Organoide als Modell für Infektionskrankheiten: Kultur von humanen und murinen Magen Organoide und Mikroinjektion von Helicobacter Pylori

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

Die Studie von Erregern beruht auf adäquate Modellsysteme, um die in vivo-Infektion nachahmen. Bei einigen Infektionserreger, sind adäquate Modellsystemen fehlt, während einige der verwendeten Systeme sind alles andere als optimal. Ein Beispiel ist der Magen-Bakterium Helicobacter pylori (H. pylori), die ursächlich für die Entwicklung von Magenkrebs in Beziehung steht. Doch in Ermangelung eines geeigneteren Zellkultursystem, viele Studien, die darauf abzielen, die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der Krebsentstehung Verwendung Krebszelllinien, die den Endpunkt der Krebskaskade darstellen zu analysieren. Primäre, nicht-transformierten Zellen wäre ein besseres Modell für diese Studien. Jedoch sind primäre Zellen, die nur von einer kleinen Anzahl von Gebern zur Verfügung und können nicht über längere Zeit kultiviert werden. In den letzten Jahren hat die Stammzellenforschung große Fortschritte gemacht, um neue Quellen für primäre Zellkulturen für die Untersuchung von Infektionsbiologie liefern.

Kulturen ausdrei Stammzellquellen verwendet: Embryonale Stammzellen (ESC), induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) oder adulten Stammzellen. Sie sind verwendet worden, um Infektionen mit Viren, wie Cytomegalovirus ^1,2 oder Hepatitis C Virus modellieren ^3-7, Parasiten wie Plasmodium falciparum ^{8 oder} Toxoplasma gondii ^{9 und} Bakterien, wie Bacterioides thetaiotaomicron ^{10 oder} Salmonella ente ^11. In jüngster Zeit wurden mehrere Ansätze veröffentlicht worden, um eine Infektion mit H. modellieren pylori mit Organoide von ESC oder iPS-Zellen ^12, Maus adulten Stammzellen ^21,22 oder menschlichen adulten Stammzellen abgeleiteten ^{13 - 15.}

Die Entwicklung von organoiden Kulturen aus adulten Stammzellen stammen aus einer Studie, in der einzelne Stammzellen aus murinen Darmepithel isoliert wurden in eine 3-dimensionale Matrix ausgesät undin Medium, das die Umgebung des Darmstammzellen enthalten EGF mitogen, R-spondin nachgeahmt Wnt-Signalisierung und Noggin zu verbessern, um Knochenmorphogeneseprotein (BMP) Signalisierungs ¹⁶ hemmen eingebettet. Insbesondere diese Kulturen erfordern keine Co-Kultur mit mesenchymalen Zellen. Unter diesen Bedingungen ist die Stammzellen proliferieren und bilden kleine Strukturen mit Domänen tragende Zellen der Darmkrypten und Domänen, die die Zellen der intestinalen Zotten enthalten. Die Organoide somit selbst zu organisieren, um die in vivo-Situation nachahmt. Heute adulten Stammzellen aus vielen murinen und humanen Geweben kann in vitro und angebaut werden Selbstorganisation Organoide, die ihre in-vivo-Gegenstück, ähnlich wie Dünn- und Dickdarms ^17, Magen ^{13,18, 19,20} Leber, Bauchspeicheldrüse ^{21 und} Prostata ^22.

Hier bieten wir ein Video-Protokoll zur Kultur Maus oder menschlichen Magen Organoide von adulten Stammzellen cells und microinject sie mit H. pylori. Dieses Protokoll basiert auf früheren Berichten ^13,18 berechnet. Diese Methode kann für die Kultivierung und infizieren andere organoide Kulturen wie Darm Organoide angepasst werden.

1. Gründung von Magen Organoide Kultur

Hinweis: Dieses Protokoll kann für die Isolierung von Magendrüsen von Maus oder menschlichem Gewebe verwendet werden. Es wird empfohlen, um Gewebe von ca. 1 cm² zu verwenden. Menschlichem Gewebe kann von Magen-Resektionen oder Biopsien erhalten werden.

1. Materialzubereitung
   Hinweis: Die verwendeten Keller Matrix Matrigel. Halten Sie das Untergeschoss Matrix auf Eis zu allen Zeiten. Bewahren Sie die Keller-Matrix bei -20 ° C und Auftauen auf Eis vor der Verwendung. Grundmedium bezieht sich auf erweiterte DMEM / F12 mit HEPES; eine geeignete Glutaminquelle wie Glutamax und geeignete Antibiotika wie 1x Primocin. Das verwendete Inkubator ist ein Standard-Zellkulturbrutschrank (37 ° C, befeuchteten Atmosphäre, 5% _CO 2)
   1. Sterilisieren Vorbereitung Utensilien durch Autoklavieren oder mit 100% Isopropylalkohol: scharfen Zangen, Scheren, ein Skalpell und ein Glas-Mikroskopie Objektträger.
   2. Am Tag vor der Trennung, legen Sie einen 24 well Zellkultur-Platte in den Inkubator.
   3. Bereiten Sie den Keller Matrix nach Herstellerempfehlung. Bereiten Aliquots von 1 ml bis Wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden.
   4. Bereiten Sie 500 ml chelatisierende Puffer und kühl auf Eis. Vorbereitung 1x Puffer aus sterilem destilliertem Wasser mit 5,6 mM Na _{2 HPO 4,} 8,0 mM KH _{2 PO 4,} 96,2 mM NaCl, 1,6 mM KCl, 43,4 mM Saccharose, 54,9 mM D-Sorbitol, 0,5 mM DL-Dithiothreit (Vorsicht), pH 7. Wenn die Planung mehrere Isolierungen, bereiten ein 5-fach konzentrierte Lösung ohne die DL-Dithiothreitol. Sterilfilter der Puffer. Vor der Isolierung, verdünnen das 5x Puffer mit sterilem Wasser auf 1x und fügen DL-Dithiothreitol kurz vor Isolation.
   5. Vorbereiten und verdünnen alle Wachstumsfaktoren entsprechend den Empfehlungen des Herstellers. Verwenden Sie kleine Teilmengen und vermeiden Frost-Tau-Zyklen. Functional Wachstumsfaktoren sind von entscheidender Bedeutung für die Ergebnisse.
   6. Coole Basismedium auf Eis und kühlen die Zentrifuge bis 46; C.
   7. Erwärmen weiteres Aliquot Basalmedium auf 37 ° C.
2. Isolierung von Drüsen
   1. Sammeln Sie ca. 1 cm² des Gewebes in eiskaltem Grundmedium. Halten Sie auf Eis, bis Vorbereitung. Während es bevorzugt ist, Gewebe so schnell wie möglich zu verarbeiten, zu speichern Gewebe Medium auf Eis, wenn nötig.
   2. Legen Sie das Gewebe in einer 10 cm Petrischale und decken Sie es mit kaltem 1x Chelat-Puffer. Durch leichtes hin und her zu waschen.
   3. Legen Sie das Gewebe in einem trockenen 10 cm Petrischale. Mit einer Pinzette, entfernen Sie vorsichtig den Schleim als auch die Muskelschicht unter einem Stereomikroskop. Durch leichtes Hin- und Herbe Waschen Sie das Gewebe in kaltem 1x chelatbildenden Puffer.
   4. Zeigen 1 cm ² Gewebe auf einem neuen, trockenen 10 cm Petrischale. Mit einer Schere schneiden Sie es in 20-50 kleine Stücke von etwa 2-5 mm² groß.
   5. Mit einer Pinzette, legen Sie alle Teile in einen 50-ml-Tube.
   6. Nehmen Sie eine sterile 10 ml Plastikpipette. Befeuchten Sie die Pipette in 1x chelatbildenden Puffer. Behaltenmit dem gleichen Pipette während des gesamten Verfahrens.
   7. 10 ml kaltem 1x chelatbildenden Puffer in die 50-ml-Tube. Durch kräftiges und Abpipettieren 10 Mal Waschen der Stücke. Lassen Sie die Stücke zu begleichen. Entfernen Sie den Überstand.
   8. Wiederholen Sie waschen (Schritt 1.2.7), bis der Überstand klar ist. Dies dauert ca. 50 bis 100 ml 1x chelatbildenden Puffer für 1 cm² des menschlichen Gewebes.
   9. Die Gewebestücke in 20 ml 1x chelatbildenden Puffer mit 10 mM EDTA ergänzt bei RT für 10 min unter leichtem Invertieren jedes 2 min inkubiert.
      Hinweis: Zeit und Temperatur dieser Inkubation kann entweder für Geschwindigkeit und / oder Konservierung von Drüsenarchitektur optimiert werden. Sie können von mehreren Stunden Inkubation bei 4 ° C auf einer rollenden Plattform bis 5 min bei 37 ° C in einem Schüttler mit 200 Umdrehungen pro Minute liegen. Gute Ausgangspunkte für Maus Magen sind 30 min bei 4 ° C auf einer rollenden Plattform und für den menschlichen Magen, 10 min bei RT.
   10. Pipette einmal sanft nach oben und unten mit der 10 ml Pipette. Lassen Sie die piECES zu begleichen. Überstand verwerfen.
   11. Verwenden der Pipette die Stücke in einen sauberen 10 cm Petrischale. Entfernen Sie die Flüssigkeit.
   12. Stellen Sie ein Glas Mikroskopie Objektträger auf der Oberseite der Gewebestücke. Beachten Sie die intakte Gewebe unter einem inversen Mikroskop für die Zellkultur mit 10-facher Vergrößerung.
   13. Druck auf die Glasobjektträger und Petrischale. Halten Sie beide in der Hand (mit sterilen Handschuhen) und Drücken Sie das Glas mit dem Daumen. Der Rand des Gewebes wird bewölkt angezeigt, dass Drüsen werden aus dem Gewebe freigesetzt.
   14. Beachten Sie die Freigabe Drüsen unter einem inversen Mikroskop für die Zellkultur mit 10-facher Vergrößerung.
   15. Sammeln Drüsen und Gewebe in 30 ml kaltem Grundmedium. Lassen Sie große Gewebestücke zu begleichen.
   16. Sammeln Sie den Überstand, der Drüsen in zwei 15-ml-Röhrchen.
   17. Zentrifuge 5 min bei 200 × g und 4 ° C. Überstand verwerfen. Das Pellet enthält isolierten Drüsen. Halten Sie sie auf Eis.
3. Seeding der Drüsen
   1. Für die Aussaat, halten Keller Matrix eiskalten zu allen Zeiten, so wird es flüssiger zu bleiben.
   2. Alternative 1: Seed 6 Vertiefungen einer Verdünnungsreihe.
      1. Hängen Sie das Pellet in 60 ul Keller Matrix.
      2. Bereiten 5 sterile 1,5-ml-Röhrchen auf Eis mit jeweils 50 & mgr; l aus Keller Matrix. Transfer 10 ul Drüsen / Keller Matrix Suspension in den ersten 1,5-ml-Tube. Suspend die Drüsen und Transfer 10 ul dieser Lösung auf den nächsten 1,5 ml-Tube. Wiederholen Sie für die nächsten Rohre.
   3. Alternative 2: Pflanzensamen eine berechnete Menge Drüsen pro Vertiefung. Beginnen Sie mit 100 Verschraubungen pro 50 ul Keller Matrix in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte.
      1. Die pelletierten Drüsen in 10 ml Grundmedium vorsichtig suspendieren. Zeigen 50 ul auf ein sauberes 10 ml Petrischale. Count Anzahl der Drüsen unter einem inversen Mikroskop für die Zellkultur mit 10-facher Vergrößerung.
      2. Berechnen der Konzentration der Drüsen in der Lösung. Übertragen Sie das Volume, contaIns 400 Drüsen auf ein neues 15-ml-Tube.
      3. Zentrifuge 5 min bei 200 × g und 4 ° C. Überstand verwerfen und halten Sie die Röhrchen auf Eis. Fügen Sie 200 ul Keller Matrix und sorgfältig resuspendieren. Halten Sie auf dem Eis.
   4. Nehmen Sie die 37 ° C warme 24-Well-Platte (siehe Schritt 1.1.2) aus dem Inkubator. Geben Sie einen Tropfen von 50 ul Drüsen im Keller Matrix in der Mitte des Brunnens. Der Tropfen wird eine Kuppel bilden.
   5. Die Platte vorsichtig Transfer zurück zum Zellkulturbrutschrank. Lassen Sie den Keller Matrix verfestigen 10 min.
   6. Bereiten warmen Medium bei allen Wachstumsfaktoren.
      1. Menschennieren: Ergänzen Sie den Basismedium mit den folgenden Wachstumsfaktoren für menschliche Magen Organoide: 50 ng / ml EGF, 10% noggin-konditionierten Medium, 10% R-spondin1-konditionierten Medium, 50% Wnt-konditionierten Medium, 200 ng / ml Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) 10, 1 nM Gastrin und 2 uM TGFbeta-Hemmer sowie 10 uM rho-assoziierten Coiled-Coil-bildendes Protein-Serin / Threonin-Kinase Inhibitor (RHOKi).
      2. Für murine Drüsen: Ergänzen Sie den Basismedium mit den folgenden Wachstumsfaktoren für Maus Magen Organoide: 50 ng / ml EGF, 10% noggin-konditionierten Medium, 10% R-spondin1-konditionierten Medium, 50% Wnt-konditionierten Medium, 100 ng / FGF10 ml, 10 nM Gastrin, 0,5 mM TGFbeta-Hemmer sowie 10 uM RHOKi.
   7. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator. 500 & mgr; l Medium bei allen Wachstumsfaktoren (1.3.6) zu jedem Vorsichtig gut ohne den Keller Matrix zu stören. Setzen Sie ihn wieder in den Inkubator.
   8. Aktualisieren Sie die Medium 3 mal pro Woche (alle 2-3 Tage). Für erfrischende Medium, entfernen Sie das alte Medium mit dem Verlassen des Tropfen Keller Matrix intakt. Vorsichtig frischen, warmen Medium bei allen Wachstumsfaktoren. Sie RHOKi hinzufügen nicht. RHOKi nur direkt nach dem Aussäen von Drüsen oder nach der Aufspaltung der Organoide (Schritt 2) hinzuzufügen.

2. Durchgang des Magen Organoide Kultur Vor Mikroinjektion.

1. Materialzubereitung
   1. Autoklaven Pasteurpipetten.
   2. Am Tag vor der Passage, legen Sie ein 4 well Zellkulturplatte im Brutschrank bei 37 ° C. Die 4-Well-Platten haben eine geringe Kanten und ermöglichen Mikromanipulation.
   3. Bereiten Sie den Keller Matrix nach Herstellerempfehlung. Am Tag der passaging, tauen Keller Matrix auf Eis.
   4. Vorbereiten und verdünnen alle Wachstumsfaktoren entsprechend den Empfehlungen des Herstellers.
   5. Kühlen Basalmedium auf Eis und kühlen die Zentrifuge auf 4 ° C.
2. Durchgang von Organoide Kulturen
   1. Nehmen Sie die Platte mit den Organoide aus dem Inkubator. Entfernen Sie Medium aus einem gut.
   2. 1 ml kaltem Basalmedium zum Keller Matrix in dem Bohrloch. Unter Verwendung einer 1 ml-Mikropipette, kräftig pipettieren nach oben und unten, bis der Keller-Matrix aufgebrochen. Transfer zu einem 15-ml-Tube. Auf Eis stellen.
   3. Nehmen Sie ein Glas Pasteurpipette und eine Feuerquelle, wie zB einem Bunsenbrenner.
      1. Halten Sie die Spitze der Pipette in das Feuer, bis die Öffnung der Spitze von 1,5 mm bis etwa 0,5 mm (Abbildung 1) verengt. Lassen Sie die Pipette auf RT abkühlen.
      2. Befeuchten Sie die Pipette in Grundmedium. Ein optimal verengt Pipetten dauern wird, bis das Medium sichtbar langsamer als ein nicht-verengten Pipette, aber es wird immer noch alleow Pipettieren gut.
   4. Nehmen Sie Organoide in der Pipette und kräftig pipettieren 10x auf und ab. Das Brechen der Organoide mit dem Auge beobachtet werden.
   5. Hinzufügen 9 ml kaltem Basalmedium und Zentrifuge 5 min bei 200 × g und 4 ° C.
   6. Vorsichtig verwerfen alle Überstand. Hängen Sie das Pellet in 250 ul Keller Matrix. Halten Sie auf dem Eis.
   7. Nehmen Sie die 37 ° C warme 4 Well-Kulturplatte und einen Tropfen von 50 ul Organoide / Keller Matrix in jeder Vertiefung.
   8. Übertragen Sie die Platte vorsichtig zurück in den Inkubator. Lassen Sie den Keller Matrix erstarren bei 37 ° C für 10 min.
   9. Bereiten geeigneten Medium entweder Maus oder Mensch Organoide wie in Schritt 1.3.6 aufgeführt.
   10. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und überlagern Keller Matrix Tropfen mit 500 ul Medium.
   11. Übertragen Sie die Platte in den Inkubator.
   12. Aktualisieren Sie das Medium 3 mal pro Woche alle 2-3 Tage (siehe 1.3.8.).
   13. Für das Einfrieren von Organoide, mechantisch stören Organoide wie für die Spaltung in diesem Protokoll beschrieben (Schritte 2.2.1-2.2.5.). Suspendieren die organoiden Fragmente in 500 ml Gefriermedium und frieren bis -80 ° C unter Verwendung von Kryoröhrchen und eines Gefrierbehälters. Für langfristige Lagerung, übertragen Sie die Röhrchen in flüssigen Stickstoff.
   14. Zum Auftauen von Organoide, bereiten die Kulturplatte, Keller Matrix, Wachstumsfaktoren, kalte und warme Medium wie in den Schritten 1.1.2, 1.1.3., 1.1.5., 1.1.6., 1.1.7 beschrieben. Wärmen Sie das gefrorene Fläschchen mit einem Wasserbad, und Transfer Zellen unmittelbar nach dem Auftauen zu einem 15-ml-Röhrchen mit 10 ml kaltem Grundmedium. Zentrifuge und die Platte, die Zellen wie in 2.2.5 bis 2.2.12 beschrieben.
       Hinweis: Mikroinjektion von Organoide ist mühsam, aber erlaubt die einzigartige Möglichkeit, die Interaktion in 3D zu studieren.
   15. Wenn 3D-Studien nicht benötigt werden, Saatgut Organoide in zwei Dimensionen. Dafür stören die Organoide wie in Schritten 2.2.1 bis 2.2.6 festgelegt. In 2250 ul kalten Medium bei allen Wachstumsfaktoren, um 250 ul Keller matrix mit organoiden Fragmente.
       1. Seed in 5 Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen mit 500 ul pro Vertiefung. Medium ändern 3 mal pro Woche, mit sorgfältig nur das Ersetzen der oberen 400 ul, in den Keller-Matrix an der Unterseite der Platte ungestört zu halten.
          Anmerkung: Organoide wird der Zellkulturplatte zu befestigen und in 2D zu erweitern. Elektronenmikroskopie zeigte, daß die apikale Seite der Zellen Flächen des Mediums in der Vertiefung (Daten nicht gezeigt).
       2. Vor der Infektion, tauschen alle Medium einschließlich Keller Matrix, damit Bakterien an die Zellen anzuhängen. Ein ähnliches Protokoll wurde auch für eine Infektion mit H. beschrieben worden pylori ^14. 2D Zellschichten möglicherweise nicht alle Zelltypen, die in 3D Organoiden vorhanden sind, enthalten.

3. Mikroinjektion von Organoide Kultur.

Hinweis: Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Bakterien in Organoiden microinject werden. Es kann hilfreich sein, um die Injektion mit Organoide startendie mehr permissive, um die Mikroinjektion sind. So kann beispielsweise der Maus Magen Organoide in sehr großen zystischen Organoide, die einfach zu zielen sind zu wachsen.

1. Materialzubereitung
   1. Ziehen Sie eine Glaskapillare in zwei Injektionsnadeln mit einer Mikropipette Puller, entsprechend der Empfehlung des Herstellers. Die Mikropipette Abzieher wird das Glaskapillare in der Mitte zu erwärmen und wird die Kapillare in zwei Teile zu ziehen, wodurch zwei Glasnadeln. Es ist praktisch, mehrere Nadeln ziehen und speichern sie in einer sauberen Petrischale.
   2. Auf eine bakterielle Infektion zu ermöglichen, entfernen Sie die Antibiotika aus allen Medien für mindestens 3 mittel Veränderungen (= 1 Woche). Dies wird Antibiotika aus Keller Matrix zu verdünnen. Bei Verwendung eines Bakterienstammes, die resistent gegen ein bestimmtes Antibiotikum, fügen Sie diesen spezifischen Antibiotikum, um Chancen für die Kontamination zu minimieren.
   3. Bereiten Sie den Arbeitstisch für Mikroinjektionen. Für die Arbeit an verschiedenen biologischen Sicherheitsstufen kann es notwendig sein, um eine Stereo platzierenMikroskop in einer Sterilbank. In diesem Protokoll injizieren H. pylori unter Biosicherheitsstufe 2 Bedingungen, unter einem Stereomikroskop in einer Sterilbank.
   4. Kultur die Bakterien nach Standardprotokollen ^13,23.
   5. Um die Multiplizität der Infektion (MOI) zu schätzen, schätzen, zwei Parameter: die Anzahl der Bakterien und die Anzahl der Zellen pro organoiden wie unten beschrieben. Das Innenministerium kann mit den Ergebnissen zu korrelieren, beispielsweise mit Gastgeber IL-8-mRNA-Expression ^13.
      1. Um die Bakteriendichte in der Infektionslösung zu berechnen, zuerst anhand einer Standardkurve der optischen Dichte und der koloniebildenden Einheiten (CFU) nach Standardprotokollen ^24. Eine optische Dichte von 0,1 bei 550 nm sollte bei etwa 10 ⁷ CFU / ml zu ergeben.
      2. Um die Anzahl der Zellen pro organoiden schätzen, zählen Anzahl von Organoide in 1 gut. Disrupt Organoide wie in den Schritten umrissen 2.2.1-2.2.4. Nach Zentrifugation 5 Minuten lang bei 200 × g und 4 ° C,1 ml enzymatische Dissoziationslösung und resuspendieren.
         1. Inkubieren bei 37 ° C unter mehrmaliges Schütteln für 5-10 min. Bestimmen, ob die Zellen in einzelne Zellen unter dem Mikroskop (inverses Mikroskop wie Leica DMIL bei 10-facher Vergrößerung) dissoziiert. Bei Bedarf verlängern die Inkubationszeit.
         2. Graf Zellen pro organoiden mit einer Zählkammer und berechnen Sie die Anzahl der Zellen pro organoiden. Menschlichen Magen Organoide mit einem Durchmesser von etwa 200 um in etwa 4.000-Zellen. Injektion von 0,2 ul einer Bakterienlösung mit 1 x ¹⁰ 9 Bakterien pro ml zu einer ungefähren MOI von 50.
2. Die Injektion von Organoide.
   Anmerkung: Für die Mikroinjektion wird die Glas Nadel in einem Halter, der in 3 Dimensionen durch einen Mikromanipulator manövriert werden kann stabilisiert. Organoide bleiben im Keller Matrix innerhalb des Bohrlochs. Abhängig von der Größe und Positionierung in der gut, nicht alle sind gleichermaßen Organoide einmEnable zur Injektion. In der Regel lassen sich die 30 größten Organoide in einem gut in 5 min ausgerichtet sein.
   1. Ernte-Bakterien und waschen Sie sie in Basismedium nach Standardprotokollen ^24.
   2. Berechnung der Anzahl der Bakterien pro ml nach der optischen Dichte (siehe Schritt 3.1.5.1). Verdünnen der Bakterien bis 1 x ¹⁰ 9 Bakterien pro ml in Basalmedium.
   3. Nehmen Sie ein Glas Nadel. Mit einer Pinzette brechen Sie die Spitze, so dass die Öffnung ungefähr 10 & mgr; m breit sein.
   4. Führen Sie die Nadel in die Injektionshalter und fixieren Sie sie mit dem Mikromanipulator.
   5. Nehmen Sie etwa 10 & mgr; l Bakterienlösung in die Nadel.
   6. Legen Sie eine 4-Well-Platte mit niedrigen Kanten enthält organoide Kulturen unter dem Stereomikroskop.
   7. Navigieren mit dem Mikromanipulator, gezielt eine einzelne Organoide mit der Nadel. Positionieren Sie die Nadel in der Nähe des organoiden und legen Sie die Nadel in die organoiden mit einer schnellen Bewegung. Injizieren approximately 0,2 ul Bakterienlösung in jede organoiden mit der Mikroinjektor.
3. Ernte Organoide für jede Analyse.
   1. Wie beispielsweise zu beheben Organoide nach 4 h. Überstand entfernen und 1 ml 2% Formaldehyd und Inkubation 20 min bei RT oder O / N bei 4 ° C. Organoide kann für die Immunhistochemie nach Standardverfahren ²⁵ verarbeitet werden.

Dieses Protokoll erlaubt Isolierung von Magendrüsen (Abbildung 2). Drüsen in Keller-Matrix, die als Tropfen aus dem gut verfestigt, wodurch eine 3-dimensionale Rahmen reich an Laminin und Kollagen, damit die Drüsen wachsen zu Organoiden (Figur 3) angeimpft. Organoide beginnen in der Regel als kleine Zysten und innerhalb von 12-16 Tage, zu Kugeln mit einem Durchmesser von 50 bis 300 & mgr; m (Abbildung 4) erweitern Sie sie. Einige Organoide wird zystische bleiben, werden einige kleine buddings zu entwickeln. Letzteres ist in der Regel ein Zeichen für eine gesunde wachsende Kultur. In diesem Protokoll wird für 100 Drüsen, 50 ul Keller Matrix und 500 ul Medium eine Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen verwendet. Dies kann jedoch nach oben oder verkleinert werden.

Der Erfolg der Mikroinjektion kann leicht unter dem Stereomikroskop beobachtet werden, wie die trübe, Bakterienlösung füllt die organoiden (Abbildung 5). Nach ausreichender Inkubationszeit kann Organoidefür einen beliebigen Analyseverfahren bearbeitet werden. Beispielsweise kann Organoiden in Paraffin eingebettet werden können Abschnitte geschnitten und gefärbt unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt werden Immunhistochemie. Mikroskopische Analyse von immun Organoiden demonstrieren erfolgreiche Injektion der Bakterien (Figur 6).

Abbildung 1. Foto des für den Durchgang Organoide verwendet Pasteurpipette. In jeder Platte ist die obere Pipette vor, die untere Pipette nach der Einengung durch Feuer. Maßstab in der oberen und rechten Fensterbereich ist cm und mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Representative Bild von isolierten menschlichen Magendrüsen. Maßstabsbalken 100 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3 Schema der Vertiefungen und für Bild des menschlichen Magen Organoiden. Isolierte menschliche Magendrüsen wurden im Keller Matrix verteilt und in Form von Tropfen in die Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen gegeben. Unten links: Übersicht eines Vertreters auch 11 Tage nach der Aussaat. Unten rechts: Die Erweiterung der angegebenen Stelle. Maßstabsleiste 100 um. Magen-Maus Organoide erweitern schneller ^18. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 4. Typische Wachstum von menschlichen Magen Organoide. Drüsen wurden in Keller Matrix und Bilder der gleichen organoiden ausgesät wurden über einen Zeitraum von 12 Tagen übernommen. Maßstabsleiste 100 & mgr; m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 5. Die Mikroinjektion von Magen Organoiden. Stereoskop-Bilder eines Magen organoiden vor (links) und während der (rechte) Mikroinjektion von Bakterien in das Lumen. Bakterien sind als Cloud innerhalb der organoiden sichtbar. Maßstabsleiste 200 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6. Immungefärbte Organoide. Menschlichen Magen Organoide wurden mit H. mikroinjiziert pylori. Nach 4 h wurden Organoiden in Paraformaldehyd fixiert und in Paraffin eingebettet. Die Schnitte wurden unter Verwendung von Antikörpern gegen die Bakterienprotein-Zytotoxizität assoziierten Gens A (CagA) nach Standardmethoden der Histologie ²⁵ gefärbt. Oben links: Bild eines repräsentativen organoiden. Unten: Höhere Vergrößerung des eingerahmten Bereich. Oben rechts:. Stärkere Vergrößerung des eingerahmten Bereich mit einem einzigen Bakterium in der Nähe der Epithelzellen Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

This protocol describes the use of ever-expanding, untransformed primary organoids from adult stem cells for infection biology. Critical steps are i) the isolation of viable glands, ii) expansion of organoids and iii) the microinjection. Below are some suggestions for modifications, troubleshooting and technical considerations.

Compared to other isolation methods, which use vigorous shaking or pipetting to release glands and can be equally successful, the technique presented here has the advantage, that the release of the glands from the tissue can directly be observed under the microscope (step 1.2.14.). If glands are not released, incubation in EDTA can be varied (see step 1.2.9.). If preferred, try to isolate glands using vigorous shaking and control the presence of glands in the supernatant under the microscope as described for mouse intestinal crypts²⁶. It is not critical, if isolated glands disintegrate during the washing steps. Organoids will still initiate from fragments or even single stem cells, as demonstrated previously^{13,18, 27}.

When glands have been isolated and seeded, but organoids are not expanding as expected, troubleshooting should start with testing activity of Wnt and R-spondin. These factors are crucial for expansion of the organoids and it is advised to test the functionality of these two factors by an in vitro assay, for example the TOP flash reporter construct using Luciferase²⁸. It is important that all growth factors are diluted and handled following manufacturers’ recommendation and kept in small aliquots to avoid freeze-thaw cycles.

The microinjection into organoids is comparable to injection of fish eggs or murine oocytes. Needles are pulled from glass capillaries and can be broken using tweezers directly before use to result in a tip end of about 10 µm. Smaller tips penetrate the organoids more easily but they also bear the risk that bacterial accumulations may clog the needle. For micromanipulation, different systems have specific advantages and limitations. It is practical to use a 3- dimensional manipulator instead of a 2 dimensional manipulator to allow maximal flexibility to reach into the wells. Oil-based microinjectors (such as Celltram, or IM-5B) provide a finer and slower manual control compared to air-based microinjectors (such as FemtoJet¹¹, or Nanojet microinjector¹⁰). In turn, the latter have the important advantage that a precise injection volume can be programmed. If microinjection is initially difficult, it may be helpful practice with large mouse gastric organoids and a dye. With practice, also smaller organoids such as mouse intestinal organoids are amenable to microinjection.

Microinjection of organoids is technically limited to a small experimental size because every organoid has to be targeted manually. Positioning or size may not render all organoids equally amenable to injection, thus the technique is limited to applications that can tolerate some heterogeneity in a well. Reflux from the injection hole is minimal^10,11, but should also be considered.

Comparing the different sources for new gastric stem cell derived cell cultures, it is evident that each of the systems has its own advantages. iPSC have been used to generate antral gastric organoids and allow following of the developmental steps towards the antral gastric lineages¹². The cultures described here can be derived from antrum or corpus. While long-term corpus cultures as described here do not contain parietal cells¹³, very early passages as well as co-cultures with mesenchymal cells have been reported to contain parietal cells^15,29.

The protocol described here has been developed for optimal long-term culture and allows unlimited maintenance of organoids (1 year tested). The organoids have typical advantages of cell lines: They can be expanded to allow larger experiments (split 1:5 every 2 weeks for human, every week for mouse organoids). They can be frozen and thawed. Human gastric organoids contain stem cells next to differentiated cells that express markers of mucous pit cells, mucous neck cells, chief cells and enteroendocrine cells. Differentiation to the lineages can be directed using Wnt and Nicotinamide. It is also possible to generate organoids from biopsies of cancers and thus organoids from healthy and cancerous tissue can be compared^13,21,33. Generally, organoids are also amenable to genetic modification and intestinal or gastric organoids have been genetically modified using bacterial artificial chromosomes (BAC) transgenes³⁰, retrovirus^26,31, lentivirus¹⁴ and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9³². Organoids have been used for various imaging techniques^13,14,29, RNA analysis¹³, Western Blot³³, Immunoprecipitation³⁴ and drug screening³³.

In summary, organoids grown from adult stem cells provide a valuable new tool for infection biology. The here provided protocol for gastric organoids may serve as basis to establish other new infection models.

Hans Clevers is an inventor on several patents for organoid culture. Otherwise the authors have nothing to disclose.

This work was supported by EU Marie Curie Fellowship (EU/300686-InfO) to S.B. and a Research Prize from the United European Gastroenterology Foundation to H.C. We would like to thank Harry Begthel, Jeroen Korving and the Hubrecht Imaging Center for technical assistance, Meritxell Huch for help with initial organoid culture and Yana Zavros for discussion.