piccole dimensioni aliquote ed evitare cicli di gelo-disgelo. Fattori di crescita funzionali sono di fondamentale importanza per i risultati.
   6. Raffreddare terreno di base su ghiaccio e raffreddare la centrifuga a 46; C.
   7. Riscaldare un'altra aliquota di terreno di base a 37 ° C.
2. Isolamento di ghiandole
   1. Raccogliere circa 1 cm² di tessuto in ghiaccio freddo terreno di base. Tenere in ghiaccio fino preparazione. Mentre è preferibile trattare il tessuto appena possibile, conservare tessuto in media su ghiaccio se necessario.
   2. Posizionare il tessuto in una capsula di Petri 10 cm e coprire con tampone chelazione 1x freddo. Lavare muovendo delicatamente avanti e indietro.
   3. Collocare il tessuto in una secca 10 centimetri piastra di Petri. Utilizzando pinze, rimuovere con attenzione il muco e lo strato muscolare allo stereomicroscopio. Lavare il tessuto in tampone chelante 1x freddo muovendo delicatamente avanti e indietro.
   4. Mettere 1 ^cm 2 di tessuto su una nuova asciutta 10 centimetri piatto, Petri. Utilizzando le forbici tagliano in 20-50 piccoli pezzi di circa 2-5 dimensioni mm².
   5. Utilizzando pinze, inserire tutti i pezzi in un tubo da 50 ml.
   6. Prendete una sterile 10 ml di plastica pipetta. Bagnare la pipetta in tampone chelante 1x. Tenereusando la stessa pipetta durante tutta la procedura.
   7. Aggiungere 10 ml freddo 1x tampone chelante al tubo da 50 ml. Lavate i pezzi vigorosamente pipettando su e giù per 10 volte. Lasciate che i pezzi stabilirsi. Rimuovere il surnatante.
   8. Ripetere il lavaggio (passo 1.2.7) fino a quando il surnatante è chiaro. Questa operazione richiede circa 50-100 ml di tampone chelante 1x per 1 cm² di tessuto umano.
   9. Incubare i pezzi di tessuto in 20 ml di 1x tampone chelante integrati con EDTA 10 mM a temperatura ambiente per 10 minuti con dolce invertendo ogni 2 min.
      Nota: Il tempo e temperatura di questa incubazione può essere ottimizzato sia per la velocità e / o la conservazione dell'architettura ghiandolare. Essi possono variare da diverse ore di incubazione a 4 ° C su una piattaforma di rotolamento per 5 min a 37 ° C in un agitatore di 200 rpm. Buoni punti di partenza per il mouse stomaco sono 30 minuti a 4 ° C su una piattaforma di rotolamento e per stomaco umano, 10 minuti a temperatura ambiente.
   10. Pipetta una volta delicatamente su e giù con la pipetta 10 ml. Lasciare che il pi grecoECE di stabilirsi. Scartare il surnatante.
   11. Utilizzando la pipetta, trasferire i pezzi per un ambiente pulito 10 centimetri piastra Petri. Rimuovere il liquido.
   12. Collocare un vetrino microscopico vetro sulla parte superiore dei pezzi di tessuto. Osservare il tessuto intatto sotto un microscopio invertito per colture cellulari con ingrandimento 10X.
   13. Applicare una pressione al vetrino e piastra di Petri. Tenere sia in mano (con guanti sterili) e premendo il vetro con il pollice. Il bordo del tessuto avrà un aspetto torbido indicando che ghiandole vengono rilasciati dal tessuto.
   14. Osservare le ghiandole rilasciati sotto un microscopio invertito per colture cellulari con ingrandimento 10X.
   15. Raccogliere ghiandole e tessuti in 30 ml di freddo medio basale. Lasciate che frammenti di tessuto di grandi dimensioni si depositano.
   16. Raccogliere il surnatante contenente ghiandole in due provette da 15 ml.
   17. Centrifugare 5 min a 200 xg e 4 ° C. Surnatante scarto. Il pellet contiene ghiandole isolati. Tenerli in ghiaccio.
3. Semina di ghiandole
   1. Per la semina, tenere matrice cantina gelida in ogni momento, in modo che rimarrà liquido.
   2. Alternativa 1: Seme 6 pozzetti di una fila di diluizione.
      1. Sospendere il pellet in 60 ml di matrice seminterrato.
      2. Preparare 5 sterili provette da 1,5 ml su ghiaccio con ciascuna contenente 50 ml di matrice seminterrato. Trasferire 10 ml di sospensione matrice ghiandole / interrato nel primo tubo 1,5 ml. Sospendere le ghiandole e trasferire 10 ml di questa soluzione alla prossima provetta da 1,5 ml. Ripetere l'operazione per i prossimi tubi.
   3. Alternativa 2: il seeding di una quantità calcolata di ghiandole per pozzetto. Inizia con 100 ghiandole per matrice seminterrato di 50 ml in un pozzetto di una piastra ben 24.
      1. Sospendere accuratamente le ghiandole pellet in 10 ml di mezzo basale. Mettere 50 ml su una superficie pulita da 10 ml capsula di Petri. Contare il numero di ghiandole sotto un microscopio invertito per colture cellulari con ingrandimento 10X.
      2. Calcolare la concentrazione di ghiandole nella soluzione. Trasferire il volume che contains 400 ghiandole ad un nuovo tubo 15 ml.
      3. Centrifugare 5 min a 200 xg e 4 ° C. Gettare il surnatante e tenere la provetta in ghiaccio. Aggiungere 200 ml di matrice seminterrato e con attenzione risospendere. Continuate a ghiaccio.
   4. Prendere la C caldo 24 pozzetti 37 ° (vedi punto 1.1.2) dal termostato. Mettere una goccia di 50 microlitri in ghiandole matrice interrato nel centro del pozzo. La goccia formerà una cupola.
   5. Trasferire accuratamente la piastra posteriore per l'incubatore di coltura cellulare. Lasciate che la matrice seminterrato solidificare 10 min.
   6. Preparare medio caldo con tutti i fattori di crescita.
      1. Per ghiandole umane: Supplemento medio basale con i seguenti fattori di crescita per organoidi gastriche umane: 50 ng / ml FEG, il 10% a medio-zucca condizionata, il 10% medio di R-spondin1 condizionata, il 50% medio Wnt condizionata, 200 ng / ml fattore di crescita dei fibroblasti (FGF) 10, 1 nM gastrina, e 2 micron inibitore TGFbeta e 10 micron di Rho-associata coiled coil formando proteina serina / treonina chinasi inibitore (RHOKi).
      2. Per ghiandole murini: Supplemento medio basale con i seguenti fattori di crescita per il mouse organoidi gastrici: 50 ng / ml FEG, il 10% a medio-zucca condizionata, il 10% medio di R-spondin1 condizionata, il 50% medio Wnt condizionata, 100 ng / ml FGF10, 10 gastrina nM, 0.5 inibitore TGFbeta mm e 10 micron RHOKi.
   7. Prendere la piastra dall'incubatore. Aggiungere con cautela 500 ml di media con tutti i fattori di crescita (1.3.6) a ogni pozzetto senza disturbare la matrice seminterrato. Mettere di nuovo al incubatrice.
   8. Aggiornare i media 3 volte a settimana (ogni 2-3 giorni). Per rinfrescare media, rimuovere la vecchia media con lasciando la goccia di matrice seminterrato intatto. Aggiungere con cautela fresco, medio caldo con tutti i fattori di crescita. Non aggiungere RHOKi. Aggiungere RHOKi solo direttamente dopo la semina di ghiandole o dopo la divisione dei organoidi (step 2).

2. Il passaggio di gastrico organoide Cultura Prima microiniezione.

1. Preparazione del materiale
   1. Pipette Pasteur Autoclave.
   2. Il giorno prima del passaggio, posizionare una piastra di coltura cellulare 4 bene in incubatore a 37 ° C. I 4 piastre e hanno bordi bassi e consentono micromanipolazione.
   3. Preparare la matrice seminterrato secondo le raccomandazioni dei costruttori. Il giorno della passaging, scongelare matrice seminterrato sul ghiaccio.
   4. Preparare e portare tutti i fattori di crescita secondo le raccomandazioni del fabbricante.
   5. Raffreddare terreno di base su ghiaccio e raffreddare la centrifuga a 4 ° C.
2. Passaggio delle Culture organoide
   1. Prendere la piastra con le organoidi dal termostato. Rimuovere media da un pozzo.
   2. Aggiungere 1 ml di terreno basale fredda alla matrice interrato nel pozzo. Usando una micropipetta 1 ml, con vigore pipetta su e giù fino la matrice seminterrato è suddiviso. Trasferire in un tubo da 15 ml. Mettere in ghiaccio.
   3. Prendete un bicchiere pipetta Pasteur e una sorgente di fuoco, come un becco Bunsen.
      1. Tenere la punta della pipetta nel fuoco fino all'apertura della punta è ridotto da 1,5 mm a circa 0,5 mm (Figura 1). Lasciare la pipetta raffreddare a temperatura ambiente.
      2. Bagnare la pipetta in terreno di base. Una pipetta ottimale ristretto assumerà il medium visibilmente più lento di una pipetta un-ridotto, ma sarà ancora tuttoow pipettaggio bene.
   4. Raccogliere organoidi nella pipetta e vigorosamente pipetta 10x su e giù. La rottura dei organoidi può essere osservata ad occhio.
   5. Aggiungere 9 ml di freddo terreno di base e centrifugare per 5 min a 200 xg e 4 ° C.
   6. Eliminare attentamente tutto il surnatante. Sospendere il precipitato in 250 ml di matrice seminterrato. Continuate a ghiaccio.
   7. Prendere la calda piastra di coltura 4 ben 37 ° C e una goccia di matrice 50 organoidi microlitri / cantina in ogni pozzetto.
   8. Trasferire la piastra con attenzione di nuovo al incubatrice. Sia la matrice seminterrato solidificare a 37 ° C per 10 min.
   9. Preparare mezzo appropriato sia per il mouse o umani organoidi come indicato al punto 1.3.6.
   10. Prendere la piastra dall'incubatore e sovrapporre ogni goccia matrice seminterrato con 500 microlitri di media.
   11. Trasferire la lastra per l'incubatore.
   12. Aggiorna il mezzo di 3 volte alla settimana ogni 2-3 giorni (vedi 1.3.8.).
   13. Per il congelamento di organoidi, Mechancamente interrompere organoidi come descritto per la divisione in questo protocollo (Piazza di 2.2.1-2.2.5.). Sospendere i frammenti organoide in 500 ml di congelamento medio e congelare a -80 ° C con cryotubes e un contenitore di congelamento. Per la conservazione a lungo termine, trasferire i tubi di azoto liquido.
   14. Per lo scongelamento di organoidi, preparare piatto la cultura, matrice di cantina, fattori di crescita, mezzo freddo e caldo come indicato dal passo 1.1.2, 1.1.3., 1.1.5., 1.1.6., 1.1.7. Scaldare il flacone congelato con un bagno d'acqua, e le cellule di trasferimento subito dopo lo scongelamento di un tubo da 15 ml con 10 ml di freddo medio basale. Centrifuga e piastra le cellule come descritto nel 2.2.5 a 2.2.12.
       Nota: microiniezione di organoidi è faticoso, ma permette la possibilità unica di studiare l'interazione in 3D.
   15. Se non sono necessari studi 3D, sementi organoidi in due dimensioni. Per questo, interrompere le organoidi come stabilito nei passaggi da 2.2.1 a 2.2.6. Aggiungere mezzo 2.250 ml fredda con tutti i fattori di crescita a 250 ml di seminterrato matrix con frammenti organoide.
       1. Seed in 5 pozzetti di una piastra ben 24 con 500 microlitri per bene. Cambiare medio 3 volte alla settimana, con cura sostituire solo la parte superiore 400 microlitri, per mantenere la matrice interrato sul fondo della piastra indisturbata.
          Nota: organoidi attribuirà alla piastra di coltura cellulare ed espandersi in 2D. Il microscopio elettronico ha mostrato che il lato apicale delle cellule affronta il mezzo nel pozzo (dati non mostrati).
       2. Prima dell'infezione, scambiare tutte di medie comprese matrice cantina, per permettere ai batteri di attaccare alle cellule. Un protocollo simile è stato descritto anche per l'infezione da H. pylori ^14. Strati cellulari 2D possono non contenere tutti i tipi di cellule che sono presenti in organoidi 3D.

3. Microiniezione di organoide Cultura.

Nota: Questo protocollo può essere utilizzato per microinject batteri in organoidi. Può essere utile per iniziare l'iniezione con organoidiche sono più permissive a microiniezione. Ad esempio, il mouse organoidi gastrici possono crescere in grandi organoidi cistica che sono facili da colpire.

1. Preparazione del materiale
   1. Tirare un capillare di vetro in due aghi da iniezione utilizzando un estrattore micropipetta, secondo le raccomandazioni dei costruttori. L'estrattore micropipetta riscalderà il capillare di vetro nel mezzo e tirerà il capillare in due parti, generando due aghi di vetro. E 'pratico per tirare diversi aghi e memorizzarli in una capsula di Petri pulita.
   2. Per consentire infezione batterica, rimuovere gli antibiotici dal supporto e per almeno 3 cambiamenti medi (= una settimana). Questo diluire gli antibiotici da matrice seminterrato. Se si utilizza un ceppo batterico che è resistente a un antibiotico specifico, aggiungere questo antibiotico specifico per ridurre al minimo le possibilità di contaminazione.
   3. Preparare il banco di lavoro per microiniezioni. Per il lavoro a diversi livelli di sicurezza biologica può essere necessario posizionare uno stereomicroscopio all'interno di un banco sterile. In questo protocollo, iniettare H. pylori sotto livello di biosicurezza 2 condizioni allo stereomicroscopio all'interno di una panchina sterile.
   4. Cultura batteri secondo protocolli standard ^13,23.
   5. Per stimare la molteplicità di infezione (MOI), stimare due parametri: il numero di batteri e il numero di cellule per organoide come indicato di seguito. Il MOI può correlare con risultati, per esempio con gli host IL-8 espressione mRNA ^13.
      1. Per calcolare la densità batterica nella soluzione infezione, prima stabilire la curva standard di unità di densità ottica e formanti colonie (CFU) secondo protocolli standard ^24. Una densità ottica di 0,1 a 550 nm dovrebbe produrre circa 10 ⁷ UFC / ml.
      2. Per stimare il numero di celle per organoide, contare il numero di organoidi in 1 bene. Disrupt organoidi come indicato dal passo 2.2.1-2.2.4. Dopo centrifugazione 5 min a 200 xg e 4 ° C,aggiungere 1 ml di soluzione di dissociazione enzimatica e risospendere.
         1. Incubare a 37 ° C con agitando ripetutamente per 5-10 min. Determinare se le cellule sono dissociate in singole cellule sotto il microscopio (microscopio invertito, come Leica DMIL a 10X di ingrandimento). Se necessario prolungare l'incubazione.
         2. Contare cellule per organoide utilizzando un emocitometro e calcolare il numero di cellule per organoide. Organoidi gastriche umane con un diametro di circa 200 micron sono circa 4.000 cellule. L'iniezione di 0,2 ml di una soluzione batterica di 1 x 10 ⁹ batteri per ml consente un MOI approssimativa di 50.
2. Iniezione di organoidi.
   Nota: Per microiniezione, l'ago di vetro è stabilizzata in un supporto, che può essere manovrato in 3 dimensioni da un micromanipolatore. Organoidi rimangono all'interno della matrice interrato nel pozzo. A causa della dimensione e posizionamento nel pozzo, non tutti sono ugualmente un organoidimENABLE a iniezione. Di solito, i 30 principali organoidi in un pozzetto possono essere mirati in 5 min.
   1. Batteri raccolto e lavarli in terreno di base secondo protocolli standard ^24.
   2. Calcolare il numero di batteri per ml a seconda della densità ottica (vedi punto 3.1.5.1). Diluire i batteri di 1 x ¹⁰ 9 batteri per ml in media basale.
   3. Prendete un ago di vetro. Uso pinze rompere la punta in modo che l'apertura sarà di circa 10 micron di larghezza.
   4. Inserire l'ago nel porta di iniezione e fissarlo al micromanipolatore.
   5. Raccogliere circa 10 ml soluzione batterica nell'ago.
   6. Collocare un piatto ben 4 con i bordi bassi contenenti culture organoide con lo stereomicroscopio.
   7. Navigazione con il micromanipolatore, indirizzare un singolo organoidi con l'ago. Posizionare l'ago vicino al organoide e quindi inserire l'ago nel organoide con un movimento rapido. Iniettare approximately 0,2 ml soluzione batterica in ogni organoide utilizzando il microinjector.
3. Harvest organoidi per qualsiasi analisi.
   1. A titolo di esempio, fissare organoidi dopo 4 ore. Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml 2% di formaldeide e incubare 20 minuti a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. Organoidi possono essere trattati per immunoistochimica secondo le procedure standard ^25.

Questo protocollo permette isolamento delle ghiandole gastriche (Figura 2). Ghiandole vengono seminate in matrice seminterrato, che solidifica come goccia all'interno di un pozzo, fornendo una struttura tridimensionale 3 ricco di laminina e collagene per consentire le ghiandole crescono in organoidi (Figura 3). Organoidi tipicamente iniziano come piccole cisti e entro 12-16 giorni, si espandono in sfere con un diametro di 50-300 micron (Figura 4). Alcuni organoidi rimarranno cistica, alcuni sviluppare piccole buddings. Quest'ultimo è di solito un segno di una cultura sempre più sana. In questo protocollo un pozzetto di una piastra ben 24 è utilizzato per 100 ghiandole, 50 ml di matrice seminterrato e 500 microlitri di media. Tuttavia, questo può essere alto o ridimensionato.

Il successo della microiniezione può facilmente osservare con lo stereomicroscopio come la soluzione torbida batterica riempie la organoide (Figura 5). Dopo un adeguato periodo di incubazione, organoidi puòtrattati per qualsiasi metodo di analisi desiderata. Ad esempio, organoidi possono essere incorporati in paraffina, sezioni possono essere tagliate e colorate con tecniche di immunoistochimica standard. Analisi microscopica di organoidi immunostained dimostrare iniezione di successo dei batteri (Figura 6).

Figura 1. Immagine di pipetta Pasteur utilizzato per il passaggio di organoidi. In ogni pannello, la pipetta superiore è prima, la pipetta più bassa dopo restringimento da un incendio. Scala in pannelli superiori e destro è di cm e mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Immagine rappresentativa di isolati ghiandole gastriche umane. Barra di scala 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Schema di pozzi e l'immagine rappresentativa della organoidi gastriche umane. Isolati ghiandole gastriche umani sono stati dispensati in matrice seminterrato e disposti come gocce in pozzetti di una piastra ben 24. In basso a sinistra: Panoramica di un pozzo rappresentante 11 giorni dopo la semina. In basso a destra: Allargamento della zona indicata. Scala bar 100 micron. Organoidi gastrici del mouse si espandono velocemente ^18. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 4. tipica crescita di organoidi gastriche umane. Ghiandole sono state seminate in matrice seminterrato e immagini della stessa organoide sono state prese in un periodo di 12 giorni. Bar 100 micron scala Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. microiniezione di organoidi gastrici. Immagini stereoscopiche di un organoide gastrica prima (a sinistra) e durante (a destra) microiniezione di batteri nel lume. I batteri sono visibili come nuvola all'interno del organoide. Barra della scala 200 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6. immunostained organoidi. Organoidi gastrici umani sono stati microiniettati con H. pylori. Dopo 4 ore, organoidi sono state fissate in paraformaldeide e inclusi in paraffina. Le sezioni sono state colorate con anticorpi rivolti al batterica proteine ​​citotossicità gene associato A (CagA) secondo i metodi standard di istologia ^25. In alto a sinistra: Immagine di un organoide rappresentante. Pannello inferiore: Maggiore ingrandimento della zona in scatola. In alto a destra:. Ingrandimento Superiore della zona in scatola con un singolo batterio vicino alle cellule epiteliali Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

This protocol describes the use of ever-expanding, untransformed primary organoids from adult stem cells for infection biology. Critical steps are i) the isolation of viable glands, ii) expansion of organoids and iii) the microinjection. Below are some suggestions for modifications, troubleshooting and technical considerations.

Compared to other isolation methods, which use vigorous shaking or pipetting to release glands and can be equally successful, the technique presented here has the advantage, that the release of the glands from the tissue can directly be observed under the microscope (step 1.2.14.). If glands are not released, incubation in EDTA can be varied (see step 1.2.9.). If preferred, try to isolate glands using vigorous shaking and control the presence of glands in the supernatant under the microscope as described for mouse intestinal crypts²⁶. It is not critical, if isolated glands disintegrate during the washing steps. Organoids will still initiate from fragments or even single stem cells, as demonstrated previously^{13,18, 27}.

When glands have been isolated and seeded, but organoids are not expanding as expected, troubleshooting should start with testing activity of Wnt and R-spondin. These factors are crucial for expansion of the organoids and it is advised to test the functionality of these two factors by an in vitro assay, for example the TOP flash reporter construct using Luciferase²⁸. It is important that all growth factors are diluted and handled following manufacturers’ recommendation and kept in small aliquots to avoid freeze-thaw cycles.

The microinjection into organoids is comparable to injection of fish eggs or murine oocytes. Needles are pulled from glass capillaries and can be broken using tweezers directly before use to result in a tip end of about 10 µm. Smaller tips penetrate the organoids more easily but they also bear the risk that bacterial accumulations may clog the needle. For micromanipulation, different systems have specific advantages and limitations. It is practical to use a 3- dimensional manipulator instead of a 2 dimensional manipulator to allow maximal flexibility to reach into the wells. Oil-based microinjectors (such as Celltram, or IM-5B) provide a finer and slower manual control compared to air-based microinjectors (such as FemtoJet¹¹, or Nanojet microinjector¹⁰). In turn, the latter have the important advantage that a precise injection volume can be programmed. If microinjection is initially difficult, it may be helpful practice with large mouse gastric organoids and a dye. With practice, also smaller organoids such as mouse intestinal organoids are amenable to microinjection.

Microinjection of organoids is technically limited to a small experimental size because every organoid has to be targeted manually. Positioning or size may not render all organoids equally amenable to injection, thus the technique is limited to applications that can tolerate some heterogeneity in a well. Reflux from the injection hole is minimal^10,11, but should also be considered.

Comparing the different sources for new gastric stem cell derived cell cultures, it is evident that each of the systems has its own advantages. iPSC have been used to generate antral gastric organoids and allow following of the developmental steps towards the antral gastric lineages¹². The cultures described here can be derived from antrum or corpus. While long-term corpus cultures as described here do not contain parietal cells¹³, very early passages as well as co-cultures with mesenchymal cells have been reported to contain parietal cells^15,29.

The protocol described here has been developed for optimal long-term culture and allows unlimited maintenance of organoids (1 year tested). The organoids have typical advantages of cell lines: They can be expanded to allow larger experiments (split 1:5 every 2 weeks for human, every week for mouse organoids). They can be frozen and thawed. Human gastric organoids contain stem cells next to differentiated cells that express markers of mucous pit cells, mucous neck cells, chief cells and enteroendocrine cells. Differentiation to the lineages can be directed using Wnt and Nicotinamide. It is also possible to generate organoids from biopsies of cancers and thus organoids from healthy and cancerous tissue can be compared^13,21,33. Generally, organoids are also amenable to genetic modification and intestinal or gastric organoids have been genetically modified using bacterial artificial chromosomes (BAC) transgenes³⁰, retrovirus^26,31, lentivirus¹⁴ and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9³². Organoids have been used for various imaging techniques^13,14,29, RNA analysis¹³, Western Blot³³, Immunoprecipitation³⁴ and drug screening³³.

In summary, organoids grown from adult stem cells provide a valuable new tool for infection biology. The here provided protocol for gastric organoids may serve as basis to establish other new infection models.

Hans Clevers is an inventor on several patents for organoid culture. Otherwise the authors have nothing to disclose.

This work was supported by EU Marie Curie Fellowship (EU/300686-InfO) to S.B. and a Research Prize from the United European Gastroenterology Foundation to H.C. We would like to thank Harry Begthel, Jeroen Korving and the Hubrecht Imaging Center for technical assistance, Meritxell Huch for help with initial organoid culture and Yana Zavros for discussion.