Method Article
The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.
Hücre kültürü, geleneksel hücre biyo materyal yüzeyi ventral reseptörleri kullanarak uygun iki-boyutlu (2B) alt tabakalar üzerinde yapılmıştır. Bununla birlikte, in vivo olarak, hücrelerin çoğu tamamen reseptörlerinin bir üç boyutlu (3D) dağılımı ile sonuçlanan hücre dışı matrisin (ECM) ile çevrilidir. Bu sinyal yolları dışında-ve böylece hücre davranış farklılıkları tetikleyebilir.
Bu makale zaten yeni bir malzeme (bir sandviç gibi kültür) bir filmi kaplayan bir 2B yüzeye yapıştırılır hücrelerin dorsal reseptörlerini uyararak standart 2D kültürlere göre önemli değişiklikler tetikler olduğunu göstermektedir. Ayrıca, ventral ve dorsal reseptörlerinin aynı anda uyarma yakın 3D ortamlarda bulunan edilene hücre davranışını değiştirir. Buna ek olarak, bağlı sistemin doğası gereği, bir sandviç gibi kültür hücre / malzeme inte farklı parametrelerin çalışma sağlar çok yönlü bir araçtırkasılma konsantrasyona, örneğin, topoğrafya, sertlik ve hem ventral ve dorsal kenarlarında farklı protein kaplamaları. Sandviç benzeri kültürler 2D yüzeylerde dayanmaktadır çünkü nihayet, birkaç analiz prosedürleri zaten 3D sistemleri için gerekli daha karmaşık prosedürleri aşarak, normal olarak kullanılabilir standart 2D kültürler için geliştirilmiş.
In vivo hücre mikroçevrelerde çoğu üç boyutlu (3D) bir yapıya sahip olsa Geleneksel olarak, hücre kültürü, iki-boyutlu (2B) alt tabakalar üzerinde yapılmıştır. Bu doğal olmayan 2D ortam düz bir dünya için kendini uyarlama bir yolu olarak, hücre davranış değişiklikleri, tetikler hangi doğrudan etkiler, hücre kaderi 1,2. Bu nedenle, 2B hücre kültürlerinde elde edilen sonuçlar her zaman in vivo tekrarlanabilir değildir. Bu, herhangi bir boyut bağımlı biyolojik mekanizma 3,4 içine daha fazla anlayış almak için daha fazla fizyolojik benzeri koşulların sağlanması isteyen yeni alakalı kültür sistemlerinin geliştirilmesi teşvik etmiştir.
2B hücreleri ventral yapışır yüzeylerde oysa, in vivo hücrelerin çoğunluğu tamamen ECM ve çevrili: 2B kültür ve in vivo ortamda 3D arasındaki ana farklardan biri ekstrasellüler matriks (ECM) demirlemiş hücre reseptörlerinin dağılımı Böylece ceII yapışma reseptörlerinin bir 3D dağıtım yoluyla gerçekleşir. Bu sayede, hücre büyümesi, hücre farklılaşması ve gen ekspresyonu gibi önemli işlevleri modüle farklı hücre yapışma sinyal yollarını başlatır. Onların değişkenlik ve karmaşıklık ortak hücre kültürü prosedürlerinin kendi standardizasyon engel olsa son on yılda, pek çok farklı 3D kültür sistemleri, 5-8 kurulmuştur. Ayrıca 3D sistemler genellikle işlemek ve 2D yüzeylerde mevcut deneysel işlemler kolayca 3D kültürler için kurulmuş olamaz kolay değildir. Buna ek olarak, edebiyat nadiren bu modellerde hücre davranışını doğru anlaşılmasını engelleyen, eşdeğer 2B durumu veya diğer 3D sistemlerle 3D kültürleri karşılaştırır.
Bir kez 2B substrat, dorsal reseptörlerinin uyarılması üzerine yapıştırılır hücrelere sahip - yeni bir malzeme (sandviç gibi kültür) bir filmi kaplayan ile - hücre hem yanıtları 3D ortamlar tetikleyebilir. reaBunun arkasında oğlu dorsal ve ventral reseptörleri yapışır ve sandviç ortamında yaymak için (Şekil 1) 9,10 hem de eş zamanlı aktivasyonu olduğunu. Bunun bir sonucu olarak, hücreler 2B kültürleri 11,12 ile ilgili olarak önemli değişimler geçirirler. Dorsal uyarım önemli hücresel yollardaki değişiklikler tetikler çünkü Böylece, hücre kaderi, çünkü sandviç kültürü montajı esnasında belirlenir. Bu nedenle, hücre kaderi yüksek sandviçe benzer kültürü 11 monte edilir zaman ile tespit edilir.
Nedeniyle sistemin doğası gereği, bir sandviç gibi kültür hem ventral ve dorsal tarafı böyle kimya, topoğrafya, sertlik ve protein kaplamalar gibi hücre / malzeme etkileşimleri farklı parametrelerin çalışma sağlayan basit ve çok yönlü bir araçtır. Bu, geniş bir v bağımsız olarak dorsal ve ventral kombinasyonu diğer 3D Systems (Şekil 2) göre çok yönlü bir yüksek derecesiYüzey koşullarının ariety. Buna ek olarak, farklı hücre hatları ve sandviç-benzeri kültür monte farklı zamanlarda olanakları geniş spektrumunu artan incelenebilir.
Sandviçe benzer kültür standart bir protokol kullanılarak aşağıda ayrıntılı olarak, ya sırt alt tabakalar, protein kaplama olarak ventral alt-tabaka ve fibronektin gibi cam lamel gibi asit (PLLA) electrospun elyaflar ya da filmler-L-laktik poli. Sandviç gibi kültürler, sadece hücre tohumlama sonra veya 2B kültür 3 saat sonra monte edilmiştir. Bununla birlikte, diğer malzeme sistemleri ve proteinler kullanılabilir dikkat ediniz; aynı şekilde sandviç benzeri bir kültürü, farklı zaman noktalarında monte edilebilir.
Dorsal Yüzeyler 1. Üretimi
2. Sandviç Kültürü
3. Analiz
Not: Sandviç gibi kültürler 2D yüzeylerde dayanmaktadır ve bu nedenle yaygın olarak zaten standart 2D kültürler için geliştirilmiş prosedürler ile analiz edilebilir. Örneğin, beri PLLA şeffaf ve cel olduğunuls xy düzlemi içinde hareket etmek kısıtlanır, mikroskopi 2B yüzeylerde olarak yapılır. Hücre göçü, bu nedenle deneme ve görüntü analizi kolaylaştırır 3D kültürleri için z-ekseni hücreler izleme gerek kalmadan, 2B kültürleri gibi analiz edilebilir. Bir çizik testi ile yara iyileşmesi tahlil incelemek için bu protokolü uygulayın:
Not: protein ve nükleik asit ekstraksiyon 2B alt tabakalar üzerinde benzer şekilde gerçekleştirilir. Ekstraksiyon verimini artırmak amacıyla hücreleri üzerinde doğrudan lizis tamponu eklemek için sandviç gibi kültür demontaj oluşur tek fazladan bir adım vardır. Örneğin mRNA çıkarımı için:
Not: Proteinlerin imüno-da 2 boyutlu yüzeylere olduğu gibi gerçekleştirilebilir. Sandviç gibi kültürler antikorlar ve tampon doğru difüzyon engel olabilir için, inkübasyon süreleri arttırılmalıdır. Ayrıca, sandviç boyama protokolü başlamadan önce demonte edilebilir, ancak bu ikinci durumda bazı hücreler dorsal ve ventral substrat alt tabakaya bazı bağlı kalacaktır.
sandviç gibi kültürün içinde dorsal reseptörlerinin uyarılması, hücre morfolojisi, hücre yapışması ve hücre içi sinyal yolları (örneğin fokal yapışma kinaz, FAK) 10-12 değişiklikleri tetikler. Diğer 3D kültürler 15,16 için görüldüğü gibi, bir örnek olarak, sandviç benzeri bir sistem içinde kültürlendi fibroblastlar, 2D göre α 5 integrin alt birimi aşın.
Hücre kaderi, hidroj eller gibi diğer 3D sistemlerinde olur Benzer şekilde, sırt reseptörleri uyarılır zaman ve sırt etkileşim özellikleri ile son derece bağlıdır. Örneğin, proteinler, sıkı bir şekilde, genellikle bağlı hidrojeller gelişmemiş aktin hücre iskeleti ile daha küçük ve yuvarlak hücrenin ve fokal yapışmalarda yayılır. Hücreler mekanik proteinler ve hücre SPREA bu katmanı yeniden mümkün değildir, böylece bu, sıkı proteinleri adsorbe bir sandviç gibi kültür kullanan yüzeylerde taklit edilebilirding engellendiği. Benzer bir şekilde, hücreler ECM yeni model olabilir hidrojeller proteinleri daha gevşek 10 adsorbe substratlar ile sandviç sistemi ile taklit edilebilir.
Dorsal reseptörlerinin uyarılması C2C12 hücre kaderine modüle ettiği gösterilmiştir. Fibronektin ile kaplı ancak sığır serum albümini (yapışkan olmayan bir protein) ile kaplanmış olmadığında electrospun PLLA liflerin doğrudan hücre hizalama Dorsal. Bu sonuç hücreleri (Şekil 4) biyolojik anlamda yapmak ve dorsal girişlerine tepki işaret 9. Ayrıca, uçak dorsal PLLA sandviç benzeri kültürler Miyogenesis düzeyinde bir artışa neden oldu. Bu ayrı farklılaşma oranlarında farklı dorsal proteinler sonuçları (Şekil 5) 9 ile etkileşim beri dorsal biyolojik uyaranlara de bağlıdır.
2B kültürüne göre sandviç gibi kültür içinde hücre göçü de değişir. Bu edildiğiniyara iyileştirici tahlilinde göstermiştir tr, sandviç kültürü içindeki hücreler, oldukça uzun bir morfolojiye kabul ve 2D substratlar üzerinde daha kısa mesafeler geçirmek (Film 1 ve 2). Hücre göç hızları ayrıca ventral ve dorsal stimülasyon 12 doğasına bağlıdır.
Benzer şekilde 3B fibronektin ve kolajen jellerin içindeki olarak 17,18, sandviç benzeri bir kültürü (Şekil 6) 12 2B durumuna göre hücre aracılı ECM yeniden düzenlenmesi (örneğin, ventral fibronektin) artar. Bu süreç kontraktilitesi inhibitörleri (blebbistatin, Y27632) süreci engellenmiş kullanımı beri dorsal mekanik uyaranlara ve hücre iskeletinin istikrar dayanır. İlginç bir şekilde, farklı bir dorsal proteini kaplama (örneğin, vitronektin ve sığır serum albümini) kullanıldığında ventral fibronektin, aynı zamanda yeniden yapılanmış ve bile, kaplanmamış 12 bıraktı.
Şekil 1:.. Standart (2B) Sketch ve sandviç gibi kültürler sandviç gibi kültürün içinde dorsal reseptörlerinin uyarılması önemli hücresel süreçleri modüle ek hücre yapışması sinyallerini tetikler , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Sandviç gibi kültür hem ventral ve dorsal yüzeylerde farklı iyi kontrol parametreleri (topografik girdiler, sertlik, degradeler ...) çalışma sağlayan çok yönlü bir sistemdir.
Şekil 3:. Sırt yüzeyler belirlenen üst ve alt tarafı göstermek için üst ve kesit görünümü hem de kabataslak (A) Düz PLLA film ve (B) electrospun lifleri.
Şekil 4:. Gerektiğinde düzlemde (p) ve hizalanmış lifleri (a) PLLA ventral (indis) olarak kullanıldığına dair veya dorsal (üst simge) yüzeylerde dahil olmak üzere farklı kültür koşulları altında C2C12 morfolojisi Noktalı çizgiler liflerin yönünü temsil etmektedir. Hücreler düzlem yüzeye kültüre ve PLLA ve hizalanmış lifleri (SW p a) dorsal uyaranlara anlamda ile kaplanmış. Özel olarak, hücreler, fibronektinle kaplanmış, ancak wi kaplı olmayan zaman sırt lifleri duyuinci sığır serum albümini (yapışkan olmayan bir protein). Sonuç olarak hücreler, fibronektinle kaplanmış elyaflara uygun ve aynı yönde hizalanır. Referans 9 uyarlanmıştır Görüntü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: farklılaşma ortam içinde 4 gün sonra sandviç gibi kültürlerde hücre farklılaşması. Farklı kültür koşulları düzlemine (P) ve sıralanmış liflerden (a) PLLA ventral (simge) veya dorsal (numaralar) olarak kullanıldığı alt-tabakalar. Örnekler her durumda fibronektin ile kaplandı da dahil olmak üzere analiz edilmiştir. (A) Floresans sarkomerik miyozin pozitif hücreler (yeşil) ve hücre çekirdekleri (kırmızı) gösteren lekeleme. (B) FarklılaştırılmışHızlı Fourier Dönüşümü hesaplanan hücreler oryantasyon. (C) Miyogenesis sarkomerik miyozin-pozitif hücrelerin yüzdesi ile belirlenen. Veri altın standart kontrol normalize edilir. Istatistiksel olarak anlamlı farklılık *** P <0.001 ile gösterilir. Referans 9 uyarlanmıştır Görüntü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6: ventral fibronektin Reorganizasyon. Sandviç kültürü yeni fibronektin fibriller oluşturarak ventral FN reorganizasyon tetikler. (Fırça gibi etiketleme, beyaz oklarla işaret) ventral fibronektin farklı dorsal protein kaplama (fibronektin, vitronektinin ve sığır serum albümini) ile sandviç benzeri kültürler içinde yeniden düzenlenirya da dorsal substrat kaplanmamış sol bile. Aktin hücre iskeleti (yeşil), çekirdekleri (mavi) ve FN (kırmızı) gösterilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Film 1: 2B Hücre göçü. L929 fibroblast iyileşmesi deneyini yara bir fibronektin kaplı cam lamel göç. Görüntüler (her 20 dakikada alınan bir çerçeve ile) 16 saat boyunca elde edildi. Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Film 2:. Sandviç gibi kültür içinde hücre göçü, bir sandviç gibi kültür içinde iyileşmesi deneyini yara göç L929 fibroblast ventral alt tabaka bir fibronektin kaplı cam lamel ve dorsal substrat bir fibronektin kaplı PLLA filmdi vardı. Görüntüler (her 20 dakikada bir alınan bir çerçeve ile) 16 saat süre ile elde edilen. Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Günümüzde, 3D kültür kanseri dahil olmak üzere hücre biyolojisinde önemli bir ilaç ve biyoteknolojik sanayi için konu yanı sıra araştırma, ve kök hücre. Bunun bir sonucu olarak çok sayıda 3D kültür sistemleri geliştirilmiştir. Ne yazık ki, 3D sistemleri arasındaki farklılıklar genellikle hücre kader anlayışı engelleyen, farklı hücre davranışı neden olur. Ayrıca, deneysel işlemler genellikle 2B kültür sistemleri gibi basit değildir. Bu nedenle bu bazı sakıncaları çok önemlidir aşmak isteyen yeni kültür sistemlerinin geliştirilmesi.
Sandviç-benzeri kültür güçlü, hücre farklılaşması, hücre morfolojisi, hücre sinyal iletimi ve hücre göçü gibi önemli hücresel süreçleri etkilemeye gösterilmiştir. Sandviç gibi kültür 3D kültür sistemleri ile 2D bağlantıları bu ifadeyi destekleyen 3D sistemlerde kültür hücreleri ile Dahası hücreler paylaşmak benzerlikler. Fizyolojik dokuları 3-14 μ aralığında gözeneklere sahipBu nedenle hücrelerin sınırlandırılmasına ve m, göç gibi hücresel süreçleri etkilerler. Dorsal ve ventral uyaranlar başına hücre morfolojisi sınırlar ve mutlaka ne olursa olsun, protein kaplamaların hücre göçü etkileyecek bir kısıtlı bir ortamda temsil gibi bu şekilde sandviç benzeri bir sistem kullanılarak değinmeyecek.
Nedeniyle dorsal ve ventral reseptörlerinin eşzamanlı uyarılmasına, sandviç gibi kültür hücre davranış boyutluluk rolünü araştırmak için sağlam bir teknolojidir. 2B yüzeylerde dayanmaktadır Dahası, bu kültür sistemi malzeme özellikleri ve farklı mikroçevrelerde altında hücre davranışının çalışma izin ECM girişleri farklı çalışma son derece çok yönlüdür. Ayrıca, dorsal reseptörleri hücre kaderi üzerinde uyarılır hangi zaman etkisi farklı zaman noktalarında dorsal alt tabakayı kaplayan tarafından incelenebilir. Bu nedenle, diğer 3D sistemlerinden farklı olarak, sandviç benzeri bir sistem geniş bir tayfıhücresel mikroçevrelerde iyi kontrol edilir. Sonuç olarak sandviç gibi sistem farklı kültür koşulları altında hücre biyolojisi ve test hücresi kaderi incelemek amacıyla farklı fizyolojik ortamlarda taklit etmek için ilginç bir hücre kültürü platformudur.
Daha önce de belirtildiği gibi, bu sistemin bir avantajı da, farklı ventral ve dorsal alt-tabakalar farklı protein kaplamalar kullanılarak incelenebilir olmasıdır. Bu nedenle, ligand yoğunluğu gibi hücre kaderi için önemli parametreler kullanılan 2B substratların her biri (örn ventral ve dorsal yüzeyler) ligand yoğunluğunu kontrol ederek ayarlanmış olabilir. Ancak, farklı yüzeyler protokolde değişiklik gerekebilir unutmayın. Örneğin, büyük dorsal substratlar kullanılarak Petri kabı kapalı örnekleri soymak için uygun inkübasyon süresi ayarlamak için ihtiyaç neden olabilir. Benzer şekilde, daha büyük bir ventral alt tabakalar için ventral sınırlı oksijen geçirgenliği numunenin merkezinde hipoksik bölgelerinde sonuçlanabilirAlt tabaka (cam lamel nedeniyle). Ayrıca, analiz prosedürleri substrat özelliklerine bağlıdır. Hala protein / nükleik asitler çıkarma sağlayacak olsa Örneğin, opak dorsal substratlar kullanılarak standart mikroskopi protokolleri engel olacaktır. Hücreler ortamdan besin almak ve atık atmak için izin verilmelidir çünkü bir diğer önemli faktör dorsal substratın geçirgenliği.
Özetle, bir sandviç gibi kültür hücre kaderi araştırmak için farklı 3D benzeri mikroçevrelerde taklit imkanı sunuyor basit bir sistemdir.
The authors have nothing to disclose.
The support from ERC through HealInSynergy (306990) and the FPU program AP2009-3626 are acknowledged.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ploy(lactic acid) | NatureWorks | 4042D | Reagent |
Cover glasses (12 mmØ) | Marienfeld | 631-0666 | Equipment |
Chloroform | Scharlab | CL0200 | Reagent |
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Sigma | 105228 | Reagent |
Syringe (1 ml) | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | Equipment |
Syringe pump | New Era Pump Systems | NE1000 | Equipment |
High Voltage DC Power Supply | Glassman High Voltage | Series FC | Equipment |
Incubator | Hucoa-Herlös | 3111 | Equipment |
Laminar flow hood | Telstar | AV30/70 | Equipment |
Human Fibronectin | Sigma | F2006 | Reagent |
RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
Inverted microscope | Leica Microsystems | DMI 6000 | Equipment |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Reagent |
Albumin | Sigma-Aldrich | A7409 | Reagent |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Reagent |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır