Method Article
This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.
Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.
İnsan uyarılmış pluripotent kök hücreleri (hiPSCs) keşif hastaya özgü kök hücrelerin 1-3 üretimi için uygun bir yöntem sağlayan, rejeneratif tıp alanında devrim yarattı. hiPSCs başarılı fibroblastlar 4,5, hematopoietik hücrelerin 6,7, idrar 8 böbrek epitel hücreleri ve 9,10 keratinositler dahil olmak üzere çeşitli somatik hücre tiplerinin, elde edilmiştir. Bugüne kadar, deri fibroblastları ve hematopoietik hücreler hastaya özgü iPSCs üretilmesi için en yaygın olarak kullanılan hücre kaynağıdır. Muhtemelen, bu deri biyopsileri ve kan toplama rutin tıbbi prosedürler ve birçok ülkede kurulmuştur hastanın kan veya cilt örneklerinin büyük biyobankalar olmasından kaynaklanmaktadır.
Kan hücreleri ve invazif çıkarma yöntemleri gerektiren deri fibroblast aksine, keratinositler hiPSC üretimi için kolay erişilebilir bir hücre tipini temsil etmektedir. Keratinocytes cildin dış epidermal bariyer oluşturur ve ayrıca çivi ve saç 11'de bulunan keratin bakımından zengin epitel hücreleri vardır. Özellikle, keratinositler saç köklerinin, iç kök kılıfı (IRS) hücreleri (12, Şekil 1) ile birlikte saç gövdesine kaplı bir dış hücresel tabakanın dış kök kılıfı (ORS) bulunabilir. Saç toplama sağlık personelinin yardım gerektirmeyen, basit bir prosedür olduğu gibi hastaların toplamak ve büyük ölçüde hiPSC nesil için hasta örneklerinin koleksiyonu kolaylaştıracak laboratuvarlar, kendi saç örneklerini göndermek için, bir fırsat sağlar. Epidermal keratinositler, aynı zamanda hiPSC üretimi 9,13 başlangıç hücreleri gibi keratinositleri kullanmanın avantajları ekleyerek, fibroblastlar ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir yeniden programlama verimliliği ve daha hızlı bir yeniden programlama kinetiği sahiptir. Ayrıca, hiPSCs da saç folikülü içinde diğer hücre popülasyonları kullanılarak üretilebilir,saç folikülü 14,15 tabanında bulunan dermal papilla hücrelerini dahildir.
Saç türetilmiş hücreleri kullanarak iPSC nesil Önceki raporlar genellikle retroviral veya lentiviral tabanlı yeniden programlama yöntemlerini 9,14,15 kullanmaktadır. Ancak, bu viral yöntemler yeniden programlama sırasında yabancı transgenlerin istenmeyen genomik entegrasyon tanıtmak. Karşılaştırma olarak, epizomal vektörlerin kullanımı entegrasyonu içermeyen iPSCs 4 oluşturmak için uygun bir non-viral yeniden programlama yöntemi temsil eder. Biz daha önce verimli epizomal vektörler 13 kullanan hiPSCs içine keratinosit yeniden programlamak için basit, düşük maliyetli ve viral olmayan bir yöntem geliştirdik. Burada koparıp saç büyüme ve keratinositler bakım ve hiPSCs oluşturmak için daha sonra yeniden programlama ile ilgili keratinosit türetilmesi dahil olmak üzere, keratinosit türetilmiş hiPSCs, üretimi için ayrıntılı bir protokol sağlar.
bireylerin insan saçı örnek toplama konak kurumlarında insan araştırma etik komitesi tarafından etik onayı gerektirir ve kurumsal kurallarına uygun yapılmalıdır.
Mızraplı Saç gelen Keratinositler 1. İzolasyonu
2. Bakım ve Keratinositler arasında Pasajlanması
Epizomal vektörlerin kullanılması keratinositlerinden hiPSCs 3. Nesil
anagen (büyüme fazı), katagen (regresyon fazı) ve telojen (dinlenme fazı) 20-21: saç 3 farklı büyüme döngüsünün evreleri geçer. anagen kıl folikülü epitel Birden çok katman içeren; Bu tabakalar ORS, IRS ve saç gövdesine (Şekil 1) içerir. Anagen kıl sonunda ORS ve saç şaft farklılaşma fesih apoptoz ile işaretlenir katajen faza, geçiş uğrar. Son olarak, apoptoz durur ve telojen folikül karakteristik telojen ile sakin olur telojen faza için katajen saç geçiş 20,21 şişer.
Şekil 1 telojen saç ve anajen saç morfolojisi göstermektedir. Biz genellikle keratinosit derivasyon için anagen saç kullanmaktadır. Bu protokol, keratinosit çıkıntılar gibi erken 3 gün gibi saç eki (Şekil 2A) fark edilebilir ve p devam edecektirroliferate (Şekil 2B). Bizim tecrübelerimize göre, bazı anagen saçlar takmak veya keratinosit akıbet uymayan başarısız olabilir; Başarılı keratinosit izolasyonunu sağlamak için her bireyden 10 anagen kıl - böylece en az 5 toplamak. Daha sonra, keratinositler, yeni bir levha üzerine geçirildi ve birden fazla geçit (Şekil 2C) için muhafaza edilebilir. Bu KSR orta Matrigel ile karşılaştırıldığında, bölüm 2'de tarif edildiği gibi keratinosit ortamı ile bir kaplama maddesi ile keratinosit iyi büyüme olduğuna dikkat etmek önemlidir.
Genişleme sonrasında, keratinositler yeniden programlama 32 gün sonra bölüm 3. Şekil 3A tipik keratinosit kaynaklı hiPSC koloni gösterir açıklandığı gibi hiPSCs oluşturmak için yeniden olabilir. Bu hiPSC koloni merkezinde bir farklılaşma gözlemlemek için ortaktır. Bir kez elle aldı, türetilmiş hiPSCs tipik sitoplazmik oranı ve bağlı tanımlanmış bir koloniye yüksek çekirdeği görüntülerli (Şekil 3B). Bu tür pluripotent belirteçleri Oct4, Nanog ve TRA-160 (Şekil 3C-E) ifadesi, daha önce tarif edildiği gibi 13,19 hiPSCs arasında kurulan hücre çizgileri daha sonra pluripotensin açısından karakterize edilebilir.
Şekil 1. Farklı büyüme aşamalarında koparıp kılların Temsilcisi görüntüler. (A) Diyagram anajen veya telojen faz tüyleri gösteren. (B) telogen faz ve (C) anagen fazda bir koparıp saç gösteren Faz kontrastlı görüntüler. HS = saç mil; IRS = İç Kök Kılıf; ORS = Dış Kök Kılıf. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bir koparıp saç Şekil saç türetilmiş keratinositler 2. Temsilcisi görüntüler. Faz kontrastlı görüntüler (A) 3 gün ve (B) 10 gün boyunca aşağı kaplama. Beyaz oklar koparıp saç keratinosit akıbet işaretleyin. Pasajlanması sonra tipik bir arnavut kaldırımlı morfolojisi ile 3. Gün keratinosit kültürünün (C) Faz kontrastlı görüntü. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil keratinosit kaynaklı hiPSCs 3. Temsilcisi görüntüler. Bir keratinosit kaynaklı hiPSC co gösteren bir Gün 32 yeniden programlama kültürünün (A) Faz kontrastlı görüntüLony. (B) El hESC benzer morfolojiye sahip keratinosit kaynaklı hiPSCs seçilmiş. Pluripotent işaretleri (C) NANOG ve (d) Oct4 ile hiPSCs immün (E) keratinosit türetilmiş hiPSCs TRA-160. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Hastaya özgü hiPSCs üretilmesi, in vitro olarak hastalıklı hücre tiplerinde patojenezinin araştırılması için eşsiz bir yaklaşım sunmaktadır ve ayrıca hastalığın fenotipleri kurtarabilir yeni moleküllerin belirlenmesi için ilaç tarama için bir platform sağlar. HiPSCs kullanılarak bu hastalığa modelleme yaklaşımı uzun QT sendromu, Huntington hastalığı, Parkinson hastalığı ve amiyotrofik lateral skleroz 22 de dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların, umut vaat eden sonuçlar vermiştir. Çeşitli girişimler zaten ABD, Avrupa, Avustralya, Çin, Güney Kore ve Japonya'da 23,24 yılında konsorsiyumlar dahil hastaya özgü hiPSCs, büyük ölçekli kütüphaneler kurmak için çalışmalar devam etmektedir.
Burada saç türetilmiş keratinositlerinden hiPSCs kurmak için bir protokol kolaylaştırır ve hastalığa özel hiPSCs büyük ölçekli kütüphanelerinin kurulması hızlı izlemek için bir potansiyele sahip olan, tarif edilmektedir. Birincisi, epizomal: Bu protokol iki avantaj sunarBu protokolde kullanılan sistem, altı yeniden programlama faktörleri bir kokteyl ile entegrasyon-free hiPSCs üretir (Oct4, Sox2, Klf4 L-MYC, LIN28, p53 shRNA) nispeten yüksek verim 4 de. Retroviral veya lentiviral aracılı yeniden programlama yöntemleri ile karşılaştırıldığında, epizomal vektörü kullanımı reprogramming sırasında yabancı transgenlerin istenmeyen genomik entegrasyonunu önler. Bu nedenle, pek çok girişimler gibi büyük ölçekli hiPSC kütüphanelerinin kurulması için entegrasyon-free yeniden programlama yöntemlerinin kullanımını tercih epizomal vektörler, bütünleştirici yeniden programlama yöntemleri üzerinde 23 Sendai virüsü veya mRNA.
İkincisi, saç kolayca erişilebilir ve invaziv prosedürlerin kullanılması veya tıbbi personele katılım olmadan hastaların kendileri hasat edilebilir. Bu keratinosit türetme ve sonraki yeniden programlama için laboratuara kendi saç örneklerinde benzersiz toplamak için farklı bölgelerden hastalar için bir fırsat ve posta sağlar. Bu stratejinin uygulanabilirliği destek olarak, yayınlanmamış veriler keratinositler başarılı bir şekilde 10 gün boyunca 4 ° C'de saklanmıştır koparıp saç izole edilebilir olduğunu göstermektedir.
Burada anlatılan metodoloji koparıp saç keratinosit türetilmesi sağlayacaktır. Keratinositler sadece tek bir saç elde edilebilir olsa da, bizim önerimiz keratinosit derivasyon için en az 5 anagen tüyleri toplamaktır. Bu protokolün bir sınırlaması bazı kıllar iyi takmak olmayabilir ve keratinositler büyümeye başarısız olabilir olmasıdır. Daha kalın saç ince saç eki kayan önlemek ve geliştirmek için kaplama sırasında kültür ortamının düşük miktarda gerektirir ise, daha iyi takmak için eğilimindedir. Keratinositler elde edilir sonra, genişletmek ve standart yavaş dondurma dondurma yöntemleri kullanılarak 16 stoklarını aşağı dondurmak için tavsiye edilir. Keratinositlerin sonradan yeniden programlanması bu protokolü açıklanan şu adımları yapılabilir. Bu önemlidirazalmış yeniden programlama verimliliği geç pasajlar gözlenen ile hücrelerin hücre yaşlanmasının 25-27 ulaşması olarak başlayan hücrelerin çoğalması oranı, yeniden programlama verimliliğini etkileyebilir unutmayın. Bu bağlamda, en geç yeniden programlama deneyler için geçit 6 daha keratinositler kullanımı. Buna ek olarak, yeniden programlama verimleri farklı bireyin keratinositler arasında değişebilir.
Son çalışmalar ~ ile genom 29 somatik CNVs olduğu bildirilen deri fibroblast% 30 bedensel dokuların 28 çok tip yaygın genetik mozaisizim öneririz. Bu CNVs DNA replikasyonu, DNA onarımı ya da transpozon harekete hataları neden olabilir. Cilde uzun süreli UV ışınlarına maruz kalma fibroblastlar ve keratinositler dahil olmak üzere, epidermal hücreler ek CNVs neden olması da mümkündür, fakat bu ölçüde tam olarak anlaşılamamıştır. Keratinositlerde CNVs yeniden programlama işlemi sırasında üzerinden gerçekleştirilir gibi, important kurulan hiPSCs genomik istikrarı korumak sağlamak için rutin karyotiplemesi veya CNV analizi gerçekleştirmek için. Özet olarak, burada hastalık modelleme ve rejeneratif tıpta için kullanılabilir saç türetilmiş keratinositler gelen hiPSCs üretimi için işlemleri tarif.
The authors have no conflict of interest.
The authors wish to thank Harene Ranjithakumaran and Stacey Jackson for technical support. This work was supported in part by grants from the National Health and Medical Research Council (R.C.B. Wong, A. Pébay), the University of Melbourne (R.C.B. Wong), Retina Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay) and the Ophthalmic Research Institute of Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay); Australian Research Council Future Fellowship (A. Pébay, FT140100047), Cranbourne Foundation Fellowship (R.C.B. Wong); intramural funding from the National Institutes for Health (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung) and operational infrastructure support from the Victorian Government.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibiotic Mix: | |||
250 ng/ml Antimycotic amphotericin B | Sigma | A2942-20ml | Antibiotic mix is made up in PBS. |
1X Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
PBS (-) | Invitrogen | 14190-144 | |
Knockout Serum Replacement (KSR) medium: | KSR medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. bFGF is added fresh to the media before use. | ||
20% knockout serum replacement (KSR) | Invitrogen | 10828-028 | |
DMEM/F12 with glutamax | Invitrogen | 10565-042 | |
1× MEM non-essential amino acid | Invitrogen | 11140-050 | |
0.5× Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
0.1 mM β-mercaptoethanol | Invitrogen | 21985 | |
bFGF (10 ng/ml, added fresh) | Millipore | GF003 | |
Keratinocyte medium: | |||
EpiLife with 60 µM Calcium | Invitrogen | M-EPI-500-CA | |
1× Human keratinocyte growth supplement (HKGS) | Invitrogen | S-001-5 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) medium: | FBS medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. | ||
10% fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | |
DMEM | Invitrogen | 11995-073 | |
0.5x Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
2 mM L-glutamine | Invitrogen | 25030 | |
0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
Extracellular Matrix (ECM): | |||
Matrigel | Corning | 354234 | Aliquot Matrigel stock and store in -80°C following manufacturer’s instructions. Stock concentration of Matrigel varies slightly from batch to batch (~9mg/ml). We recommend to use 200µl matrigel for coating a 12-well plate (~150µg/well). |
Coating Matrix Kit | Invitrogen | R-011-K | |
Plasmids: | Note that pCXLE-eGFP is only used for monitoring transfection efficiency and is not required for reprogramming. | ||
- pCXLE-eGFP | Addgene | 27082 | |
- pCXLE-hOct3/4-shP53F | Addgene | 27077 | |
- pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | |
- pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | |
Transfection reagent Fugene HD | Promega | E231B | |
Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | Make up 0.1% gelatin in distilled water. Autoclave before use. |
Reduced Serum medium: OPTI-MEM | Invitrogen | 31985062 | |
Accutase | Sigma | A6964-100ml | |
Mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder | MEF can be inactivated by mitomycin C treatment or irradiation as described previously 16. | ||
26G needle | Terumo | NN2613R | |
6-well plate (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353046 | |
12-well plate (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353043 | |
10 cm dish (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353003 | |
Dispase | Invitrogen | 17105-041 | Use at 10 mg/ml |
Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Use at 1 mg/ml |
TRA-160 antibody | Millipore | MAB4360 | Use at 5 µg/ml |
OCT4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | Use at 5 µg/ml |
NANOG antibody | R&D Systems | AF1997 | Use at 10 µg/ml |
MycoAlert Detection kit | Lonza | LT07-418 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır