Method Article
This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.
Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.
人类诱导多能干细胞(人iPS细胞)的发现已经彻底改变了再生医学的领域中,提供用于产生患者特异性干细胞1-3的一种可行的方法。人iPS细胞已经成功地从不同的体细胞类型,包括成纤维细胞4,5,造血细胞6,7,从尿8肾小管上皮细胞和角质形成细胞9,10产生的。迄今为止,皮肤成纤维细胞和造血细胞代表了最常用的细胞来源,用于产生病人的具体的iPSC。可以说,这是由于这样的事实,即皮肤活检和采血是常规的医疗程序,并已在许多国家建立大型生物库患者血液或皮肤的样品。
相较于血细胞和皮肤成纤维需要侵入性的提取方法,角质代表一个方便的细胞类型的hiPSC产生。 KeratinocytES是形成皮肤的外表皮屏障,并且还发现,在指甲和头发角蛋白11的富上皮细胞。特别是,角朊细胞可以在毛囊,即覆盖毛干连同内根鞘(IRS)的细胞(12, 图1)的外部的蜂窝层的外根鞘(ORS)中找到。由于毛发收集是一个简单的过程,不需要医务人员的协助下,它提供了一个机会,让患者收集并发送自己的头发样品的实验室,这将极大地方便了hiPSC代病人样本的采集。表皮角化细胞也有较高的重编程效率和更快的重编程动力学相比的成纤维细胞,加入到用角质形成细胞作为起始细胞hiPSC代9,13的优点。此外,人iPS细胞还可以使用毛囊内其他细胞群产生,包括位于毛囊14,15的底部的毛乳头细胞。
IPSC的代发使用来源的细胞以前的报告中经常使用逆转录病毒或慢病毒为基础的重编程方法9,14,15。然而,这些病毒方法的重新编程过程中引进国外转基因不良基因组整合。相比较而言,使用游离型载体的代表一个可行的,非病毒重新编程方法来生成积分-自由iPSCs的4。我们以前曾开发出一种简单,经济有效和非病毒的方法来有效地重新编程角化细胞到使用附加型载体13人iPS细胞。在这里,我们提供的角质细胞衍生的人iPS细胞,包括来自弹拨头发,扩展和维护的角质形成和随后的重新编程,以产生iPS细胞的角质形成细胞的推导的生成的详细协议。
从个人人类头发样品的集合需要通过人的研究伦理委员会在宿主机构伦理委员会批准,并应符合进行与机构准则。
从弹拨头发1.隔离的角质形成细胞
2.维护和角质形成细胞传代
3.从一代人iPS细胞角质形成细胞利用游离型载体
毛发经过生长周期3个不同阶段:生长期(生长阶段),退行期(回归阶段)和休止期(休息阶段)20,21。生长期毛囊中含有上皮多层;这些层包括ORS,IRS和毛干( 图1)。毛发生长初期最终经历过渡到退行期阶段,该阶段的特点是ORS的和终止的毛干分化的细胞凋亡。最后,退行期的头发过渡到休止期,在细胞凋亡停止,休止期毛囊变得与静态特征休止期隆起20,21。
图1示出了休止期头发和毛发生长初期的形态。我们通常利用生长期的头发角质细胞推导。按照此协议,角质细胞副产物可以观察到头发附着( 图2A)以后,早在3天,将继续为proliferate( 图2B)。根据我们的经验,一些生长期的毛发可能无法连接或不遵守角质细胞生长;因此,收集至少5 - 10从各个生长期的毛发,以确保成功角质细胞的隔离。随后,将角质细胞可传代到新的板,并保持多个通道( 图2C)。要注意,如在第2描述的,相对于基质胶与KSR培养基上有一个涂层矩阵的角化细胞培养基角化细胞的更好的成长是很重要的。
扩建之后,角质形成细胞可以被重新编程为32天后重新编程的第3 图3A描述显示了一个典型的角质细胞衍生的hiPSC殖民地生成iPS细胞。这是常见的观察一些分化在hiPSC殖民地的中心。一旦人工采摘,派生的iPS细胞通常显示出高核细胞质比率和规定菌落绑定元( 图3B)。人iPS细胞的建立的细胞系可以接着如先前13,19所述,如多能标记物的OCT4,NANOG和TRA-160( 图3C-E)的表达进行表征为多能性。
图1.在不同的生长阶段弹拨的毛发代表图像。(A)表示在生长期或休止期的毛发。相位对比图像,显示在(B)的休止期和(C)的生长期一个拨弦头发。 HS =毛干; IRS =内根鞘; ORS =外毛根鞘。比例尺= 100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
的弹拨头发人物头发衍生的角质形成细胞2.代表性图像。相位对比图像镀下来(A)中3天,(B)的10天。白色箭头标记角质形成细胞从弹拨头发生长。第3天角质形成细胞与传代后,一个典型的鹅卵石形态(C)相衬图像。比例尺= 100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图的角质细胞衍生的iPS细胞代表性的图像。一个32天重编程的文化呈现出角质细胞衍生的hiPSC共同的(A)相衬图像罗尼。 ( 二)手动选择角质细胞衍生的iPS细胞具有形态类似于胚胎干细胞。 iPS细胞多能性与标志(C)NANOG和(D)OCT4和免疫(E)的角质细胞衍生的iPS细胞TRA-160。比例尺= 100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
患者特异性人iPS细胞的产生提供了用于在体外研究发病在患病细胞类型的独特方法,并且还提供了用于药物筛选平台,以确定新的分子,可以拯救疾病表型。使用人iPS细胞这种疾病建模方法已取得了令人鼓舞的结果,适用于各种疾病,包括长QT综合征,亨廷顿氏病,帕金森氏病和肌萎缩性侧索硬化22。若干举措已经展开,建立以病人特异性iPS细胞,其中包括在美国,欧洲,澳大利亚,中国,韩国和日本财团23,24大型图书馆。
在这里,一个协议从头发角质形成细胞衍生的iPS细胞建立描述,它具有方便和快速轨道建立疾病特异性iPS细胞的大规模库的潜力。该协议提供了两个好处:第一,游离系统在本协议中使用的生成使用六重编程因子鸡尾酒集成无iPS细胞(OCT4,SOX2,KLF4,L-MYC,LIN28,为的shRNA P53)在相对 高效率的4。相比于逆转录病毒或慢病毒介导的重编程方法,利用附加型载体的重新编程避免在国外转基因的基因组不可取的整合,因此,许多举措有利于利用集成的无重编程的方法建立大型hiPSC库,如附加型载体,仙台病毒或mRNA,综合以上方法重新编程23。
其次,头发是方便,可以由患者无需使用侵入性程序或医务人员的出勤收获自己。这为来自不同地区的患者自己的头发样本中一个独特的机会,收集和邮件实验室进行角质推导和随后的重新编程。为支持这一战略的可行性,我们未公布的数据表明,角质形成细胞可以成功地从保存在4℃至10天的弹拨头发隔离。
这里所描述的方法将允许角质细胞从弹拨头发推导。虽然角质形成细胞可以从只是一个单一的头发得到,我们的建议是收集至少5生长期的毛发的角质细胞的推导。此协议的一个限制是某些毛发可能不附加井和角化细胞可能无法生长。较厚的头发往往附着比较好,而汗毛需要电镀,以避免浮动,增强附着在培养液量减少。一旦角化细胞衍生,最好扩大并使用标准的慢速冷冻冷冻保存方法16冻结向下股票。随后的角质形成细胞重编程,可以在执行这个协议描述的以下步骤。重要的是要注意,起始细胞的增殖速率可能影响重编程效率,在晚期传代以降低重编程效率观察细胞达到细胞衰老25-27。在这方面,使用角质形成不迟于通道6用于重编程的实验。另外,重新编程的效率可能不同个体的角质细胞之间变化。
最近的研究表明,在多种类型的体组织28的广泛的遗传嵌合体,以〜报道具有躯体的CNV在基因组中29皮肤成纤维细胞的30%。这些拷贝数变异可以通过在DNA复制,DNA修复或转座子动员错误引起的。它也有可能是长时间的紫外线照射到皮肤可能会导致在表皮细胞,包括成纤维细胞和角化细胞的其他拷贝数变异,但这种程度还不是很清楚。如角质形成细胞的CNV将在重编程过程中进行过,它是即时portant来执行例行核型或CNV分析,以确保所建立的人iPS细胞维持基因组稳定性。总之,我们在这里所描述的方法用于产生人iPS细胞的自发衍生的角质形成细胞,其可用于疾病建模和再生医学。
The authors have no conflict of interest.
The authors wish to thank Harene Ranjithakumaran and Stacey Jackson for technical support. This work was supported in part by grants from the National Health and Medical Research Council (R.C.B. Wong, A. Pébay), the University of Melbourne (R.C.B. Wong), Retina Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay) and the Ophthalmic Research Institute of Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay); Australian Research Council Future Fellowship (A. Pébay, FT140100047), Cranbourne Foundation Fellowship (R.C.B. Wong); intramural funding from the National Institutes for Health (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung) and operational infrastructure support from the Victorian Government.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibiotic Mix: | |||
250 ng/ml Antimycotic amphotericin B | Sigma | A2942-20ml | Antibiotic mix is made up in PBS. |
1X Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
PBS (-) | Invitrogen | 14190-144 | |
Knockout Serum Replacement (KSR) medium: | KSR medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. bFGF is added fresh to the media before use. | ||
20% knockout serum replacement (KSR) | Invitrogen | 10828-028 | |
DMEM/F12 with glutamax | Invitrogen | 10565-042 | |
1× MEM non-essential amino acid | Invitrogen | 11140-050 | |
0.5× Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
0.1 mM β-mercaptoethanol | Invitrogen | 21985 | |
bFGF (10 ng/ml, added fresh) | Millipore | GF003 | |
Keratinocyte medium: | |||
EpiLife with 60 µM Calcium | Invitrogen | M-EPI-500-CA | |
1× Human keratinocyte growth supplement (HKGS) | Invitrogen | S-001-5 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) medium: | FBS medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. | ||
10% fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | |
DMEM | Invitrogen | 11995-073 | |
0.5x Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
2 mM L-glutamine | Invitrogen | 25030 | |
0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
Extracellular Matrix (ECM): | |||
Matrigel | Corning | 354234 | Aliquot Matrigel stock and store in -80°C following manufacturer’s instructions. Stock concentration of Matrigel varies slightly from batch to batch (~9mg/ml). We recommend to use 200µl matrigel for coating a 12-well plate (~150µg/well). |
Coating Matrix Kit | Invitrogen | R-011-K | |
Plasmids: | Note that pCXLE-eGFP is only used for monitoring transfection efficiency and is not required for reprogramming. | ||
- pCXLE-eGFP | Addgene | 27082 | |
- pCXLE-hOct3/4-shP53F | Addgene | 27077 | |
- pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | |
- pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | |
Transfection reagent Fugene HD | Promega | E231B | |
Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | Make up 0.1% gelatin in distilled water. Autoclave before use. |
Reduced Serum medium: OPTI-MEM | Invitrogen | 31985062 | |
Accutase | Sigma | A6964-100ml | |
Mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder | MEF can be inactivated by mitomycin C treatment or irradiation as described previously 16. | ||
26G needle | Terumo | NN2613R | |
6-well plate (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353046 | |
12-well plate (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353043 | |
10 cm dish (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353003 | |
Dispase | Invitrogen | 17105-041 | Use at 10 mg/ml |
Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Use at 1 mg/ml |
TRA-160 antibody | Millipore | MAB4360 | Use at 5 µg/ml |
OCT4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | Use at 5 µg/ml |
NANOG antibody | R&D Systems | AF1997 | Use at 10 µg/ml |
MycoAlert Detection kit | Lonza | LT07-418 |
请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形
请求许可This article has been published
Video Coming Soon
版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有,本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。